ISOLASI DAN IDENTIFIKASI BAKTERI ENDOFIT

PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI BAKTERI ENDOFIT DALAM BATANG TANAMAN Artemisia Annua L. YANG DIUJI POTENSI ANTIBAKTERINYA TERHADAP Eschericia coli DAN Staphylococcus aureus

Skripsi Diajukan Untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi ( S. Farm. ) Program Studi Farmasi

Oleh : Antonius Alfian Yuan Dias Priharta NIM : 038114064

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2008


Skripsi

ISOLASI DAN II}ENTTFIKASI BAKTERI ENDOFTT DALAM BATANG TANAMAN ArtemisiaAnnuaL. YANG DIUJI POTENSI ANTIBAKTERINYA TERHADLP Eschericia co# DAN Staphylococcusaureils

Iliajukan Oleh : Antonius Alfian Yuan Dias Priharta NIM:038114064

Telahdisetujuioleh:

Pembimbing:

o{ t ^,s

',

i

I('

,'u!L--' MariaDwibudi Jumpowati,S.Si.

Tanggaf , ?1 ..fov.*.,.i..*g.o8 (,

III


Pengesahan Skripsi Berjudul: ISOLASI DA}{ IDENTIFIKASI BAKTERI ENIX}FTT DALAM BATANG TANAMAN Artemisis Anw* L YAITG DIUJI POTENSI ANTIBAKTEilNYA TERAD AP Exhefcia coli DAlt Staphytoeorussursus

OIetr AntoniusAlfian Yuan Dias Priharta NIM:038114S64

Dipertahankandi hadapanPanitiaPengujiSlripsi FakultasFarmasiUniversitasSanataDharma Padatanggal: 15 Januari3008

Mengetahui FakultasFarmasi Dharma

*r.rt.,urt. Pembimbing:

MariaDwi Budi Jumpowafi,S.Si. PanitiaPengr$i:

TandaTangan

1. Mari*Dwi Budi Jumpowati,S.Si.

0&v

44,,

2. Y*stina Sri Hartini,M.Si., Apt. 3. Igl Y" Kristio Budiasmoro,M.Si.

1Y

YTw r


Skripsi ini dipersembahkan untuk : Yesus Kristus Bapak Bernardinos Dias Sidharta Ibu Caecilia Enita Amarwati Crezensia Alfiora Dea Dema Dias Oktabenita Felisita Anesti Kusumastuti

Without Love, I’m Nothing . . . .

v


LEMBAR PER}IYATAA}{ PENSETilJUAI{ PUBLIKASI KARYA ILMIAH T]NTUKKEPEI{TINGAI\I AI{ADEMIS UniversiasSanataDharma: Yaagbertandatangandi bawahini, sayamahasiswa : AntoniusAlfian YuanDiashihffa Nomorlrdahasiswa : 038114064 ilmu pengetahuan, sayameilbtrikar ke,padaPerpustakaaa Deui pengembangan UniversitasSanahDharmakaryailmiah sayayangberjudtl : "ISOLASI DAN IDENTIFIKASI BAIffSRI ENDOFIT DAI,AM BATAFIG TANAMAN Artenisin an $til L. YAFIG IIIUJI POTENSI ANTIBAI(IERIIYYA TERIIADAP Escheria cotri DAF{ Str,phyloeweets asteuf besertaperangkatyangdiperlukan(bila ada).Dengandemikiansayamemkrikm k€padaPerpusakaanUniversitasSanataDharua bak unt* mcnyimparqmedalambsh* pang*alandata ngnlihkandalambentukmedialain, mengelolanya di Internetdau media s€caraterbatas,danmerrpublikasikannya memdisribusikan tain untr* kepentinganakademistanpaperlu memintaijin dari $lya malryut mcrrberikanrcyalti kepadasayaselamat€tapmencatrfimkmnamasayas*agai pmulis. Derrikianpsmyafaanini yangsayabuatdengrusebenarnya. Dibnatdi Yoryaka*a Padatanggal: 30 Jauuari2008

Yrnn Dias Priharta)


PRAKATA Puji dan syukur ke hadirat Tuhan Yesus Kristus yang telah melimpahkan berkat, kesabaran, kekuatan, dan karunia-Nya, sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini dengan baik. Skripsi yang penulis susun berjudul ISOLASI DAN IDENTIFIKASI BAKTERI ENDOFIT DALAM BATANG TANAMAN Artemisia Annua L. YANG DIUJI POTENSI ANTIBAKTERINYA TERHADAP Eschericia coli DAN Staphylococcus aureus. Skripsi ini disusun untuk memenuhi salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Farm) Program Studi Farmasi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Pada kesempatan ini tidak lupa penulis mengucapkan banyak terimakasih kepada : 1. Tuhan Yesus Kristus yang telah memberi rahmat dan berkat-Nya serta perlindungan dan bimbingan-Nya pada setiap umat-Nya. 2. Bapak, Ibu, dan adik Dhea atas doa, kasih sayang, perhatian, dan dukungannya baik moril maupun materiil yang selalu diberikan padaku. 3. Ibu Maria Dwi Budi Jumpowati, S.Si., selaku dosen pembimbing utama yang telah memberikan bimbingan, pengarahan, waktu, kesabaran, dan saran hingga skripsi ini dapat tersusun. 4. Ibu Yustina Sri Hartini, M.Si., Apt., selaku dosen penguji yang telah banyak memberikan saran dan masukan kepada penulis. 5. Bapak Ign. Y. Kristio Budiasmoro, M.Si., selaku dosen penguji yang telah banyak memberikan saran dan masukan kepada penulis. 6. Pihak BPTO Tawangmangu, terutama Bapak Agus. Terimakasih telah

