Isolasi bakteri patogen Escherichia coli O157:H7 pada

Majalah Farmasi Indonesia, 20(2), 73 – 76, 2009

Isolasi bakteri patogen Escherichia coli O157:H7 pada sampel seafood dan deteksi gena flich7 secara PCR Isolation of bacterial pathogen Escherichia coli o157:h7 in seafood samples and detection of flich7 gene by using PCR Marlina 1*), Elidahanum Husni 1 ,Fitri Amalinda 1, Son Radu 2 dan Mitsuaki Nishibuchi 3 1

) Fakultas Farmasi, Universitas Andalas, Padang, Indonesia ) Faculty of Food Science and Technology, Universiti Putra Malaysia, 43400, Selangor, Malaysia 3 ) Center for Southeast Asian Studies, Kyoto University, Kyoto 606-8501, Japan 2

Abstrak Escherichia coli O157:H7 adalah bakteri patogen pada manusia dan dapat menyebabkan haemorrhagic colitis, haemolytic uraemic syndrom dan thrombotic thrombocytopenic purpura. Telah dilakukan penelitian terhadap sampel P. pelagicus (rajungan) dan P. merguensis (udang putih) yang dibeli di pasar kota Padang dari September 2007 sampai Februari 2008. Untuk mengisolasi bakteri ini, digunakan medium pengaya mEC dan dilanjutkan dengan menanamnya pada media selektif CHROMAgar 0157 khusus untuk E.coli O157: H7. Hanya lima belas kultur positif mempunyai gena fliCH7 menggunakan metode PCR. Kata kunci: Escherichia coli O157:H7, CHROMAgar 0157, gena fliCH7, metode PCR.

Abstract Escherichia coli O157:H7 is an important human pathogen causing haemorrhagic colitis, haemolytic-uraemic syndrom and thrombotic thrombocytopenic purpura. In this study, P. pelagicus dan P. merguensis samples were collected from markets in Padang from Sept 2007 until Feb 2008. For isolation of the bacteria, samples were firstly enriched in mEC media, followed by plating onto CHROMAgar 0157 for E.coli O157:H7. Consequently, the suspected colonies were confirmed by polymerase chain reaction (PCR) assay using primers specific for O157:H7 to detect a fliCH7 gene. Only 15 of them confirmed as E. coli O157:H7 in PCR assay. Key words: Escherichia coli O157:H7, CHROMAgar 0157, fliCH7 gene, PCR.

Pendahuluan Escherichia coli O157:H7 adalah strain dari bakteri Enterohaemorrhagic Escherichia coli (EHEC) yang bersifat patogen pada manusia. Sifat patogen dari E. coli O157:H7 ini berasal dari toksin yang diproduksinya yaitu Shiga-like Toxin. Keracunan Shiga-like Toxin ini pada manusia dapat menimbulkan Haemorrhagic Colitis yang ditandai dengan diare berdarah dan Haemolytic Uraemic Syndrome (HUS) yaitu infeksi

Majalah Farmasi Indonesia, 20(2), 2009

pada saluran kencing (Jothikumar and Griffiths, 2002; Nakasone et al., 2005). Kasus infeksi E. coli O157:H7 banyak dilaporkan terjadi di Amerika Serikat dan Jepang. Di Amerika, E. coli O157:H7 menyebabkan lebih dari 73.000 orang terinfeksi setiap tahunnya. Sementara di Jepang tahun 1996 lebih dari 9000 orang terinfeksi dan lebih dari 10 orang meninggal dunia (Alam and Zurek, 2005). Kasus-kasus infeksi

73

Isolasi bakteri pathogen...........

ini terjadi akibat mengkonsumsi makanan yang tercemar E. coli O157:H7, makanan yang tidak matang, bahkan disajikan tanpa dimasak (Kumar et al., 2001; Priti, 2004). Sementara itu di Indonesia kasus infeksi oleh bakteri yang menyebabkan diare banyak sekali dilaporkan. Data statistika memperlihatkan terjadinya 300 kasus diare per 1000 penduduk Indonesia setiap tahunnya. (Suardana, 2005). Salah satunya adalah diare berdarah yang disebabkan oleh E. coli O157:H7. Namun, penelitian tentang agen pembawa bakteri ini seperti pada makanan atau minuman yang terkontaminasi masih sedikit dilaporkan (Priti, 2004). Pada penelitian ini dilakukan deteksi E. coli O157:H7 dengan menggunakan kombinasi metode Most Probable Number-Polymerase Chain Reaction (MPN-PCR). Kombinasi metode ini dapat digunakan untuk mengetahui jumlah koloni bakteri sekaligus pendeteksian secara spesifik terhadap gen E. coli O157:H7. Salah satu gen spesifik yang terdapat pada E. coli O157:H7 adalah gen fliCH7 (Wang et al., 2003). Metodologi Bahan dan Alat

