Ekspresi Inducible Nitric Oxide Synthase (INOS) dan Gambaran Histopatologi Jantung pada Hewan Model Tikus (Rattus norvegicus) Hiperkolesterolemia yang Diberi Terapi Yogurt Susu Kambing The Inducible Nitric Oxide Synthase (INOS) Expression and Histopathology Appearance of Heart in Hypercholesterolemic Rat (Rattus norvegicus) Model by Goat Milk Yogurt Therapy Serena Olivia Natasya. H, Masdiana C. Padaga, Dyah Kinasih Wuragil Program Kedokteran Hewan Universitas Brawijaya Email:
[email protected] ABSTRAK Hiperkolesterolemia merupakan suatu keadaan dimana terjadi peningkatan serum Low Density Lipoprotein (LDL) dalam tubuh diatas batas normal. Pemberian diet hiperkolesterol diketahui dapat menyebabkan keadaan hiperkolesterolemia. Yogurt susu kambing memiliki kandungan bakteri asam laktat, peptida bioaktif, dan antioksidan yang berfungsi menurunkan kadar kolesterol dalam darah. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh pemberian yogurt susu kambing terhadap ekspresi INOS dan gambaran histopatologi jaringan jantung. Tikus yang dipakai dalam penelitian ini adalah tikus putih (Rattus norvegicus) jantan berumur 12 minggu yang dibagi dalam 5 kelompok yaitu kelompok kontrol, kelompok hiperkolesterolemia, kelompok hiperkolesterolemia dengan terapi yogurt 300 mg/kg BB, kelompok hiperkolesterolemia dengan terapi yogurt 600 mg/kg BB, dan kelompok hiperkolesterolemia dengan terapi yogurt 900 mg/kg BB. Hasil penelitian menunjukkan bahwa pemberian terapi yogurt susu kambing memberikan pengaruh yang berbeda nyata (p<0,05) terhadap ekspresi INOS antar kelompok. Pada terapi dosis 300 mg/kg BB menunjukkan adanya peningkatan ekspresi INOS terhadap kelompok kontrol sebesar 428% dan 600 mg/kg BB sebesar 211%, sedangkan dosis 900 mg/kg BB merupakan dosis terbaik dengan ekspresi INOS yaitu 117%. Selain itu pemberian terapi yogurt susu kambing berpengaruh terhadap perbaikan histopatologi jantung yang ditunjukkan dengan struktur kardiomiosit tidak beraturan dan bergelombang menjadi lebih baik yaitu susunan serat miofibril menjadi teratur. Dapat disimpulkan bahwa yogurt susu kambing dengan dosis 900 mg/kg BB merupakan dosis terbaik yang dapat digunakan sebagai terapi alternatif dalam keadaan hiperkolesterolemia. Kata kunci : Hiperkolesterolemia, yogurt susu kambing, inducible nitric oxide synthase (INOS), dan histopatologi jantung ABSTRACT Hypercholesterolemia is a condition of higher level of Low Density Lipoprotein serum (LDL) in the body. Giving hypercholesterol diet lead to hypercholesterolemia. Goat milk yogurt contents of bioactive peptide that can lower the cholesterol level in the blood. This research aimed to know the effect of giving goat milk yogurt towards the INOS expression and the heart histopathology. This research used male rats (Rattus norvegicus) aged 12 weeks that divided into 5 groups : control group, hypercholesterolemic group, hypercholesterolemic with 300 mg/kg BW goat milk yogurt therapy, hypercholesterolemic with 600 mg/kg BW goat milk yogurt therapy, and hypercholesterolemic with 900 mg/kg BW goat milk yogurt therapy. The results indicated 1