vi


membantu dalam pengadaan dan determinasi tanaman Artemisia annua L. 7. Eyang Putri beserta keluarga besar di Klaten, terimakasih atas doa, perhatian, kasih sayang, nasehat, dan dukungan untukku. 8. Pakdhe dan Budhe beserta keluarga, terutama Budhe Erlin, terimakasih atas perhatian, nasehat, dan dukungan untukku. 9. Felisita, terimakasih untuk doa, perhatian, cinta, kesabaran, serta dukungan yang sangat berkesan untukku. 10. Pak Kartatmo, Pak Mukmin, Mas Narto selaku Staff Sekretariat Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, terimakasih telah membantu dalam memperlancar administrasi hingga tersusunnya skripsi ini. 11. Mas Sarwanto, Mas Sigit, Mas Wagiran selaku Laboran Laboratorium Biologi Farmasi, terimakasih atas semua bantuannya selama ini. 12. Teman-teman kelompok C 2003 : Anien, Siska, Eveline, Hartono, Komang, Indhu, Devi, Titien, Ratna, Yulia, Madya, Punto, Esti, Tata, Budi, Rosa, Vera, Ratih, dan Maria. Terimakasih atas kerjasama dan kebersamaannya selama ini. Che 03 Never Die... 13. Anak-anak kontrakan : Abang Aan, Hengky, Manto, Irwan, Ndaroe, Topan, dll. Thanks untuk kebersamaaannya. Keep the Spirit.. 14. Anak-anak No Label cabang Teknik Sipil Atma Jaya, thanks untuk kebersamaaannya. Tetap semangat mengejar wanita sampai Nirwana.. 15. Teman-teman KKN USD XXXIII Gantiwarno Kelompok 29 : Mbak Non (PBI), Valent (MIPA), Melinda (Psi), Sandra (S.Ing), Ika (P.Mat), Dika (IKOM), Punto (PBI), dan Bu Parlan selaku Ibu Pondokan, terimakasih atas

vii


bantuan, dukungan dan kebersamaannya selama ini. 16. Lukas Eko, teman skripsi Rosa, dan Bayu (PBI), terimakasih atas kerjasama, bantuan, dan kebersamaannya selama ini. 17. Yoyok, thanks telah membawakan tanaman Artemisia annua L. dari Tawangmangu sampai ke Jogja. 18. Teman-teman angkatan 2003 yang tidak mungkin saya sebutkan satu persatu, terimakasih atas kebersamaannya selama ini. 19. Semua pihak yang telah membantu dan mendukung penulis hingga tersusunnya skripsi ini. Penulis sangat menyadari bahwa dalam skripsi ini masih banyak terdapat kesalahan dan kekurangan, oleh karena itu saran dan kritik yang sifatnya membangun sangat penulis harapkan demi kesempurnaan penulisan ini. Akhirnya penulis berharap semoga skripsi ini bermanfaat bagi pengembangan ilmu farmasi pada khususnya dan kemajuan ilmu pengetahuan pada umumnya.

Yogyakarta, 21 November 2007 Hormat penulis

Antonius Alfian Yuan Dias Priharta

viii


PER}IYATAAH KEASLIAN PENELITIAI{

Sayamenyatakandengansesuagguhnya bahwa slcripsiyang sayaftrlis tm tidak memuatkarya atau bgian karya orang lain, kecuali yarrgtetah disebrskan dalamdaftarpustakasebgaimanalayaknyakaryailmiah.

Yogyakarfa,21 November2007

Antonius

tx

YuanDiasPrihsrra


INTISARI

Tanaman Artemisia annua L. merupakan tanaman yang digunakan sebagai obat anti malaria. Pada tanaman A.annua L ini diketahui ada mikrobia endofit yang membentuk koloni dalam jaringan pada daerah batang sampai akar (Simanjuntak dkk, 2004). Mikrobia endofit tumbuh di jaringan vaskular dari tanaman inangnya (Stone et al, 2000). Mikrobia endofit diketahui dapat memperbaiki pertumbuhan tanaman karena kemampuannya menekan pertumbuhan mikrobia-mikrobia patogen dengan cara kompetisi, menghasilkan senyawa antibiotik, atau menginduksi ketahanan tanaman (Pudaritadesantamaria, 2004). Tujuan penelitian ini adalah mengetahui adanya isolat bakteri endofit dalam batang tanaman A.annua L., menguji potensi antibakteri dari isolat bakteri endofit tersebut terhadap bakteri Eschericia coli dan Staphylococcus aureus serta mengetahui identitas bakteri endofit penghasil senyawa antibakteri tersebut. Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental murni dan bersifat eksploratif-deskriptif. Isolasi bakteri endofit dari batang tanaman A.annua L. dilakukan dengan metode streak plate, potensi antibakteri diuji dengan metode paper disc. Identifikasi bakteri endofit dilakukan dengan pengamatan morfologi koloni, morfologi sel, dan uji biokimia. Hasil dari penelitian ini adalah senyawa antibakteri yang dihasilkan bakteri endofit yang diisolasi dari tanaman A.annua L. mempunyai potensi antibakteri terhadap bakteri Eschericia coli dan Staphylococcus aureus, serta diketahui identitas bakteri endofit penghasil senyawa antibakteri tersebut adalah genus Amphibacillus.

Kata kunci :

Bakteri endofit, zona hambat, Artemisia annua L., Eschericia coli, Staphylococcus aureus, Amphibacillus.

x


ABSTRACT Artemisia annua. L. is a plant which is used as antimalaria. At this A.annua. L. is known that is endophytic mikrobia forming colony in tissue at stem area until root (Simanjuntak et al, 2004). Endophytic mikrobia grew in vascular tissue from the plant (Stone et al, 2000). Endophytic microbia can fix up the development of the plant because its ability to suppress the pathogenic development in survival way, producing antibiotic compounds, or inducting the vurnability of the plant (Pudaritadesantamaria, 2004). The purpose of this research was to find the endophytic bacteria isolate toward Eschericia coli and Staphylococcus aureus, and to find the identity of the endophytic bacteria which produced this antibacteria compounds. This result was pure experimental research and it was an explorative descriptive research. The endophytic bacteria isolation from A.annua. L.’s stem was used streak plate method, the antibacterial potential was tested using paper disc method. The identification of endophytic bacteria was using colony morphology observation, cell morphology, and biochemical test. The result of this research were an antibacterial compounds which was produced by endophytic bacteria was isolated from A.annua. L, had the potential antibacteria to E.coli and S.aureus, and it was known that the identity of the endophytic bacteria which produced this antibacteria compounds was Amphibacillus.

