Department of Food and Agricultural Products Processing Technology Faculty of Agricultural Technology Gadjah Mada University Jalan Flora No. 1, Sleman, Yogyakarta 55281 Indonesia
ELECTROPHORESIS ELECTROPHORESIS Yunika Mayangsari, S.Si., M. Biotech 2012
Warming up Elektroforesis adalah teknik pemisahan molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik. Prinsip kerja :
Na+Cl-
–
+
cathode
anode
Sifat partikel bermuatan Bergerak ke kutub yang berlawanan dengan muatannya (partikel/ion positif bergerak ke katoda dan sebaliknya) Perbedaan muatan dan ukuran partikel mengakibatkan laju bergerak berbeda terjadi pemisahan
Jenis elektroforesis Elektroforesis kertas dan Selulosa
Asetat
Elektroforesis Kertas dan Selulosa Asetat (lanj.) Prinsip kerja keduanya sama, perbedaan
pada media penyangga Berperan pada pemisahan protein atas dasarmobilitasnya pada pH tertentu Pada titik isoelektriknya, protein tidak akan bergerak dalam medan listriknya. Titik isoelektrik ??
Elektroforesis Kertas dan Selulosa Asetat (lanj.) Elektroforesis Kertas, menggunakan kertas saring sebagai medium penyangga, sesuai untuk latihan murah ; kelemahan : lama (running semalam) dan pemisahan kurang baik. Elektroforesis Selulosa Asetat, selulosa asetat sebagai medium penyangga, keuntungan: elusi lebih baik, shg pemisahan lebih baik, running lbh cepat dibanding kertas (1 jam).
Elektroforesis gel Matriks berupa polimer berpori Ukuran pori (konsentrasi materi
polimer) menentukan nilai koefisien gesekan (f) semakin besar prosentase gel semakin kecil ukuran pori Matriks yang biasa digunakan:
Poliakrilamida Agarose (polisakarida)
Struktur agarose dan poliakriamida
Aplikasi Elektroforesis Analisis protein (ukuran) SDS-
PAGE Analisis DNA (ukuran, sekuensing) Agarose
APPLICATION OF Electrophoresis Gel Separation of protein
mixture Separation of glycoprotein Lipids separation Nucleic acid (DNA, RNA) Enzymes mixture separation
10
Analisis protein (SDS-PAGE) Molekul Protein
• Muatan bervariasi • Muatan per massa bervariasi
Elektroforesis Gel Poliakrilamida Sodium Dodesil Sulfat (SDS – PAGE) Digunakan secara luas untuk analisis protein lebih menguntungkan dibanding kertas dan selulosa asetat pemisahan lebih baik Medium penyangga : hasil polimerisasi akrilamida dan bis-akrilamida, dengan katalis amonium persulfat (APS) dan tetrametilendiamin (TEMED) Pada sampel protein, ditambahkan SDS dan merkaptoetanol untuk merusak struktur 3 dimensi protein (remember: reduksi ikatan …?)
Elektroforesis Gel Poliakrilamida Sodium Dodesil Sulfat (SDS – PAGE) (lanj.) Pemisahan
molekul didasarkan pada perbedaan berat molekul. Konsentrasi akrilamid menentukan ukuran pori yang terbentuk, makin rendah konsentrasi akrilamid yang digunakan, makin besar ukuran pori gel, gel semakin lunak dan mudah rapuh.
Hubungan antara konsentrasi akrilamid dan pori-pori
(sumber : Kurniawati dan Wanandi, 2001) % Poliakrilamid
Ukuran pori (nm)
3
4.4
5
3.6
10
2.6
20
1.8
30
1.3
SDS (sodium dodesil sulfat) SDS berfungsi menghilangkan perbedaan muatan dan
perbedaan konformasi diantara protein-protein yang ada pada sampel, dengan cara memberikan muatan negatif. Pemanasan sampel dilakukan untuk tahap denaturasi protein. (remember biokimia dasar: denaturasi??) Kompleks SDS-polipeptida berbentuk seperti batang dan bermuatan negatif, muatan tidak dipengaruhi pH (kisaran pH 7-10) Sehingga, migrasi polopetida hanya berdasarkan berat molekulnya. Makin besar berat molekul, makin lambat migrasinya dalam gel elfo.