that decreasing of INOS expression significantly different between the treatments (p<0.05). The most effective dose for therapy is 900 mg/kg BW. Morever, giving the goat milk yogurt therapy affected the improvement of the wavy cardiomyocytes became better with normal structure of myofibril. It could be concluded that the goat milk yogurt therapy could be used as alternative therapy for hypercholesterolemia. Keywords: Hypercholesterolemia, goat milk yogurt, inducible nitric oxide synthase (INOS), and heart histopathology. darah namun penggunaan dalam jangka panjang dapat mengakibatkan efek samping seperti penurunan berat badan, nyeri lambung, dan depresi (Kasper et al., 2005). Salah satu terapi alternatif yang diketahui dapat menurunkan kadar kolesterol dalam darah adalah yogurt (Pereira et al., 2003; Yulinery et al., 2006; Belviso et al., 2009; Lee et al., 2010). Bakteri asam laktat dalam yogurt mampu memetabolisme kolesterol di dalam usus halus sehingga tidak diserap oleh tubuh (Ooi and Liong, 2010). Yogurt merupakan produk pangan hasil fermentasi dari bakteri asam laktat (Surajudin dkk., 2005). Yogurt dapat dibuat dari susu sapi maupun susu kambing. Susu kambing memiliki banyak manfaat daripada susu sapi, kelebihannya yaitu kadar protein susu kambing lebih tinggi, ukuran globuler lemak lebih kecil sehingga mudah dicerna (Haenlin et al., 2004). Susu kambing juga memiliki kandungan asam amino pada protein yang lebih tinggi daripada susu sapi (Greppi et al., 2008). Protein pada susu tidak selalu aktif dan bermanfaat ketika masih dalam bentuk asli, namun akan aktif ketika ada aktivitas proteolitik yang mengubah protein menjadi molekul kecil dan aktif. Salah satu cara untuk mengaktifkan protein yaitu melalui proses fermentasi sehingga menghasilkan biopeptida (Ramchandran et al., 2009). Biopeptida hasil fermentasi yogurt mampu menginduksi sistem imun seluler dan berfungsi sebagai antiinflamasi (Levings et al., 2002). Penggunaan yogurt susu kambing diharapkan mampu menjadi alternatif untuk
PENDAHULUAN Penyebab utama kematian secara global yaitu tingginya angka kejadian penyakit kardiovaskuler. Faktor penyebab penyakit kardiovaskuler adalah kadar kolesterol dalam darah melebihi batas normal (Rerkasem et al., 2008). Angka prevalensi penyakit kardiovaskuler yang menyebabkan kematian pada manusia mencapai 30-80% (WHO, 2009) sedangkan pada hewan terutama anjing dan kucing mencapai 13-32,8% (Steiner, 2008). Beberapa jenis anjing yang sering terserang penyakit ini seperti Schnauzer, German shepherd, Cocker spaniel, Bichon frise, dan Cross breed (Fonturbel, 2011). Hiperkolesterolemia merupakan peningkatan serum Low Density Lipoprotein (LDL) dalam darah sehingga mengakibatkan molekul LDL teroksidasi dan terbentuknya lipid peroksida. Lipid peroksida merusak sel endotel pembuluh darah sehingga menyebabkan inflamasi dan menginisiasi munculnya sitokin proinflamasi seperti interleukin-1 (IL-1) dan TNF-α (Weetman, 2002). Sitokin proinflamasi menginduksi Inducible Nitric Oxide Synthase (INOS) dalam miosit dan endotel vaskular untuk memproduksi Nitric Oxide (NO). Pada penelitian sebelumnya diketahui bahwa jumlah NO yang diproduksi secara berlebih dalam jantung dapat menyebabkan terjadinya kerusakan pada bagian miokardium (Hussain et al., 2007). Penggunaan obat hiperkolesterolemia mampu menurunkan kadar kolesterol dalam 2
pengobatan penyakit hiperkolesterolemia. Berdasarkan latar belakang tersebut dilakukan penelitian untuk mengetahui ekspresi INOS dan gambaran histopatologi jantung pada hewan model tikus (Rattus norvegicus) hiperkolesterolemia yang diberi terapi yogurt susu kambing.
spirtus, aquades, NaOH, NaCl fisiologis 0,9%, NaCl, pewarna Hematoksilin Eosin (HE), parafin, alkohol 70%, alkohol 80%, alkohol 90%, xylol, H2O2, BSA 1 %, methanol absolut, etanol absolut, antibodi primer mouse anti INOS, antibodi sekunder rabbit anti-mouse IgG berlabel biotin, diamino benzidine (DAB).
