Pokok Bahasan IV : TEKNIK ASEPTIS
Pendahuluan Teknik kultur jaringan mensyaratkan kondisi aseptik, bebas dari bakteri, jamur, yeast dan jasad renik lain pada setiap tahapan kegiatannya. Hambatan utama keberhasilan pelaksanaan kultur jaringan adalah adanya kontaminasi yang dapat timbul baik selama prosedur tersebut dikerjakan maupun selama kultur dipelihara didalam ruang inkubator. Kontaminasi oleh mikroorganisme menjadi problem yang sangat serius, karena mikrobia kontaminan akan segera mengkonsumsi zat hara yang ada pada medium kultur. Mikroorganisme ini meskipun berukuran sangat kecil, tetapi jumlahnya sangat banyak dan aktivitas metabolismenya sangat tinggi, jika pertumbuhannya tidak dapat dicegah maka dalam waktu yang relatip singkat segera mendominasi kultur. Sel dan jaringan tanaman yang dikulturkan akan mati, matinya eksplan dapat disebabkan karena dibebaskanya senyawa-senyawa toksik sebagai hasil metabolisme dari mikrobia kontaminan, dapat juga karena eksplannya "dimakan" oleh mikrobia kontaminan tsb. Kontaminasi dapat timbul pada setiap tahapan dari pelaksanaan kultur jaringan, prosedur kerja aseptis yang harus dikerjakan untuk menanggulangi kontaminasi adalah: 1. Sterilisasi ruang kerja 2. Sterilisasi medium dan alat-alat 3. Sterilisasi eksplan.
Tujuan Instruksional Khusus: Setelah mengikuti kuliah ini diharapkan mahasiswa dapat menjelaskan prinsip kerja aseptik yang meliputi: teknik Sterilisasi ruang kerja, medium, alatalat dan eksplan.
Subpokok Bahasan 1 : STERILISASI RUANG KERJA, MEDIUM, ALAT-ALAT DAN EKSPLAN
Pendahuluan Sebagaimana telah diuraikan pada Pokok Bahasan Laboratorium Kultur Jaringan, kegiatan aseptis dimulai didalam Ruang Steril dan Ruang Inkubasi / Kultur, kegiatan utama yang dilakukan meliputi sterilisasi dan penanaman eksplan diatas atau didalam medium kultur. Laboratorium sederhana setidaknya mempunyai dua ruangan tersebut, yang kebersihannya senantiasa harus diperhatikan. Ruang kerja yang kotor, akibat terlalu banyak orang yang lalu lalang didalamnya, dapat mengundang timbulnya kontaminasi. Ruang kultur yang tidak terpelihara dapat mengundang serangga-serangga kecil untuk masuk kedalam botol-botol yang berisi medium kultur. Serangga-serangga kecil ini menimbulkan permasalahan tersendiri karena spora-spora jamur dan bakteri biasanya ikut lerbawa masuk kedalam botol kultur. Ruang kerja harus mudah dibersihkan dan dilengkapi dengan AC sehingga senantiasa kering dan sejuk. Kegiatan sterilisasi medium dan alat-alat dikerjakan diruang persiapan. Kebersihan dan organisasi laboratorium yang efisien, ditunjang dengan peralatan yang memadai, dapat menciptakan kondisi aseptis yang terkendali.
Materi Subpokok Bahasan 1 Sterilisasi ruang kerja Ruang kerja yang digunakan untuk pekerjaan aseptis adalah ruang steril, ruangan ini harus senantiasa bersih, dinding dan lantai bersihkan setiap pagi dengan zat anti kuman / desinfektan. Udara didalam ruangan disterilisasi dengan lampu Ultra Violet (UV) yang kekuatannya disesuaikan dengan besarnya ruangan yang dipakai, lampu ini hanya dinyalakan jika ruangan tidak dipakai dan harus dimatikan ketika digunakan untuk bekerja. Radiasi UV tidak berbahaya bagi manusia karena tidak mengion, namun demikian harus diwaspadai karena dapat mengubah DNA dengan pembentukan dimer antara dua basa tirnin pada satu rantai DNA. Penetrasi sinar UV utamanya pada bagian superfisial dari jaringan sehingga dapat melukai kulit dan retina mata. Sinar UV dapat menghasilkan ozon sehingga peneliti yang akan bekerja haras menunggu 15-30
menit setelah UV dimatikan, maksudnya supaya ozon tidak terhirup. Peneliti yang akan bekerja didalam ruangan ini haras memakai jas lab. masker dan tutup kepala, juga harus mencuci tangan dengan sabun antiseptik, kalau perlu menggunakan sarung tangan dari karet. Didalam ruangan ini terdapat alat-alat yang dapat menciptakan kondisi aseptis yang terkendali, antara lain Laminar Air Flow dan stenl box (entkas). a. Laminar air flow (laf). Alat ini sangat baik dan efisien, namun harganya relatip mahal untuk menciptakan atmosfer yang steril dimana pekerjaan-pekerjaan aseptis haras dilakukan. Prinsip kerja alat ini yaitu dengan hembusan udara yang sudah disaring (lihat gambar 1).
