Ekstraksi, Pemisahan Senyawa, dan Identifikasi ...
Mukhriani
EKSTRAKSI, PEMISAHAN SENYAWA, DAN IDENTIFIKASI SENYAWA AKTIF Mukhriani* * Program Studi Farmasi Fakultas Ilmu Kesehatan UIN Alauddin Makassar Abstrak Ekstraksi merupakan proses pemisahan bahan dari campurannya dengan menggunakan pelarut yang sesuai. Proses ekstraksi dihentikan ketika tercapai kesetimbangan antara konsentrasi senyawa dalam pelarut dengan konsentrasi dalam sel tanaman. Setelah proses ekstraksi, pelarut dipisahkan dari sampel dengan penyaringan. Ekstrak awal sulit dipisahkan melalui teknik pemisahan tunggal untuk mengisolasi senyawa tunggal. Oleh karena itu, ekstrak awal perlu dipisahkan ke dalam fraksi yang memiliki polaritas dan ukuran molekul yang sama. Identifikasi golongan senyawa dilakukan dengan uji warna, penentuan kelarutan, bilangan Rf dan ciri spectrum UV. Identifikasi yang paling penting dan digunakan secara luas ialah pengukuran spektrum serapan dengan menggunakan spektrofotometer. Kata Kunci : Ekstraksi, Identifikasi Senyawa dilakukan pengembangan obat tradisional
PENDAHULUAN
I
ndonesia negara terbesar
merupakan
satu
melalui penelitian-penelitian ilmiah terba-
hayati
ru dan diproduksi secara modern agar bisa
yang memiliki lebih dari
dimanfaatkan sebagai obat untuk kepent-
dengan
salah
kekayaan
30.000 spesies tanaman tingkat tinggi.
ingan
kesehatan
Hingga saat ini tercatat 7000 spesies tana-
masyarakat. Proses saintifikasi tersebut
man telah diketahui khasiatnya namun ku-
sangat penting agar penggunaan obat tradi-
rang dari 300 tanaman yang digunakan se-
sional tidak berdasarkan pengalaman saja
bagai bahan baku industri farmasi secara
tetapi memiliki bukti ilmiah sehingga bisa
reguler. WHO pada tahun 2008 mencatat
digunakan
bahwa 68% penduduk dunia masih meng-
kesehatan formal yang modern.
dalam
dan
kesejahteraan
sistem
pelayanan
gantungkan sistem pengobatan tradisional
Salah satu metode yang digunakan
yang mayoritas melibatkan tumbuhan un-
untuk penemuan obat tradisional adalah
tuk menyembuhkan penyakit dan lebih dari
metode
80% penduduk dunia menggunakan obat
ekstraksi tergantung pada sifat bahan dan
herbal untuk mendukung kesehatan mereka
senyawa yang akan diisolasi. Sebelum
(Saifuddin, dkk., 2011).
memilih suatu metode, target ekstraksi
Untuk mendukung hal tersebut maka
ekstraksi.
Pemilihan
metode
perlu ditentukan terlebih dahulu. Ada be-
361
Jurnal Kesehatan
Volume VII No. 2/2014
berapa target ekstraksi, diantaranya (Sarker
dapat digunakan adalah sebagai berikut :
SD, dkk., 2006):
Maserasi
1.
Senyawa
bioaktif
yang
tidak
Maserasi merupakan metode seder-
diketahui
hana yang paling banyak digunakan. Cara
Senyawa yang diketahui ada pada
ini sesuai, baik untuk skala kecil maupun
suatu organisme
skala industri.(Agoes,2007). Metode ini
Sekelompok senyawa dalam suatu
dilakukan dengan memasukkan serbuk
organisme yang berhubungan secara
tanaman dan pelarut yang sesuai ke dalam
struktural.
wadah inert yang tertutup rapat pada suhu
Semua senyawa metabolit sekunder
kamar. Proses ekstraksi dihentikan ketika
yang dihasilkan oleh suatu sumber tetapi
tercapai kesetimbangan antara konsentrasi
tidak dihasilkan oleh sumber lain dengan
senyawa dalam pelarut dengan konsentrasi
kontrol yang berbeda, misalnya dua jenis
dalam
dalam marga yang sama atau jenis yang
ekstraksi, pelarut dipisahkan dari sampel
sama tetapi berada dalam kondisi yang ber-
dengan penyaringan. Kerugian utama dari
beda.
metabolit
metode maserasi ini adalah memakan ban-
sekunder yang ada pada suatu organisme
yak waktu, pelarut yang digunakan cukup
untuk studi sidik jari kimiawi dan studi
banyak, dan besar kemungkinan beberapa
metabolomik.
senyawa hilang. Selain itu, beberapa sen-
2. 3.
