AKTIVITAS ANTIOKSIDAN SUPEROKSIDA DISMUTASE PADA HATI TIKUS HIPERKOLESTEROLEMIA YANG DIBERI EKSTRAK KULIT MAHONI (Swietenia macrophylla)
MARSUDI SIBURIAN
DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2011
ABSTRAK MARSUDI SIBURIAN. Aktivitas Antioksidan Superoksida Dismutase pada Hati Tikus Hiperkolesterolemia yang Diberi Ekstrak Kulit Mahoni (Swietenia macrophylla). Dibimbing oleh SULISTIYANI dan SYAMSUL FALAH. Kulit kayu mahoni merupakan limbah industri kayu yang kaya akan kandungan metabolit sekunder. Penelitian tentang potensi ekstrak kulit kayu mahoni sebagai antioksidan telah dilakukan sebelumnya. Penelitian ini bertujuan mempelajari mekanisme ekstrak air kulit kayu mahoni dalam menurunkan tingkat oksidasi lipid yang dapat dilihat melalui penentuan aktivitas antioksidan endogen pada organ hati. Sebanyak 35 ekor tikus jantan dibagi menjadi 5 kelompok (n=7) yaitu normal, hiperkolesterolemia, lovastatin, ekstrak 1, dan ekstrak 2. Kelompok normal diberi pakan standar, kelompok hiperkolesterolemia (HK) diberi pakan kolesterol (1,5%) dan PTU (0,5 mg/KgBB), kelompok lovastatin (HK+lovastatin 0,2875 mg/KgBB), kelompok E1 (HK+ekstrak mahoni 4,2 mg/KgBB), serta kelompok E2 (HK+ekstrak mahoni 21 mg/KgBB). Masa percobaan berlangsung selama 8 minggu. Aktivitas antioksidan superoksida dismutase (SOD) hati tikus ditentukan dengan menghitung persentase hambatan proses autooksidasi pirogalol menjadi purpurogalin oleh SOD, jumlah purpurogalin yang terbentuk diukur menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 340 nm. Aktivitas antioksidan SOD pada hati tikus kelompok normal sebesar 47.96±12.37%. Aktivitas antioksidan SOD untuk semua kelompok perlakuan tidak berbeda nyata (=0.05). Hasil ini menunjukkan bahwa peranan ekstrak kulit kayu mahoni sebagai antioksidan pada tikus bukan dengan meningkatkan aktivitas antioksidan superoksida dismutase melainkan melalui suatu mekanisme lain.
ABSTRACT MARSUDI SIBURIAN. Superoxide Dismutase Antioxidant Activity in Hypercholesterolemic Rat Liver Treated with Mahoni’s (Swietenia macrophylla) Bark Extract. Under the direction of SULISTIYANI and SYAMSUL FALAH. Mahoni’s stem bark is wood industrial waste that rich in secondary metabolites. Research about its antioxidant potency has been done previously. This research was performed to study about the mahoni’s bark extract mechanism on lowering lipid peroxidation by determining the activity of endogenous antioxidant in the liver. Thirty five male rats were divided into 5 groups (n=7) normal, hypercholesterolemic, lovastatin, extract 1, and extract 2 group. Normal group fed with standard rat chow, hypercholesterolemic group (HK) with cholesterol chow (1,5%) and PTU (0,5 mg/KgBW), lovastatin group (HK + lovastatin 0,2857 mg/KgBW), E1 group (HK+ mahoni extract 4,2 mg/KgBW), and E2 group (HK + mahoni extract 21 mg/KgBW). Experiments were carried out for 8 consecutive weeks. The rat liver superoxide dismutase (SOD) antioxidant activity were determined by calculating the inhibition percentage of pyrogallol autooxidation process became purpurogallin by SOD, total formed purpurogallin was measured using spectrophotometer with 340 nm wavelength. The SOD antioxidant activities in normal group of rats was 47.96±12.37%. There was not any significant SOD antioxidant activities difference between all rats group of treatment (=0.05). These result showed that mahoni’s bark extract roles as antioxidant in rats was achieve not by increasing the activity of superoxide dismutase but by other mechanism.
AKTIVITAS ANTIOKSIDAN SUPEROKSIDA DISMUTASE PADA HATI TIKUS HIPERKOLESTEROLEMIA YANG DIBERI EKSTRAK KULIT MAHONI (Swietenia macrophylla)
MARSUDI SIBURIAN
Skripsi sebagai salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2011
Judul skripsi
Nama NIM
: Aktivitas Antioksidan Superoksida Dismutase pada Hati Tikus Hiperkolesterolemia yang Diberi Ekstrak Kulit Mahoni (Swietenia macrophylla) : Marsudi Siburian : G84061570
Disetujui Komisi Pembimbing
drh. Sulistiyani, M.Sc., Ph.D Ketua
Dr. Syamsul Falah, S.Hut., M.Si. Anggota
Diketahui
Dr. I Made Artika, M.App.Sc. Ketua Departemen Biokimia
Tanggal lulus:
PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan YME atas rahmat dan karunia-Nya penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah ini sebagai salah satu persyaratan untuk memperoleh gelar sarjana sains di Departemen Biokimia. Karya ilmiah ini berjudul Aktivitas Antioksidan Superoksida Dismutase pada Hati Tikus Hiperkolesterolemia yang Diberi Ekstrak Kulit Mahoni (Swietenia macrophylla) yang sebagian penelitiannya didanai oleh program penelitian strategis unggulan IPB atas nama Dr. Syamsul Falah, S.Hut., M.Si. dkk. Penelitian ini telah dilaksanakan pada bulan Agustus hingga November 2010 di Laboratorium Departemen Biokimia FMIPA IPB, Darmaga-Bogor. Penulis mengucapkan terima kasih kepada drh. Sulistiyani, M.Sc. Ph.D selaku pembimbing utama dan Dr. Syamsul Falah, S.Hut., M.Si. selaku pembimbing kedua atas bimbingannya selama penelitian dan penyusunan karya ilmiah ini. Ucapan terimakasih juga penulis sampaikan kepada orangtua dan saudara-saudara tercinta atas segala doa dan dukungan. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Ratna Mustika, Donna Fujie, Renna Yulia, Putra Hidayat, Feni Tri Asmoro, serta teman-teman Biokimia atas bantuannya dalam penelitian ini. Semoga karya tulis ini dapat bermanfaat bagi pembaca.
Bogor, Juli 2011
Marsudi Siburian
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Bogor pada tanggal 26 Oktober 1988 dari ayah Tumpal Siburian (Alm) dan ibu Diana Sihombing, sebagai anak kelima dari lima bersaudara. Tahun 2006, penulis lulus dari Sekolah Menengah Umum Negeri 3 Kota Bogor dan pada tahun yang sama diterima di IPB melalui Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI). Penulis diterima di Departemen Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Penulis pernah aktif dalam organisasi kemahasiswaan. Tahun 2008-2009 penulis aktif menjadi staf Divisi Pengembangan Sumber Daya Mahasiswa Himpunan Profesi Community of Research and Education in Biochemistry (CREB’s). Selama perkuliahan, penulis pernah melaksanakan praktik lapangan di bagian Bioteknologi Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) dan menulis laporan ilmiah yang berjudul Produksi Xilanase oleh Aspergillus ficuum DSM 932 melalui Fermentasi Substrat Padat.
DAFTAR ISI Halaman DAFTAR GAMBAR ......................................................................................... vi DAFTAR LAMPIRAN ...................................................................................... vi PENDAHULUAN ............................................................................................. 1 TINJAUAN PUSTAKA Radikal Bebas Dalam Tubuh ....................................................................... Hiperkolesterolemia dan Radikal Bebas ...................................................... Antioksidan Endogen dan Eksogen ............................................................. Superoksida Dismutase ............................................................................... Swietenia macrophylla ................................................................................ Peran Hati sebagai Biotransformator ...........................................................