Bahan-bahan yang diperlukan antara lain: Sampel berupa P. pelagicus dan P. merguensis, beberapa media percobaan seperti: CHROMagarTM O157, mEC Broth (Kyokuto®), Luria Burtani (LB) broth, Luria Burtani Agar (LBA). Bahan-bahan untuk pereaksi PCR antara lain: primer, taq polymerase, 5 x buffer PCR, MgCl2, 10 mM dan dNTP’s. Bahan untuk elektroforesa antara lain gel agarose, ethidium bromida dan 1 x buffer TBE. Alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: Mesin PCR (Eppendorf Mastercyclergradient®), tabung eppendorf 1,5; 0,5 dan 0,2 mL, cawan petri, pipet mikro (Eppendorf®), vortex (Mixer® VM-1000), sentrifugator (Eppendorf Minispin®), inkubator (Gallenkamp®), rotary shaker incubator (Bigger Bill Digital®), laminar air flow (ESCO®), autoklaf, perangkat elektroforesa dan coloni counter (Stuart scientific®). Isolasi bakteri E. coli O157:H7

Ditimbang sebanyak 10 g sampel yang telah dipotong-potong dan ditambahkan mEC broth hingga 100 mL. Pipet ke dalam 3 tabung eppendorf sebanyak 1 mL dan 100 µL pada media CHROMagar O157 dalam cawan petri. Lakukan sampai didapatkan 9 tabung eppendorf yang berisi 1 mL larutan sampel dalam 3 kali pengenceran dan

74

3 cawan petri yang berisi media CHROMagar O157 dengan 100 µL larutan sampel. Lalu diinkubasi pada suhu 37º C selama 24 jam. Biakan di dalam tabung eppendorf digunakan untuk ekstraksi DNA dan biakan yang di dalam media CHROMagar O157 yang memberikan warna ungu menandakan adanya E. coli O157:H7. Jumlah koloni bakteri tersebut dihitung dengan coloni counter. Deteksi gen fliCH7 E. coli O157:H7

Ekstraksi genom DNA dilakukan dengan metode Boil Cell Extraction (BCE). Supernatan yang diperoleh dipindahkan ke dalam tabung eppendorf baru untuk selanjutnya dilakukan proses reaksi dalam mesin PCR. Komponen yang digunakan dalam proses PCR adalah: primer untuk mendeteksi gen fliCH7, taq polymerase, 5 x buffer PCR, MgCl2, 10 mM dan dNTP’s. Primer yang digunakan untuk mendeteksi gena fliCH7 adalah: Primer 1 (fliCH7-F) : 5’GCGCTGTCGAGTTCTATCGAGC-3’ dan Primer 2 (fliCH7-R): 5’-CAACGGTGAC-TTTATCGCCATTC-3’.

Proses PCR dilakukan selama 35 siklus. Setelah perbanyakan DNA selesai, dilanjutkan dengan elektroforesa menggunakan gel agarose. Sebagai penenda digunakan ladder 100 basepairs. Gel kemudian diwarnai dengan etidium bromida dan hasil pemisahan gen diamati menggunakan alat foto Gel documentation dibawah lampu UV.

Hasil dan Pembahasan Hasil

Setelah dilakukan isolasi bakteri E. coli O157:H7 dari P. pelagicus dan P. merguensis, maka didapat isolat E. coli O157:H7 yang tumbuh pada medium CHROMagar O157 yang ditunjukkan oleh koloni berwarna ungu tunggal. Dari 6 sampel yang diisolasi dengan menggunakan metode MPN, dimana bakteri ditumbuhkan dalam mEC broth, diperoleh 18 kultur yang akan dideteksi gena fliCH7 dengan menggunakan metode PCR. Dari 18 kultur tersebut diperoleh 15 kultur (83,33 %) yang positif memiliki gena fliCH7, yaitu 8 kultur (44,44 %) dari P. pelagicus dan 7 kultur (38,33 %) dari P. merguensis. Dan jumlah koloni bakteri yang diperoleh dari sampel P. pelagicus adalah 460 MPN/g pada pengambilan I, pada pengambilan II sebanyak 150 MPN/g, dan pada pengambilan III sebanyak 15 MPN/g. Sedangkan jumlah koloni bakteri dari sampel P. merguensis pada pengambilan I adalah 15 MPN/g, pada pengambilan II sebanyak 28