Gambar 4.1. Laminar air flow dengan bagian-bagiannya (a) udara masuk (b) blower (c) HEPA filter (d) ruang kerja aseptis (e) prefllter.
Udara yang dihisap oleh blower dihembuskan melalui HEPA (high efficiency particulate air) filter dengan porositas 0,22 μm, spora-spora jamur dan bakteri akan tertahan, sehingga udara yang berhembus keluar sudah suci hama, laf kadang-kadang dilengkapi dengan UV. Sebelum mulai bekerja, permukaan meja kerja laf disemprot dan dilap dengan kain yang telah dibasahi alkohol 70% atau spiritus, semua alat-alat dimasukkan ruang kerja (lihat gambar 2. detail ruang kerja). Alat-alat dan medium harus sudah steril baik permukaan maupun bagian dalamnya, untuk botol kultur yang berisi media, permukaannya disemprot atau dilap dengan alkohol 70%. Untuk laf yang dilengkapi dengan UV, sebelum bekerja lampu UV dinyalakan selama 30-60 menit untuk mematikan kontaminan pada permukaan ruang kerja.
Gambar 4.2. Detail ruang kerja dan Laminar air flow, botol berisi medium kultur dan alat-alat harus diletakkan dikanan kiri ruang kerja dan tidak boleh menghalangi hembusan udara steril.
Didalam laf juga sering dilengkapi dengan instalasi gas yang diperlukan untuk sterilisasi alat-alat dengan pembakaran, tetapi ini dapat diganti dengan lampu spiritus atau baktisinerator. b. Steril box (entkas) Alat lain untuk dapat menciptakan ruang kerja yang steril dengan harga yang relatip murah adalah steril box (entkas). Alat ini berujud seperti kotak yang terbuat dari bahan kaca (lihat gambar 4.3 ), plywood, papan kayu atau yang lebih sederhana misalnya dari kardus yang didalamnya dilapisi aluminum foil. Steril box atau entkas dapat dibuat dengan ukuran sesuai dengan yang dikehendaki, yang penting untuk diperhatikan adalah tangan kita dapat menjangkau setiap dinding entkas karena akan memudahkan untuk membersihkannya.
