60 Rev Biomed 1994; 5:60-69.
Identificación de protozoarios del género Leishmania con sondas biotinadas de kDNA en la Península de Yucatán, México.
José Pérez-Mutul, Luis Balam-Tzeek, Silvia Canto-Lara. Centro de Investigaciones Regionales “Dr. Hideyo Noguchi”, Universidad Autónoma de Yucatán. Mérida, Yucatán, México.
RESUMEN. Antecedentes.- Estudios epidemiológicos recientes han mostrado que la región selvática de la Península de Yucatán constituye una zona endémica importante de la Leishmaniasis cutánea, conocida como “úlcera del chiclero”. La identificación del parásito es importante para el diagnóstico y para evaluar el tratamiento de la enfermedad. Objetivo.- En el presente trabajo identificamos los parásitos aislados de enfermos con “úlcera del chiclero” procedentes de la Península empleando metodología de hibridación con sondas biotinadas de kDNA. Material y métodos.- Purificamos el DNA total de 134 cepas de parásitos de Leishmania aislados de sendos pacientes. Purificamos el kDNA de dos
cepas de referencia (OMS) y lo marcamos con la técnica de “nick translation”. Analizamos por hibridación en “dot blot” las 134 preparaciones de DNA con las sondas biotinadas. Revelamos los híbridos con el sistema estreptavidina/fosfatasa alcalina. Resultados.- Hemos identificado con esta metodología 3 aislados como Leishmania braziliensis (2.2%) y 131 como Leishmania mexicana (97.8%). Conclusiones.- Demostramos por primera vez la presencia de Leishmania braziliensis en la Península de Yucatán, México.
Palabras claves: Leishmania, hibridación, kDNA biotinado.
Solicitud de sobretiros: José Pérez-Mutul. Centro de Investigaciones Regionales “Dr. Hideyo Noguchi”. Universidad Autónoma de Yucatán. Av. Itzaes No. 490 x 59. C.P. 97000. Mérida, Yucatán, México. Fax: (99) 23-61-20. Recibido el 9/Feb./1994. Aceptado para publicación el 16/Mayo/1994.
Vol. 5/No. 2/Abril-Junio, 1994.
61 J Pérez-Mutul y cols. SUMMARY. IDENTIFICATION OF PROTOZOAN FROM THE GENUS LEISHMANIA BY BIOTINYLATED kDNA PROBES IN THE PENINSULA OF YUCATAN, MEXICO. Antecedents.- Recent epidemiological studies have shown that the sylvatic region of the Peninsula of Yucatan in Mexico is an important endemic area of cutaneous leishmaniasis, known as “chiclero’s ulcer”. Parasitological identification is essential for diagnosis and to establish appropiate treatment. Objective.- In this paper, we report the identification of the parasites isolated from patients with “chiclero’s ulcer” in the Yucatan, Mexico by using DNA hybridization techniques with biotinylated kDNA probes. Material and Methods.- All the DNA from 134 different strains of Leishmania was purified, kDNA of two reference strains was isolated and labeled by nick translation. We analysed the 134 DNA preparations by dot blot DNA hybridization with the biotinylated probes and identified the hybrids by streptavidin and a biotin-conjugated alkaline phosphatase. Results.- By using this methodology, we identified 3 strains of Leishmania braziliensis and 131 strains of Leishmania mexicana. Conclusions.- The presence of L. braziliensis has been demonstrated in the Peninsula of Yucatan, Key words: Leishmania, nucleic hybridization, biotinylated kDNA.
acids
INTRODUCCION. Los protozoarios del género Leishmania causan un amplio espectro de enfermedades en el hombre, las cuales varían desde la forma visceral hasta las formas cutánea y mucocutánea (1). Ciertas especies del parásito se han asociado con las Revista Biomédica
diferentes formas clínicas (2). Por ello, la patogenicidad, el tratamiento y los métodos para controlar la enfermedad en el humano están determinados, al menos en parte, por la especie de Leishmania infectante. En las zonas endémicas donde existen más de una especie patógena, la identificación temprana del parásito durante la infección es importante para el diagnóstico y para evaluar el tratamiento y el pronóstico de la enfermedad (3). Estudios clínicos y epidemiológicos recientes (4,5) han demostrado que la región selvática de la Península de Yucatán, México constituye una zona endémica importante de la leishmaniasis cutánea, conocida comúnmente como “úlcera del chiclero”. No existe al presente una identificación de los parásitos aislados a partir de los enfermos con leishmaniasis cutánea en la Península de Yucatán. El objetivo del presente trabajo fue identificar las especies de Leishmania aisladas de los enfermos empleando metodología de hibridación de ácidos nucleicos con sondas no radiactivas de kDNA.