Identifikasi
seluruh
sel
tanaman.
Setelah
proses
Proses ekstraksi khususnya untuk
yawa mungkin saja sulit diekstraksi pada
bahan yang berasal dari tumbuhan adalah
suhu kamar. Namun di sisi lain, metode
sebagai berikut :
maserasi dapat menghindari rusaknya sen-
1.
Pengelompokan bagian tumbuhan
yawa-senyawa yang bersifat termolabil.
(daun, bunga, dll), pengeringan dan
Ultrasound - Assisted Solvent Extraction
penggilingan bagian tumbuhan.
Merupakan metode maserasi yang
2.
Pemilihan pelarut
dimodifikasi dengan menggunakan bantu-
3.
Pelarut polar: air, etanol, metanol,
an ultrasound (sinyal dengan frekuensi
dan sebagainya.
tinggi, 20 kHz). Wadah yang berisi serbuk
4. 5.
Pelarut
semipolar:
etil
asetat,
sampel ditempatkan dalam wadah ultra-
diklorometan, dan sebagainya.
sonic dan ultrasound. Hal ini dilakukan
Pelarut nonpolar: n-heksan, petrole-
untuk memberikan tekanan mekanik pada
um eter, kloroform, dan sebagainya.
sel hingga menghasilkan rongga pada sampel. Kerusakan sel dapat menyebabkan
Ekstraksi Jenis-jenis metode ekstraksi yang
peningkatan kelarutan senyawa dalam pel362
Ekstraksi, Pemisahan Senyawa, dan Identifikasi ...
Mukhriani arut dan meningkatkan hasil ekstraksi.
Reflux dan Destilasi Uap
Perkolasi
Pada metode reflux, sampel di-
Pada metode perkolasi, serbuk sam-
masukkan bersama pelarut ke dalam labu
pel dibasahi secara perlahan dalam sebuah
yang dihubungkan dengan kondensor. Pel-
perkolator (wadah silinder yang dilengkapi
arut dipanaskan hingga mencapai titik did-
dengan kran pada bagian bawahnya). Pela-
ih. Uap terkondensasi dan kembali ke da-
rut ditambahkan pada bagian atas serbuk
lam labu.
sampel dan dibiarkan menetes perlahan
Destilasi uap memiliki proses yang
pada bagian bawah. Kelebihan dari metode
sama dan biasanya digunakan untuk
ini adalah sampel senantiasa dialiri oleh
mengekstraksi minyak esensial (campuran
pelarut baru. Sedangkan kerugiannya ada-
berbagai
lah jika sampel dalam perkolator tidak ho-
pemanasan, uap terkondensasi dan destilat
mogen maka pelarut akan sulit menjangkau
(terpisah sebagai 2 bagian yang tidak sal-
seluruh area. Selain itu, metode ini juga
ing bercampur) ditampung dalam wadah
membutuhkan banyak pelarut dan me-
yang terhubung dengan kondensor. Keru-
makan banyak waktu.
gian dari kedua metode ini adalah senyawa
Soxhlet
yang bersifat termolabil dapat terdegradasi
Metode
ini
dilakukan
dengan
senyawa
menguap).
Selama
(Seidel V 2006).
menempatkan serbuk sampel dalam sarung selulosa (dapat digunakan kertas saring)
Pemisahan Senyawa
dalam klonsong yang ditempatkan di atas
Kromatografi Lapis Tipis (Thin Layer
labu dan di bawah kondensor. Pelarut yang
Chromatography)
sesuai dimasukkan ke dalam labu dan suhu
Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
penangas diatur di bawah suhu reflux. Ke-
dan kromatograsi kolom pada prinsipnya
untungan dari metode ini adalah proses
sama. Apabila suatu cuplikan yang meru-
ektraksi yang kontinyu, sampel terekstraksi
pakan campuran dari beberapa komponen
oleh pelarut murni hasil kondensasi sehing-
yang diserap lemah oleh adsorben akan
ga tidak membutuhkan banyak pelarut dan
keluar lebih cepat bersama eluen, se-
tidak memakan banyak waktu. Kerugiann-
dangkan komponen yang diserap kuat akan
ya adalah senyawa yang bersifat termolabil
keluar lebih lama (Hostettman,1995). KLT
dapat terdegradasi karena ekstrak yang di-
merupakan suatu teknik pemisahan dengan
peroleh terus-menerus berada pada titik
menggunakan adsorben (fase stasioner)
didih.
berupa lapisan tipis seragam yang disalutkan pada permukaan bidang datar berupa 363
Jurnal Kesehatan
Volume VII No. 2/2014
lempeng kaca, pelat aluminium, atau pelat
9.