Gambar 4.3 Steril box (entkas) yang terbuat dari bahan kaca Sebelum mulai bekerja, dinding entkas dibersihkan lebih dahulu dengan melap kain yang sudah dibasahi alkohol 70%. Ruang kerja didalam entkas disterilisasi dengan formalin tablet yang ditaruh didalam cawan porselin kecil dan diletakkan disudut-sudut ruangan, setiap cawan berisi satu tablet. Uap formalin ini dapat mensterilkan udara yang terdapat didalam entkas. Alat-alat dan botol kultur yang berisi media disemprot
permukaannya satu persatu dengan alkohol 70% kemudian dimasukan kedalam entkas, dibiarkan 30 menit baru mulai bekerja. Pada entkas juga dapat ditambahkan lampu UV, entkas ini seluruh dinding luarnya harus ditutup dengan aluminum foil, hal ini diperlukan untuk menghindari mata dan kulit dari bahaya radiasi UV. Sterilisasi media dan alat-alat Media yang mengandung bahan-bahan yang tahan panas sterilisasinya dilakukan dengan pemanasan basah, menggunakan alat yang namanya autoclave, bekerjanya dengan tekanan uap. Standar teknis untuk Sterilisasi ini adalah pada temperatur 121°C, tekanan antara 15 - 17 psi dengan waktu antara 15-40 menit tergantung dari banyaknya media yang disterilisasi. Untuk 15 ml media dalam tabung reaksi atau botol kecil berukuran 75 ml, Sterilisasi dilakukan dengan tekanan 15 psi selama 20 menit. Volume yang lebih besar membutuhkan tekanan yang lebih tinggi dengan waktu yang lebih lama. Autoclave yang digunakan ada bermacam-macam, mulai dari yang paling sederhana sampai yang dapat diprogram (programmable). Autoclave sederhana pemanasan airnya menggunakan kompor gas, sedangkan pengaturan suhu tekanan dan waktunya dilakukan secara manual. Pada waktu mengoperasikan autoclave ini, jangan tergesa-gesa menutup klep pembuang sebelum udara yang ada didalam autoclave diganti seluruhnya oleh uap air yang mendidih sehingga akan tercapai temperature 121°C ( langkah ini tidak dikerjakan untuk autoclave yang programmable). Setelah waktu Sterilisasi selesai (15-20 menit) klep-klep pembuang dibuka pelan-pelan, tekanan uap didalam autoclave pelan-pelan akan sama dengan tekanan atmosfer, pembukaan klep pembuang yang tergesa-gesa akan mengakibatkan medium yang ada didalam botol kultur mendidih dan meluap. Alat lain yang mempunyai prinsip kerja mirip dengan autoclave adalah pressure cooker, alat yang biasa digunakan untuk memasak didapur ini kapasitasnya sangat terbatas, sehingga tidak dianjurkan untuk pekerjaan pada skala laboratorium karena tidak efisien. Autoclave yang paling modern adalah yang programmable, dapat diatur waktu, suhu dan tekanannya secara automatis sehingga dapat dijalankan sambi! mengerjakan pekerjaan yang lain.
Tabel 4. 1. Lama waktu minimal untuk sterilisasi media Volume per wadah (ml)
Waktu minimal sterilisasi pada 121°C (menit)
20 – 50
15
75
20
250 – 500
25
1.000
30
1.500
35
2.000
40 (Biondi dan Thorpe, 1978)
Sterilisasi medium kultur dengan menggunakan autoclave mempunyai banyak kelemahan, antara lain: 1. Sukrosa akan terurai menjadi fruktosa dan glukosa 2. Penggunaan temperatur yang tinggi pada autoclave dapat mengakibatkan terbentuknya caramel gula yang berwarna coklat, merupakan racun didalam medium kultur 3. Sejalan dengan lamanya waktu sterilisasi, pH medium dapat mengalami perubahan, terjadi pengendapan garam-garam dan depolimerisasi agar. Beberapa komponen medium ada yang tidak stabil kalau kena panas yang tinggi, misalnya GAs, Ca-panthothenate dan Thiamin-HCl harus disterilisasi dengan ultra filtrasi (Millipore filter) pada suhu ruangan (25°C). Dengan memakai ultrafiltrasi larutan yang berisi bahan-bahan yang termolabil dimasukkan kedalam medium kultur yang telah steril, langkah ini dikerjakan didalam ruang steril (laf) ketika medium agar telah agak dingin tetapi belum memadat. Ada beberapa macam Millipore filter, yang terbuat dari polyethylene film sekali pakai terus dibuang (disposable), ada Millipore filter yang dilengkapi dengan holder , filter holder ini dapat disterilisasi dengan autoclave (autoclavable). Porositas dari filternya juga bermacam-macam, mulai dari 0,22 - 0,45 μm. Untuk larutan termolabil dalam jumlah sedikit (5-50 ml) dengan mudah dapat disterilisasi dengan Millipore filter yang dipasang pada ujung syrink (alat suntik). Dalam jumlah besar (50 - 5000 liter) sterilisasi dengan ultrafiltrasi ini harus dibantu dengan pompa vakum.