2 2 5 5 6 6
BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat ........................................................................................... 7 Metode Penelitian ....................................................................................... 7 HASIL DAN PEMBAHASAN Pengaruh Penyimpanan terhadap Kondisi Sampel Hati................................ 8 Pengaruh Pakan Kolesterol terhadap Aktivitas SOD.................................... 9 Pengaruh Pemberian Ekstrak Mahoni terhadap Aktivitas SOD ....................10 SIMPULAN DAN SARAN Simpulan.....................................................................................................11 Saran...........................................................................................................11 DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................11 LAMPIRAN ......................................................................................................14
DAFTAR GAMBAR Halaman 1 Tahapan biosintesis kolesterol ....................................................................... 3 2 Biosintesis asam empedu primer .................................................................... 4 3 Mahoni berdaun lebar (Swietenia macrophylla King) .................................... 6 4 Aktivitas antioksidan SOD pada sampel hati tikus yang telah mengalami penyimpanan dan yang tidak mengalami penyimpanan .................................. 9 5 Aktivitas antioksidan SOD hati tikus pada kelompok pemberian pakan normal dan pakan kolesterol .......................................................................... 9 6 Aktivitas antioksidan SOD pada kelompok pemberian ekstrak ......................10
DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1 Rancangan percobaan ....................................................................................15 2 Ekstraksi serbuk kayu mahoni .......................................................................16 3 Penyiapan pakan kolesterol ...........................................................................16 4 Penentuan waktu inkubasi .............................................................................17 5 Preparasi sampel hati tikus ............................................................................18 6 Analisis aktivitas antioksidan superoksida dismutase .....................................18 7 Data konsentrasi kolesterol darah tikus minggu ke-8 .....................................19 8 Data konsentrasi lipid peroksida darah tikus minggu ke-8..............................19 9 Nilai absorbansi kontrol pengukuran aktivitas antioksidan SOD ....................20 10 Penentuan waktu inkubasi berdasarkan nilai absorbansi kontrol.....................23 11 Data absorbansi pengukuran aktivitas antioksidan SOD sampel hati tikus dan contoh perhitungan .........................................................................24 12 Aktivitas antioksidan SOD hati tikus .............................................................26 13 Hasil analisis statistik ....................................................................................27
PENDAHULUAN Masyarakat modern saat ini terbiasa mengonsumsi makanan yang rendah serat dan mengandung kolesterol tinggi. Beberapa contoh dari makanan tersebut antara lain produk daging (sapi, kambing, babi) dan olahannya, kuning telur, jerohan, keju, dan mentega. Makanan berlemak yang memiliki kadar lemak jenuh tinggi sangat tidak baik dikonsumsi dalam jumlah besar. Konsumsi makanan berlemak dengan kadar kolesterol lebih dari 300 mg per hari dapat memicu timbulnya berbagai penyakit yang diakibatkan oleh meningkatnya konsentrasi kolesterol di dalam darah atau yang biasa disebut hiperkolesterolemia (Lichtenstein et al. 2006). Beberapa penelitian menunjukkan bahwa keadaan hiperkolesterolemia dapat menyebabkan terjadinya peningkatan jumlah radikal bebas di dalam tubuh yang ditandai oleh meningkatnya oksidasi lipid. Giri (2008) melaporkan bahwa tikus Sprague Dawley yang diinduksi hiperkolesterolemia dengan pemberian pakan kaya kolesterol dan PTU selama 13 minggu mengalami peningkatan konsentrasi lipid peroksida dalam darah sebesar 371.75%. Radikal bebas merupakan unsur atau senyawa yang memiliki satu atau lebih elektron yang tidak berpasangan. Radikal bebas di dalam tubuh berperan dalam komunikasi antarsel (biosinyal), aktivasi sel Kupffer, dan apoptosis atau peristiwa matinya sel (Wu et al. 2004). Namun radikal bebas yang berlebih di dalam tubuh dapat mengakibatkan dampak negatif. Dampak negatif tersebut antara lain oksidasi terhadap berbagai komponen sel seperti protein dan DNA yang dapat menyebabkan timbulnya penyakit degeneratif seperti kanker dan penuaan sel (Hseu et al. 2008). Senyawa yang dapat menghambat dampak negatif dari radikal bebas dalam tubuh dinamakan antioksidan. Senyawa antioksidan ini akan menyerahkan satu atau lebih elektronnya kepada radikal bebas sehingga menjadi molekul yang stabil dan menghentikan berbagai kerusakan yang ditimbulkan radikal bebas (Tandon et al. 2005). Tubuh dapat memproduksi senyawa antioksidan sendiri, yang disebut antioksidan endogen, tetapi bila jumlah radikal bebas dalam tubuh berlebih, maka antioksidan endogen tidak akan mampu mengendalikan jumlah radikal bebas sehingga terjadi keadaan stres oksidatif. Oleh karena itu, tubuh memerlukan antioksidan dalam jumlah yang
lebih besar. Hal ini dapat dilakukan dengan memberi asupan antioksidan dari luar tubuh, yang disebut antioksidan eksogen, baik dari sumber alami maupun sintetik untuk membantu dalam proses pengendalian radikal bebas dalam tubuh. Pengendalian radikal bebas dalam tubuh pun dapat dibantu dengan mengkonsumsi makanan yang dapat meningkatkan produksi antioksidan endogen (Park et al. 2002 ;Lewis 2008). Lewis (2008) melaporkan bahwa pemberian senyawa flavonoid pada tikus Sprague Dawley dapat meningkatkan aktivitas superoksida dismutase. Senyawa flavonoid dan tanin banyak terdapat pada tanaman. Salah satu tanaman yang memiliki kandungan senyawa fitokimia tersebut adalah tanaman Swietenia macrophylla King atau yang dikenal sebagai mahoni berdaun lebar (Ningsih 2010). Ekstrak air dari serbuk kulit kayu mahoni telah diketahui dapat menurunkan konsentrasi lipid peroksida pada tikus yang diberi perlakuan hiperurisemia (Lavenia 2010). Penelitian tersebut melaporkan bahwa pemberian ekstrak air dari kulit kayu mahoni dapat menurunkan tingkat oksidasi lipid sebesar 26.86% hingga ke konsentrasi normal dari oksidasi lipid di dalam hati tikus. Namun, jumlah senyawa polifenol seperti flavonoid dan tanin yang dapat diserap oleh tubuh sangatlah sedikit. Selain itu, senyawa polifenol ini didalam tubuh pun memiliki waktu paruh yang pendek (Middleton et al. 2000). Hal ini menimbulkan adanya dugaan bahwa senyawa-senyawa polifenol tersebut tidak dapat bertindak sebagai antioksidan secara langsung di dalam tubuh namun senyawa ini dapat mempengaruhi aktivitas antioksidan endogen. Utami (2010) melaporkan pemberian ekstrak air kulit batang mahoni dosis pencegahan hiperkolesterolemia mampu menurunkan konsentrasi lipid peroksida pada darah tikus, tetapi belum diketahui apakah ekstrak air kulit kayu mahoni itu bertindak secara langsung dalam menangkal radikal bebas atau secara tidak langsung dengan meningkatkan produksi antioksidan dalam tubuh. Penelitian ini bertujuan mempelajari mekanisme ekstrak air kulit kayu mahoni dalam menurunkan tingkat oksidasi lipid yang dapat dilihat melalui penentuan aktivitas antioksidan superoksida dismutase pada organ hati. Hipotesis penelitian ini adalah ekstrak air kulit kayu mahoni dapat meningkatkan aktivitas antioksidan endogen dalam tubuh. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi tentang pengaruh ekstrak kulit kayu
2
mahoni terhadap aktivitas enzim antioksidan endogen dalam tubuh, khususnya terhadap aktivitas superoksida dismutase. TINJAUAN PUSTAKA Radikal Bebas dalam Tubuh Radikal bebas adalah sebuah atom, gugus atom, atau molekul yang memiliki satu atau lebih elektron yang tidak berpasangan pada kulit terluarnya. Radikal bebas secara kimiawi dapat dengan mudah terbentuk saat terjadi putusnya ikatan kovalen yang menghasilkan dua atom atau dua molekul baru yang mempunyai satu elektron bebas hasil pemutusan ikatan. Keberadaan elektron yang tidak berpasangan ini mendorong molekul tersebut untuk mengambil elektron dari molekul atau senyawa lain agar molekul tersebut menjadi lebih stabil, sesuai dengan kaidah oktet. Perilaku radikal bebas ini dapat memicu terjadinya pembentukan radikal bebas yang lain sehingga dapat membuat suatu reaksi berantai. Radikal bebas dapat ditemukan dalam tubuh manusia, sebagian besar tergolong ke dalam kelompok spesies oksigen reaktif (reactive oxygen species). Beberapa spesies oksigen reaktif yang terdapat di dalam tubuh adalah O2●-, H2O2, dan ●OH (Shaban et al. 2003). Spesies oksigen reaktif ini dihasilkan oleh tubuh secara normal dalam proses metabolisme aerobik pada mitokondria dan mikrosom. Di dalam tubuh, selain sebagai hasil samping dari proses metabolisme aerobik, spesies oksigen reaktif memiliki beberapa peranan, diantaranya dalam proses komunikasi antar sel (biosinyal), aktivasi sel Kupffer, dan apoptosis atau peristiwa matinya sel secara terprogram (Wu et al. 2004). Beberapa fungsi dari spesies oksigen reaktif tersebut menunjukkan bahwa molekul tersebut diperlukan didalam tubuh. Namun keberadaan molekul radikal bebas dalam tubuh yang melebihi kebutuhan normal sel dapat mengganggu integritas sel dan bereaksi dengan komponen sel. Komponen sel yang dapat bereaksi dengan radikal bebas antara lain komponen struktural yaitu berbagai molekul penyusun membran sel dan komponen sel fungsional yaitu protein dan DNA, yang akhirnya menimbulkan kerusakan sel. Reddy et al. (1998) melaporkan bahwa tingkat oksidasi lipid di dalam tubuh pekerja yang terpapar emisi karbon selama bekerja lebih tinggi dibandingkan dengan pekerja yang tidak terpapar emisi karbon. Selain itu, radikal bebas juga dapat memicu kanker,
penyakit jantung, dan penyakit pembuluh darah otak (Kumar & Kumar 2009). Tubuh telah memiliki sistem pertahanan antioksidan yang kompleks untuk melindungi sel dan sistem organ tubuh dari spesies oksigen reaktif yang berlebihan. Sistem ini saling berinteraksi dan berintegrasi dalam menetralisasi radikal bebas. Hiperkolesterolemia dan Radikal Bebas Hiperkolesterolemia adalah kondisi saat konsentrasi kolesterol di dalam darah melebihi batas normal. Kolesterol adalah lipid ampifatik yang termasuk dalam golongan sterol dan di dalam tubuh dapat ditemukan dalam bentuk bebas dan ester dengan asam lemak. Kolesterol merupakan senyawa penyusun membran dari sel hewan. Sterol ini telah terbukti memiliki peranan penting dalam berbagai fungsi sel, termasuk dalam penentuan fungsi enzim dan permeabilitas membran. Tidak ada senyawa lain dari kelompok sterol yang dapat menggantikan seluruh peran dari kolesterol pada membran sel mamalia. Umumnya sel mamalia tidak dapat hidup saat tidak terdapat kolesterol (Albert & Battaglia 2005). Organisme dapat memperoleh kolesterol melalui dua cara yaitu mensintesisnya dan melalui diet. Sintesis kolesterol berlangsung hampir pada seluruh jaringan hewan, tetapi pada hewan mamalia aktivitas biosintesis kolesterol yang tertinggi terjadi pada organ hati, kelenjar adrenal, ovarium, dan testis (Valenzuela et al. 2003). Prekursor yang digunakan oleh hati untuk mensintesis kolesterol adalah asetil KoenzimA (asetil KoA) yang merupakan hasil metabolisme karbohidrat, protein, atau lemak. Biosintesis kolesterol terbagi menjadi empat tahap. Tahapan pertama melibatkan perubahan asetil koA menjadi 3-hidroksi-3-metilglutarilKoA (HMG-KoA) yang dikatalisis oleh enzim HMG-KoA sintase, dilanjutkan sintesis HMGKoA menjadi mevalonat yang dikatalisis oleh enzim HMG-KoA reduktase (Gambar 1a). Tahapan selanjutnya adalah pembentukan unit-unit isoprenoid dari mevalonat (Gambar 1b). Tahapan ketiga adalah proses polimerisasi enam molekul isoprenoid untuk membentuk molekul skualena (Gambar 1c). Tahap paling akhir ialah proses terbentuknya inti sterol dari skualena, yang kemudian akan diubah menjadi kolesterol (Gambar 1d). Laju sintesis kolesterol oleh tubuh ditentukan oleh laju pembentukan mevalonat oleh HMG-KoA reduktase. Kerja enzim ini dapat dihambat oleh kolesterol dari hasil sintesis tubuh dan hasil degradasi LDL. Selain itu kerja HMG-
3
KoA reduktase juga dapat dihambat oleh beberapa obat penurun kolesterol golongan statin. Proses sintesis kolesterol ini dapat memenuhi sekitar 50% dari total kolesterol
yang dibutuhkan oleh tubuh dan sisanya diperoleh dari diet (Murray et al. 2005).