Tidak ada sumber listrik.
plastik. Pengembangan kromatografi ter-
KLT digunakan secara luas untuk
jadi ketika fase gerak tertapis melewati ad-
analisis solute-solute organic terutama da-
sorben (Deinstrop, Elke H,2007 ).
lam bidang biokimia, farmasi, klinis, fo-
1. 2. 3.
4.
5.
KLT dapat digunakan jika :
rensic,
Senyawa tidak menguap atau tingkat
dengan cara membandingkan nilai Rf solut
penguapannya rendah.
dengan nilai Rf senyawa baku atau untuk
Senyawa bersifat polar, semi polar,
analisis kualitatif (Gandjar IG., 2008).
non polar, atau ionik.
Penggunaan umum KLT adalah untuk
Sampel dalam jumlah banyak harus
menentukan banyaknya komponen dalam
dianalisis secara simultan, hemat
campuran, identifikasi senyawa, memantau
biaya, dan dalam jangka waktu ter-
berjalannya
tentu.
efektifitas pemurnian, menentukan kondisi
Sampel yang akan dianalisis akan
yang sesuai untuk kromatografi kolom,
merusak kolom pada Kromatografi
serta untuk memantau kromatografi ko-
Cair (KC) ataupun Kromatografi Gas
lom, melakukan screening sampel untuk
(KG).
obat (Gandjar IG, 2008).
Pelarut yang digunakan akan meng-
Flash
ganggu penjerap dalam kolom Kro-
(Sepacore®)
matografi Cair. 6.
7.
8.
baik
Flash
untuk
suatu
analisis
reaksi,
kualitatif
menentukan
Chromatography Chromatography
Column Column
Senyawa dalam sampel yang akan
dipopulerkan oleh Clark W. Still dari Uni-
dianalisis
dideteksi
versitas Columbia pada tahun 1978, se-
dengan metode KC ataupun KG atau
bagai alternatif lain dari kromatografi
memiliki tingkat kesulitan yang ting-
gravitasi yang lambat dan sering tidak
gi.
efisien. Flash chromatography berbeda
Setelah proses kromatografi, semua
dari teknik konvensional, yaitu partikel
komponen
perlu
silika gel yang digunakan sedikit lebih
dideteksi (berkaitan dengan nilai Rf).
kecil yaitu silica gel 60, 70-230 mesh (63-
Komponen dari suatu campuran dari
200 µm), aliran pelarut terbatas yang
suatu
dideteksi
disebabkan oleh partikel silika gel kecil,
terpisah setelah pemisahan atau akan
dan menggunakan tekanan gasnitrogen (ca.
dideteksi dengan berbagai metode
10-15 psi) untuk mendorong pelarut me-
secara bergantian (misalnya pada
lalui kolom dari fase diam. Hasil akhirnya
drug screening).
cepat dengan kromatografi yang beresolusi
tidak
dalam
senyawa
dapat
sampel
akan
364
Ekstraksi, Pemisahan Senyawa, dan Identifikasi ...
Mukhriani
tinggi. Sepacore® flash chromatography
yaitu kelarutan (hidrofilisitas atau hi-
menjawab keterbatasan dalam flash chro-
dofobisitas), sifat asam-basa, muatan, sta-
matography column dengan meningkatkan
bilitas, dan ukuran molekul. Sifat ekstrak
tekanan sampai dengan 10 bar/145 psi atau
juga dapat membantu dalam pemilihan
50 bar/725 psi. Sistem kromatografi ini
metode isolasi yang tepat. Misalnya, suatu
sepenuhnya otomatis termasuk deteksi UV,
ekstrak metanol atau fraksi dari suatu
kolektor fraksi dan perangkat lunak di an-
ekstrak mengandung senyawa polar lebih
tara banyak fitur dapat diatur sesuai
baik dilakukan reversed-phase HPLC (RP-
dengan kebutuhan spesifik pemisahan.