MATERI DAN METODE Alat dan Bahan Peralatan yang digunakan dalam peelitian ini adalah kandang tikus, alat bedah, cawan petri, animal restrain, alat sonde lambung, gelas ukur, labu ukur (500 ml dan 1000 ml), reagent bottle, corong kaca, erlenmeyer, microtube, tabung reaksi, vortex (Guo-Huq), pipet ukur, bulb, aluminium foil, autoclave, bunsen, alat sentrifuge (Sorvall Biofuge Primo R Centrifuge, Sorvall Legend Micro 17), kompor, panci, spatula, waterbath, mikropipet, pH meter (Eutech Instrument Cyberscan Ph 310), pH indicator, object glass, beaker glass (50 ml, 250 ml, 500 ml, 1000 ml), timer, neraca analitik (Precisa 3000 D), neraca O’Hauss, mesin freeze dried (Christ Beta 1-8K), refrigerator, termometer, mikroskop cahaya (Olympus BX51), dan inkubator (Memmert). Bahan yang digunakan adalah tikus (Rattus norvegicus) jantan strain wistar umur 10-12 minggu dan berat badan 100150 gram yang diperoleh dari Unit Pengembangan Hewan Penelitian (UPHP) Universitas Gadjah Mada Yogyakarta dan telah mendapatkan persetujuan Laik Etik dari Komisi Etik Penelitian Universitas Brawijaya (KEP UB) dengan no. 217-KEPUB, kuning telur puyuh, asam kholat (Catalog No: M5M5306), minyak babi, PBS, PBS Azida, PFA 4%, susu kambing, starter yogurt met freeze dried Lyo-San Inc. 500 Aeroparc, C.P. 598, Lachute, Qc, Canada J8H 4G4 (Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus acidophilus, dan Streptococcus thermophilus), alkohol,
Metode Preparasi Hewan Coba Hewan coba dibagi menjadi 5 kelompok yaitu kelompok Kontrol (A), kelopok Hiperkolesterolemia (B), terapi yogurt susu kambing dosis 300 mg/kg BB (C), dosis 600 mg/kg BB (D) dan 900 mg/kg BB (E). Kelompok tikus B, C, D dan E diberikan diet hiperkolesterolemia secara oral melalui sonde lambung. Pakan diet hiperkolesterol terdiri dari campuran asam kholat 0,1%, minyak babi 10%, dan kuning telur puyuh rebus 5% kemudian dilarutkan dalam air sampai volume 2 ml (Gani et al., 2013). Pemberian Terapi Yogurt Susu Kambing Pemberian yogurt susu kambing secara per oral tiap ekor tikus pada hari ke 22 sampai hari ke 49 yaitu dari penentuan dosis terapi dibagi menjadi tiga perlakuan diantaranya : 300 mg/kg BB diberikan pada tikus kelompok C, dosis 600 mg/kg BB untuk tikus kelompok D dan dosis 900 mg/kg BB untuk tikus kelompok E. Masing - masing kelompok terdiri dari 4 ekor dan setiap dosis terapi menggunakan volume pengenceran 1,5 ml. Pengambilan Organ Jantung Tikus dikorbankan dengan cara dislokasi leher, selanjutnya dilakukan pembedahan bagian abdomen. Jantung diperoleh dengan mengeluarkan isi abdomen terlebih dahulu kemudian dicuci dengan NaCl fisiologis 0.9% dan direndam pada larutan Paraformaldehid (PFA) 4%). Jantung 3
digunakan untuk pembuatan preparat histopatologi dan imunohistokimia untuk pengukuran ekspresi INOS.
dengan PBS pH 7,4 selama 3x5 menit. Preparat dilakukan counterstaining dengan Mayer’s Hematoxylin selama 5 menit lalu dicuci dengan air mengalir. Tahap terakhir preparat kemudian dikering anginkan dan dilanjutkan mounting menggunakan entellan lalu ditutup dengan cover glass (Ramos, 2005). Hasil akhir diamati menggunakan mikroskop cahaya dengan perbesaran 400x.
Pembuatan dan Pengamatan Gambaran Histopatologi Jantung Pembuatan preparat histopatologi menurut Junquiera and Carneiro (2007), terdiri dari tahapan fiksasi, dehidrasi, penjernihan, infiltrasi parafin, embeeding, sectioning, penempelan di gelas objek, dan pewarnaan Hematoksilin Eosin (HE). Preparat histopatologi jantung diamati secara visual menggunakan mikroskop Olympus BX51 perbesaran lemah (400x) dilanjutkan perbesaran kuat (1000x). Perubahan yang diamati pada bagian jantung yang mengalami kerusakan berupa struktur otot jantung tidak beraturan atau bergelombang.