MATERIAL Y METODOS. Reactivos y materiales.- Todas las enzimas utilizadas se obtuvieron de Bethesda Research Laboratories (USA): proteinasa K, DNA polimerasa I, deoxirribonucleasa I, ribonucleasa A, fosfatasa alcalina biotinada, estreptavidina. Todos los reactivos estándares de grado biología molecular se obtuvieron de Sigma Chemical Company (USA). El nucleótido biotinado Bio-11dUTP se obtuvo de Sigma Chemical Company (USA). La membrana de nitrocelulosa 0.45 um se obtuvo de Schleicher & Schuell (Alemania). Aislamiento del parásito.- Se aislaron a partir de las lesiones cutáneas de los enfermos, mediante aspiración con aguja de los bordes de la lesión. Los protozoarios obtenidos fueron cultivados en
62 Identificación de Leishmania. el medio modificado de Senekjie y mantenidos a 2 2 oC ( 6 ) . L a s c a r a c t e r í s t i c a s c l í n i c a s y epidemiológicas más relevantes de la mayor parte de estos enfermos serán presentadas en otra parte (Canto-Lara S et al., manuscrito sometido para publicación). Purificación de DNA total de los parásitos.Procedimos en cada caso de los 134 aislados de Leishmania con 6-10 ml de medio líquido del cultivo del parásito en fase estacionaria. El paquete celular se resuspendió en amortiguador Tris/C1 100 mM (pH 8), EDTA 100 mM, NaCl 50 mM. Se lisó con SDS al 1% y se digirió con proteinasa K a 100 µg/ml durante 2 horas a 37 oC. Se extrajo con un volumen igual de fenol saturado con Tris/ Cl (pH 8) y la fase acuosa de esta extracción se trató con un volumen igual de cloroformo/ isoamílico (24:1). La fase acuosa de esta última extracción se precipitó con dos volúmenes de etanol en presencia de acetato de sodio 0.3 M a -20 oC. El precipitado resuspendido que corresponde a ácidos nucleicos totales se digirió con RNAasa pancreática durante 1 hora a 37 oC. Se repitieron los procedimientos de extracción con fenol y cloroformo/isoamílico y de precipitación con etanol y acetato de sodio. El DNA total purificado se resuspendió en Tris/Cl 10 mM (pH 8), EDTA 1 mM. Cuantificamos las preparaciones de DNA purificado por espectrofotometría ultravioleta a 260 nm, teniendo en cuenta que una DO 260 de 1.0 corresponde aproximadamente a 50 µg/ml de DNA doble cadena en la muestra. Recuperación estimada de DNA total.- Para estimar la recuperación promedio de DNA total en función del número de células, contamos al microscopio en la cámara Neubauer el número de células de 5 cultivos diferentes del parásito. Purificamos el DNA de los 5 cultivos y relacionamos la cantidad total de DNA recuperado entre el número total de células de los cultivos. Preparación de las sondas moleculares.- Purificamos el DNA de kinetoplasto (kDNA) de dos cepas de referencia de la OMS: L. [L.] mexicana MHOM/BZ/82/Bel.21 y L.[V] braziliensis
MHOM/BR/84/LTB300. El aislamiento del kDNA se realizó esencialmente como se había descrito previamente (7). Marcaje de las sondas.- Utilizamos la técnica de “nick translation” (8) para marcar el kDNA purificado de las dos cepas de referencia de Leishmania, los cuales usamos como sondas moleculares de hibridación. Marcamos 1 ug de kDNA de cada cepa de referencia, utilizando 10 U de DNA Pol I y 1 ng de DNAasa I en presencia de los nucleótidos dATP, dCTP, dGTP y Bio-11dUTP a 25 uM cada uno. Se incubó la reacción durante 90 minutos a 15 oC. Análisis de hibridación en “dot blot”.