HPLC). Berbagai sifat fisika dari ekstrak
Flash chromatography merupakan sistem
juga dapat ditentukan dengan beberapa
pemisahan yang sangat populer sekarang
percobaan berikut (Sarker SD, dkk., 2006):
ini, karena sangat mudah untuk dilakukan,
Hidrofobisitas atau hidofilisitas. Sua-
fleksibel, dan dapat dikerjakan secara uni-
tu indikasi polaritas ekstrak sesuai dengan
versal (Talamona, 2005).
senyawa yang ada dalam ekstrak dapat
c.
dideterminasi dengan mengeringkan ali-
Fraksinasi
Ekstrak awal merupakan campuran
quot dari campuran dan mencoba melarut-
dari berbagai senyawa. Ekstrak awal sulit
kannya kembali dalam variasi pelarut pada
dipisahkan melalui teknik pemisahan tung-
beberapa tingkatan polaritas.
gal untuk mengisolasi senyawa tunggal.
Sifat asam-basa. Sifat ini membawa
Oleh karena itu, ekstrak awal perlu
partisi dalam pelarut air pada range pH,
dipisahkan ke dalam fraksi yang memiliki
khususnya 3, 7, dan 11 dapat membantu
polaritas dan ukuran molekul yang sama.
determinasi sifat asam-basa dari senyawa
Fraksinasi dapat dilakukan dengan metode
dalam ekstrak.
ektraksi cair-cair atau dengan kromatografi
Muatan. Informasi nilai muatan dari
cair vakum (KCV), kromatografi kolom
senyawa dapat diiperoleh dengan pen-
(KK),
size-exclution
gujian pada sejumlah kondisi, efek dari
(SEC),
solid-phase
chromatography extraction
(SPE)
penambahan beberapa penukar ion ke da-
( Sarker SD, dkk., 2006).
lam
Isolasi Senyawa
digunakan untuk merancang metode iso-
Faktor yang perlu diperhatikan sebe-
campuran.
Informasi
ini
dapat
lasi yang melibatkan kromatografi penukar
lum melakukan isolasi adalah sifat dari
ion.
senyawa target yang ada dalam ekstrak
Stabilitas terhadap panas. Tes stabili-
awal atau dalam fraksi. Sifat umum mole-
tas terhadap panas dilakukan dengan
kul yang dapat membantu proses isolasi
menginkubasi sampel pada suhu 90˚C 365
Jurnal Kesehatan
Volume VII No. 2/2014
selama 11 menit dalam penangas air diikuti
tidak
dengan pengujian terhadap senyawa yang
pembanding dapat dianggap sebagai bukti
tidak terpengaruh.
bahwa kedua senyawa itu sama. Spektrum
Ukuran.
senyawa
serapan ultraviolet-visibel tidak didasarkan
adanya
pada getaran atom dalam molekul akan
makromolekul seperti protein yang ada da-
tetapi pada kenyataannya elektron tertentu
lam ekstrak.
yang terikat longgar dapat ditingkatkan ke
1.
Droplet Countercurrent Chromatog-
arah energi yang lebih tinggi dengan
raphy (DCCC)
menyerap
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
gelombang tertentu.
2.
untuk
dialisis
dengan
dapat
digunakan
Tabung
diketahui
pengujian
(KCKT/HPLC) 3.
Hyphenated
Spektra
techniques
radiasi UV
dengan digunakan
panjang untuk
(HPLC-
mengetahui keberadaan ikatan rangkap
PDA, LC-MS, LC-NMR, LC-MS
terkonjugasi pendek misalnya aromatik
NMR)
dan panjang misalnya karotenoida. Spektra IR digunakan untuk mengetahui gugus
Metode Identifikasi Identifikasi golongan senyawa dapat
fungsi
dan
perkiraan
dilakukan dengan uji warna, penentuan
(Harborne, 1998).
kelarutan, bilangan Rf dan ciri spectrum
Spektrofotometer UV
jenis
senyawa
UV (Harborne, 1998). Identifikasi yang
Daerah pengukuran spektrofoto me-
paling penting dan digunakan secara luas
ter UV adalah pada panjang gelombang
ialah pengukuran spektrum serapan dengan
200-400 nm. Spektrum UV disebut juga
menggunakan
spektrofotometer.