Mevalonat
Asetil-KoA tiolase
Asetoasetil-KoA 5-fosfomevalonat HMG-KoA sintase
5-pirofosfomevalonat
HMG-KoA
3-Fosfo-5pirofosfomevalonat
HMG-KoA reduktase
pyrofosfomevalonat Δ3-Isopentenil pirofosfat
Mevalonat
Dimetilalil pirofosfat
(a)
(b)
Skualena Dimetilalil pirofosfat
Δ3-Isopentenil pirofosfat
Geranil pirofosfat Skualena 2,3-epoksida
Farnesil pirofosfat
Lanosterol
Skualena
(c) (d) Gambar 1 Tahapan biosintesis kolesterol (Lehninger 2004)
Kolesterol
4
Diet yang kaya akan kolesterol dan lemak jenuh dapat menekan pembentukan reseptor Low Density Lipoprotein (LDL), sehingga meningkatkan jumlah kolesterol yang beredar di dalam darah, keadaan ini dapat memicu terjadinya kondisi hiperkolesterolemia. Selain itu, hiperkolesterolemia juga dapat terjadi karena beberapa faktor, seperti bobot badan, usia, kurang olahraga, stres emosional, gangguan metabolisme, dan kelainan genetik (Grundy 1991). Kondisi hiperolesterolemia, dalam eksperimen menggunakan hewan percobaan, dapat dibuat dengan melakukan induksi hiperkolesterolemia terhadap hewan percobaan secara eksogen dan endogen. Cara eksogen yaitu dengan pemberian pakan yang mengandung kolesterol dengan kadar yang tinggi. Induksi dengan cara endogen dapat dilakukan dengan melakukan injeksi PTU, injeksi ini dilakukan untuk merusak kelenjar tiroid yang akan menimbulkan kondisi hipotiroid yang dihubungkan dengan peningkatan konsentrasi LDL plasma akibat penurunan katabolisme LDL. Tubuh akan berusaha untuk mengeluarkan kelebihan kolesterol di dalam tubuh. Jalur utama pengeluaran kolesterol dari dalam tubuh adalah melalui jalur sintesis asam empedu yang berlangsung di hati. Kolesterol akan diubah menjadi asam empedu, yaitu asam kolat dan asam kenodeoksikolat. Jalur sintesis asam empedu ini diawali reaksi hidroksilasi kolesterol pada karbon 7α oleh sitokrom P450 kolesterol 7α-hidroksilase (CYP7A1) menjadi 7α-hidroksikolesterol,
suatu kelompok senyawa oksisterol (Gambar 2) (Murray et al. 2005; Zhao & Wright 2010). Kelompok senyawa oksisterol merupakan aktivator bagi Liver X Receptors (LXR), yang merupakan sensor bagi kolesterol. Saat jumlah oksisterol meningkat, maka LXR akan menjaga sel dari kelebihan kolesterol dengan cara meningkatkan ekskresi kolesterol melalui jalur sintesis asam empedu melalui peningkatan ekspresi dari CYP7A1. Meningkatnya ekspresi CYP7A1 akan meningkatkan aktivitas dari CYP7A1 (Zhao & Wright 2010). Meningkatnya aktivitas CYP7A1 akan meningkatkan konsumsi oksigen dan NADPH, yang kemudian akan meningkatkan radikal superoksida (O2-) yang dihasilkan (Kuthan et al. 1978). Radikal superoksida yang dihasilkan dalam ekskresi kolesterol akan meningkatkan jumlah radikal bebas di dalam tubuh sehingga tingkat oksidasi di dalam tubuh dapat meningkat. Meningkatnya oksidasi di dalam tubuh juga dipengaruhi oleh menurunnya aktivitas enzim antioksidan di dalam tubuh yang disebabkan oleh diet kaya kolesterol (Fki et al. 2005). Keterkaitan antara kondisi hiperkolesterolemia dengan tingkat oksidasi biomolekul dalam tubuh yang menandakan meningkatnya jumlah radikal bebas pun didukung oleh beberapa penelitian diantaranya Alviani (2007) yang menyatakan pemberian pakan kolesterol 1.25% dapat meningkatkan konsentrasi lipid peroksida tikus hingga lima kali dari konsentrasi lipid peroksida tikus normal.
7-Hidroksilase Kolesterol
7-Hidroksikolesterol 12-Hidrok silase
2 KoA-SH Propionil-Koa
2 KoA-SH Propionil-Koa
Kenodeoksikolil-KoA
Kolil-KoA
Gambar 2 Biosintesis asam empedu primer (Lehninger 2004)
5
Antioksidan Endogen dan Eksogen Antioksidan adalah suatu molekul atau senyawa yang dapat menangkap radikal bebas. Antioksidan dalam makanan dapat mencegah atau memperlambat proses makanan menjadi tengik ataupun rusak dan mengalami perubahan warna. Molekulmolekul antioksidan di dalam tubuh bertugas untuk melindungi sel-sel tubuh dan komponen tubuh lainnya dari radikal bebas, baik yang berasal dari metabolisme tubuh ataupun yang berasal dari lingkungan. Antioksidan juga diduga dapat mencegah terjadinya kanker karena kemampuannya dalam menangkal radikal bebas yang merupakan salah satu penyebab kanker (Kumar & Kumar 2009). Berdasarkan reaksinya dengan radikal bebas atau oksidan dalam sistem pertahanan tubuh, antioksidan dikelompokkan menjadi antioksidan primer, antioksidan sekunder, dan antioksidan tersier. Antioksidan primer bekerja dengan memutus rantai reaksi menjadi senyawa nonradikal atau radikal yang lebih stabil. Antioksidan jenis ini dapat menetralisasi radikal bebas dengan menyumbangkan salah satu elektronnya. Antioksidan yang termasuk dalam kelompok ini adalah tokoferol dan asam askorbat (Christyaningsih et al. 2003). Antioksidan sekunder bekerja dengan cara mencegah tahapan inisiasi dalam reaksi berantai radikal bebas. Antioksidan yang tergolong dalam kelompok ini adalah superoksida dismutase dan glutation peroksidase. Antioksidan tersier merupakan antioksidan yang bertugas untuk memperbaiki molekul-molekul yang telah mengalami kerusakan akibat radikal bebas. Antioksidan tersier juga berperan dalam membuang berbagai molekul yang telah rusak akibat teroksidasi sebelum molekul-molekul tersebut terakumulasi dalam tubuh dan mengganggu berbagai proses di dalam sel tubuh (Tandon et al. 2005). Berdasarkan sumbernya, antioksidan dalam tubuh manusia dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu antioksidan endogen dan antioksidan eksogen. Antioksidan endogen merupakan antioksidan yang dihasilkan oleh tubuh, berupa enzim yang dapat mengubah radikal bebas menjadi radikal bebas lain atau senyawa lainnya yang lebih tidak berbahaya bagi tubuh. Beberapa contoh enzim antioksidan endogen adalah superoksida dismutase, katalase, dan glutation peroksidase (Ming et al. 2009). Antioksidan eksogen adalah senyawa-senyawa yang memiliki daya antioksidan yang berasal dari luar tubuh,
contohnya adalah vitamin A, asam askorbat, tokoferol, dan beberapa polifenol (Ming et al. 2009). Senyawa-senyawa ini dapat diperoleh dari tanaman atau hewan yang kita konsumsi. Superoksida Dismutase Superoksida dismutase merupakan salah satu enzim antioksidan yang dihasilkan oleh tubuh. Superoksida dismutase merupakan enzim antioksidan terbanyak di dalam tubuh, yang sebagian besar dari enzim ini terletak di organ hati. Enzim ini termasuk dalam golongan metaloenzim. Berdasarkan kofaktor dan distribusinya didalam tubuh, enzim superoksida dismutase dibagi menjadi copper, zinc superoxide dismutase (Cu, Zn-SOD) yang terdapat dalam sitoplasma eukariot, manganese superoxide dismutase (Mn-SOD) yang terdapat pada mitokondria organisme aerobik, iron superoxide dismutase (Fe-SOD) yang terdapat pada prokariot dan ekstra selular superoksida dismutase (ec-SOD) yang banyak ditemukan pada cairan ekstraselular mamalia (Choi 1999). SOD tergolong enzim yang sangat stabil karena tiap subunitnya dihubungkan oleh ikatan non-kovalen dan terangkai olah rantai disulfida. Senyawa sianida dan dietilditiokarbamat dapat menghambat aktivitas dari Cu, Zn-SOD tetapi tidak Mn-SOD dan Fe-SOD. Inaktivasi dari enzim SOD inipun dapat terjadi saat adanya molekul H2O2 dan EDTA (Choi et al. 1999). Aktivitas dari superoksida dismutase dapat diukur dengan menggunakan beberapa cara, diantaranya dengan mengukur daya hambat yang ditimbulkan SOD terhadap reaksi yang bergantung pada radikal superoksida ataupun dengan menggunakan metode pulse radiolytic. Tetapi cara yang paling umum digunakan adalah dengan pengukuran daya hambat suatu reaksi yang bergantung pada radikal superoksida, diantaranya adalah metode yang berdasar reduksi sitokrom c oleh xantin oksidase (McCord 1969) dan metode yang berdasar rekasi autooksidasi dari pirogalol (Marklund & Marklund 1974). Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Marklund dan Marklund (1974) metode pengukuran aktivitas SOD dengan memanfaatkan proses autooksidasi dari pirogalol memiliki sensitifitas yang sama dengan metode yang dilakukan oleh McCord (1969). Pirogalol atau benzene-1,2,3-triol atau benzenatriol merupakan senyawa reduktor kuat, senyawa ini diperoleh dari hasil pemanasan terhadap asam galat dan juga dari hasil pemanasan campuran asam paraklorofenoldisulfonat dengan kalium
6
hidroksida. Dalam larutan basa senyawa pirogalol akan bereaksi dengan oksigen yang terdapat di udara membentuk senyawa purpurogalin dan mengalami perubahan warna dari tidak berwarna menjadi berwarna kuning. Prinsip dari metode ini adalah SOD akan menghambat proses autooksidasi senyawa pirogalol menjadi senyawa purpurogalin dengan menangkap oksigen. Aktivitas SOD ditentukan dengan menghitung persentase hambatan autooksidasi pirogalol dengan membandingkan konsentrasi purpurogalin yang terbentuk pada larutan yang berisi pirogalol dan enzim SOD dengan larutan yang hanya berisi pirogalol saja. Satu unit SOD didefinisikan sebagai banyaknya enzim yang diperlukan untuk menghambat reaksi autooksidasi sebanyak 50% (Marklund & Marklund 1974). Swietenia macrophylla Tanaman Swietenia macrophylla King atau yang dikenal dengan nama tanaman mahoni berdaun lebar merupakan tanaman asli dari daerah Amerika yang memiliki habitat tumbuh tersebar di Amerika Tengah, Amerika Selatan, Asia bagian selatan dan pasifik, serta Afrika Barat. Secara taksonomi tanaman ini tergolong ke dalam famili Meliaceae. Tanaman ini juga memiliki nama lain diantaranya Swietenia candolei Pittier, Swietenia krukovii Gleason, Swietenia belizensis Lundel, Swietenia macrophylla King var. Marabaensis Ledoux et Lobato, dan Swietenia tessmanii Harms. Mahoni berdaun lebar ini dapat tumbuh hingga mencapai tinggi 40-60 meter dan lingkar batang 3-4 meter (Maiti et al. 2007). Tanaman ini memiliki kulit berwarna abu-abu dan halus ketika masih muda kemudian berubah menjadi berwarna coklat tua dengan kulit yang menggembung dan mengelupas (Gambar 3). Daun bertandan dan menyirip dengan panjang berkisar 35-50 cm, tersusun bergantian, 4-6 pasang tiap daun, lebarnya berkisar 9-18 cm. Bunganya kecil berwarna putih, panjangnya 10-20 cm serta malainya bercabang (Joker & Schmidt 2000). Pohon mahoni di daerah asalnya banyak dipergunakan dalam industri kayu (Verissimo et al. 1995). Industri kayu di Kabupaten Bogor pun telah mempergunakan mahoni sebagai bahan bakunya. Lahan seluas 1937.78 ha di Kabupaten Bogor khusus dipergunakan sebagai hutan industri mahoni dengan produksi 8252.06 m3 kayu mahoni per tahun. Dalam proses industri ini, kulit kayu mahoni
merupakan salah satu limbahnya (Supriadi 2006). Selain sebagai bahan baku pada industri kayu, mahoni pun telah banyak digunakan sebagai bahan untuk ramuan jamu-jamuan untuk menyembuhkan berbagai penyakit. Sebagai contoh, masyarakat di daerah India telah mempergunakan biji mahoni sebagai antidiare. Biji dari mahoni pun diketahui memiliki aktifitas antiinflamasi, antimutagen, dan antitumor (Maiti et al. 2007). Beberapa senyawa yang terkandung dalam biji mahoni adalah swietenin swietenolida, swietemahonin kayasin, andirobin, augustineolida, 7-deaseto7-oksogenudin, 6-deoksi swietenin proseranolida, 6-hidroksi swietenina, dan 6-Oasetil swietenolida (Maiti et al. 2007). Bagian lain dari mahoni yang telah diketahui memiliki khasiat untuk menyembuhkan berbagai penyakit adalah bagian kulit kayunya. Kulit kayu mahoni diketahui memiliki potensi sebagai antioksidan. Lavenia (2010) menyatakan ekstrak air kulit kayu mahoni dapat menurunkan konsentrasi lipid peroksida sebesar 26.86% hingga tingkat normal pada tikus. Kulit kayu mahoni memiliki kandungan triterpenoid, limonoid, flavonoid, tanin, saponin, katekin, epikatekin, dan swietemakrofilanin (Mootoo et al. 1999, Falah et al. 2008). Senyawa-senyawa tersebut diketahui mempunyai aktivitas antioksidan secara in vitro (Kumar & Kumar 2009). Secara in vivo senyawa flavonoid dan tanin pun memiliki kemampuan untuk meningkatkan aktivitas antioksidan endogen (Lewis 2008; Park et al. 2002).