Analisis Data Data kualitatif untuk gambaran histopatologi jantung dianalisis serta disajikan secara deskriptif dan data kuantitatif untuk mengetaui ekspresi INOS yang dianalisis dengan SPSS 16.0 Edition for Windows. HASIL DAN PEMBAHASAN Efek Terapi Yogurt Susu Kambing Terhadap Ekspresi Inducible Nitric Oxide Synthase (INOS) Tikus Model Hiperkolesterolemia Hasil penelitian pada kelompok hiperkolesterolemia yang diterapi yogurt susu kambing dibandingkan dengan kelompok hiperkolesterolemia menunjukkan penurunan rata-rata ekspresi Inducible Nitric Oxide Synthase (INOS). Ekspresi INOS dengan pewarnaan imunohistokimia terlihat berwarna coklat.Rata-rata ekspresi INOS pada jantung tikus perlakuan (Tabel 1) menunjukkan hasil yang berbeda nyata antar perlakuan. Hasil uji statistik (One-Way ANOVA) dilanjutkan dengan uji Beda Nyata Jujur atau Tukey dengan tingkat kepecayaan 95%. Berdasarkan Tabel 1 diketahui nilai persentase ekspresi INOS jaringan jantung kelompok kontrol (A) menunjukkan persentase ekspresi INOS tikus dalam jumlah yang rendah sedangkan ekspresi INOS jaringan jantung pada kelompok hiperkolesterolemia (B) menunjukkan perbedaan yang nyata (p<0,05) dibandingkan kelompok kontrol
Pengamatan Ekspresi INOS dengan Metode Imunohistokimia Preparat jaringan jantung direndam dengan larutan xylol I dua kali, xylol II dua kali, alcohol bertingkat (100%, 90%, 80%, dan 70%) dan aquades 2 menit. Setelah itu disimpan selama 24 jam pada suhu 4 oC. Preparat dicuci dalam PBS pH 7,4 (3x5 menit), dilanjutkan dengan perendaman dalam 3% H2O2 dan preparat dicuci seperti sebelumnya. Langkah selanjutnya yaitu blocking dengan cara menggunakan 1% BSA selama 45 menit. Kemudian diinkubasi dengan antibodi primer mouse anti INOS antibody dan diinkubasi selama semalam pada suhu 4oC lalu dicuci dengan PBS pH 7,4 (3x5 menit). Jaringan ditetesi antibodi sekunder rabbit anti mouse IgG berlabel biotin dan diinkubasi selama 1 jam. Jaringan lalu dicuci dengan PBS pH 7,4 (3x5 menit). Jaringan ditetesi Strep AvidinHorseradish Peroxidase (SA-HRP) selama 40 menit. Jaringan lalu dicuci dengan PBS pH 7,4 (3x5 menit). Ditambahkan kromagen Diamino Benzidine (DAB). Preparat dicuci 4
(A), hal ini berarti induksi kolesterol dengan minyak babi, asam kholat, dan kuning telur puyuh rebus pada kelompok hiperkolesterolemia (B) dapat menyebabkan stress oksidatif sehingga mengakibatkan kerusakan organ jantung. Data pada Tabel 1 menunjukkan bahwa yogurt susu kambing
mampu menurunkan secara nyata ekspresi INOS jaringan jantung tikus hiperkolesterolemia.
Tabel 1 Rata-rata persentase area ekspresi INOS pada masing-masing kelompok perlakuan Kelompok Perlakuan
Rata – rata ekspresi INOS
Peningkatan Ekspresi INOS terhadap kontrol (%) a 1,632 ± 0,171 0 Tikus kontrol (A) 11,947 ± 0,537e 632 Hiperkolesterolemia (B) 8,617 ± 0,622d 428 Terapi dosis 300 mg/kg BB (C) c 5,085 ± 0,681 211 Terapi dosis 600 mg/kg BB (D) b 3,555 ± 0,370 117 Terapi dosis 900 mg/kg BB (E) Keterangan: Notasi a, b, c, d, dan e menunjukkan adanya perbedaan yang signifikan antar perlakuan terhadap ekspresi INOS (p<0,05). Pada keadaan hiperkolesterolemia mengakibatkan oksigen terduksi menjadi anion superoksida (O2--), dengan bantuan antioksidan didalam tubuh untuk melawan radikal bebas seperti enzim katalase mengakibatkan hidrogen peroksida (H2O2) tidak dapat berikatan dengan Fe2+ (besi), namun apabila produksi enzim katalase didalam tubuh menurun maka H2O2 berikatan dengan Fe2+ sehingga menghasilkan hidrogen peroksi (OH--) yang bersifat reaktif untuk merusak membran sel (Song et al., 2000 ) didukung oleh pendapat Cintra et al. (2006), bahwa kerusakan jaringan pada jantung dapat disebabkan oleh pakan yang mengandung kadar kolesterol tinggi sehingga menyebabkan jumlah lipid peroksida yang tinggi dan menjadi sumber radikal bebas pada tubuh. Radikal bebas yang terbentuk akibat tingginya kadar kolesterol di dalam darah dapat menyebabkan hipertrofi jantung dan apoptosis yang mengurangi kontraktilitas jantung (Bloedon et al., 2008) Produksi Nitric Oxide (NO) oleh NO synthase INOS