Key words :

endophytic bacteria, inhibition zone, Artemisia annua L., Eschericia coli, Staphylococcus aureus, Amphibacillus.

xi


DAFTAR ISI

Halaman Judul..................................................................................................... ii Halaman Persetujuan Pembimbing...................................................................... iii Halaman Pengesahan........................................................................................... iv Halaman Persembahan........................................................................................

v

Prakata................................................................................................................. vi Pernyataan Keaslian Karya................................................................................. ix Intisari.................................................................................................................

x

Abstract............................................................................................................... xi Daftar Isi............................................................................................................. xii Daftar Tabel....................................................................................................... xvi Daftar Gambar................................................................................................... xvii Daftar Lampiran................................................................................................ xviii BAB I. PENDAHULUAN A. Latar Belakang.................................................................................. 1 1. Permasalahan.............................................................................. 3 2. Keaslian Penelitian..................................................................... 3 3. Manfaat Penelitian...................................................................... 4 B. Tujuan Penelitian.............................................................................. 4 BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA A. Antibiotik......................................................................................... 5 B. Mikrobia Endofit............................................................................. 7

xii


C. Artemisia annua L. ......................................................................... 10 D. Rekombinasi Genetik..................................................................... 12 E. Bakteri Uji...................................................................................... 14 F. Metode Pengujian Potensi Senyawa Antimikrobia........................ 16 G. Identifikasi Mikrobia...................................................................... 18 H. Keterangan Empiris....................................................................... 21 BAB III. METODOLOGI PENELITIAN A. Jenis dan Rancangan Penelitian..................................................... 23 B. Variabel dan Definisi Operasional................................................. 23 C. Bahan dan Alat Penelitian.............................................................. 25 D. Tahapan Penelitian........................................................................ 28 1. Determinasi tanaman Artemisia annua L. ................................ 28 2. Pengumpulan batang Artemisia annua L. ................................. 28 3. Pembuatan MS Medium (Murashige-Shoog Medium).............. 28 4. Disinfeksi Batang Artemisia annua L. ..................................

31

5. Penanaman Batang Artemisia annua L. pada MS Medium...... 31 6. Isolasi

Bakteri

Endofit

dengan

Metode

Streak

Plate........................................................................................... 32 7. Pengujian Potensi Antibakteri dari Isolat Bakteri Endofit Terhadap

E.coli

dan

S.aureus

Secara

Difusi

Paper

disc............................................................................................. 32 8. Identifikasi Bakteri Endofit........................................................ 33

xiii


E. Analisis Hasil................................................................................. 40 BAB IV. HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN 1. Determinasi Tanaman Artemisia annua L. ................................... 43 2. Pengumpulan Batang Tanaman Artemisia annua L. ..................... 43 3. Pembuatan MS Medium (Murashige-Shoog Medium).................. 44 4. Disinfeksi Batang Tanaman Artemisia annua L. ......................

46

5. Penanaman Batang Artemisia annua L. pada MS Medium........... 47 6. Isolasi Bakteri Endofit dengan Metode Streak Plate..................... 49 7. Pengujian Potensi Antibakteri dari Senyawa Antibakteri yang Dihasilkan Isolat Bakteri Endofit kode B dan kode D Terhadap S.aureus dan E.coli Secara Difusi Paper disc............................... 52 8. Pengujian Potensi Antibakteri dari Senyawa Antibakteri yang Dihasilkan

Isolat

Bakteri

Endofit

dengan

Bakteri

Uji

S.aureus.......................................................................................... 54 9. Pengujian Potensi Antibakteri dari Senyawa Antibakteri yang Dihasilkan Isolat Bakteri Endofit dengan Bakteri Uji E.coli......... 59 10. Identifikasi Bakteri Endofit kode B dan Bakteri Endofit kode D...............................................................................

63

a. Pengamatan Morfologi Sel Isolat Bakteri Endofit kode B dan Bakteri Endofit kode D.............................................................. 64 b. Pengamatan Morfologi Koloni Isolat Bakteri Endofit kode B dan Bakteri Endofit kode D....................................................... 71 c. Uji Biokimia.............................................................................. 73

xiv


BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN A. Kesimpulan.................................................................................... 85 B. Saran.............................................................................................. 85 DAFTAR PUSTAKA........................................................................................ 86 LAMPIRAN...................................................................................................... 90 BIOGRAFI PENULIS....................................................................................... 102

xv


DAFTAR TABEL

Tabel I. Hasil

Pengukuran

Diameter

Zona

Hambat

dari

Senyawa

Antibakteri yang Dihasilkan Bakteri Endofit kode B Terhadap S.aureus dengan Waktu Inkubasi 24 Jam.......................................... 56 Tabel II. Hasil

Pengukuran

Diameter

Zona

Hambat

dari

Senyawa

Antibakteri yang Dihasilkan Bakteri Endofit kode D Terhadap S.aureus dengan Waktu Inkubasi 24 Jam.......................................... 57 Tabel III. Hasil

Pengukuran

Diameter

Zona

Hambat

dari

Senyawa

Antibakteri yang Dihasilkan Bakteri Endofit kode B Terhadap E.coli dengan Waktu Inkubasi 24 Jam .............................................. 60 Tabel IV. Hasil