Sistem Buffer Buffer digunakan untuk menjaga kestabilan pH
medium pada elfo Pada umumnya inert, akan tetapi buffer tertentu, co: borat, dapat membentuk kompleks dengan medium seperti pati, sehingga tdk tepat digunakan untuk elfo Biasanya digunakan konsentrasi 0,05 – 0,10 M semakin besar molaritas , semakin tajam zona pemisahan yang dihasilkan, akan tetapi 1 µ = m c 2 waktu pemisahan lebih lama 2 Sodium phosphate buffer has higher ionic strength than tris-hydrochloride buffer µ = ionic strength ; m = molarity of an ion ; c = the charge carried by the ion
SDS-PAGE : Sistem Buffer Diskontinyu Sistem buffer yang umum digunakan pada
SDS-PAGE adalah sistem buffer Diskontinyu Sistem ini menggunakan ion buffer sample (Komposisi dan pH) yang berbeda dalam gel dengan larutan buffer elektroda. Keunggulan : pemisahan protein berlangsung lebih baik dan lebih tajam
Gel elektroforesis Gel yang digunakan dalam sistem ini terdiri atas gel penumpuk (Stacking gel) yang berpori besar dan Gel pemisah (separating gel/ resolving gel) yang berpori lebih kecil. Molekul sampel yang melewati gel penumpuk berada di atas gel pemisah dan sampel diletakkan di atas gel penumpuk. Sampel yang tertumpuk (stacked) pada gel penumpuk (pori besar), setelah dialirkan arus listrik maka molekul akan bergerak melewati pori-pori gel pemisah, dan terpisahkan berdasar BM.
Recipe for Discontinuous SDS PAGE (example) Stock solution
Stacking gel
Gel concentration, % 20.0
10.0
5.0
Reservoir buffer, ml
Acrylamide-bisacrylamide (30:0.8)
2.5
20.0
10.0
5.0
Stacking gel buffer stock
5.5
-
-
-
-
Resolving gel buffer stock
-
3.75
3.75
3.75
-
Reservoir buffer stock
-
-
-
-
100
10% SDS
-
0.3
0.3
0.3
-
1.5% ammonium persulfate
0.2
1.5
1.5
1.5
-
Water
11.3
4.45
14.45
19.45
900
TEMED
0.015
0.015
0.015
0.015
-
Stacking gel Resolving gel Resolving buffer 08.01.14
: 0.0125M Tris-HCl, pH 6.8 : 0.375M Tris-HCl, pH 8.8 : 0.025M Tris, 0.192M glicine, pH 8.3 suwedo hadiwiyoto : elektroforesis
19
Separating Gel Preparation Prepared all reagents needed Mix all except ammonium persulfate and
TEMED Degassed the solution under a vacuum to prevent air bubbles during polymerization Add ammonium persulfate and TEMED, soon the gel is ready to be polymerized Before the gel polimerizes, introduce solution into gel sandwich using pipet as soon as posible Stop when gel solution reach about 1.5 cm from top of front plate or 0.5 cm below level where teeth of comb will reach Gently layer about 1 cm of water on top of separating gel solution Allow gel to polymerize, 30-60 minutes 08.01.14
suwedo hadiwiyoto : elektroforesis
20
Stacking Gel Preparation Prepare all reagents need for stacking gel Pour off water covering separating gel Mix all reagents except ammonium persulfate
and TEMED Degassed the solution under a vacuum to prevent air bubbles during polymerization Add ammonium persulfate and TEMED, soon the gel is ready to be polymerized Before the gel polimerizes, pipet stacking gel solution onto separating gel until solution reaches top of front plate Carefully insert comb into gel sandwhich until bottom of teeth reach top of front plate
08.01.14
suwedo hadiwiyoto : elektroforesis
21
SAMPLE PROTEIN PREPARATION Sample must be protein isolate To prepare a sample protein : Extraction Determination of protein content Concentrating protein solution
Protein extraction : Samples may be taken from whole tissue or from cell culture. In most cases,
solid tissues are first broken down mechanically using a blender, homogenizer, or by sonication A combination of biochemical and mechanical techniques – including various types of filtration and centrifugation – can be used to separate different cell compartments and organelles
08.01.14
suwedo hadiwiyoto : elektroforesis
22
SAMPLE PROTEIN PREPARATION Determination of protein content : Absorbance at 280 nm (absolute method; rapid method) Bradford (biorad) assay : reaction of bradford reagent (serva