dapat bereaksi dengan anion superoksida (O2--) dan membentuk peroksinitrit (ONOO-) yang menyebabkan terjadinya peroksidasi lipid yang ditandai dengan meningkatnya ekspresi INOS. Produksi NO yang tidak normal dalam sel dan jaringan jantung menunjukkan adanya patogenesis. INOS ditemukan dalam makrofag, neutrofil, dan dapat menghasilkan reactive nitrogen species (RNS) (Stein, 2008). Kelompok tikus yang mendapat terapi yogurt susu kambing dosis 300 mg/kg BB, 600 mg/kg BB, 900 mg/kg BB secara signifikan (P<0,05) menunjukan penurunan rata-rata ekspresi INOS. Ekspresi INOS pada kelompok tikus terapi 900 mg/kg BB menunjukkan perbedaan yang tidak signifikan (P>0,05) terhadap kelompok tikus kontrol, hal ini menunjukkan bahwa dosis 900 mg/kg BB adalah dosis terbaik untuk terapi hiperkolesterolemia namun dosis tersebut belum menunjukkan perbaikan optimal mendekati kelompok kontrol. Pemberian yogurt susu kambing dapat mempengaruhi penurunan ekspresi INOS. 5
Gambar 1 Ekspresi INOS pada jantung dengan pewarnaan IHK perbesaran 1000X. Keterangan:(A) jantung kontrol / normal; (B) jantung tikus hiperkolesterolemia (C) jantung tikus hiperkolesterolemia terapi yogurt dosis 300 mg/kg BB (D) jantung tikus hiperkolesterolemia terapi yogurt dosis 600 mg/kg BB (E) jantung tikus hiperkolesterolemia terapi yogurt dosis 900 m ( ) ekspresi Inducible Nitrit Oxide Synthaze (INOS)
Yogurt susu kambing mampu menurunkan ekspresi INOS pada jaringan jantung tikus hiperkolesterolemia yang ditunjukkan adanya penurunan rata-rata ekspresi INOS pada Tabel 1 yang sebanding dengan penurunan jumlah warna coklat yang ditunjukkan dengan tanda panah pada gambar 1 C, D, dan E. Turunnya ekspresi INOS pada jaringan jantung akibat pemberian yogurt susu kambing karena memiliki kandungan biopeptida dan vitamin sehingga mampu mencegah dan menetralkan radikal bebas yang bersifat toksik serta
menimbulkan kerusakan oksidatif dan inflamasi pada jaringan. Kandungan biopeptida yogurt susu kambing seperti laktoferin dapat berikatan dengan Fe2+ atau mekanisme iron binding yang mencegah Fe2+ berikatan dengan H2O2. Jaringan jantung pada tikus kontrol menunjukkan ekspresi INOS dengan jumlah yang rendah karena menurut Lorenz (2002), ekspresi tersebut secara normal sebagai regulator kalsium pada sel. Nitric oxide merupakan hasil produksi INOS dan mengikuti jalur
6
cyclic Guanosine Monophosphate (cGMP) untuk mengatur transportasi natrium. Pemberian susu kambing dalam bentuk yogurt lebih efektif karena terdapat proses fermentasi yang berfungsi untuk menghasilkan biopeptida dalam susu. Biopeptida pada susu kambing seperti laktoferin juga berfungsi untuk menghambat produksi sitokin proinflamasi seperti Interleukin-1 (IL-1), Tumor Necrosis Factor (TNF-α), Interleukin-6 (IL-6), dan INOS (Artym et al., 2003). Kandungan lain dalam yogurt susu kambing adalah vitamin C dan vitamin E. Vitamin C berfungsi sebagai penghambat reaksi tehadap radikal bebas dan pelindung terhadap peroksidasi lemak di dalam membran, sedangkan vitamin E merupakan penghenti radikal bebas yang efisien di membran sel karena bentuk radikal bebas dapat distabilkan dan bereaksi langsung dengan superoksida dan anion hidroksil serta berbagai lipid peroksida. Vitamin E juga berfungsi sebagai antioksidan yang larut dalam lemak sehingga mengurangi terjadinya peroksidasi lipid (Gamal, 2011). Penjelasan diatas telah membuktikan bahwa yogurt susu kambing dapat mengurangi terjadinya inflamasi dan penurunan ekspresi INOS melalui biopeptida aktif dan antioksidan. Antioksidan dapat bekerja dengan cara sebagai pemberi atom hidrogen terhadap radikal bebas atau mengubahnya ke bentuk lebih stabil, selain itu antioksidan juga dapat memperlambat laju autooksidasi
dengan mekanisme pemutusan rantai autooksidasi sehingga kerusakan pada membran sel dapat berkurang (Bogdan et al., 2000). Salah satu mekanisme jantung dalam mengeliminasi adanya radikal bebas adalah mekanisme scavenging oleh antioksidan. Penangkapan radikal bebas O2-dan donasi hidrogen menghasilkan produk stabil seperti H2O2 yang memiliki fungsi sebagai vasodilatasi sehingga menurunkan ritme sistem pembuluh darah sehingga beban jantung dapat dikurangi (Alvarez et al., 2008). Belum optimalnya penurunan ekspresi Inducible Nitric Oxide Synthase (INOS) pada terapi yogurt susu kambing dosis 900 mg/kg BB dapat digunakan sebagai acuan penelitian lanjut dengan peningkatan dosis atau jangka waktu yang lebih panjang. Terapi Yogurt Susu Kambing Terhadap Gambaran Histopatologi Jantung Tikus Model Hiperkolesterolemia Hasil penelitian dari terapi yogurt susu kambing terhadap gambaran histopatologi jaringan jantung yang mengalami hiperkolesterolemia dengan pewarnaan Hematokslin Eosin (HE) disajikan pada (Gambar 2). Gambaran histopatologi jaringan jantung pada masingmasing kelompok perlakuan menunjukkan perbedaan struktur kardiomiosit pada miokardium.