Gambar 3 Mahoni berdaun lebar (Swietenia macrophylla King) Peran Hati sebagai Biotransformator Hati merupakan organ terbesar di dalam tubuh manusia dengan bobot antara 12001600 gram, sekitar 2-3 % dari bobot tubuh,
7
dengan konsumsi oksigen sekitar 20-30%. Organ ini disusun oleh sel hepatosit, yang menyusun hingga 90% dari bobot total hati. Sel hepatosit kaya akan retikulum endoplasma, sesuai dengan tingginya sintesis protein dan lipid (Koolman 2005). Organ hati merupakan pusat dari metabolisme antara (intermediary metabolism) dari tubuh. Beberapa fungsi utama dari hati adalah fungsi metabolisme, penyerapan nutrien dari saluran pencernaan ke dalam pembuluh darah, memasok metabolit dan nutrien ke bagian tubuh yang membutuhkan, detoksifikasi, dan ekskresi metabolit-metabolit yang tidak diperlukan oleh tubuh melalui kelenjar empedu. Fungsi metabolisme yang dilakukan oleh hati mencakup metabolisme karbohidrat, metabolisme lipid, metabolisme asam amino dan protein, penyimpanan, serta proses biotransformasi (Koolman 2005). Fungsi biotransformasi yang dilakukan oleh hati adalah salah satu fungsi yang berkaitan dengan radikal bebas dan antioksidan endogen di dalam tubuh. Biotransformasi ialah proses konversi suatu senyawa menjadi senyawa lain. Fungsi ini tidak hanya terbatas dalam mengubah suatu senyawa yang berbahaya menjadi tidak berbahaya tetapi juga mencakup konversi suatu senyawa menjadi senyawa lain agar dapat dipergunakan oleh tubuh atau diproses untuk diekskresikan. Fungsi biotransformasi menjadi penting karena tubuh menerima atau mendapat berbagai senyawa asing, atau xenobiotics, dari makanan atau melalui kontak dengan lingkungan, melalui kulit dan paruparu. Salah satu contoh proses biotransformasi adalah pengubahan senyawa-senyawa radikal bebas yang berbahaya di dalam tubuh menjadi air dan oksigen, proses ini dikatalisis oleh beberapa enzim antioksidan yang diproduksi oleh hati yaitu superoksida dismutase, katalase, dan glutation peroksidase (Koolman 2005). BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat Dalam percobaan ini sampel yang digunakan berupa hati tikus yang berasal dari penelitian Mustika (2010) yang didanai oleh penelitian Program Unggulan IPB (PUI) atas nama Dr. Syamsul Falah S.Hut., M.Si. dkk pada tahun 2009. Dalam penelitian tersebut tikus yang digunakan adalah tikus putih jantan galur Sprague Dawley, tikus diperoleh dari Badan POM saat berumur 2 bulan dengan
bobot badan 100-150 g. Kulit batang mahoni (S. macrophylla King) yang digunakan berasal dari pohon mahoni berumur 15 tahun yang ditanam di Arboretrum Universitas Winaya Mukti, Sumedang. Bahan-bahan yang digunakan dalam pengukuran aktivitas superoksida dismutase adalah larutan KCl, larutan EDTA (pH 7.4), bufer fosfat 50 mM (pH 8.2), dan pirogalol 10 mM. Alat-alat yang digunakan adalah oven mikropipet, neraca analitik, pengaduk magnetik, alat-alat gelas, hot plate, peralatan ekstraksi, pipet volumetrik, vorteks, homogenizer manual, sentrifus Beckman J221, rotor sentrifus JA 10 (r = 10,4cm), spektrofotometer UV-Vis. Metode Penelitian Rancangan Percobaan Dalam penelitian Mustika (2010) dipergunakan 35 ekor tikus. Hewan coba tersebut dibagi ke dalam lima kelompok masing-masing terdiri atas tujuh ekor. Kelompok I adalah kontrol normal yang hanya diberi pakan standar (komposisi protein 18%, lemak 4-6%, dan abu 7-9%). Kelompok II hingga V adalah kelompok hiperkolesterolemia yang diberi pakan kolesterol 1.5% (pakan standar 53%, kuning telur 36%, minyak curah 6%, dan lemak kambing 5%) dan dicekok PTU 0.5 mg/KgBB. Kelompok III adalah kelompok hiperkolesterolemia yang diberi tambahan cekok lovastatin 0.2875 mg/KgBB (kelompok lovastatin). Kelompok IV adalah kelompok hiperkolesterolemia yang diberi tambahan cekok ekstrak kulit batang mahoni dosis 1 sebesar 4.2 mg/KgBB (kelompok ekstrak 1), sedangkan kelompok V diberi ekstrak dosis 2 sebesar 21 mg/KgBB (kelompok ekstrak 2). Ekstrak kulit batang mahoni ini diberikan dari awal hingga akhir perlakuan. Tikus yang dipergunakan diadaptasikan selama sepuluh minggu untuk diseragamkan cara hidup dan makanannya. Makanan hewan percobaan diberikan sebanyak 25 g/ekor/hari dan air minum diberikan secara ad libitum. Pemberian pakan dan pencekokan ekstrak dilakukan selama percobaan (dari minggu ke0 sampai minggu ke-8). Selama percobaan darah diambil sebanyak 5 kali. Tiga hari setelah pengambilan darah terakhir dilakukan nekropsi. Nekropsi dilakukan dengan terlebih dahulu membius tikus menggunakan eter hingga tikus mati. Tikus kemudian dibedah dan diambil organ hatinya. Hati tikus dibilas menggunakan larutan NaCl 0.9%, ditimbang, dan disimpan di dalam freezer (20oC).