blue G) with protein gives a blue color which can be measured at 595 nm. The standar curve for the assay is bovin serum albumin (BSA) Lowry assay : reaction of lowry reagent (folin-ciocalteu phenol) with protein gives a blue color which can be measured at 750 nm. The standar curve for the assay is bovin serum albumin (BSA) Bicichoninic acid (BCA) assay : reaction of BCA and protein gives a blue color which can be measure at 562 nm. The standar curve for the assay is bovin serum albumin (BSA)
08.01.14
suwedo hadiwiyoto : elektroforesis
23
SAMPLE PROTEIN PREPARATION Concentrating sample protein : Using trichloro acetic acid (TCA)
Sample and TCA solution is mixed, incubated in ice for 30 minutes. The prcipitate protein is collected by centrifugation, washing with ethanol-ether (1:1) to remove TCA
Using organic solvent : acetone
Cold acetone is added to sample, mixed, and incubated at -20oC for 10 minutes. The precipitae protein is collected by centrifugation (10.000 x g for 5 minutes)
Polyethylene glycol (PEG) precipitation : solution of 50%
polyethylene glycol Ultrafiltration Lyophylization (freeze drying)
08.01.14
suwedo hadiwiyoto : elektroforesis
24
Loading sample The solution of proteins to be analyzed is
mixed with SDS, an anionic detergent which denatures secondary and non– disulfide–linked tertiary structures, and applies a negative charge to each protein in proportion to its mass. Heating the samples to at least 60oC shakes up the molecules, helping SDS to bind Spin down protein solution for 1 second Introduce sample solution into well using syring. Be careful to avoid introducing air bubbles as this allow some of sample to be carried to adjacent well
08.01.14
Note : A tracking dye may be added to the protein to allow the experimenter to track the progress of the protein solution through the gel during the electrophoretic run Precipitation of protein in sample buffer may be due to denatured protein, too litle SDS, too litle reducing agent, overlay acidic condision, or presence of pottasium which precipitates SDS
suwedo hadiwiyoto : elektroforesis
25
Running a gel Attached electrode plugs to
proper electrodes Turn on power supply and set the voltage to 200 V and tyhe ampere about 60-110 mA depend on gel thickness Turf off power supply Remove electrode plugs from electrodes Carefully remove a spacer
08.01.14
suwedo hadiwiyoto : elektroforesis
26
STAINING Protein : Coomassie blue R250 stain : coomassie blue R-250, methanol, glacial acetic
acid Silver stain : silver nitrate, NaOH, ammonium hydroxide, citric acid, formaldehyde
Glycoprotein: basic fuchin – sulfite stain Lipids : sudan black B. Staining is carried out before electrophoresis Nuclein acid : RNA with pyronine Y : pyronine Y, lanthanum acetate, acetic acid, methanol Native DNA with methylene green : methylene green, acetate buffer pH 4,1 Denatured DNA with pyronine B
08.01.14
suwedo hadiwiyoto : elektroforesis
27
Staining and destaining a gel with coomassie blue Pick up the gel and transfer it into a small
container containing coomasie stain solution Agitate for 5-20 minutes depend upon the gel thickness Cover container with lid or plastic wrap during staining and destaining Pour out stain and rinse the gel with water Add commasie destain and agitate overnight Rinse the gel with water
08.01.14
suwedo hadiwiyoto : elektroforesis
28
STAINING WITH COOMASSIE BLUE
08.01.14
suwedo hadiwiyoto : elektroforesis
STAINING WITH SILVER NITRATE
29
Gel elektoforesis
SEE YOU NEXT MEETING
IDENTIFICATION / INTERPRETATION Calculate retardation factor (Rf) of sample and standard If Rf sample and Rf standard is same then it can be assumed sample is same with standard
08.01.14
suwedo hadiwiyoto : elektroforesis
32
Gel Agarosa (Identifikasi DNA/RNA) Gel ini tersusun atas agarosa. Agarosa untuk kualifikasi fragmen-fragmen DNA
dengan rentang ukuran beberapa ratus hingga 20.000 kb. Agarosa tidak bersifat toksik, kompleks berupa bubuk yang terdiri dari campuran polimer dengan 2 unit dasar galaktosa, agarosa dan agaropektin.
