III. TEKNIK PEWARNAAN GRAM IDENTIFIKASI BAKTERI Tujuan: 1. Mempelajari cara menyiapkan olesan bakteri dengan baik sebagai prasyarat untuk memeplajari teknik pewarnaan 2. Mempelajari cara melakukan pewarnaan sederhana bakteri untuk mengamati bagian atau struktur bakteri 3. Mempelajari prosedur pewarnaan gram, memahami tahapan prosedur dan reaksi kimiawi yang terlibat dalam prosedur
Pendahuluan Bakteri berukuran sangat kecil dan tipisa sehingga sukar dilihat struktur tubuhnya walaupun dengan bantuan mikroskop. Untuk melihat morfologi bakteri secara lebih jelas dikembangkan teknik pewarnaan bakteri. Prinsip pewarnaan bakteri adalah pertukaran antara ion zat warna dengan ion protoplasma sel. Ada dua kelompok zat pewarna bakteri.(1) bersifat asam, berupa anion dan umum digunakan dalam bentuk garam natrium. (2) bersifat alkalis, berupa kation dan umum digunakan dalam bentuk klorida. Selain zat warna diperlukan zat tambahan yang berfungsi untuk mengendapkan hasil rekasi zat warna dengan komponen dinding sel bakteri. Zat tersebut dikenal dengan istilah zat pematek yang akan melekatkan zat warna pada plasma sel. Contoh zat pematek adalah: Amonium, fenol, Yodium, Asam tanat, Garam-garam Aluminium, Besi, Timah, Seng, Tembaga, Chrom, dll. Pematek dapat ditambahkan sebelum pewarnaan, ditambahkan ke dalam larutan zat warna atau saat diatara pewarnaan menggunakan dua zat warna. Umumnya larutan zat warna dibuat dalam konsentrasi kurang dari 1% untuk meningkatkan daya lekat warna pada dinding sel bakteri. Teknik pewarnaan bakteri dapat dibagi menjadi:
Pewarnaan sedehana atau tunggal, dengan menggunakan satu macam zat warna seperti: Metilen Blue, Karbol Violet dan Air Fucshin.
Pewarnaan diferensial dengan menggunakan dua atau lebih zat warna.
Prosedur 1. Pewarnaan Sederhana
Bersihkan kaca objek dengan alkohol sehingga bebas dari lemak. Kemudian panaskan diatas lampu spirtus.
Buat sediaan preparat dalam bentuk suspensi. Jika sampel berbentuk padat gunakan NaCl fisiologis untuk membuat suspensi.
Pijarkan ose lalu dinginkan. Celupkan ose ke dalam suspensi bakteri dan goreskan pada kaca objek. Jika bakteri yang akan diperiksa terdapat pada medium padat(media agar), maka teteskan NaCl Fisiologis terlebih dahulu pada kaca preparat kemudian goreskan bakteri tersebut dengan ose.
Keringkan preparat dengan mengangin-anginkan pada suhu ruang atau dekat hawa hangat api, kemudian lalukan preparat diatas api bunsen sebanyak 3 x.
Dinginkan preparat kemudian beri 5 tetes zat warna diatas suspensi yang telah mengering dan diamkan selama 1-2 menit.
Zat warna yang berlebih dituang dari preparat dan dicuci dengan air yang telah disediakan dalam botol semprot
Preparat dikeringkan dengan kertas saring atau dekat nyala api
Preparat kemudian ditetesi dengan sedikit minyak imersi pada bagian yang akan diamati
Hasil yang diamati dicatat dan digambar
Hasil pewarnaan:
Dengan air fucshin sel bakteri berwarna merah
Dengan kristal violet sel bakteri berwarna violet
Dengan biru metilen sel bakteri berwarna biru
Hasil pengamatan: 1.
Gambarkan bentuk sel bakteri yang saudara lihat
2.