7
Gambar 2. Histopatologi miokardium jantung tikus dengan pewarnaan Hematoksilin Eosin perbesaran 400X Keterangan: Tikus kontrol (A), Tikus hiperkolesterolemia (B), Tikus hiperkolesterolemia terapi yogurt susu kambing 300 mg/kg BB (C), Tikus hiperkolesterolemia terapi yogurt susu kambing 600 mg/kg BB (D), Tikus hiperkolesterolemia terapi yogurt susu kambing 900 mg/kg BB (E), kardiomiosit bergelombang (k1), kardiomiosit normal (k2), kongesti (k) dan Hipertrofi (H).
Pada kelompok kontrol (Gambar 2A) menunjukkan gambaran histologi jaringan jantung tikus normal ditandai dengan bentuk dan susunan serat miofibril teratur. Gambaran ini sesuai dengan Eroschenko (2003) bahwa gambaran histologi jantung adalah serat otot jantung memiliki beberapa ciri yaitu terdiri atas sel-sel yang panjang, terdapat diskus interkalaris di dalamnya, bercabang tunggal, terletak paralel satu sama lain dan memiliki satu atau dua inti yang terletak di tengah sel, selain itu juga terlihat miofibril pada potongan jantung melintang.
Pada kelompok hiperkolesterolemia (Gambar 2B) terjadi perubahan gambaran histologi jantung karena kondisi hiperkolesterolemia yang ditandai dengan perubahan struktur kardiomiosit tidak beraturan yang merupakan tahap awal terjadinya nekrosis, dan hipertrofi yang ditandai adanya penebalan miosit karena inaktivasi NO sehingga menyebabkan menyebabkan remodelling ventrikel dan terjadi hipertrofi akibat mempertahankan perfusi jaringan akibat beban jantung yang meningkat karena peningkatan tekanan 8
darah (Fantinelli et al., 2012). Pembuluh darah juga mengalami kongesti disebabkan oleh vaskularisasi sel terlalu banyak menyimpan lemak sehingga sirkulasi darah terhambat dan eritrosit terakumulasi. Hal ini sesuai dengan penelitian Hassan et al. (2012) bahwa terjadinya hipertrofi dan apoptosis kardiomiosit yang ditandai dengan struktur bergelombang tidak beraturan dan penebalan miosit pada jaringan jantung tikus hiperkolesterolemia. Mekanisme hipertrofi dan apoptosis menurut Song et al. (2000) yaitu terjadinya aktivasi produksi O2-NADPH. O2-- akan diubah oleh SOD menjadi H2O2 dan OH– sehingga dapat mengaktivasi MAPKs melalui peran enzim tyrosine kinase. Aktivasi MAPK ini dapat menyebabkan hipertrofi dan apoptosis jaringan jantung. Produksi NO oleh synthase INOS dapat berikatan dengan O2-- dan membentuk ONOO-- yang akan mengubah kanal ion dan fungsi pompa ion. Aktivitas tersebut dapat mengakibatkan pengurangan sensitivitas miofilamen sehingga ikatan actin dan myocin terganggu dan terjadi kerusakan pada kardiomiosit. Peningkatan ekspresi INOS terjadi karena reaksi inflamasi pada jaringan jantung akibat makrofag yang teraktivasi melakukan konversi molekul oksigen menjadi Reactive Oxygen Intermediate (ROI) dan memproduksi Nitric Oxide (NO). Semakin banyak produksi NO mengakibatkan ekspresi INOS meningkat pada jaringan jantung (Bogdan et al., 2000). Pemberian terapi yogurt susu kambing mampu memperbaiki kerusakan jantung ditunjukkan pada kelompok hiperkolesterolemia yang diberi yogurt susu kambing 300 mg/kg BB (Gambar 2C) menunjukkan perbaikan kardiomiosit yaitu berkurangnya gelombang dan perbaikan struktur miofibril namun masih terdapat hipertrofi miosit, sedangkan kelompok hiperkolesterolemia yang diberi yogurt susu