- Las muestras de DNA de los parásitos se desnaturalizaron con NaOH 0.3 M durante 1 hora a 68 oC y se neutralizaron con Tris/Cl pH 7.5 y solución salina/ citrato (SSC). Las muestras desnaturalizadas y neutralizadas se depositaron en membranas de nitrocelulosa 0.45 µm, utilizando el dispositivo “Multiwell filtration minifold” (Schleicher & Schuell) y una bomba de vacío de baja presión. El DNA se inmovilizó durante 2 horas a 80 oC con vacío. Los procedimientos de prehibridación y de hibridación se realizaron de acuerdo con lo descrito (9). Sin embargo, las condiciones estándares de la hibridación y de los lavados posthibridación se modificaron para compensar la Tm más baja que resulta del uso de sondas biotinadas, como sigue: la concentración de formamida se redujo de 50% a 45%, se hibridó a 42 oC y se añadieron dos lavados finales con 0.16X SSC a 50 oC durante 15 minutos cada uno. Detección cromogénica del DNA biotinado.Se bloquearon sitios activos de la nitrocelulosa con BSA al 3% durante 1 hora a 42 o C. Las incubaciones con estreptavidina y fosfatasa alcalina biotinada se realizaron esencialmente de acuerdo con lo descrito por el proveedor (Bethesda Research Laboratories). La reacción con los sustratos cromogénicos NBT y BCIP se realizó a temperatura ambiente y en la obscuridad durante 3-4 horas. Vol. 5/No. 2/Abril-Junio, 1994.
63 J Pérez-Mutul y cols. RESULTADOS. En relación con el aislamiento de DNA total de los parásitos, el procedimiento de purificación nos permitió recuperar entre 20 y 100 µg de DNA total de cada aislado de Leishmania. La relación entre las lecturas espectrofotométricas 260/280 de cada muestra en ningún caso fue menor de 1.71.8, lo cual nos indica un grado aceptable de pureza del ácido mnucleico. La recuperación promedio de DNA total en función del número de células fue de 0.5 µg de DNA total por 10 6 células. Además, en experimentos preliminares de hibridación determinamos que utilizando DNA correspondiente a 10 7 células por “dot”, obtenemos una buena señal cromogénica al cabo de 3-4 horas de revelar el sistema estreptavidina/fosfatasa alcalina. Utilizamos por tanto en lo sucesivo, 5 µg de DNA total de cada aislado del parásito para analizar en experimentos de hibridación. En cuanto al marcaje de las sondas moleculares con la técnica de “nick translation”, en la figura 1, se muestran los resultados de cinética
del marcaje. Utilizamos 0, 20 pg, 60 pg y 100 pg de DNAasa I. Se tomaron alícuotas a los tiempos 0, 30, 60, 90 y 120 minutos de iniciada la reacción. En estos experimentos de cinética utilizamos 0.1 ug de kDNA y 1 U de DNA Pol I para cada una de las cantidades de DNAasa señaladas arriba. De estos experimentos determinamos que las condiciones óptimas para el marcaje de las sondas son 100 pg de DNAasa y 1 U de Pol I/0.1 ug de kDNA durante 90-120 minutos de reacción a 15 oC. Para los experimentos de hibridación en “dot blot”, marcamos 1 ug de kDNA de cada una de las cepas de referencia (L. mexicana y L. braziliensis) utilizando las cantidades proporcionales correspondientes de Pol I y DNAasa. En la figura 1 se muestra también una alícuota de este último marcaje con kDNA de L. mexicana, el cual utilizamos en los experimentos de hibridación. En la figura 2 se muestran los resultados de la hibridación de 55 aislados de Leishmania (1 al 55) con la sonda marcada de L. mexicana. Utilizamos 5 µg de DNA total de cada aislado. Después de haber desnaturalizado y neutralizado todas las
Figura 1.- Cinética del marcaje de kDNA con la técnica “nick translation”. Utilizamos 0.1 µg de kDNA de L. mexicana y 1 U de DNA Pol I para cada una de las cantidades de DNAasa probadas. Utilizamos 0, 20 pg, 60 pg y 100 pg de DNAasa I. El nucleótido biotinado (Bio-11-dUTP) se utilizó a concentración de 25 µM. Se incubó la reacción a 15 o C y se tomaron alícuotas a los tiempos 0, 30, 60, 90 y 120 minutos de iniciada la reacción. Se detuvo la actividad enzimática con EDTA. Las alícuotas se depositaron y se inmovilizaron en nitrocelulosa. Se reveló el kDNA biotinado con el sistema estrepatavidina/fosfatasa alcalina.
