KONDISI pH ULTRAFILTRASI PADA PEMURNIAN ENZIM XILANASE
LAPORAN PENELITIAN
Oleh : Ir. Darti Nurani, MSi
PROGRAM STUDI TEKNOLOGI INDUSTRI PERTANIAN INSTITUT TEKNOLOGI INDONESIA SERPONG 2006
1
2
KONDISI pH ULTRAFILTRASI PADA PEMURNIAN XILANASE Darti Nurani 1), AchmadinLuthfi2), Rehany Susanna C. Mooy3) 1)
Dosen Program Studi Teknologi Industri Pertanian, Institut Teknologi Indonesia, Serpong 2) Peneliti Bioindustri, BPPT 3) Alumni Program Studi Teknologi Industri Pertanian, Institut Teknologi Indonesia, Serpong
Abstrak Pemisahan protein adalah bagian penting dari industri bioproses. Banyak bioproduk berupa protein diantaranya adalah produk enzim xilanase, sehingga proses pemisahan dan pemurnian protein perlu mendapat perhatian. Dengan keterbatasan metode pemurnian enzim melalui pemisahan protein yang memiliki berat molekul yang hampir mirip perbandingan rasionya, yaitu satu banding sepuluh, maka perlu dikaji lebih lanjut metode pemurnian enzim dengan meningkatkan atau menurunkan nilai radius hidrodinamik dari kondisi bufer (yaitu kekuatan ion dan pH). Penelitian ini bertujuan untuk mempelajari kondisi pH terbaik dan jenis membran yang tepat pada proses pemurnian enzim xilanase secara ultrafiltrasi. Penelitian ini bersifat deskriptif. Metode yang digunakan untuk pemurnian enzim xilanase adalah ultrafiltrasi dengan variasi pH 4,94; 5,80; 6,60; 7,40 dan 8,20. Proses ultrafiltrasi menggunakan dua jenis membran, yaitu polyethersulfone dan regenerated cellulose. Analisis yang dilakukan meliputi analisis kadar protein, analisis aktivitas enzim xilanase dan analisis aktivitas spesifik. Hasil pemurnian xilanase terbaik yang diperoleh dari ultrafiltrasi menggunakan membran polyethersulfone dicapai pada pH 4,94; dengan kandungan protein permeate sebesar 0,884 mg/ml, aktivitas xilanase sebesar 12,277 U/ml dan aktivitas spesifik sebesar 13,888 U/mg. Hasil pemurnian xilanase terbaik yang diperoleh dari ultrafiltrasi menggunakan membran regenerated cellulose pada pH 8,20; dengan kandungan kadar protein rentetate sebesar 0,580 mg/ml dan aktivitas enzim xilanasenya sebesar 7,192 U/ml. Kata kunci: pemurnian, xilanase, ultrafiltrasi
PENDAHULUAN Enzim xilanase berperanan penting diantaranya di industri kertas, dalam proses pemutihan pulp dengan membantu melepaskan lignin dari pulp. Kendala yang dihadapi untuk memproduksi enzim xilanase adalah tahapan proses pemurniannya. Salah satu metoda pemurnian enzim adalah cara filtrasi. Ada
3
beberapa metoda filtrasi untuk memurnikan enzim, diantaranya: reverse osmosis, ultrafiltrasi dan mikrofiltrasi. Menurut Harrison (1994) ultrafiltrasi dikenal sebagai proses operasi alternatif yang sangat efektif dan telah mulai diaplikasikan secara luas di bidang farmasi dan industri pangan. Meskipun ultrafiltrasi telah digunakan secara luas, potensinya untuk fraksinasi protein belum dieksploitasi dalam industri bioteknologi. Ultrafiltrasi
secara tradisional telah digunakan untuk pemisahan