Alat-alat yang digunakan didalam ruang steril antara lain : scalpel, pinset bermacam-macam ukuran, petridish, cork borrer, pipet, alat-alat gelas (botol kultur dsb), gunting, kertas saring dsb. Alat-alat tersebut, sebelum disterilisasi, dibersihkan terlebih dahulu kemudian dibungkus rapi dengan kertas coklat. Alatalat yang akan disterilisasi dengan autoclave tidak boleh dibungkus dengan aluminum foil sebab uap air tidak dapat masuk kedalam bungkusan. Untuk botol kultur, sebelumnya harus dicuci kemudian ditutup dengan aluminum foil atau bahan lain yang terbuat dari karet, kain atau plastik yang tahan panas. Botol kultur dengan penutup yang berulir, tidak boleh ditutup terlalu rapat ketika disterilisasi, ini diperlukan agar tidak terjadi perbedaan tekanan dengan ruangan didalam autoclave, perbedaan tekanan akan mengakibatkan pecahnya botol kultur. Sterilisasi eksplan Eksplan adalah bagian kecil dari tanaman baik itu sel, jaringan, ataupun organ yang digunakan untuk memulai suatu kultur. Eksplan yang digunakan didalam kultur jaringan harus yang masih muda (primordia), sel-selnya masih bersifat meristematik. Sel-sel yang bersifat meristematik dicirikan dengan sifatnya yang selalu membelah, selnya berukuran kecil tetapi inti selnya relatip besar, penuh plasma, vacuola kecil-kecil, dinding sel tipis terdiri dari dinding primitip yang berupa selulosa microfibril. Bagian tanaman yang bersifat meristematik antara lain terdapat pada ujung (kuncup) batang atau akar, dikenal dengan nama meristem apikal, pada batang disebut shoot apical meristem sedangkan meristem yang terdapat pada kuncup diketiak daun disebut meristem aksiler (gambar 4. 4).
Gambar 4. 4. Tanam dikotil dengan kuncup apikal dan aksiler dimana didalamnya terdapat sel-sel yang meristematik. Bagian tanaman yang bersifat meristematik seringkali terdapat dalam keadaan terbuka sehingga kotoran dan berbagai kontaminan seringkali menempel pada bagian permukaannya. Kontaminan ini dapat berupa bakteri, jamur dan spora-sporanya, serangga dan telur-telurnya, protozoa dsb. Keadaan ini terutama dijumpai pada tanaman donor yang tumbuh dilapangan. Kultur jaringan mensyaratkan kondisi aseptis yang terkendali, jika kontaminan ini tidak dihilangkan maka medium yang mengandung banyak nutrisi akan dengan cepat dipenuhi oleh mikrobia kontaminan tersebut. Untuk mengurangi adanya kontaminan pada permukaan eksplan, tanaman donor sebaiknya ditanam didalam rumah kaca. Pada beberapa jenis tanaman seperti ketimun dan umbi akar wortel, seringkali dijumpai adanya kontaminan internal yang terdapat
didalam jaringan tanaman. Kontaminan internal ini sangat sulit untuk diatasi, karena sterilisasi permukaan tidak akan efektip. Eksplan yang digunakan ukurannya sangat bervariasi dari yang hanya dapat dilihat dengan mikroskop (mikroskopis) misalnya mikrospora, shoot apical meristem, embrio dsb sampai yang berukuran 1 cm atau lebih misalnya ruas batang, daun, hipokotil, biji, rhizom dsb. Bagian-bagian tanaman tersebut seringkali masih tertutup oleh jaringan / sarung-sarung daun misalnya pada daun tebu, hal ini akan memudahkan prosedur sterilisasi karena secara alamiah bagian daun yang ada didalamnya masih suci hama. Eksplan yang berukuran terlalu besar akan membawa resiko kontaminasi yang lebih besar, namun jika digunakan eksplan yang terlalu kecil pertumbuhan dan respon yang diharapkan juga tidak sebaik jika menggunakan eksplan yang berukuran besar. Dilemma ini menyebabkan tidak adanya metoda sterilisasi eksplan yang baku untuk semua tanaman. Hal penting yang harus diperhatikan pada sterilisasi eksplan adalah bahwa eksplan dan mikrobia kontaminan keduanya adalah jasad hidup, kontaminasi harus dihilangkan tanpa mematikan eksplan. Bahan pensteril yang umum digunakan untuk sterilisasi eksplan adalah calcium hypochlorite , sodium hypochlorite, sublimat/mercuric chloride (HgCl2), alkohol dsb. Konsentrasi dan lama waktu sterilisasi sangat bervariasi tergantung dari jenis eksplan dan tempat tumbuhnya. Eksplan yang ditumbuhkan dalam rumah kaca relatip lebih bersih, sedangkan yang berasal dari lapangan pada umumnya lebih kotor, lebih terkontaminasi sejak dari awalnya sehingga prosedur sterilisasi harus dibuat lebih keras dengan meningkatkan konsentrasi bahan pensteril atau dengan memperpanjang waktu sterilisasi. Semua bahan-bahan pensteril adalah toksik terhadap eksplan, sehingga perlu dilakukan pencucian yang berulang-ulang agar semua bahan pensteril yang menempel dapat tercuci. Untuk meningkatkan penetrasi bahan pensteril, seringkali ditambahkan 1 atau 2 tetes agensia pembasah ( Triton-X , Tween 20 atau Tween 80) yang fungsinya menambah tegangan pada permukaan eksplan. Penggunaan pompa vakum juga dapat meningkatkan penetrasi bahan pensteril pada permukaan jaringan sehingga dapat meningkatkan efisiensi sterilisasi.