kambing 600 mg/kg BB (Gambar 2D) mengalami perbaikan struktur myofibril yang ditandai dengan gambaran struktur otot jantung yang rapi namun masih terdapat hipertrofi miosit. Pada kelompok hiperkolesterolemia yang diberi yogurt susu kambing 900 mg/kg BB (Gambar 2E) mengalami perbaikan lebih baik dibandingkan kelompok dosis sebelumnya yang ditunjukkan dengan struktur kardiomiosit mendekati normal dan pembuluh darah diantara myosit tidak mengalami kongesti. Mekanisme perbaikan gambaran histopatologi jantung yaitu peptida bioaktif seperti laktoferin pada yogurt susu kambing dapat mengurangi stress oksidatif melalui proteksi seluler dan proses perbaikan (Palniswamy et al., 2012). Laktoferin mampu memperbaiki membran sel karena adanya proses penghambatan terhadap radikal bebas sehingga kerusakan berkurang, selain itu vitamin E pada yogurt susu kambing mampu mencegah radikal bebas melakukan oksidasi membran sel. Biopeptida tersebut juga dapat menghasilkan antiinflamasi seperti interleukin 10 (IL-10) yang berfungsi sebagai penekanan aktifitas limfosit dan makrofag sehingga kerusakan pada membran sel jantung dapat membaik. Proses perbaikan kerusakan jaringan jantung akibat radikal bebas dilakukan dengan cara donor elektron pada zat yang kurang stabil dan antioksidan seperti glutathione peroksidase, vitamin C, vitamin E dapat bekerja memperbaiki kerusakan jaringan. Pengaruh dari peningkatan dosis yogurt susu kambing ialah menghasilkan antioksidan yang lebih tinggi sehingga dapat berperan aktif dalam menghambat peroksidasi lipid dengan menangkap radikal bebas dan menekan pembentukan radikal bebas yang merupakan penyebab kerusakan jaringan jantung (Bogdan et al., 2000). 9
Bogdan, C. 2000. Nitric Oxide and the Immune Response. Immunology Rev :110. Eroschenko VP. 2003. Atlas Histologi dengan Korelasi Fungsional. Ed 9.Jakarta: EGC, p.80-3. Fantinelli, J. C., C. Caldiz., M. C. Álvarez., C. D. Garciarena, G. E. C. de Cingolani and Susana M. Mosca. 2012. Oxidative Damage in Cardiac Tissue from Normotensive and Spontaneously Hypertensive Rats: Effect of Ageing, Oxidative Stress and Diseases. In Tech 141-156. Gamal, Y.M., Elmasry, dan D.H. ElGhoneimy. 2011. Immunomodulatory Effect of Food . Pediatric Allergy Immunology l 9 (1) : 3-13. Gani.N., L. L. Momuat., and M.M. Pitoi. 2013. Profil Lipida Plasma Tikus Wistar yang Hiperkolesterolemia pada Pemberian Gedi Merah (Abelmoschus manihot L.). Jurnal Mipa Unsrat 2 (1) : 44-49. Gamal, Y.M., Elmasry, dan D.H. ElGhoneimy. 2011. Immunomodulatory Effect of Food . Pediatric Allergy Immunology l 9 (1) : 3-13. Greppi, G., P. Roncada, dan R. Fortin. 2008. Protein Components of Goat Milk. Dairy Goat feeding and Nutrition 1 : 1-24. Haenlein, G.F.W. 2004. Goat Milk Human Nutrition. Animal and Food Science 51 : 155-163. Hassan,A.A., Nagwa M. Rasmy, Mervat I. Foda and Wafaa K. Bahgaat., 2012. Production of Functional Biscuits for Lowering Blood Lipids. Journal of Dairy and Food Sciences 7 (1): 01-20 1817308X Hussain SNA, Giaid A, Dawiri QEI, Sakkal D, Hattori R, Guo Y. 2007. Expression of nitric oxide synthase and GTP cyclohydrolase I in the ventilatory and
KESIMPULAN Pemberian terapi yogurt susu kambing dapat menurunkan ekspresi Inducible Nitric Oxide Synthase (INOS) pada jantung yang merupakan penanda terjadinya inflamasi. Penurunan terbaik pada dosis 900 mg/kg BB dengan penurunan 117%. Pemberian terapi yogurt susu kambing dapat memperbaiki gambaran histopatologi jantung tikus (Rattus norvegicus) hiperkolesterolemia yang ditunjukkan dengan perbaikan struktur dan bentuk kardiomiosit mendekati normal. UCAPAN TERIMAKASIH Peneliti mengucapkan terimakasih kepada Prof. Dr. Ir. Chanif Mahdi, MS sebagai ketua penelitian atas kesempatan dalam penelitian penulis, analis dan staf Laboratorium Biokimia, Laboratorium Molekuler dan Laboratorium Fisiologi Hewan FMIPA Universitas Brawijaya serta Laboratorium Patologi RS. Dr. Soetomo Surabaya. DAFTAR PUSTAKA Álvarez, M. C., C. Caldiz., J. C. Fantinelli., C. D. Garciarena., G. M. Console., G. E. C. De Cingolani and S. M. Mosca. 