Apa tujuan pemanasan diatas nyala api
2. Pewarnaan Diferensial Pewarnaan digunakan untuk mengetahui morfologi dan identifikasi jenis bakteri. Pewarna yang digunakan dua atau lebih. Contoh pewarnaan diferensial adalah pewarnaan Gram, pewarnaan Spora, pewarnaan kapsul, dll. Pewarnaan Gram Cara kerja
Siapkan preparat sampel dalam bentuk suspensi diatas kaca objek dan keringkan dengan mengangin-anginkan atau meletakkannya dekat api. Setelah itu lalukan di atas api sebnayak 3x.
Tetesi preparat tersebut dengan zat warna Karbol Gentian Violet. Diamkan selama 30 detik. Buang zat warna berlebih.
Tambahkan zat pematek Lugol (Iodium : Kalium Iodium : Aquades = 1 : 2 : 300), selama 30 detik. Kemudian cuci dengan air
Bilas preparat dengan alkohol 96% selama 2 detik hingga zat warna larut kemudian bilas dengan akuades.
Tetesi preparat dengan pewarna kedua. Diamkan selama 30 detik. Buang kelebihan zat warna. Bilas dengan akuades.
Keringkan preparat dan diatasnya diberi satu tetes minyak imersi untuk menghindarkan perbedaan indek bias. Amati di bawah mikroskop.
Catat hasil pengamatan.
Hasil : Bakteri gram positif berwarna ungu dan Bakteri negatif berwarna merah Beberapa perbedaan bakteri gram positif dan negatif
Bakteri gram positif
Mangandung Mg Ribonukleat
Sangat sensitif terhadap zat warna trifenilmetan
Sensitif terhadap penisilin
Tahan basa, tidak larut dalam KOH 1%
Kisaran isoelelektrik pH 2,5 – 4
Biasanya berbentuk kokus atau batang pembentuk spora kecuali Lactobacillus dan Cyanobacterium
Dapat bersifat tahan asam
Contoh :
Staphylococcus albus, Bacillus subtilis
Bakteri gram negatif
Tidak mengandung Mg ribonukleat
Kurang sensitif terhadap zat warna trifenilmetan
Sensitif terhadap streptomisin
Sensitive basa, larut dalam KOH 1%
Kisaran isoelektrik pH 4,5 – 5,5
Biasanya berbentuk batang non spora kecuali neisseria
Tidak tahan asam
Contoh :
Salmonella thypii Escericia coli
Pewarnaan Gram Hasil dan pengamatan 1.
Jelaskan bentuk sel, rangkaan dan warnanya
2.
klasifikasikan mikroorganisme tersebut berdasarkan reaksi gram
3.
apa keuntungan pewarnaan digerensial di bandingkan pewarnaan tunggal
3. Pewarnaan Negatif Pewarnaan ini bertujuan untuk mengetahui morfologi bakteri yang tidak dapat diwarnai dengan teknik sederhana. Sesuai namanya, yang diwarnai pada teknik ini adalah latar belakang suspensi preparat menggunakan tinta cina, sehingga mikroorganisme terlihat transparan diantara medan yang gelap. Tujuannya adalah melihat morfologi bakteri.
Cara kerja : 1. Sediakan dua buah kaca objek yang bersih dan bebas dari lemak 2. Teteskan setetes tinta cina pada salah satu ujung kaca objek 3. Letakkan suspensi bakteri di samping tinta cina dengan menggunakan kawat ose steril. 4. Dengan kaca objek yang kedua, kedua tetesan tersebut dicampurkan dan diratakan dengan posisi 45o terhadap kaca objek dibawahnya. Selanjutnya kaca objek tersebut didorong menuju ujung sebelahnya (diapus) sehingga membentuk sebuah lapisan film yang tipis 5. Keringkan kaca objek tersebut, amati dibawah mikroskop Hasil Pewarnaan Bakteri berupa bagian bening pada latar yang gelap a.
Bakteri kotoran gigi
b.
Menggunakan pewarna tinta cina
Pewarnaan Negatif Gambarkan hasil pengamatan saudara