Pengukuran

Diameter

Zona

Hambat

dari

Senyawa

Antibakteri yang Dihasilkan Bakteri Endofit kode D Terhadap E.coli dengan Waktu Inkubasi 24 Jam .............................................. 61 Tabel V. Hasil Uji Biokimia Bakteri Endofit kode B dan Bakteri Endofit kode D................................................................................................ 82 Tabel VI. Hasil Identifikasi Bakteri Endofit kode B, Bakteri Endofit kode D, dan Bakteri Genus Amphibacillus ..................................................

xvi

84


DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Skema Kerja Penelitian .................................................................. 42 Gambar 2. Hasil Pengujian Potensi Senyawa Antibakteri yang Dihasilkan Bakteri Endofit kode B Terhadap S.aureus dengan Waktu Inkubasi 24 Jam ............................................................................ 55 Gambar 3. Hasil Pengujian Potensi Senyawa Antibakteri yang Dihasilkan Bakteri Endofit kode D Terhadap S.aureus dengan Waktu Inkubasi 24 Jam ............................................................................ 57 Gambar 4. Hasil Pengujian Potensi Senyawa Antibakteri yang Dihasilkan Bakteri Endofit kode B Terhadap E.coli dengan Waktu Inkubasi 24 Jam ........................................................................................... 60 Gambar 5. Hasil Pengujian Potensi Senyawa Antibakteri yang Dihasilkan Bakteri Endofit kode D Terhadap E.coli dengan Waktu Inkubasi 24 Jam ........................................................................................... 61 Gambar 6. Pengecatan Gram Isolat Bakteri Endofit kode B .......................... 65 Gambar 7. Pengecatan Gram Isolat Bakteri Endofit kode D .......................... 66 Gambar 8. Pengecatan Spora Isolat Bakteri Endofit kode B .......................... 67 Gambar 9. Pengecatan Spora Isolat Bakteri Endofit kode D .......................... 68 Gambar 10. Pengecatan Acid Fast Isolat Bakteri Endofit kode B .................... 69 Gambar 11. Pengecatan Acid Fast Isolat Bakteri Endofit kode D .................... 70

xvii


DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Surat Keterangan Determinasi Tanaman A.annua L.................... 90 Lampiran 2. Tanaman A.annua L..................................................................... 92 Lampiran 3. Isolasi Bakteri Endofit pada MS Medium dengan Waktu Inkubasi 3 hari ............................................................................. 92 Lampiran 4. Isolasi Kembali Bakteri Endofit dengan Metode Streak Platting dengan Waktu Inkubasi 24 Jam ................................................... 93 Lampiran 5. Hasil Uji Motilitas Bakteri Endofit kode B dan Bakteri Endofit kode D pada Medium Semi Solid ................................................ 93 Lampiran 6. Hasil Uji Morfologi Koloni Bakteri Endofit kode B dan Bakteri Endofit kode D pada Nutrient Broth ............................................ 94 Lampiran 7. Hasil Uji Morfologi Koloni Bakteri Endofit kode B dan Bakteri Endofit kode D pada Nutrient Agar Tegak .................................. 94 Lampiran 8. Hasil Uji Morfologi Koloni Bakteri Endofit kode B dan Bakteri Endofit kode D pada Nutrien Agar Miring .................................. 95 Lampiran 9. Hasil Uji Asam sulfida (H2S) ....................................................... 95 Lampiran 10. Hasil Uji Dekarboksilasi Lisin ..................................................... 96 Lampiran 11. Hasil Uji Indol .............................................................................. 97 Lampiran 12. Hasil Uji Methylen Red (MR) ..................................................... 97 Lampiran 13. Hasil Uji Sitrat ............................................................................. 98 Lampiran 14. Hasil Uji Katalase ........................................................................ 99 Lampiran 15. Hasil Uji Oksidase ....................................................................... 99

xviii


Lampiran 16. Hasil Uji Gelatin .......................................................................... 100 Lampiran 17. Hasil Uji Oksidasi-Fermentasi (OF) tanpa Paraffin .................... 100 Lampiran 18. Hasil Uji Oksidasi-Fermentasi (OF) dengan Paraffin ................. 101

xix


BAB I PENDAHULUAN

A. Latar Belakang Antibiotik merupakan substansi yang dihasilkan oleh mikrobia yang dalam konsentrasi rendah mampu menghambat pertumbuhan atau membunuh mikrobia lain. Setiap antibiotika mempunyai aktivitas penghambatan hanya terhadap kelompok mikrobia tertentu yang disebut spektrum penghambatan (Suwandi, 1989) Pada tanaman A.annua L ini diketahui bahwa ada mikrobia endofit yang membentuk koloni dalam jaringan pada daerah batang sampai akar, dari hasil identifikasi diketahui bahwa mikrobia tersebut adalah Bacillus polymixa (Simanjuntak, Bustanusallam, Malini, Otovina, Rahayuningsih, & Said, 2004). Bacillus polymixa termasuk dalam genus Bacillus yang mempunyai ciri sel berbentuk batang, gram positif, fakultatif anaerob, membentuk endospora, motil, dan bersifat katalase positif (Holt, Krieg, Sneath, Staley, & Williams, 2000). Mikrobia endofit adalah mikrobia yang hidup di jaringan tanaman pada periode tertentu dan mampu hidup dengan membentuk koloni dalam jaringan tanaman tanpa membahayakan inangnya. Mikrobia endofit tumbuh di jaringan vaskular dari tanaman inangnya (Stone, Bacon, White, 2000). Setiap tanaman tingkat tinggi dapat mengandung beberapa mikrobia endofit. Mikrobia endofit tersebut mampu menghasilkan metabolit sekunder yang diduga sebagai transfer genetik (genetic recombination) dari tanaman inangnya ke dalam mikrobia endofit