spektrum elektronik karena terjadi sebagai
Pengukuran ini tidak merusak senyawa dan
hasil interaksi radiasi UV terhadap mole-
senyawa dapat dipakai lagi untuk uji-uji
kul yang mengakibatkan molekul tersebut
yang
gabungan
mengalami transisi elektronik. Apabila ra-
spektrofotometri
diasi elektromagnetik dikenakan pada sua-
lain.
kromatografi memungkinkan
Seringkali dan
fraksinasi
menjadi
tu molekul atau atom maka sebagian dari
sempurna terhadap campuran alami yang
radiasi tersebut diserap oleh molekul atau
sangat kecil jumlahnya dan identifikasi
atom tersebut sesuai dengan strukturnya
setiap komponennya secara pasti.
yang mempunyai gugus kromofor (Mulja,
Tiga jenis spektrum serapan telah
1990).
dikenal yaitu sinar tampak, ultraviolet dan inframerah.
Kesamaan
Spektrofotometer IR
spektrum
Radiasi infrared (IR) atau infrared
inframerah suatu senyawa murni yang
merupakan bagian dari spektrum elektro366
Ekstraksi, Pemisahan Senyawa, dan Identifikasi ...
Mukhriani
magnetik antara daerah gelombang cahaya tampak
dan
gelombang
Gandjar IG & Abdul R. 2008. Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta. Pustaka Pelajar. Hostettman, 1995.Cara Kromatografi Preparatif”Penggunaan pada Isolasi Senyawa Alam” ITB, Bandung Harborne JB. 1998. Phytochemical Methods: A guide to modern techniques of plant analysis 3rd Edition. Chapman and Hall, London. Saifuddin A, Rahayu, Yuda Hilwan. 2011. Standarisasi Bahan Obat Alam. Graha Ilmu. Yogyakarta. hal. 1-22. Seidel V. Initial and ulkextraction. In: Sarker SD, Latif Z & Gray Al, editors. Natural product Isolation, 2nd ed. Totowa ()Ney Jersey). Humana Press Inc. 2006. hal. 31-5 Sarker SD, Latif Z, & Gray AI. 2006. Natural products isolation. In: Sarker SD, Latif Z, & Gray AI, editors. Natural Products Isolation. 2nd ed. Totowa (New Jersey). Humana Press Inc. hal. 6-10, 18. Seidel V., 2006. Initial and bulk extraction. In: Sarker SD, Latif Z, & Gray AI, editors. Natural Products Isolation. 2nd ed. Totowa (New Jersey). Humana Press Inc. hal. 31-5. Silverstain,R.M., Webster,F.X., (1998), Spectrometric Identification Of Organic Compound, sixth edition, John Wiley & Sons,Inc,US, hal 71-74. Talamona A. 2005. Laboratory Chromatography Guide. Büchi Labortechnik AG.. Switzerland. hal 12. Mulja M. 1990. Aplikasi Spektrofotometer UV-VIS. Mecphiso. Surabaya. Hal 3.
mikrowafe.
Penggunaan terbesar terhadap kimia organik adalah pada panjang gelombang 4000400 cm-1. Frekuensi radiasi IR kurang dari 100 cm-1 diabsorbsi dan diubah oleh molekul organik menjadi energi rotasi molekul. Serapan ini diukur. Radiasi IR dalam daerah panjang gelombang 10000-100 cm-1 diabsorbsi dan diubah oleh sebuah molekul organik ke dalam energi vibrasi molekul. Serapan ini juga dihitung. Tapi, spektrum vibrasi muncul sebagai tanda lebih baik karena sebuah perubahan energi vibra tunggal diikuti oleh sejumlah perubahan energi rotasi. Absorbsi frekuensi atau panjang gelombang tergantung pada massa relatif atom, gaya konstan ikatan dan geometri atom. Posisi tanda dalam spektrum IR disajikan dalam jumlah gelombang yang memiliki satuan cm-1. Jenis ikatan yang dapat ditunjukkan pada daerah serapan 1300-800 cm-1 (C-C, C-O, C-N), 19001500 cm-1 (C═O, C═N, N═O), 2300-2000 cm-1 (C≡C, C≡N), dan 3000-2200 (C-H, OH, N-H) (Silverstain, 1998). DAFTAR PUSTAKA Agoes.G.2007. Teknologi Bahan Alam, ITB Press Bandung. Deinstrop, Elke. 2007. Applied Thin-Layer Chromatography. 2nd ed. Weinheim: Wiley-VCA hal. 1-2.
367