Tabel 4. 2. Efektifitas beberapa bahan pensteril Bahan pensteril
Konsentrasi
Lama
Efektifitas
perendaman Cacium hypochlorite
(9-10)%
(5 - 30 ) menit
Sangat bagus
Sodium hypoehlorite
2%(bayclin 20%)
(5 - 30 ) menit
Sangat bagus
(10-12)%
(5 - 15 ) menit
Bagus
(1-2)%
(2 - 10 ) menit
Sangat bagus
1%
(5 - 30 ) menit
Bagus
(0,1 - 1)%
(2 - 10 ) menit
Memuaskan
(4 - 50) mg 1-1
(30 - 60) menit
Cukup bagus
Hydrogen peroxide Bromine water (H2O2) Silver nitrate Mercuric chloride Antibiotics
Bhojwani & Razdan, (1983) Pra-sterilisasi dengan mencuci eksplan menggunakan sabun/detergent dan dibiarkan beberapa saat dibawah pancuran air yang mengalir selama 15-30 menit juga diperlukan untuk memecah koloni kontaminan agar lebih peka terhadap bahan pensteril. Bahan yang sudah bersih dikecilkan ukurannya kemudian dibawa kedalam ruang steril untuk disterilisasi lebih lanjut. Untuk sterilisasi eksplan kadang-kadang digunakan dua atau lebih bahan pensteril, misalnya direndam didalam larutan sodium hypochlorite kemudian dicuci dengan air steril dilanjutkan dengan perendaman didalam larutan sublimate dan pembilasan dengan air steril. Untuk eksplan yang berdaging (umbi kentang, wortel), eksplan yang tertutup sarung daun (pucuk tebu), dan biji muda yang masih terdapat didalam buah (anggrek) dapat disterilisasi dengan merendam didalam alkohol beberapa saat, kemudian dilewatkan diatas nyala api dan dibiarkan sampai nyala api padam, cukup efektif untuk membawa kultur bebas dari kontaminasi.
Latihan soal-soal 1. Jelaskan bagaimana prinsip kerja autoclave, apa kelemahan sterilisasi medium dengan autoclave! 2. Jelaskan apa bahayanya sinar UV yang digunakan untuk sterilisasi ruang kerja! 3. Jelaskan bagaimana prinsip kerja Laminar Air Flow! 4. Jelaskan cara sterilisasi medium dalam jumlah banyak yang ditambahkan asam-asam amino dan Gibberellin! 5. Jelaskan tahapan-tahapan yang harus dijalankan untuk sterilisasi eksplan yang berasal dari lapangan!
Petunjuk jawaban latihan soal-soal 1. Ingat cara kerja autoclave dan akibat yang ditimbulkan oleh pemanasan yang bertekanan terhadap komponen medium! 2. Ingat sifat-sifat sinar UV! 3. Ingat arti Laminar Air Flow! 4. Ingat cara sterilisasi medium! 5. Ingat cara sterilisasi eksplan secara bertingkat!