2

(Tan & Zou, 2001). Kemampuan mikrobia endofit memproduksi metabolit sekunder yang sesuai dengan tanaman inangnya merupakan peluang yang sangat besar dan dapat diandalkan untuk memproduksi metabolit sekunder dari mikrobia endofit yang diisolasi dari tanaman inangnya tersebut (Radji, 2005). Bakteri endofit Bacillus polymixa hasil isolasi dari tanaman A.annua L., dapat memproduksi metabolit artemisinin yang sangat potensial sebagai anti malaria (Simanjuntak, dkk, 2004). Pada isolasi mikrobia endofit, diperlukan media yang dapat menyokong pertumbuhan tanaman inang bakteri endofit (Mucciarelli, Scannerini, Bertea, & Maffei, 2001). Media Murashige-Skoog (MS) merupakan media yang digunakan untuk hampir semua macam tanaman karena mengandung konsentrasi garamgaram mineral yang tinggi dan senyawa N dalam bentuk NO3- dan NH4+ (Hendaryono,1994). Staphylococcus aureus dapat menghemolisis darah dan mengkoagulasi plasma, juga menginfeksi bisul, impetigo, dan infeksi luka yang menimbulkan nanah. Eschericia coli dapat menyebabkan infeksi saluran kemih, terjadinya diare, sepsis, dan meningitis. (Jawetz, Melnick, & Adelberg, 1996). S.aureus (gram positif) dan E.coli (gram negatif) dipilih untuk mengetahui keefektifan potensi antibakteri dari senyawa yang dihasilkan oleh bakteri endofit terhadap bakteri gram positif dan gram negatif, sehingga dapat diketahui spektrum penghambatan dari senyawa antibakteri tersebut. Jan G. Bruhn dan Lars Bohlin pada tahun 1997 memperkenalkan molecular

pharmacognosy,

yang

mendifinisikan

pharmacognosy

sebagai


3

pengetahuan molekuler yang menyelidiki hubungan struktur dan aktifitas dari bahan-bahan alam dengan potensinya sebagai obat. Bahan-bahan alam yang berpotensi sebagai obat dapat menjadi model atau prekursor dalam penemuan obat baru (Samuelsson, 1999). Untuk memperoleh antibiotik baru perlu dilakukan pencarian sumber penghasil antibiotik (Suwandi, 1989). Oleh karena itu, eksplorasi mikrobia endofit potensial merupakan alternatif untuk mendapatkan senyawa antibiotik baru. (Simanjuntak, dkk, 2004). 1. Permasalahan Dari latar belakang yang telah diuraikan di atas, permasalahan yang muncul dalam penelitian ini adalah : a. Apakah bakteri endofit dapat diisolasi dari batang A.annua L. ? b. Apakah senyawa yang dihasilkan bakteri endofit yang diisolasi dari batang A.annua L. mempunyai potensi antibakteri terhadap E.coli dan S.aureus ? c. Bagaimana identitas bakteri endofit penghasil senyawa antibakteri terhadap E.coli dan S.aureus tersebut ? 2. Keaslian Penelitian Sejauh penelusuran pustaka dan jurnal belum pernah dilakukan penelitian tentang isolasi dan identifikasi bakteri endofit dari batang tanaman A.annua L. yang mempunyai potensi antibakteri terhadap E.coli dan S aureus. Penelitian isolasi dan identifikasi bakteri endofit dari batang tanaman A annua L yang mempunyai potensi antibakteri terhadap E.coli dan S.aureus dilakukan bersama dengan Rachmawati (2007). Perbedaan dari penelitian bersama ini adalah digunakan bakteri uji yang berbeda, di mana Rachmawati (2007)


4

menggunakan bakteri uji Bacillus subtilis dan Salmonella thypii. 3. Manfaat penelitian a. Manfaat teoritis Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi tentang senyawa yang dihasilkan bakteri endofit yang diisolasi dalam batang A.annua L. yang memiliki potensi antibakteri. b. Manfaat praktis Penelitian ini diharapkan dapat menemukan isolat bakteri endofit penghasil senyawa antibakteri yang dapat mendukung bidang kefarmasian dan mampu memberikan informasi tentang senyawa antibakteri yang dihasilkan oleh bakteri endofit sebagai model atau prekursor dalam rangka penemuan obat baru di masa yang akan datang. c. Manfaat metodologis Metode yang digunakan dalam penelitian ini dapat digunakan dan terus dikembangkan dalam usaha pencarian bakteri endofit penghasil senyawa antibakteri. B. Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan untuk: 1. Mengisolasi bakteri endofit dalam batang A.annua L. 2. Menguji potensi senyawa yang dihasilkan bakteri endofit yang diisolasi dari batang A.annua L. terhadap E.coli dan S.aureus. 3. Mengetahui identitas bakteri endofit penghasil senyawa antibakteri terhadap E.coli dan S.aureus tersebut.


BAB II PENELAAHAN PUSTAKA

A. Antibiotik Antibiotik didefinisikan sebagai produk metabolit yang dihasilkan oleh organisme tertentu, yang dalam konsentrasi rendah bersifat merusak atau menghambat mikrobia lain. Dengan kata lain, antibiotik merupakan zat kimia yang dihasilkan oleh suatu mikrobia yang dapat menghambat mikrobia lain (Pelczar & Chan, 1988) Antibiotik adalah zat-zat kimia yang dihasilkan oleh fungi dan bakteri, yang mempunyai khasiat mematikan atau menghambat pertumbuhan mikrobia, sedangkan toksisitasnya bagi manusia relatif kecil. Turunan zat tersebut yang dibuat secara semi-sintetis termasuk kelompok ini, begitu pula senyawa sintesis dengan khasiat antibakteri lazimnya disebut antibiotik (Pelczar & Chan, 1988). Terjadinya resistensi mikrobia yang tadinya peka terhadap antibiotika dapat terjadi melalui mutasi pada kromosomnya atau pertukaran materi genetik di antara mikrobia. Pertukaran materi kromosomal sangat jarang, yang banyak terjadi adalah pertukaran materi genetik ekstrakromosomal, baik berupa plasmid konjugatif ataupun plasmid non konjugatif. Secara biokimiawi, resistensi bakteri terhadap antibiotika dapat terjadi melalui mekanisme: (i). Berkurangnya permeabilitas mikrobia terhadap obat, (ii). inaktifasi antibiotika oleh enzim yang dihasilkan bakteri, (iii). modifikasi reseptor obat, (iv). meningkatnya sintesa senyawa yang antagonistik terhadap obat (Sjahrurachman, 1996)