berdasarkan ukuran, tetapi aplikasi untuk protein yang berukuran sama sangat jarang dilakukan. Meskipun demikian, ultrafiltrasi memungkinkan untuk mudah diperbanyak dalam pemisahan protein untuk skala industri. Dengan sistem ultrafiltrasi, dimungkinkan untuk penyediaan pemisahan protein dalam jumlah besar yang mendukung kelanjutan riset di bidang ini. Oleh karena itu, akan dilakukan penelitian proses pemurnian enzim xilanase menggunakan metoda ultrafiltrasi pada kondisi pH dan jenis membran yang tepat. Namun, metode pemurnian enzim melalui pemisahan protein yang memiliki berat molekul yang hampir mirip perbandingan rasionya, yaitu satu banding sepuluh, masih sangat terbatas (Cherkasov dan Polotsky, 1996). Penelitian ini akan dilakukan dengan pendekatan penelitian yang telah dilakukan oleh Saksena dan Zydney (1994), yaitu mempelajari pengaruh pH pada ukuran protein. Berdasarkan hasil penelitian mereka menunjukkan bahwa pemisahan protein bergantung pada titik isoelektrisnya. Adanya perubahan pH dapat mengubah muatan pada protein dan membran. Penelitian lanjutan yang dilakukan oleh Pujar dan Sydney (1998) menunjukkan bahwa dengan bertambahnya
muatan pada protein akan
4
menyebabkan bertambah pula volume efektifnya. Hal ini menyebabkan terjadi difusi awan ion di sekitarprotein (the electrical double layer). Fenomena ini digunakan dalam pemisahanxilanasedari protein non ezim sehingga diperoleh aktivitas enzim yang tinggi dengan menggunakan metode ultrafiltrasi. Penelitian ini bertujuan untuk mempelajari kondisi pH terbaik dan jenis membran yang tepat pada proses pemurnian enzim xilanase secara ultrafiltrasi.
BAHAN DAN METODA Bahan dan alat Enzim xilanase yang digunakan pada penelitian ini dihasilkan oleh Bacillus stearothermophillus DSM 22 (koleksi BPPTCC- Laboratorium Teknologi Bioindustri dan Teknologi, Serpong). Bahan lain yang dibutuhkan antara lain Na2HPO4, NaHPO4.H2O, oat spelt xylan, NaOH0,1 M, pereaksi DNS (3,5 Dinitrosalisilic acid), xilosa, BSA (Bovine Serum Albumin), pereaksi Bradford. Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi: Amiconstirred cells, vortex, spektrofotometer, pH meter, timbangan, sentrifus, mikropipet, dan peralatan gelas dan peralatan umum di laboratorium mikrobiologi dan biokimia.
Metoda Penelitian ini bersifat deskriptif. Penelitian diawali dengan perlakuan pendahuluan terhadap enzim xilanase kasar yang dihasilkan oleh Bacillus stearothermophillus DSM 2 dengan sentrifugasi agar diperoleh enzim dengan aktivitas tinggi dan terbebas dari sejumlah bahan pengotor, pyrogens dan virus-
5
virus serta protein-protein enzim lain selain xilanase yang dapat menyebabkan tersumbatnya pori-pori membran, yang akan mempengaruhi proses ultrafiltrasi. Supernatan yang diperoleh dari hasil sentrifugasi, selanjutnya divariasikan pHnya, yaitu pH 4,94; 5,80; 6,60; 7,40 dan 8,40. Kemudian masing-masing sampel dilakukan ultrafiltrasi dengan menggunakan membran berukuran 30 kDa dengan dua jenis membran yang berbeda, yaitu polyethersulfone dan regenerated cellulose. Pengujian sampel dilakukan terhadap larutan yang tertahan di atas membran (rentetate) dan yang lolos dari membran (permeate). Pengambilan sampel umpan dilakukan di awal sebelum ultrafiltrasi dan pengambilan sampel rentetate dilakukan hingga jumlah enzim tersisa 10 ml. Sampel permeate ditampung selama proses ultrafiltrasi berlangsung, kemudian sampel dianalisis aktivitas enzim (Bailey, 1992) dan kadar proteinnya (Bradford, 1976) serta analisis aktifitas spesifik (Suhartono, 1989).
HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil pemurnian enzim xilanase dengan ultrafiltrasi menggunakan membran polyethersulfone pada kondisi pH yang berbeda Hasil analisis aktivitas enzim xilanase, kadar protein dan aktivitas spesifik produk hasil pemurnian enzim xilanase dengan ultrafiltrasi menggunakan membran polyethersulfone pada kondisi pH yang berbeda dapat dilihat pada Tabel 1, 2 dan 3.
6
Tabel 1. Aktivitas enzim xilanase hasil ultrafiltrasi menggunakan membran polyethersulfone pada kondisi pH yang berbeda Produk ultrafiltrasi
permeate
rentetate
pH ultrafiltrasi
Aktivitas enzim (U/ml)
4,94 5,80 6,60 7,40 8,20 4,94 5,80 6,60 7,40 8,20
12,2777 2,983 5,708 2,642 1,888 3,396 10,476 4,856 1,085 4,053
Tabel 2. Kadar protein hasil ultrafiltrasi menggunakan membran polyethersulfone pada kondisi pH yang berbeda Produk ultrafiltrasi
permeate
rentetate
pH ultrafiltrasi
Aktivitas enzim (mg/ml)
4,94 5,80 6,60 7,40 8,20 4,94 5,80 6,60 7,40 8,20
0,884 0,746 3,122 7,155 5,359 5,138 2,182 5,497 3,619 5,193
Berdasarkan Tabel 1 dan 2 dapat dilihat bahwa proses ultrafiltrasi menggunakan membran polyethersulfone paling baik dicapai pada kondisi pH 4,94. Hal ini dapat diketahui dari tingginya aktivitas enzim xilanase pada permeate (12,777 U/ml) meskipun kandungan protein permeate sangat sedikit (0,884 mg/ml); dan tingginya kandungan protein yang tertahan pada membran (rentetate) sebesar 5,138 mg/ml dengan aktivitas enzim xilanasenya yang rendah yaitu sebesar 3,396 U/ml. Hal ini diperjelas oleh hasil perhitungan aktivitas
7
spesifiknya, pada pH ultrafiltrasi 4,94, nilai aktivitas spesifiknya tertinggi diperoleh pada produk permeate, yaitu sebesar 13,888 U/mg (Tabel 3).
Tabel 3. Aktivitas spesifik enzim hasil ultrafiltrasi menggunakan membran polyethersulfone pada kondisi pH yang berbeda Produk ultrafiltrasi
permeate
rentetate
pH ultrafiltrasi
Aktivitas enzim (U/mg)
4,94 5,80 6,60 7,40 8,20 4,94 5,80 6,60 7,40 8,20
13,888 3,999 1,828 0,369 0,352 0,661 4,801 0,883 0,299 0,780
Hal tersebut dapat disebabkan oleh tingginya titik isoelektrik protein enzim xilanase; yaitu pada pH sebesar 9,3 (Banco, et al, 1995). Keadaan tersebut menyebabkan tingginya tingkat kelarutan protein enzim xilanase pada pH 4,94, sehingga memudahkan enzim tersebut lolos melewati membran. Hasil pemurnian enzim xilanase dengan ultrafiltrasi menggunakan membran regenerated cellulose pada kondisi pH yang berbeda Hasil analisis aktivitas enzim xilanase, kadar protein dan aktivitas spesifik produk hasil pemurnian enzim xilanase dengan ultrafiltrasi menggunakan membran regenerated cellulose pada kondisi pH yang berbeda dapat dilihat pada Tabel 4, 5 dan 6.