8
Pengukuran Sampel Hati Tikus Segar sebagai Pembanding Tikus berumur 6 bulan 2 minggu dinekropsi dan diambil hatinya. Hati tikus kemudian dibilas menggunakan larutan NaCl 0.9%, dikeringkan menggunakan kertas tisu, lalu ditimbang bobotnya. Hati tkus kemudian diukur aktivitas superoksida dismutasenya. Hasil pengukuran ini digunakan sebagai pembanding untuk melihat apakah sampel hati tikus dan pirogalol yang digunakan masih dalam keadaan baik. Pengukuran Aktivitas Superoksida Dismutase (Marklund dan Marklund 1974 dengan modifikasi oleh Gatellier et al. 2004) Preparasi Sampel. Sebanyak 1.15 gram hati tikus dicampurkan dengan 13 mL larutan ekstraksi yang mengandung 0.15 M KCl dan 0.79 M EDTA (pH 7.4) kemudian dihomogenisasi menggunakan homogenizer manual. Lalu homogenat disentrifugasi pada 9000 rpm menggunakan sentrifus Beckman J2-21 dengan rotor JA 10 pada suhu 4oC selama 10 menit. Supernatan kemudian dipergunakan untuk uji aktivitas enzim superoksida dismutase. Penentuan Waktu Inkubasi Sampel untuk Pengukuran Aktivitas SOD. Sebanyak 75 µl pirogalol 10 mM dicampurkan dengan 2850 µl bufer fosfat 50 mM (pH 8.2) kemudian ditambahkan 75 µl larutan ekstraksi. Larutan tersebut diukur absorbansinya pada panjang gelombang 340 nm setiap 10 detik selama 10 menit. Waktu inkubasi ditentukan saat grafik hubungan antara waktu dan absorbans masih memiliki nilai r2 sebesar 0.99. Analisis Aktivitas SOD pada Hati. Sebanyak 75 µl pirogalol 10 mM dicampurkan dengan 2850 µl bufer fosfat 50 mM (pH 8.2), kemudian dilakukan penambahan 75 µl sampel. Tingkat autooksidasi dari pirogalol saat ditambahkan dengan sampel dibandingkan dengan standar (dengan 75 µl larutan ekstraksi) dengan pengukuran peningkatan nilai absorbansi pada λ 420 nm selama 2 menit. Satu unit enzim SOD dinyatakan sebagai banyaknya enzim yang dibutuhkan untuk menghambat reaksi autooksidasi pirogalol sebanyak 50%. Analisis Statistik (Matjik & Sumertajaya 2000) Rancangan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap atau RAL. Analisis data dilakukan dengan metode Analysis of
Variance (ANOVA). Jika terdapat perbedaan dalam perlakuan, maka dilakukan uji Duncan. Model RAL adalah sebagai berikut (Matjik & Sumertajaya 2000): Yij = µ + τi + εij Keterangan: i = 1, 2, ..., t dan j = 1, 2, ..., r Yij = pengamatan perlakuan ke-i dan ulangan ke-j µ = pengaruh rataan umum τi = pengaruh rataan ke-i, i = 1, 2, 3, 4, 5 εij = pengaruh galat perlakuan ke-i dan ulangan ke-j, j = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 HASIL DAN PEMBAHASAN Pengaruh Penyimpanan terhadap Kondisi Sampel Hati Sampel hati yang digunakan telah mengalami penyimpanan selama 12 bulan di dalam freezer. Dalam penyimpanan sampel menjadi rawan terhadap kerusakan. Oleh karena itu perlu dilakukan suatu pengujian yang dapat menunjukkan apakah sampel masih dalam kondisi baik atau tidak. Jika sampel masih dalam keadaan baik maka enzim SOD dalam sampel hati yang mengalami penyimpanan akan tetap memiliki aktivitas sebagai antioksidan. Pengujian dilakukan dengan membandingkan aktivitas enzim SOD dari sampel hati yang telah mengalami penyimpanan (diwakili oleh sampel hati tikus kelompok perlakuan normal) dengan sampel hati segar yang diperoleh dari tikus berumur 6,5 bulan (sama dengan usia tikus yang dipergunakan sebagai hewan percobaan dan tidak mengalami penyimpanan sebelum diukur aktivitas antipksidan SODnya). Aktivitas antioksidan SOD ditentukan dengan mengukur daya hambat yang diberikan ekstrak hati pada proses autooksidasi pirogalol. Aktivitas antioksidan SOD dinyatakan dalam bentuk persen hambatan proses autooksidasi pirogalol. Dari hasil pengukuran didapatkan daya hambat untuk sampel hati kelompok perlakuan normal adalah sebesar 47.96±12.37% dan sampel hati segar sebesar 22.98±7.93% (Gambar 4). Daya hambat yang diberikan oleh kedua kelompok sampel berbeda nyata secara statistik (p<0.05). Walaupun berbeda nyata, tetapi sampel hati dapat dikatakan masih dalam kondisi yang baik. Hal ini dapat terlihat dari persentase hambatan yang diberikan oleh sampel hati kelompok perlakuan normal yang dua kali lebih besar dibandingkan dengan sampel hati segar. Besarnya persentase hambatan yang
9
70 60 50 40 30 20 10 0 Sampel yang Sampel yang tidak mengalami mengalami penyimpanan penyimpanan
Gambar 4 Aktivitas antioksidan SOD pada sampel hati tikus yang telah mengalami penyimpanan dan yang tidak mengalami penyimpanan Pengaruh Pakan Kolesterol terhadap Aktivitas SOD Sampel hati yang digunakan pada penelitian ini berasal dari tikus yang berasal dari penelitian Mustika (2010). Tikus ini didesain untuk penelitian mengenai potensi ekstrak mahoni sebagai pencegah hiperkolesterolemia, sehingga dalam tahapan perlakuannya semua tikus, kecuali kelompok normal, mendapat asupan kolesterol dalam dietnya. Rata-rata aktivitas antioksidan SOD hati tikus untuk kelompok normal (47.96±12.37%) dan kelompok hiperkolesterolemia (44.22±13.68%) tidak berbeda nyata secara statistik (p>0.05) (Gambar 5). Fki et al. (2005) dalam penelitiannya menunjukkan bahwa kondisi hiperkolesterolemia dapat mengurangi
antioksidan di dalam tubuh dan juga mengurangi aktivitas dari enzim SOD dan katalase hingga 24% jika dibandingkan dengan kelompok normal pada penelitiannya. Rata-rata konsentrasi kolesterol darah minggu ke-0 dan ke-8 untuk kelompok normal adalah sebesar 63.77±6.76 mg/dL dan 76.49±8.23 mg/dL dan untuk kelompok hiperkolesterolemia sebesar 63.26 ±7.33 mg/dL dan 95.34±15.24 mg/dL (Mustika 2010). Konsentrasi kolesterol tikus kelompok normal antara minggu ke-0 dan minggu ke -8 tidak berbeda nyata sedangkan konsentrasi kolesterol tikus kelompok hiperkolesterolemia pada minggu ke-8 mengalami kenaikan sebesar 52.27% dibanding konsentrasi kolesterolnya pada minggu ke-0. Jika dilihat dari persentase kenaikan konsentrasi kolesterol pada kelompok hiperkolesterolemia maka dapat dikatakan bahwa tikus pada kelompok tersebut telah mengalami hiperkolesterolemia. Namun nilai rata-rata konsentrasi kolesterol pada kedua kelompok perlakuan masih termasuk normal karena kolesterol darah tikus dikatakan hiperkolesterolemia saat konsentrasinya lebih dari 130 mg/dL (Malole & Pramono 1989). Zhao dan Wright (2010) melaporkan bahwa kolesterol akan menyebabkan stres oksidatif saat telah terjadi kondisi hiperkolesterolemia karena pada saat kondisi hiperkolesterolemia akan terjadi peningkatan pembuangan kolesterol dari dalam tubuh. Artinya pada penelitian ini tidak terjadi peningkatan pembuangan kolesterol dari dalam tubuh tikus sehingga tidak terjadi keadaan stres oksidatif yang dapat mempengaruhi konsentrasi SOD pada hati tikus. Hal inilah yang menyebabkan terjadinya perbedaan hasil dengan hasil penelitian dari Fki et al. (2005)
70 Persentase Hambatan (%)
Persentase Hambatan (%)
diberikan menunjukkan bahwa SOD dalam sampel hati yang telah disimpan selama 12 bulan masih dalam kondisi baik dan masih dapat menjalankan fungsinya sebagai enzim antioksidan. Lebih tingginya daya hambat dari sampel hati perlakuan normal disebabkan oleh adanya perbedaan perlakuan tikus. Tikus yang digunakan sebagai pembanding tidak mengalami penyekokan dan hanya mengalami pengambilan darah sebanyak satu kali sehingga stres akibat perlakuan yang diterima oleh kedua kelompok tikus ini berbeda. Stres akibat perlakuan dapat memicu terjadinya stres oksidatif pada tikus. Menurut Ellah et al. (2008) stres oksidatif pada tikus dapat menyebabkan meningkatnya aktivitas enzim SOD pada hati tikus.
60 50 40 30 20 10 0 Normal
HK
Gambar 5 Aktivitas antioksidan SOD hati tikus pada kelompok pemberian pakan normal dan pakan kolesterol.
10
Pengaruh Pemberian Ekstrak Mahoni terhadap Aktivitas SOD Penelitian ini menganalisis aktivitas antioksidan SOD yang terdapat di dalam hati tikus sebagai gambaran pengaruh pemberian ekstrak mahoni terhadap aktivitas antioksidan SOD. Aktivitas antioksidan SOD yang terukur dari kelompok hiperkolesterolemia, kelompok ekstrak 1, dan ekstrak 2 secara berurutan adalah 44.29±13.68%, 43.83±11.77%, dan 40.58±11.99% (Gambar 6). Secara statistik aktivitas antioksidan SOD dari ketiga kelompok ini tidak berbeda nyata. Dalam kata lain kelompok yang menerima asupan ekstrak dalam perlakuannya tidak mengalami peningkatan jumlah SOD dalam tubuhnya. Jika dilihat konsentrasi lipid peroksida darahnya, lipid peroksida kelompok HK (3.380 nmol/mL) masih lebih tinggi dibandingkan kelompok ekstrak 1 (2.353nmol/mL) dan kelompok ekstrak 2 (2.789 nmol/mL). Peroksidasi lipid kelompok perlakuan ekstrak lebih kecil dibandingkan dengan kelompok HK. Hal ini berarti kinerja ekstrak sebagai antioksidan tetap ada. Namun, berdasarkan konsentrasi lipid peroksida dapat dikatakan bahwa ekstrak kulit kayu mahoni tidak bertindak sebagai antioksidan dengan cara meningkatkan aktivitas antioksidan endogen (SOD) tetapi kemungkinan besar komponen-komponen ekstrak bekerja secara langsung dalam mencegah terjadinya peroksidasi lipid. Kelompok lovastatin digunakan sebagai kontrol positif dalam mencegah hiperkolesterolemia pada penelitian Mustika (2010). Lovastatin, salah satu senyawa golongan statin, merupakan inhibitor 70
Persentase hambatan (%)
60 50 40 30 20 10 0 HK
Lovas
E1
E2
Gambar 6 Aktivitas antioksidan SOD pada kelompok pemberian ekstrak