6

Resistensi mikrobia terhadap antibiotika akibat perubahan permeabilitas dapat terjadi akibat perubahan pada reseptor obat, penurunan kapasitas transpor obat dan perubahan struktur dinding sel. Mekanisme ini merupakan mekanisme tersering dalam hal resistensi terhadap tetrasiklin dan sulfonamida. Resistensi bakteri karena modifikasi obat secara enzimatik banyak ditemukan terhadap antibiotika beta-laktam, kloramfenikol dan aminoglikosida. Enzim-enzim yang memodifikasi antibiotika tersebut dapat disandi oleh gen kromosom maupun gen ekstrakromosom, misalnya pada Staphylococcus yang resisten terhadap penisilin G, menghasilkan β laktamase yang merusak obat tersebut (Jawetz dkk, 1996). Resistensi bakteri terhadap antibiotika karena perubahan reseptor dapat ditemukan pada resistensi terhadap streptomisin. Telah diketahui bahwa pada bakteri yang resisten, ribosomnya berbeda dibandingkan dengan bakteri yang sensitif terhadap streptomisin. Hal ini disebabkan terjadinya mutasi noktah satu asam amino pada ribosom 30S. Dampak klinis resistensi tipe ini tidak begitu penting karena sifatnya tidak menyebar. Contoh lain resistensi jenis ini adalah resistensi terhadap penisilin pada bakteri Neisseria gonorrhoeae sebagai akibat perubahan pada penicillin binding protein (PBP) (Sjahrurachman, 1996). Bahan-bahan alam telah sejak lama digunakan untuk pengobatan. Bahan alam meliputi segala organisme seperti tanaman, hewan, dan mikroorganisme. Obat-obat modern yang digunakan pada masa kini sekitar 40 persennya berasal dari bahan-bahan alam. Obat-obatan dari bahan alam tersebut termasuk juga jenis obat-obat penting seperti glikosida jantung, morfin, dan antibiotik. Beberapa jenis antibiotik merupakan turunan dari bahan-bahan alam yang struktur kimianya telah


7

dimodifikasi untuk menghasilkan senyawa dengan efek farmakologis yang diinginkan (Samuelsson, 1999). B. Mikrobia Endofit Mikrobia endofit adalah mikrobia yang hidup di dalam jaringan tanaman pada periode tertentu dan mampu hidup dengan membentuk koloni dalam jaringan tanaman tanpa membahayakan inangnya (Radji, 2005). Mikrobia endofit tumbuh di jaringan vaskular dari tanaman inangnya (Stone et al, 2000). Jaringan vaskular (pembuluh) terdapat di seluruh tubuh tanaman, mengangkut zat-zat antara akar dan tunas (Campbell, Reece, Mitchell, 2002). Setiap tanaman tingkat tinggi dapat mengandung beberapa mikrobia endofit yang mampu menghasilkan senyawa biologi atau metabolit sekunder yang diduga sebagai akibat transfer genetik (genetic recombination) dari tanaman inangnya ke dalam mikrobia endofit (Tan & Zou, 2001). Kemampuan mikrobia endofit memproduksi senyawa metabolit sekunder sesuai dengan tanaman inangnya merupakan peluang yang sangat besar dan dapat diandalkan untuk memproduksi metabolit sekunder dari mikrobia endofit yang diisolasi dari tanaman inangnya tersebut (Radji, 2005). Dari sekitar 300.000 jenis tanaman yang tersebar di muka bumi ini, masing-masing tanaman mengandung satu atau lebih mikrobia endofit yang terdiri dari bakteri atau fungi (Strobel & Daisy, 2003). Sehingga apabila endofit yang diisolasi dari suatu tanaman obat dapat

menghasilkan metabolit sekunder sama dengan tanaman aslinya atau

bahkan dalam jumlah yang lebih tinggi, maka kita tidak perlu menebang tanaman


8

aslinya untuk diambil sebagai simplisia, yang kemungkinan memerlukan waktu yang relatif lama untuk dipanen (Radji, 2005). Mikrobia endofit

meningkatkan adaptasi ekologi inangnya dengan

menaikkan toleransi mereka pada “stress” lingkungan (lingkungan yang kurang menguntungkan) dan juga menaikkan resistensi inangnya terhadap fitopatogen dan atau herbivora termasuk serangga yang memakan tanaman inang. Mikrobia endofit juga dapat melindungi inangnya dari serangan bakteri atau fungi patogen dari lingkungan disekitarnya (Tan & Zou, 2001). Berbagai jenis mikrobia endofit telah berhasil diisolasi dari tanaman inangnya, dan telah berhasil dibiakkan dalam medium pembenihan yang sesuai. Demikian pula metabolit sekunder yang diproduksi oleh mikrobia endofit tersebut dapat diisolasi dan dimurnikan serta dielusidasi struktur molekulnya (Radji, 2005). Beberapa penelitian terkait dengan mikrobia endofit yang berpotensi sebagai antibiotik telah dilakukan. Cryptocandin adalah antifungi yang dihasilkan oleh mikrobia endofit Cryptosporiopsis quercina yang berhasil diisolasi dari tanaman obat Tripterigeum wilfordii, dan berkhasiat sebagai antifungi yang patogen terhadap manusia yaitu Candida albicans dan Trichopyton spp. (Strobel, Miller, Miller, Condron, Teplow, & Hess, 1999). Phomopsiahalasin merupakan metabolit yang diisolasi dari mikrobia endofit Phomopsis spp.berkhasiat sebagai antibakteri Bacillus subtilis, Salmonella enterica, Staphylococcus aureus, dan dapat juga menghambat pertumbuhan fungi Candida tropicalis (Horn, Simmonds, Schartz, & Blaney, 1995). Antibiotik berspektrum luas yang disebut munumbicin