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64 Identificación de Leishmania. muestras de DNA, se depositaron y se inmovilizaron en nitrocelulosa. Se hibridó y se reveló con el sistema estreptavidina/fosfatasa alcalina. En la nitrocelulosa depositamos también DNA total correspondiente a las cepas de referencia L. mexicana, L. braziliensis y Trypanosoma cruzi como controles. Se observa que el kDNA biotinado de L. mexicana sólo hibridó con el DNA homólogo y no hibridó ni con L. braziliensis ni con T. cruzi. Además, de estos 55 aislados de Leishmania hubo 2 que no hibridaron con la sonda de L. mexicana. Los restantes son positivos con esta sonda. En la figura 3 se muestran los resultados de la hibridación de estos mismos 55 aislados de Leishmania, los cuales depositamos en réplica de la figura 2 pero analizados con la sonda marcada de L. braziliensis. Utilizamos la misma cantidad de DNA de cada aislado y procedimos igual que como se describió para la figura 2. Se observa que el kDNA biotinado de L. braziliensis sólo hibridó con el DNA homólogo y
no hibridó ni con L. mexicana ni con T. cruzi. De estos 55 aislados sólo 2 hibridaron con la sonda de L. braziliensis. Los restantes fueron negativos con esta sonda. Comparando las figuras 2 y 3 se advierte que los 2 aislados positivos con la sonda de L. braziliensis corresponden a los 2 aislados negativos con la sonda de L. mexicana. Viceversa, todos los aislados positivos con L. mexicana son negativos con la sonda de L. braziliensis. Así, hemos identificado de estos 55 aislados, 2 que corresponden a L. braziliensis y los restantes a L. mexicana. En la figura 4 se muestran los resultados de la hibridación de los aislados 56 al 111 con la sonda biotinada de L. mexicana. Utilizamos la misma cantidad de DNA de cada aislado así como de los controles incluidos. Por lo demás, procedimos como se describió anteriormente para las figuras 2 y 3. En la figura 5, analizamos estos aislados de Leishmania (56 al 111) que depositamos en réplica de la figura 4 pero hibridados con
Figura 2.- Análisis de hibridación de los aislados de Leishmania 1 al 55 con la sonda marcada de Leishmania mexicana. Utilizamos 5 µg de DNA total de cada aislado. Después de haber desnaturalizado y neutralizado todas las muestras de DNA, se depositaron y se inmovilizaron en nitrocelulosa. Se hibridó con el kDNA biotinado de L. mexicana y se reveló con el sistema estreptavidina/fosfatasa alcalina. En la nitrocelulosa depositamos también DNA total de las cepas de referencia L. mexicana, L. braziliensis y Trypanosoma cruzi como controles.
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65 J Pérez-Mutul y cols. la sonda biotinada de L. braziliensis. Comparando las figuras 4 y 5 se advierte que hubo 1 aislado negativo con la sonda de L. mexicana y que este aislado corresponde al aislado positivo con la sonda de L. braziliensis. Viceversa, todos los aislados positivos con L. mexicana fueron negativos con la sonda de L. braziliensis. Así, hemos identificado de estos 56 aislados, 1 que corresponde a L. braziliensis y los restantes a L. mexicana. En la figura 6 se muestran los resultados de la hibridación de los aislados 112 al 134 con la sonda biotinada de L. mexicana. La cantidad de DNA para los aislados y los controles y el procedimiento experimental se hizo de acuerdo con lo descrito anteriormente. Se observa que todos estos aislados son positivos con la sonda de L. mexicana. No se muestra la hibridación de estos aislados con la sonda de L. braziliensis cuyos resultados son negativos. Concluimos así que estos 23 aislados corresponden a L. mexicana.
DISCUSION. Se había descrito con anterioridad un método basado en análisis de hibridación de ácidos nucleicos para identificar especies de Leishmania en muestras biológicas (10). Esta técnica usa el DNA de kinetoplasto (kDNA) como sonda molecular de hibridación y es capaz de discriminar entre los complejos de Leishmania braziliensis y Leishmania mexicana, los principales agentes causales de leishmaniasis cutánea en el Nuevo Mundo. Esta metodología ha permitido identificar los parásitos en hamsters infectados (10), en pacientes humanos (11, 12) y en insectos vectores de la enfermedad (13). No existía previamente la identificación bioquímica o molecular de una muestra significativa de parásitos aislados de enfermos con leishmaniasis cutánea en la Península de Yucatán. Solamente se había descrito la identificación con anticuerpos monoclonales de dos aislados del pa-
Figura 3.- Análisis de hibridación de los aislados de Leishmania 1 al 55 con la sonda marcada de Leishmania braziliensis. Utilizamos 5 µg de DNA total de cada aislado así como de las cepas de referencia utilizadas como controles. Las muestras fueron depositadas en réplica de la figura 2. El procedimiento experimental se realizó de acuerdo con lo descrito.