2008. Is Cardiac Hypertrophy in Spontaneously Cause of the Consequence of Oxidative Stres. Artym, J. 2003. Orally Administered Lactoferrin Restores Humoral Immune Response in Immunocompromised Mice. lmmunol Lett. 9(1) : 9-15. Bloedon, L.T., S. Balikai, J. Chittams, S.C. Cunnane J.A. Berlin, D.J. Rader and P.O. Szapary, 2008. Flaxseed and Cardiovascular Risk Factors: Results from a Double Blind, Randomized, Controlled Clinical Trial. J. the American College of Nutrition, 27(1): 65-74. 10
limb muscles during endotoxemia. Am J Respir Cell Mol Biol ;17:173–180. Junquiera and Carneiro. 2007. Basic Histology. The Mc Graw-Hill Companies. Kasper, D.L., 2005, Harrison’s Manual of Medicine, Mc Graw Hill Medical Publishing Division, New York, 208-212. Levings, M.K., R. Bacchetta, U. Schulz, dan M.G. Ron-carolo. 2002. The Role of IL10 and TGF-γ in the Differentiation and Effector Function of T Regulatory Cells. Immunology 129 : 263–76. Lawrence, G.S. 2004. Implikasi Klinis Disfungsi Endotel and Radikal Bebas : Unit Riset Vascular, bagian Patologi, FK Unhas, RSUP Dr. Wahidin Sudirohusodo. Makassar. Ooi, L.G. and M. T. Liong. 2010. Cholesterol-Lowering Effects of Probiotics and Prebiotics: A Review of in Vivo and in Vitro. Int. J. Mol. Sci. 11(6): 2499–2522. Palaniswamy, M., B. Nandhini. and J. Angayarkanni. 2012. Angiotensin Converting Enzyme Inhibitory Activity and Antioxidant Properties of Goat Milk Hydrolysates. International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences 4 (4) ISSN-0975-1491. Pereira, D. I. A., A. L. Mc Cartney, and G.R. Gibson. 2003. An In Vitro Study of the probiotic Potential of a Bile-SaltHydrolyzing Lactobacillus fermentum Strain, and Determination of Its Cholesterol-Lowering Properties. Appl. Environ. Microbiol. 69 (8):4743-4752. Ramchandran, L., Sciences H. & Campus W.2009. Low-fat Yoghurt as Influenced by fatReplacer. Faculty of Health, Engineering and Science Victoria University. Australia. Ramos, Vara, J.A. 2005. Technical Aspects of Immunohistochemistry. Vet Pathology 42 : 405–426.
Rerkasem, K., P.J. Gallagher, R.F. Grimble, P.C. Calder, and C.P. Shearman. 2008. Managing Hypercholesterolemia and its Correlation with Carotid plaque Morphology in Patients Undergoing Carotid Endoterectomy (A Review). Vascular Health Risk Manage., 4(6):1259-1264. Song W, Lu X, Feng Q. 2000. Tumor necrosis factor-alpha induces apoptosis viainducible nitric oxide synthase in neonatal mouse cardiomyocytes. Cardiovasc Res ; 45:595– 602. Stein B, Eschenhagen T, Rudiger J. 2008. Increased expression of constitutivenitric oxide synthase III, but not inducible nitric oxide synthase II, in human heart failure. J Am Coll Cardiol. 32:1179 – 1186. Steiner, J. M. 2008. Lipid Metabolism and Hyperlipidemia In Dogs. Gastrointestinal Laboratory, Department of Small Animal Clinical Sciences, College of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences. Surajudin,Fauzi R. K., dan Purnomo Dwi. 2005. Yoghurt Susu Fermentasi yang Menyehatkan. Jakarta : Agromedia Pustaka. Hal.3-12. Weetman, A., dan L.J. De Groot. 2002. Autoimmunity to The Tyroid Gland. Clinical Sciences Center Sheffield, England Faculty of Medicine, Dentistry and Health The Medical School University of Sheffield WHO (World Health Organization).2009. Cardiovascular diseases. Available from: http:/www.who.Int cardiovascular diseases n/. 3. (19 November 2013).
11