9

dihasilkan oleh endofit Streptomyces spp. strain NRRL 30562 yang merupakan endofit yang diisolasi dari tanaman Kennedia nigriscans, dapat menghambat pertumbuhan

Bacillus

anthracis

dan

Mycobacterium

tuberculosis

yang

multiresisten terhadap berbagai obat anti TBC (Castillo et al, 2002). Ditinjau dari hubungan tersebut, mikrobia endofit berpotensi untuk digunakan pada pengobatan modern, pertanian, dan industri. Fungi dan bakteri adalah mikrobia yang paling umum membentuk koloni pada jaringan tanaman, yang selanjutnya disebut mikrobia endofit (Strobel & Daisy, 2003). Endofit umumnya tidak ditemukan pada organ yang spesifik tetapi kebanyakan spesies mikrobia endofit diisolasi dari batang dan juga dari daun (Anonim, 2005). Untuk mengidentifikasi suatu jenis mikrobia perlu dilakukan isolasi untuk memperoleh biakan murni. Menurut Pelczar & Chan (1986) setiap koloni yang berlainan mewakili macam mikrobia yang berbeda sehingga hal ini dapat digunakan untuk melakukan isolasi suatu mikrobia. Untuk mengisolasi mikrobia di bawah kondisi laboratorium perlu disediakan nutrien dan kondisi fisik yang akan memenuhi persyaratan tipe mikrobia tertentu yang sedang ditelaah. Sejalan dengan hal tersebut, berbagai macam medium digunakan di dalam mikrobiologi, dikombinasikan dengan berbagai kondisi fisik untuk inkubasi (Pelczar & Chan, 1986). Banyak prosedur untuk isolasi mikrobia endofit yang relatif mudah dan biasa digunakan oleh orang yang terlatih dalam dasar teknik mikrobiologi. Setiap tanaman tingkat tinggi dapat mengandung beberapa mikrobia endofit. Endofit tidak menunjukkan tanda- tanda keberadaan mereka sehingga sulit dideteksi dan


10

hanya dapat diteliti dengan menggoreskan secara hati- hati permukaan jaringan yang telah dibersihkan dengan etanol dan NaOCl (pemutih). Penambahan dan waktu untuk pencelupan dalam NaOCl beragam sesuai dengan jaringan dari inang (Anonim, 2005). Mikrobia endofit dapat diisolasi dari permukaan jaringan tanaman yang telah dibersihkan dan ditumbuhkan pada medium pertumbuhan yang sesuai. Pada isolasi mikrobia endofit, diperlukan medium yang dapat menyokong pertumbuhan tanaman inang bakteri endofit (Mucciarelli, Scannerini, Bertea, & Maffei, 2001). Medium Murashige-Skoog (MS) merupakan medium yang digunakan untuk hampir semua macam tanaman karena mengandung konsentrasi garam-garam mineral yang tinggi dan senyawa N dalam bentuk NO3- dan NH4+ (Hendaryono, 1994). Jaringan tanaman yang dikultur memerlukan unsur hara makro dan unsur hara mikro dari dalam medium tumbuh, dari dalam medium kultur juga harus ada bahan-bahan

lain

yang

berguna

untuk

merangsang pertumbuhan

serta

perkembangan sel jaringan yang dikulturkan. Pemisahan eksplan dari tanaman induk menyebabkan perubahan biosintesa dalam tanaman tersebut, sehingga pemberian unsur hara kedalam medium kultur untuk membantu eksplan supaya dapat tumbuh dan berkembang. Bahan-bahan itu adalah bahan organik yang meliputi karbohidrat, vitamin, asam amino, serta zat yang mengatur pertumbuhan (Katuuk, 1989) C. Artemisia annua L. Tanaman A.annua termasuk Familia Asteraceae ; Genus Artemisia ; Spesies Artemisia annua L. Mempunyai nama daerah : Anuma (Irian Jaya);


11

Anuma (Jawa) (Anonim, 1999) Tanaman A.annua L. merupakan terna semusim, tinggi 30–100 cm. Batang tegak, bulat persegi, berwarna hijau kecoklatan. Daun majemuk, bentuk oval, lonjong, panjang 10-18 cm, lebar 6-15 cm, ujung runcing, pangkal tumpul, anak daun bentuk oval, tepi bergerigi, pertulangan daun tegas, warna ungu kehijauan, hijau. Bunga majemuk, bentuk tandan, terletak di ujung batang, panjang mencapai 30 cm, kelopak hijau, bentuk bintang, berlekuk lima, mahkota halus mengelilingi cawan bunga tempat benang sari dan putik, diameter 2-3 mm, warna putih gading. Biji berbentuk lanset, kecil, berwarna coklat. Akar serabut, berwarna putih kekuningan. Bagian daun dari tanaman A.annua L. biasa digunakan sebagai obat demam (anti piretik) dan dapat juga digunakan sebagai obat anti malaria. Kandungan kimia dari tanaman A.annua L. yaitu saponin, flavonoida, polifenol, dan minyak atsiri (Anonim, 1999). A.annua L. adalah tumbuhan obat berupa perdu berasal dari Cina. Di Cina tumbuhan ini disebut qinghao. Di Amerika Serikat tumbuhan ini dikenal dengan nama sweet annie atau wormwood. Sejak zaman dulu, menurut catatan “Chinese Handbook of Prescriptions for Emergency Treatments,” yang dicetak tahun 340 sebelum Masehi, orang Cina menggunakannya untuk mengobati demam (Anonim, 2005). Minyak atsiri yang dihasilkan tanaman Artemisia annua L diketahui dapat menghambat dengan baik pertumbuhan bakteri Gram Positif Enterococcus. Kandungan minyak atsiri dari A.annua L meliputi camphor (44%), germacrene D (16%), trans-pinocarveol (11%), beta-selinene (9%), beta-caryophyllene (9%) and