Majalah Farmasi Indonesia, 20(2), 2009

Marlina

Gambar 1. Gen fliCH7 pada kultur E. coli O157:H7 pada gel agarose 1 % dari sampel Portunus pelagicus. MPN/g, dan pada pengambilan III sebanyak 3,0 MPN/g. Isolasi diawali dengan menanamkan sampel pada medium pengaya mEC broth. Sampel ditanam dalam suspensi 10 %. Sampel ini kemudian diencerkan dengan pengenceran 10-2 dan 10-3. Dari masing-masing pengenceran dipipet sebanyak 1 mL ke dalam 3 kelompok tabung MPN dan sebanyak 100 µL ditanam pada media CHROMagar O157. Dalam pembiakan bakteri digunakan mEC broth dan media CHROMagar O157, dimana mEC broth mengandung bile salts No. 3 yang dapat menekan pertumbuhan bakteri Gram positif sehingga E. coli O157:H7 dapat hidup dengan baik. CHROMagar O157 merupakan medium identifikasi yang sangat selektif yang hanya dapat mengidentifikasi bakteri E.coli O157 saja, mengandung campuran bahan kromogenik yang akan memberikan warna ungu untuk bakteri E. coli O157:H7. Selain itu penanaman pada media CHROMagar O157 bertujuan untuk mendapatkan koloni tunggal E. coli O157:H7. Dari hasil penelitian, keberadaan bakteri E.coli O157:H7 pada P. pelagicus dan P. merguensis ditemukan pada pengenceran 10-1 dari penanaman pada CHROMagar O157. Hasil ini cukup mengejutkan, karena bakteri E.coli O157:H7 ditemukan pada sampel bahan

Majalah Farmasi Indonesia, 20(2), 2009

makanan. Data ini sangat penting karena dalam keadaan mentah sampel ini telah terkontaminasi oleh bakteri patogen E.coli O157:H7. Untuk mengkonfirmasi keberadaan bakteri E.coli O157:H7 ini, dilanjutkan dengan pendeteksian gen fliCH7 yang terdapat pada bakteri ini. Dari hasil penelitian diperoleh Dari 18 kultur murni bakteri E. coli O157:H7 dari P. pelagicus dan P. merguensis yang diuji, terdapat 8 kultur (44,44 %) positif mengandung gen fliCH7 dari P. pelagicus dan 7 kultur (38,88 %) dari P. merguensis. Banyak nya kultur yang positif harus menjadi perhatian konsumen, karena jika bakteri E. coli O157:H7 ini mengkontaminasi makanan dan masuk kedalam tubuh, dia dapat menimbulkan infeksi seperti diare berdarah, infeksi pada saluran cerna (Haemorrhagic Colitis) dan Haemolytic Uraemic Syndrome. Kesimpulan Isolasi E. coli O157:H7 dari P. pelagicus dan P. merguensis pada CHROM agar O157 memberikan koloni yang berwarna ungu tunggal yang menggam-barkan adanya kontaminasi E. coli O157:H7 pada P. pelagicus dan P. merguensis. Sebanyak 15 kultur (83,33 %) dari 18 kultur E. coli O157:H7 dinyatakan positif memiliki gen fliCH7 yang diuji dengan metode MPN-PCR.

75

Isolasi bakteri pathogen...........

Daftar Pustaka Alam, M. J. and L. Zurek., 2005, “Association of Escherichia coli O157:H7 with Houseflies on A Cattle Farm”, Appl. Environ. Microbiol.,70(12). 7578-7580. Jothikumar, N. and. Griffiths, M. W, 2002, Rapid Detection of Escherichia coli O157:H7 with Multiplex Real-Time PCR Assays, Appl. Environ. Microbiol., 68(6). 3169-3171. Kumar, H. S., S. K. Otta, I. Karunasagar, 2001, Detection of Shiga-toxigenic Escherichia coli (STEC) in Fresh Seafood And Meat Marketed in Mangalore, India by PCR, Lett. In Appl. Microbiol., 33. 334-338. Nakasone, N., H. H. Tran, M. B. Nguyen, N. Higa, C. Toma, T. Song, Y. Ichinose, M. Iwangga, 2005, Short Report : Isolation of Escherichia coli O157:H7 From Fecal Samples of Cows In Vietnam, Am. J. Med. Hyg., 73(3). 586-587. Priti, R. A. L., 2004, Waspadai Serangan Bakteri E. coli O157:H7”, http://www.dkp.go.id/content.php. Suardana, I. W., 2005, Identifikasi Escherichia coli O157:H7 dan Shiga toxin Escherichia coli (STEC) Pada Feses Sapi, Daging Sapi, dan Feses Manusia Di Kabupaten Badung Propinsi Bali. Wang, L., D. Rothemund, H. Curd, P. R. Reeves, 2000, Sequence Diversity of the Escherichia coli H7 fliC Genes: Implication for DNA-Based Typing Scheme for E. coli O157:H7, J. of Clinical Microbiol.,38(5). 1786-1790. * Korespondensi : Marlina Fakultas Farmasi, Universitas Andalas, Padang Indonesia E-mail : [email protected]

76

Majalah Farmasi Indonesia, 20(2), 2009