Agarosa dilarutkan dalam cairan buffer mendidih dan
akan membentuk gel pada suhu sekitar 38 derajad C. Pada konsentrasi 1% w/v gel dalam bufer yang mengandung air dalam kadar tinggi, struktur seratnya baik, ukuran porinya besar dan tahan terhadap gesekan. Molekul DNA bermuatan negatif di dalam medan listrik dan molekul DNAbergerak melalui gel pada kecepatan yang berbeda bergantung pada ukurannya. Keuntungan : DNA dapat dideteksi
• DNA bermuatan negatif. • Jika diletakan pada medan listrik, DNA bergerak ke kutub positif (anode). • Gel agarose digunakan untuk memperlambat gerakan DNA dan terpisah berdasarkan ukurannya.
DNA
-
Power
+ • Gel agarose berpori-pori, DNA bergerak melewati Scanning Electron Micrograph of Agarose Gel (1×1 µm)
Seberapa cepat DNA migrasi? Kekuatan medan listrik, bufer, konsentrasi gel agarose ukuran DNA! *DNA berukuran kecil bergerak lebih cepat daripada DNA yg panjang elektroforesis memisahkan DNA berdasarkan ukurannya DNA
kecil besar
-
Power
+
Membuat Gel Agarose
Gel agarose dibuat dengan mendidihkan serbuk agarose dalam larutan bufer.
Bufer
Labu utk mendidihkan
Agarose
Electrophoresis Equipment Power supply
Tutup
Tangki Gel Kabel
Casting tray Sisir Gel
Gel casting tray & combs
Preparing the Casting Tray
Seal the edges of the casting tray and put in the combs. Place the casting tray on a level surface. None of the gel combs should be touching the surface of the casting tray.
Agarose
Larutan bufer
Campur serbuk agarose dan larutan bufer. Use a flask that is several times larger than the volume of buffer.
Membuat Gel Agarose
Agarose tidak larut pada suhu kamar (kiri). Larutan itu dididihkan sampai jernih (kanan).
Gently swirl the solution periodically when heating to allow all the grains of agarose to dissolve. ***Be careful when boiling - the agarose solution may become superheated and may boil violently if it has been heated too long in a microwave oven.
Menuangkan gel
Diamkan larutan agarose mendingin (~60ºC) dan kemudian tuangkan dalam cetakan. Jangan sampai ada gelembung udara.
Each of the gel combs should be submerged in the melted agarose solution.
Ketika dingin, agarose polimerisasi, membentuk gel yg fleksibel. Setelah dinging (30-45 minute) gel berwarna agak putih. Hati-hati copot sisir dan selotape.
Letakkan gel dalam alat elektroforesis.
DNA
buffer
wells
Cathode (negative)
Anode (positive)
Tuangkan bufer sehingga diatas gel +/- 1 mm. Cak setiap sumuran terisi bufer.
Preparasi Sample Campur sample DNA dengan bufer sampel. Ini memudahkan sampel masuk kedalam sumuran, karena adanya gliserol yg memperberat sampel.
6X Loading Buffer: • Bromophenol Blue (for color) • Glycerol (for weight)
Memasukkan sampel ke Gel
Carefully place the pipette tip over a well and gently expel the sample. The sample should sink into the well. Be careful not to puncture the gel with the pipette tip.
Running the Gel
Letakkan penutuo, hubungkan dengan kabel, hubungkan dengan power supply. Cek kabel terhubungkan dengan benar - DNA migrasi ke anode (merah). Jika dihidupkan, terbentuk gelembung pada elektrode
Cathode (-)
wells Bromophenol Blue
DNA (-) Gel Anode (+)
Setelah dihidupkan, cek bahwa warna bergerak pada arah yg benar. Bromophenol blue bergerak serah dg DNA.
Standar tangga DNA 12,000 bp 5,000
DNA migration Note: bromophenol blue migrasi = 300 bp DNA
bromophenol blue +
2,000 1,650 1,000 850 650 500 400 300 200 100
Inclusion of a DNA ladder (DNAs of know sizes) on the gel makes it easy to determine the sizes of unknown DNAs.