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Figura 4.- Análisis de hibridación de los aislados de Leishmania 56 al 111 con la sonda biotinada de L. mexicana. Utilizamos la misma cantidad de DNA total de cada aislado así como de los controles incluidos (5 µg). Por lo demás, procedimos como se describió anteriormente.
Figura 5.- Análisis de hibridación de los aislados de Leishmania 56 al 111 con el kDNA biotinado de L. braziliensis. La cantidad de DNA total de cada aislado y de los controles probados fue la misma (5 µg). Las muestras fueron depositadas en réplica de la figura 4. El procedimiento experimental se realizó de acuerdo con lo descrito.
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Figura 6.- Análisis de hibridación de los aislados de Leishmania 112 al 134 con la sonda biotinada de L. mexicana. La cantidad de DNA total que utilizamos para los aislados y los controles fue la misma. El procedimiento experimental se realizó igual que como describimos anteriormente.
rásito de enfermos procedentes de la Península (14). Ambos aislados correspondieron a Leishmania mexicana. Nosotros mostramos aquí la identificación de 134 aislados diferentes de Leishmania correspondientes a enfermos con leishmaniasis cutánea de la Península de Yucatán. Hemos identificado las especies de estos parásitos aislados de los enfermos empleando metodología convencional para la purificación de DNA total de los parásitos y para el análisis de hibridación de ácidos nucleicos con sondas no radiactivas de kDNA (9,12). Hemos identificado 3 aislados pertenecientes a Leishmania braziliensis y los 131 restantes Revista Biomédica
pertenecientes a Leishmania mexicana. Demostramos por primera vez la presencia de Leishmania braziliensis en la Península de Yucatán. Hasta recientemente se asumía que la “úlcera del chiclero” en la Península era causada exclusivamente por Leishmania mexicana (15). Anteriormente se había demostrado la identificación de Leishmania braziliensis aislada de enfermos con “úlcera del chiclero” tanto en Belice (16) como en Guatemala (17), ambos países limítrofes con la Península de Yucatán. En México se había demostrado como hallazgo accidental la identificación de Leishmania braziliensis en un paciente con “úlcera del chiclero” procedente del Estado de Oaxaca (18). No sabemos por qué en nuestra región los casos de leishmaniasis cutánea asociada con Leishmania braziliensis sean muy escasos (3 de 134 aislados), a diferencia de lo que se presenta tanto en Belice (16) como en Guatemala (19). En estos países los enfermos con leishmaniasis cutánea causada por Leishmania braziliensis son mayoritarios en relación con los casos asociados a Leishmania mexicana. Finalmente, verificamos la utilidad de un método basado en hibridación de DNA con sondas no radiactivas para la identificación del parásito en los enfermos con “úlcera del chiclero”. Es importante distinguir la especie infectante de Leishmania en un paciente determinado para evaluar el tratamiento apropiado, ya que la impresión clínica es que las lesiones cutáneas no tratadas causadas por Leishmania braziliensis se resuelven más lentamente que las causadas por Leishmania mexicana (19).
AGRADECIMIENTOS. Agradecemos al personal encargado del cultivo de Leishmania en el Departamento de Inmunología del C.I.R. “Dr. Hideyo Noguchi” su ayuda valiosa en la manutención y crecimiento de todos los aislados del parásito de los enfermos y de las cepas de referencia de Leishmania. Agrade-
68 Identificación de Leishmania. cemos a la Q.F.B. Guadalupe García-Escalante y al Dr. John Ehrenberg-Enríquez la gentil provisión de un cultivo de Trypanosoma cruzi para la purificación de DNA. Este trabajo recibió apoyo financiero del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (México), Convenio CONACYT D113-904508 y del UNDP/ World Bank/WHO Special Programme for Research and Training in Tropical Diseases, Grant ID900248.
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