8
Tabel 4. Aktivitas enzim xilanase hasil ultrafiltrasi menggunakan membran regenerated cellulose pada kondisi pH yang berbeda Produk ultrafiltrasi
permeate
rentetate
pH ultrafiltrasi
Aktivitas enzim (U/ml)
4,94 5,80 6,60 7,40 8,20 4,94 5,80 6,60 7,40 8,20
12,252 2,472 4,126 1,888 4,053 4,929 3,299 5,367 6,584 7,192
Tabel 5. Kadar protein hasil ultrafiltrasi menggunakan membran regenerated cellulose pada kondisi pH yang berbeda Produk ultrafiltrasi
permeate
rentetate
pH ultrafiltrasi
Aktivitas enzim (mg/ml)
4,94 5,80 6,60 7,40 8,20 4,94 5,80 6,60 7,40 8,20
4,061 2,348 3,094 2,652 6,796 3,702 2,072 1,575 2,072 0,580
Berdasarkan Tabel 4 dan 5 dapat dilihat bahwa proses ultrafiltrasi menggunakan membran regenerated cellulose paling baik dicapai pada kondisi pH 8,20. Hal ini dapat diketahui dari tingginya aktivitas enzim xilanase pada rentetate (7,192 U/ml) meskipun kandungan protein rentetate sangat sedikit (0,580 mg/ml); dan tingginya kandungan protein yang melewati membran (permeate) sebesar 6,796 mg/ml dengan aktivitas enzim xilanasenya yang rendah yaitu sebesar 4,126 U/ml. Hal ini diperjelas oleh hasil perhitungan aktivitas
9
spesifiknya, pada pH ultrafiltrasi 8,20, nilai aktivitas spesifiknya tertinggi diperoleh pada produk rentetate, yaitu sebesar 12,397 U/mg (Tabel 6).
Tabel 6. Aktivitas spesifik enzim hasil ultrafiltrasi menggunakan membran regenerated cellulose pada kondisi pH yang berbeda Produk ultrafiltrasi
permeate
rentetate
pH ultrafiltrasi
Aktivitas enzim (U/mg)
4,94 5,80 6,60 7,40 8,20 4,94 5,80 6,60 7,40 8,20
3,017 1,053 1,334 0,712 0,596 1,332 1,592 3,409 3,178 12,397
Hal tersebut dapat disebabkan oleh karena ultrafiltrasi pada pH 8,20 adalah kondisi yang semakin mendekati titik isoelektrik protein enzim xilanase yaitu sebesar 9,3; sehingga kelarutannya semakin rendah dan banyak yang tertahan pada membran.
KESIMPULAN Hasil pemurnian xilanase terbaik yang diperoleh dari ultrafiltrasi menggunakan membran polyethersulfone dicapai pada pH 4,94; dengan kandungan protein permeate sebesar 0,884 mg/ml, aktivitas xilanase sebesar 12,277 U/ml dan aktivitas spesifik sebesar 13,888 U/mg. Hasil pemurnian xilanase terbaik yang diperoleh dari ultrafiltrasi menggunakan membran regenerated cellulose pada pH 8,20; dengan kandungan kadar protein rentetate sebesar 0,580 mg/ml dan aktivitas enzim xilanasenya sebesar 7,192 U/ml.
10
DAFTAR PUSTAKA Bailey, M.J.,1992. Interlaboratory testing of methods for assay of xylanase activity. Journal of Biotechnology, 23: 257-270. Blanco, 1995. Purification and properties of xylanase A from alkali-tolerant Bacillus sp strain BP-23. American societyfor microbiology. Barcelona. Bradford, M., 1976. A rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantitiesof proteinutilizing theprincipleof protein-dye binding. Anal. Biochem. 72: 248-254 Cherkasov A.N. and Polotsky, A.E.,1996. The resolving power of ultrafiltration. J.Membr, Sci. 110: 79-82. Pujar N.S and Sydney, A.L, 1998. Electrostatic effect on protein partitioningin size-exclution chromatography and membrane ultrafiltration. J.Chromatography 796:229-238
11