HMG-KoA reduktase yaitu salah satu enzim yang berperan dalam proses biosintesis kolesterol.Lovastatin, walaupun secara struktur tidak dapat bereaksi sebagai molekul antioksidan, mampu menghambat rekasi isoprenoid dalam proses aktivasi NADPH oksidase, melalui cara itu lovastatin dapat menghambat pembentukan radikal superoksida sehingga mengurangi kemungkinan terjadinya peroksidasi lipid oleh radikal bebas (Bokoch & Prossnitz 1992). Aktivitas antioksidan SOD dari kelompok ini, yang ditunjukkan melalui besarnya penghambatan autooksidasi dari pirogalol, adalah sebesar 48.03±6.04%. Besarnya aktivitas dari kelompok ini tidak berbeda nyata dengan aktivitas SOD kelompok normal. Hasil ini sesuai dengan beberapa penelitian lain yang menunjukkan bahwa lovastatin dapat mempertahankan aktivitas enzim SOD dalam keadaan stres oksidatif. Chen et al. (1997) melaporkan bahwa penggunaan lovastatin pada tikus hiperkolesterolemia dapat menurunkan tingkat peroksidasi lipid dan mempertahankan aktivitas SOD hingga taraf normal (hingga sama dengan aktivitas SOD pada kelompok normal dengan penelitian Chen et al. 1997). Ma et al. (2003) menyatakan bahwa peningkatan peroksidasi lipid dapat menyebabkan penurunan aktivitas enzim SOD. Ekstrak air kulit mahoni yang dipergunakan diketahui mengandung senyawa alkaloid, flavonoid, tanin, saponin, dan triterpenoid (Ningsih 2010). Flavonoid yang terkandung pada ekstrak termasuk ke dalam kelompok flavon dan flavonol. Ningsih (2010) melaporkan bahwa konsentrasi flavonoid yang terkandung adalah setara dengan 0.0402% (b/b) kuersetin, kuersetin merupakan senyawa golongan flavonol yang paling aktif dan umumnya terdapat pada tanaman. Senyawa polifenol diketahui memiliki berbagai aktivitas di dalam sistem biologis tubuh, misalnya saja antioksidan, tetapi pengetahuan tentang mekanisme senyawa polifenol di dalam tubuh sebagai antioksidan masih belum diketahui secara pasti. Hal ini dikarenakan polifenol akan mengalami proses metabolisme ketika masuk ke dalam tubuh, sehingga memungkinkan terjadinya kehilangan kemampuan sebagai antioksidan. Beberapa aktvitas biologis dari senyawa polifenol di dalam tubuh yang telah diketahui antara lain senyawa polifenol, terutama senyawa flavonoid golongan flavon, memiliki
11
aktivitas sebagai inhibitor enzim xantin oksidase sehingga dapat mengurangi pembentukan radikal bebas yang dihasilkan oleh xantin oksidase (Hoorn et al. 2002). Senyawa isoflavon, genistein, juga diketahui dapat meningkatkan ekspresi gen dari enzim glutation peroksidase yang menyebabkan meningkatnya pertahanan antioksidan endogen dalam tubuh (Suzuki et al. 2002). Selain itu, kuersetin diketahui dapat menghambat pembentukan radikal bebas karena kemampuannya dalam mengkelat ion logam sehingga dapat mencegah terjadinya pembentukan radikal bebas melalui rekasi Fenton, kuersetin juga diketahui dapat meningkatkan ekspresi gen dari enzim antioksidan terutama kelompok enzim glutation (Moskaug et al. 2004). SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Pemberian ekstrak air kulit kayu mahoni dosis antihiperkolesterolemia (4.2 mg/KgBB dan 21 mg/KgBB) tidak mempengaruhi aktivitas SOD pada hati tikus. Aktivitas SOD dari semua kelompok perlakuan tikus tidak berbeda satu sama lain. Hal ini berarti peranan ekstrak mahoni sebagai antioksidan dalam tubuh bukanlah dengan meningkatkan antioksidan superoksida dismutase. Saran Perlu dilakukan penelitian lanjutan untuk melihat mekanisme yang dilakukan ekstrak air kulit kayu mahoni dalam peranannya sebagai antioksidan dalam tubuh. Saran yang diajukan diantaranya adlaah melakukan pengukuran konsentrasi terhadap enzim antioksidan lain dalam tubuh (katalase dan glutation peroksidase) dan mengukur berbagai senyawa polifenol yang beredar dalam tubuh tikus. DAFTAR PUSTAKA Albert AD, Battaglia KB. 2005. The role of cholesterol in rod outer segment membranes. Progress in Lipid Research 44: 99-124. Alviani. 2007. Khasiat ramuan ekstrak daun jati belanda terhadap peroksidasi lipid hati tikus hiperlipidemia [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Bokoch GM, Prossnitz V. 1992. Isoprenoid metabolism is required for stimulation of the respiratory burst oxidase of HL-60 cells. J Clin Invest 89:402-408. Chen L et al. 1997. Preservation of endogenous antioxidant activity and inhibition of lipid peroxidation as common mechanisms of antiatherosclerotic effects of vitamin E, lovastatin and amlodipine. JACC 30: 569-575. Choi J, Roche E, Caquet T. 1999. Characterization of superoxide dismutase activity in Chironomus riparius Mg. (Diptera, Chironomidae) larvae – a potential biomarker. Comparative Biochemistry and Physiology Part C 124: 73–81. Christyaningsih J, Suwandito, Purnomo SU. 2003. Pengaruh suplementasi vitamin E dan C terhadap aktivitas enzim superoksida dismutase (SOD) dalam eritrosit tikus yang terpapar asap rokok kretek. JBP 5: 87-91. Dachriyanus et al. 2007. Uji efek AMangostin terhadap kadar kolesterol total, trigliserida, kolesterol HDL, dan kolesterol LDL darah mencit putih jantan serta penentuan lethal dosis 50 (Ld50). J Sains Tek Far 12: 64-72. Ellah MRA, Okada K, Goryo M, Oishi A, Yasuda J. 2009. Superoxide dismutase activity as a measure of hepatic oxidative stress in cattlefollowing ethionine administration. The Veterinary Journal 182: 336-341. Falah S, Suzuki T, Katayama T. 2008. Chemical constituents from Swietenia macrophylla bark and their antioxidant activity. Pakistan Journal of Biological Sciences 11: 2007-2012. Fki I, Bouaziz M, Sahnoun Z, Sayadi S. 2005. Hypocholesterolemic effects of phenolicrich extracts of Chemlali olive cultivar in rats fed a cholesterol-rich diet. Bioorganic & Medicinal Chemistry 13: 5362–5370. Giri LN. 2008. Potensi antioksidan daun salam: kajian in vivo pada tikus hiperkolesterolemia dan hiperglikemia [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan
12
Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Grundy SM. 1991. Multifactorial ethiology of hypercholesterolemia: implication for prevention of coronary heart disease. Atheros Thromb 11: 1619-1635. Hoorn DECV et al. 2002. Accurate prediction of xanthine oxidase inhibition based on the structure of flavonoids. European Journal of Pharmacology 451: 111-118. Hseu YC et al. 2008. Antioxidant activities of Toona Sinensis leaves extracts using different antioxidant mode. Food and Chemical Toxicology 46: 105–114. Joker D, Schmidt L. 2000. Seed leaflet: Swietenia macrophylla King. [terhubung berkala]. http://www.sl.kvl.dk/upload/ swietenia_macrophylla_int.pdf. [17 Nov 2009]. Koolman J, Roehm KH. 2005. Color Atlas of Biochemistry. ed. ke-2. Stuttgart: Georg Thieme Verlag. Kumar S, Kumar D. 2009. Antioxidant and radical scavenging activities of edible weeds. African Journal of Food Agriculture Nutrition and Development 9: 1174-1190. Kuthan H, Tsuji H, Ulsrich V. 1978. Generation of superoxide anion as a source of hydrogen peroxide in a reconstituted monooxygenase system. FEBS LETTERS 91:343-345. Lavenia A. 2010. Potensi ekstrak kulit batang mahoni sebagai antioksidan pada tikus hiperurisemia [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Lehninger AL, Nelson DL, Cox MM. 2004. Principles of Biochemistry. New York: Worth Pr. Lewis JB. 2008. Effects of bran from sorghum grains containing different classes and levels of bioactive compounds in colon carcinogenesis [tesis]. Texas: A&M University. Lichtenstein AH et al. 2006. Diet and lifestyle recommendations revisition 2006: A
scientific statement from the American heart association nutrition committee. Circulation 114: 82-96. Ma FX, Liu LY, Xiong XM. 2003. Protective effects of lovastatin on vascular endothelium injured by low density lipoprotein. Acta Pharmacol Sin 24 : 1027-1032. Maiti A, Dewanjee S, Mandal SC. 2007. In vivo evaluation of antidiarrhoeal activity of the seed of Swietenia macrophylla King (Meliaceae). Tropical Journal of Pharmaceutical Research 6: 711-716. Malole MBM, Pramono CSU. 1989. Penggunaan Hewan-Hewan Percobaan di Laboratorium. Bogor: PAU IPB. Marklund S, Marklund G. 1974. Involvement of the superoxide anion radical in the autooxidation of pyrogallol and a convenient assay for superoxide dismutase. Eur J Biochem 47: 469-474. McCord JM, Fridovich I. 1969. Superoxide dismutase: an enzymic function for erythrocuprein (hemocuprein). The Journal of Biological Chemistry 244: 6049-6055. Middleton E, Kandaswami C, Theoharides TC. 2000. The effects of plant flavonoids on mammalian cells: implications for inflammation, heart disease, and cancer. Pharmacol Rev 52: 673–751. Ming M, Guanhua L, Zhanhai Y, Guang C, Xuan Z. 2009. Effect of the Lycium barbarum polysaccharides administration on blood lipid metabolism and oxidative stress of mice fed high-fat diet in vivo. Food Chemistry 113: 872–877. Mootoo BS et al. 1999. Limonoids from Swietenia macrophylla and S. aubrevilleana. J Nat Prod 62: 1514-1517. Moskaug JO, Carlsen H, Myhrstad M, Blomhoff R. 2004. Molecular imaging of the biological effects of quercetin and quercetin-rich foods. Mechanisms of Ageing and Development 125: 315-324. Murray RK, Granner DK, Mayes PA, Rodwell VW. 2005. Harper’s Illustrated
13
Biochemistry Twenty-Sixth Edition. New York: McGraw-Hill. Mustika R. 2010. Khasiat ekstrak kulit kayu mahoni (Swietenia macrophylla King.) sebagai pencegah hiperkolesterolemia pada tikus putih [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Ningsih F. 2010. Kandungan flavonoid kulit kayu mahoni (Swietenia macrophylla King) dan toksisitas akutnya terhadap mencit [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Park SY. 2002. Effect of rutin and tannic acid supplements on cholesterol metabolism in rats. Nutrition Research 22: 283–295. Reddy KK, Reddy TPK, Somasekharaiah BV, Kumari KS. 1998. Free radical generation and lipid peroxidation among the dry cell industry workers exposed to carbon. Indian Journal of Clinical Biochemistry 13: 27-32. Shaban NZ, Helmy MH, El-Kersh MAR, Mahmoud BF. 2003. Effects of Bacillus thuringiensis toxin on hepatic lipid peroxidation and free-radical scavengers in rats given alpha-tocopherol or acetylsalicylate. Comparative Biochemistry and Physiology Part C 135: 405–414. Supriadi A. 2006. Potensi, kegunaan, dan nilai tambah kayu dari hutan wilayah Kabupaten Bogor. Di dalam: Kontribusi Hutan Rakyat dalam Kesinambungan Industri Kehutanan. Prosiding Seminar Hasil Litbang Hasil Hutan; Bogor, 21 September 2006. Bogor: Pusat Penelitian dan Pengembangan Hasil Hutan. Hlm 5863. Suzuki K et al. 2002. Genistein, a soy isoflavone, induces glutathione peroxidase in the human prostate cancer cell lines LNCAP and PC-3. Int J Cancer 99: 846852. Tandon VR, Verma S, Singh JB, Mahajan A. 2005. Antioxidants and cardiovascular health. JK Science 7: 61-64.
Tourino S et al. 2008. Antioxidant/prooxidant effects of bioactive polyphenolics. EJEAFChe 7: 3348-3352. Utami DFR. 2010. Peroksidasi lipid pada tikus hiperkolesterolemia selama pemberian ekstrak kulit batang mahoni (Swietenia macrophylla) [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Valenzuela A, Sanhueza J, Susana N. 2003. Cholesterol oxidation: health hazard and the role of antioxidants in prevention. Biol Res 36: 291-302. Verissimo A, Barreto P, Tarifa R, Uhl C. 1995. Extraction of a high-value natural resource in Amazonia: the case of mahogany. Forest Ecology and Management 72: 39-60. Wu J et al.. 2004. Liposome-mediated extracellular superoxide-dismutase gene delivery protects against acute liver injury in mice. Hepatology 40: 195-204. Zhao C, Wright KD. 2010. Liver X receptor in cholesterol metabolism. Journal of Endocrinology 204: 233–240.
LAMPIRAN
15
Lampiran 1 Rancangan percobaan
Tikus sejumlah 35 ekor
Kontrol Normal (I)
Kontrol Hiperkolesterolemia (II)
Kontrol Lovastatin (III)
Ekstrak kulit mahoni 1 (IV)
Adaptasi hewan uji
Ekstrak kulit mahoni 2 (V)
10 Minggu
Induksi hiperkolesterolemia pada kelompok II, II, IV, dan V dengan pakan kolesterol 1.5% dan PTU 2 mg/KgBB
Perlakuan: Kelompok I diberi pakan standar
8 Minggu
Kelompok II diberi pakan kolesterol dan dicekok PTU Kelompok III diberi pakan kolesterol dan dicekok lovastatin 0.2857/KgBB Kelompok IV diberi pakan kolesterol dan dicekok ekstrak kulit kayu mahoni 1 Kelompok V diberi pakan kolesterol dan dicekok ekstrak kulit kayu mahoni 2
Nekropsi dan pengambilan organ hati tikus
Analisis Aktivitas Antioksidan Superoksida Dismutase
16
Lampiran 2 Ekstraksi serbuk kayu mahoni (Ningsih 2010) Serbuk kulit batang mahoni
Ekstraksi dengan air
Residu
Filtrat
Penguapan pelarut dengan penguap vakum putar
Ekstrak air kulit kayu mahoni
Lampiran 3 Penyiapan pakan kolesterol (Momuat et al. 2001 dengan modifikasi Mustika 2010) 90 kg Telur ayam direbus Diambil kuning telurnya (10.81 kg) dikeringkan dan dihaluskan Tepung kuning telur (kolesterol 1.5%)
Ditambahkan lemak kambing (1.5 kg) dan minyak curah (1.8 kg)
Ditambah pakan standar (15.89 kg)
Dijadikan pelet
Penentuan konsentrasi kolesterol tepung kuning telur
17
Lampiran 4 Penentuan waktu inkubasi 75 µl pyrogallol 10 mM
ditambah 2850 µl bufer fosfat 50 mM (pH 8.2) dan 75 µl larutan ekstraksi
Serapan diukur pada λ 340 nm setiap 10 detik selama 10 menit
Dibuat kurva hubungan antara absorbans dan waktu inkubasi
Ditentukan lama inkubasi berdasarkan grafik hubungan absorbans dan waktu inkubasi yang didapat
18
Lampiran 5 Preparasi sampel hati tikus Sebanyak 1.15 gram hati disimpan dalam 13 mL larutan ekstraksi
Dihomogenisasi menggunakan homogenizer manual
Kemudian homogenat disentrifugasi pada 9000 rpm menggunakan sentrifus Beckman J2-21 rotor JA 10 selama 10 menit pada suhu 4OC
Supernatan disimpan sebagai sampel untuk analisis aktivitas antioksidan superoksida dismutase
Lampiran 6 Analisis aktivitas antioksidan superoksida dismutase 75 µl pyrogallol 10 mM
Ditambahkan 2850 µl bufer fosfat 50 mM (pH 8.2)
Kemudian ditambahkan 75µl sampel homogenat Inkubasi (waktu inkubasi dilakukan berdasarkan hasil penentuan waktu inkubasi) Serapan diukur pada λ 340 nm
19
Lampiran 7 Data konsentrasi kolesterol darah tikus minggu ke-8 (Mustika 2010)
1 2 3 4 5 6 7 Rataan St.Dev
N 73.9 92.7 75.7 70.9 77 78.7 66.5 76.49 8.23
Kolesterol Darah Tikus (mg/dL) HK L E1 75.2 105.8 123.3 100.2 96.7 101 76.1 88.8 94 108.5 80.1 114.6 107.6 78.3 101.5 110.6 90.5 81.4 89.2 94.5 102.3 95.34 90.67 102.59 15.24 9.56 13.54
E2 101 74.8 80.5 100.6 84.9 89.2 88.5 10.66
Lampiran 8 Data konsentrasi lipid peroksida darah tikus minggu ke-8 (Utami 2010)
1 2 3 4 5 6 7 Rataan St.Dev
N 0.457 0.936 0.976 1.127 1.137 0.991 1.261 0.984 0.258
Lipid Peroksida Darah Tikus (nmol/mL) HK L E1 1.596 6.084 0.132 2.433 0.735 0.054 0.008 1.194 0.007 1.194 0.738 0.467 0.39 0.691 0.423 1.539 0.643 0.758 0.557 1.093 0.063 1.102 1.597 0.272 0.838 1.990 0.282
E2 0.132 0.49 0.507 1.026 0.457 0.758 0.562 0.303
Lampiran 9 Nilai absorbansi kontrol pengukuran aktivitas antioksidan SOD 01`11`10a 1 2 0.049 0.060 0.074 0.092 0.101 0.124 0.127 0.151 0.152 0.179 0.176 0.206 0.198 0.231 0.220 0.255 0.241 0.277 0.261 0.300 0.280 0.320 0.299 0.340 0.316 0.359 0.334 0.378 0.350 0.395 0.365 0.412 0.380 0.428 0.395 0.443
01`11`10b 1 2 0.059 0.079 0.090 0.110 0.120 0.140 0.148 0.168 0.176 0.195 0.201 0.221 0.225 0.244 0.249 0.268 0.270 0.291 0.291 0.312 0.312 0.332 0.330 0.351 0.348 0.368 0.365 0.386 0.381 0.402 0.398 0.418 0.413 0.433 0.427 0.448
02`11`10a 1 2 0.044 0.084 0.070 0.119 0.095 0.147 0.120 0.176 0.144 0.203 0.167 0.230 0.189 0.255 0.210 0.279 0.230 0.302 0.250 0.324 0.268 0.346 0.285 0.365 0.303 0.384 0.319 0.403 0.335 0.420 0.350 0.436 0.364 0.452 0.379 0.467
02`11`10b 1 2 0.055 0.049 0.088 0.081 0.117 0.114 0.147 0.143 0.175 0.171 0.201 0.198 0.226 0.225 0.250 0.250 0.273 0.273 0.294 0.296 0.315 0.317 0.335 0.337 0.354 0.355 0.372 0.373 0.390 0.389 0.405 0.405 0.422 0.421 0.436 0.436
03`11`10a 1 2 0.049 0.053 0.078 0.084 0.107 0.115 0.133 0.145 0.158 0.172 0.183 0.199 0.206 0.224 0.228 0.247 0.250 0.270 0.269 0.290 0.290 0.310 0.308 0.330 0.325 0.349 0.342 0.366 0.358 0.382 0.375 0.399 0.389 0.415 0.403 0.429
03`11`10b 1 2 0.078 0.039 0.110 0.062 0.140 0.085 0.167 0.109 0.195 0.130 0.221 0.150 0.245 0.170 0.269 0.190 0.292 0.208 0.313 0.226 0.334 0.243 0.352 0.259 0.371 0.275 0.389 0.290 0.405 0.304 0.421 0.319 0.437 0.333 0.450 0.347
04`11`10 1 2 0.032 0.055 0.053 0.083 0.075 0.110 0.096 0.136 0.116 0.162 0.136 0.186 0.155 0.210 0.174 0.232 0.192 0.254 0.209 0.274 0.226 0.294 0.242 0.313 0.257 0.332 0.272 0.348 0.287 0.366 0.300 0.380 0.314 0.396 0.328 0.411
180
0.409
0.457
0.443
0.463
0.392
0.482
0.451
0.451
0.418
0.445
0.464
0.360
0.340
0.426
0.429
190 200 210
0.422 0.435 0.448
0.472 0.486 0.499
0.454 0.468 0.480
0.477 0.490 0.503
0.405 0.418 0.431
0.497 0.511 0.525
0.466 0.478 0.492
0.466 0.477 0.490
0.431 0.443 0.455
0.457 0.470 0.483
0.479 0.491 0.503
0.372 0.384 0.395
0.352 0.365 0.376
0.440 0.452 0.465
0.442 0.455 0.468
Waktu (s) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170
Rerata Kontrol 0.056 0.085 0.114 0.140 0.166 0.191 0.215 0.237 0.259 0.279 0.299 0.318 0.335 0.353 0.369 0.385 0.400 0.414
20
Lanjutan Lampiran 9 Nilai absorbansi kontrol pengukuran aktivitas antioksidan SOD Waktu (s) 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400 410 420 430
01`11`10a 1 2 0.461 0.512 0.472 0.524 0.484 0.536 0.494 0.548 0.506 0.558 0.515 0.570 0.526 0.580 0.536 0.591 0.545 0.599 0.553 0.608 0.562 0.618 0.570 0.626 0.579 0.635 0.587 0.643 0.595 0.651 0.603 0.660 0.609 0.668 0.617 0.674 0.624 0.680 0.630 0.685 0.636 0.691 0.643 0.697
01`11`10b 1 2 0.492 0.515 0.503 0.526 0.514 0.538 0.525 0.547 0.535 0.557 0.545 0.566 0.555 0.577 0.567 0.584 0.581 0.592 0.592 0.601 0.600 0.607 0.610 0.616 0.617 0.624 0.625 0.631 0.631 0.637 0.639 0.646 0.645 0.651 0.651 0.659 0.657 0.665 0.662 0.670 0.665 0.677 0.669 0.683
02`11`10a 1 2 0.441 0.538 0.453 0.551 0.464 0.563 0.474 0.574 0.484 0.585 0.494 0.595 0.504 0.605 0.513 0.615 0.522 0.625 0.531 0.633 0.539 0.643 0.547 0.652 0.555 0.662 0.563 0.670 0.572 0.678 0.578 0.686 0.585 0.694 0.592 0.701 0.599 0.707 0.605 0.714 0.610 0.721 0.617 0.727
02`11`10b 1 2 0.505 0.502 0.516 0.513 0.528 0.523 0.538 0.535 0.547 0.545 0.559 0.556 0.569 0.566 0.578 0.575 0.588 0.584 0.596 0.592 0.605 0.600 0.614 0.608 0.622 0.616 0.630 0.623 0.638 0.631 0.646 0.637 0.653 0.644 0.658 0.651 0.664 0.657 0.669 0.663 0.674 0.669 0.680 0.674
03`11`10a 1 2 0.467 0.495 0.479 0.506 0.489 0.516 0.500 0.527 0.510 0.537 0.520 0.547 0.529 0.557 0.538 0.566 0.548 0.575 0.557 0.583 0.564 0.592 0.572 0.601 0.580 0.608 0.588 0.616 0.595 0.622 0.602 0.630 0.608 0.637 0.615 0.644 0.621 0.650 0.629 0.657 0.634 0.663 0.641 0.669
03`11`10b 1 2 0.515 0.408 0.526 0.418 0.537 0.429 0.547 0.439 0.557 0.449 0.566 0.459 0.575 0.468 0.583 0.477 0.593 0.486 0.602 0.495 0.611 0.504 0.618 0.511 0.626 0.519 0.634 0.526 0.639 0.534 0.645 0.541 0.650 0.549 0.658 0.555 0.663 0.561 0.670 0.568 0.676 0.575 0.682 0.581
04`11`10 1 2 0.387 0.477 0.398 0.489 0.409 0.501 0.418 0.511 0.428 0.522 0.438 0.533 0.448 0.543 0.456 0.552 0.466 0.561 0.473 0.570 0.483 0.578 0.491 0.588 0.499 0.596 0.506 0.604 0.514 0.613 0.521 0.619 0.528 0.627 0.535 0.634 0.542 0.641 0.548 0.647 0.555 0.655 0.561 0.661
Rerata Kontrol 0.480 0.491 0.502 0.513 0.523 0.533 0.543 0.552 0.562 0.570 0.579 0.587 0.596 0.603 0.611 0.618 0.625 0.632 0.638 0.644 0.650 0.656
21
Lanjutan Lampiran 9 Nilai absorbansi kontrol pengukuran aktivitas antioksidan SOD Waktu (s) 440 450 460 470 480 490 500 510 520 530 540 550 560 570 580 590 600
01`11`10a 1 2 0.648 0.703 0.655 0.708 0.661 0.713 0.666 0.717 0.671 0.724 0.677 0.729 0.683 0.735 0.687 0.740 0.693 0.744 0.697 0.749 0.701 0.753 0.706 0.759 0.710 0.763 0.715 0.766 0.719 0.771 0.722 0.775 0.726 0.780
Keterangan: 1`11`10a → 1`11`10 a b
01`11`10b 1 2 0.671 0.689 0.675 0.696 0.679 0.701 0.684 0.706 0.688 0.712 0.682 0.717 0.698 0.723 0.703 0.726 0.708 0.730 0.711 0.735 0.715 0.740 0.718 0.743 0.720 0.749 0.725 0.753 0.730 0.757 0.734 0.762 0.736 0.767
02`11`10a 1 2 0.623 0.732 0.629 0.739 0.635 0.743 0.640 0.751 0.646 0.755 0.651 0.760 0.656 0.766 0.661 0.770 0.665 0.776 0.671 0.782 0.675 0.785 0.680 0.791 0.685 0.794 0.688 0.799 0.691 0.802 0.696 0.806 0.701 0.809
02`11`10b 1 2 0.685 0.681 0.691 0.686 0.695 0.692 0.702 0.696 0.707 0.702 0.712 0.708 0.716 0.711 0.721 0.717 0.725 0.720 0.729 0.725 0.731 0.728 0.738 0.733 0.739 0.735 0.742 0.740 0.746 0.744 0.749 0.747 0.753 0.752
03`11`10a 1 2 0.646 0.674 0.651 0.680 0.657 0.684 0.662 0.689 0.667 0.694 0.672 0.698 0.677 0.702 0.682 0.707 0.687 0.711 0.691 0.715 0.695 0.720 0.699 0.724 0.704 0.728 0.707 0.733 0.712 0.736 0.715 0.741 0.717 0.745
03`11`10b 1 2 0.688 0.587 0.693 0.593 0.700 0.600 0.706 0.603 0.713 0.610 0.719 0.613 0.725 0.622 0.731 0.625 0.737 0.631 0.742 0.637 0.747 0.641 0.749 0.645 0.748 0.651 0.753 0.655 0.756 0.660 0.759 0.665 0.764 0.667
04`11`10 1 2 0.567 0.667 0.573 0.671 0.580 0.677 0.585 0.683 0.592 0.690 0.596 0.695 0.602 0.698 0.605 0.703 0.611 0.710 0.616 0.715 0.621 0.719 0.625 0.724 0.631 0.729 0.634 0.733 0.640 0.738 0.643 0.742 0.648 0.746
Rerata Kontrol 0.662 0.667 0.673 0.678 0.684 0.688 0.694 0.698 0.703 0.708 0.712 0.717 0.720 0.725 0.729 0.733 0.737
: tanggal pengukuran : pengukuran dilakukan pada pagi hari : pengukuran dilakukan pada siang hari
22
23
Lampiran 10 Penentuan waktu inkubasi berdasarkan nilai absorbansi kontrol
Absorbansi rerata kontrol (A)
Kurva hubungan antara waktu dan absorbansi 0.500
0.400 (180, 0.429) 0.300 0.200 R² = 0.988
0.100 0.000 0
50
100
150
200
Waktu (s)
Keterangan: Waktu inkubasi yang baik adalah saat kurva hubungan antara waktu dan absorbansi masih memiliki nilai r2>0,9 (masih linear). Sehingga ditentukan waktu inkubasi untuk pengukuran aktivitas SOD sampel hati tikus adalah selama 180 detik.
24
Lampiran 11 Data absorbansi pengukuran aktivitas antiksidan SOD sampel hati tikus dan contoh perhitungan Waktu (s)
Fresh
E2
0.158
4
0.018
0.185
14
0.024
0.193
19
0.021
0.157
20
0.018
0.130
25
0.040
0.318
36
0.025
0.190
6
0.029
0.233
1
0.026
0.173
23
0.030
0.224
24
0.017
0.159
30
0.025
0.163
31
0.024
0.201
32
0.021
0.186
11
0.032
0.192
15
0.017
0.133
17
0.023
0.163
26
0.021
0.222
28
0.032
0.202
33
0.035
0.334
35
0.038
0.230
5
0.029
0.190
9
0.021
0.197
29
0.019
0.118
12
0.040
0.296
13
0.030
0.262
16
0.024
0.200
18
0.021
0.211
1
0.035
0.242
7
0.035
0.322
8
0.017
0.114
27
0.018
0.162
22
0.023
0.183
34
0.031
0.250
F1
0.026
0.266
F2
0.022
0.330
F3
0.030
0.303
Kontrol 2 4 14 19 20 25 36
0.60 0.40 0.20 0.00 0
Absorbansi (A)
0.023
50
100 Waktu (s)
150
200
Kontrol 6 1 23 24 30 31 32
0.60 0.40 0.20 0.00 0
Absorbansi (A)
2
Absorbansi (A)
180
50
100 Waktu (s)
150
200
Kontrol 11 15 17 26 28 33 35
0.60 0.40 0.20 0.00
0
Absorbansi (A)
E1
Hiperkolesterolemia
Lovastatin
Normal
0
Absorbansi (A)
Kelompok
50
100 Waktu (s)
150
200
0.60 0.40 0.20 0.00 0
50
100 Waktu (s)
150
200
Kontrol 5 9 29 12 13 16 18
Kontrol 1 7 8 27 22 34
0.60 0.40 0.20 0.00 0
50
100 Waktu (s)
150
200
25
Lanjutan Lampiran 11 Data absorbansi pengukuran aktivitas antiksidan SOD sampel hati tikus dan contoh perhitungan Aktivitas antioksidan SOD dinyatakan dalam persentase hambatan terhadap pembentukan purupurogalin Contoh Perhitungan Aktivitas Antioksidan SOD Sampel Hati Normal 2:
26
Lampiran 12 Aktivitas antioksidan SOD hati tikus (ditunjukkan oleh hambatan terhadap proses autooksidasi pyrogallol) Klmpk
Nomor
Bobot hati
N
2 4 14 19 20 25 36 6 10 23 24 30 31 32 11 15 17 26 28 33 35 5 9 29 12 13 16 18 1 7 8 27 22 34 1 2 3
1.1670 1.1471 1.1564 1.1562 1.1566 1.1484 1.1544 1.1528 1.1531 1.1427 1.1534 1.1460 1.1500 1.1531 1.1559 1.1590 1.1470 1.1522 1.1523 1.1520 1.1494 1.1582 1.1473 1.1529 1.1569 1.1489 1.1600 1.1466 1.1506 1.1455 1.5960 1.1515 1.1559 1.1487 1.1539 1.1576 1.1553
L
HK
E1
E2
Fresh
Hambatan (%) 63.7653 55.1764 54.6396 63.4969 69.9387 25.3834 55.7132 45.2454 60.5445 47.9294 61.8865 62.9601 52.4923 55.7132 57.0552 68.8650 62.4233 46.0506 54.3712 48.4663 19.7469 56.7868 52.7607 73.4279 31.2883 37.7301 52.7607 49.0031 44.4402 22.9678 73.9647 61.3497 57.0552 63.7653 35.5828 17.3313 26.7255
Hambatan per gram (%) 54.6404 48.1008 47.2497 54.9186 60.4692 22.1033 48.2616 39.2483 52.5058 41.9440 53.6557 54.9390 45.6455 48.3160 49.3600 59.4176 54.4231 39.9676 47.1849 42.0714 17.1802 49.0302 45.9869 63.6898 27.0450 32.8402 45.4834 42.7377 38.6235 20.0505 46.3438 53.2781 49.3600 54.6404 30.8370 14.9717 23.1329
27
Lampiran 13 Hasil analisis statistik Hasil analisis statistik aktivitas antioksidan SOD sampel hati tikus kelompok perlakuan normal dengan sampel hati segar ANOVA Sum of Squares df Mean Square F Sig. Between Groups 1310.699 1 1310.699 10.03787 0.013229 Within Groups 1044.603 8 130.5754 Total 2355.301 9 Hasil analisis statistik aktivitas antioksidan SOD sampel hati tikus untuk semua kelompok perlakuan ANOVA Between Groups Within Groups Total
Sum of Squares 256.321 3813.626 4069.946
df 4 29 33
Mean Square 64.080 131.504
F .487
Sig. .745
Duncan Perlakuan
N
Subset for alpha = .05 1 E2 6 40.5899 E1 7 43.8305 L 7 44.2293 N 7 47.9634 HK 7 48.0363 Sig. .296 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a Uses Harmonic Mean Sample Size = 6.774. b The group sizes are unequal. The harmonic mean of the group sizes is used. Type I error levels are not guaranteed.