12

artemisia ketone (3%) (Juteau, Masotti, Bessiere, Dherbomez, & Viano, 2002). Minyak tersebut merupakan metabolit sekunder yang kaya akan senyawa terpenoid. Contoh umum terpenoid adalah methanol, camphor (monoterpen), famesol, dan artemisinin (sesquiterpenoid). Artemisinin dan derivatifnya alphaarteether digunakan sebagai antimalaria. Terpen atau terpenoid aktif terhadap bakteri, fungi, virus, dan protozoa. Mekanisme kerja terpen belum diketahui dengan baik dan dispekulasi terlibat dalam perusakan membran sel oleh senyawa lipofilik (Anonim, 2005). Pada tanaman A.annua L ini diketahui bahwa ada mikrobia endofit yang membentuk koloni dalam jaringan pada daerah batang sampai akar, dari hasil identifikasi diketahui bahwa mikrobia tersebut adalah Bacillus polymixa (Simanjuntak dkk, 2004). Mikrobia endofit dapat memproduksi senyawa metabolit sekunder sesuai dengan tanaman inangnya. Dari hasil penelitian Simanjuntak (2004), diketahui bahwa mikrobia endofit (Bacillus polymixa) hasil isolasi dari tanaman A.annua L dapat memproduksi senyawa antimalaria artemisinin. D. Rekombinasi Genetik Setiap tanaman tingkat tinggi dapat mengandung beberapa mikrobia endofit yang mampu menghasilkan senyawa biologi atau metabolit sekunder yang diduga sebagai akibat terjadinya transfer genetik (genetic recombination) dari tanaman inangnya ke dalam mikrobia endofit (Tan & Zou, 2001). Transfer DNA atau perpindahan DNA ke dalam bakteri endofit dari tanaman Artemisia annua L. diduga melalui cara transformasi. Transformasi merupakan pengambilan DNA oleh bakteri dari lingkungan di sekelilingnya.


13

DNA yang berada di sekitar bakteri (DNA asing) dapat berupa potongan DNA atau fragmen DNA yang berasal dari sel bakteri lainnya atau organisme lainnya. DNA yang masuk ke dalam sel bakteri selanjutnya dapat berintegrasi dengan DNA bakteri sehingga terbentuk DNA rekombinan (Tjahjoleksono, 2005). Proses transfer genetik ini melibatkan juga enzim restriksi, enzim restriksi adalah enzim yang dapat memotong molekul DNA pada lokasi-lokasi spesifik yang jumlahnya terbatas, potongan molekul DNA ini disebut fragmen restriksi. Fragmen restriksi berupa fragmen DNA untai-ganda dengan sedikitnya satu ujung untai-tunggal, yang disebut ujung lengket (Campbell et al, 2002). Ujung lengket plasmid bakteri endofit akan berpasangan dengan ujung lengket yang berkomplementer dari fragmen DNA A.annua L sehingga didapatkan plasmid rekombinan. Sel bakteri endofit kemudian mengambil plasmid rekombinan dengan mekanisme transformasi. Transformasi merupakan pengambilan DNA oleh bakteri dari lingkungan di sekelilingnya. DNA yang berada di sekitar bakteri (DNA asing) dapat berupa potongan DNA atau fragmen DNA yang berasal dari sel bakteri lainnya atau organisme lainnya (Tjahjoleksono,2005). Menurut Radji (2005), kemampuan bakteri endofit dalam memproduksi senyawa metabolit sekunder yang sesuai dengan tanaman inangnya merupakan suatu koevolusi antara bakteri endofit dengan tanaman inangnya. Koevolusi adalah pengaruh mutual pada evolusi dari dua spesies berbeda yang berinteraksi satu sama lain dan yang secara timbal balik saling mempengaruhi adaptasi masing-masing (Campbell et al, 2002).


14

E . Bakteri Uji Pewarnaan Gram memilahkan bakteri menjadi kelompok Gram-positif dan Gram-negatif. Bakteri Gram-positif berwarna ungu karena tetap mengikat kompleks zat warna kristal violet-yodium meskipun

diberi larutan pemucat

(alkohol 95%). Bakteri Gram-negatif berwarna merah karena kompleks kristal violet-yodium larut sewaktu pemberian larutan pemucat, dan dapat diwarnai oleh cat lawan yang berwarna merah (Lay, 1994). Dalam penelitian ini, bakteri yang digunakan sebagai bakteri uji bersifat gram positif yaitu Staphylococcus aureus dan sebagai gram negatif adalah Eschericia coli. 1. Eschericia coli E.coli merupakan bakteri gram negatif yang berbentuk batang lurus, bergerak dengan flagel atau tidak dapat bergerak, mudah tumbuh dengan pembenihan sederhana. Pada pembiakan, E.coli membentuk koloni bulat konveks, halus, dan pinggir-pinggir nyata (Jawetz et al, 1986). E.coli termasuk dalam genus Eschericia, dengan ciri berukuran 1,1-1,5 μ m x 2,0-6,0 μ m, bersifat fakultatif anaerob, tumbuh dengan optimal pada suhu 370 C.

Memberikan reaksi negatif untuk tes oksidase, hidrolisis urea, tes H2S, dan tes sitrat, mereduksi nitrat, memberikan reaksi positif untuk tes katalase dan tes Methylen Red (Holt et al, 2000). E.coli adalah anggota flora usus normal, umumnya tidak menyebabkan penyakit bila masih dalam usus. E.coli dapat menyebabkan penyakit bila telah mencapai jaringan di luar tractus digestivus, seperti saluran kemih, saluran empedu, paru-paru, peritoneum, dan selaput otak (Jawetz et al, 1996).


15

E.coli adalah penyebab yang paling lazim dari infeksi saluran kemih dan merupakan penyebab infeksi saluran kemih pertama pada kira-kira 90% wanita muda. E.coli yang menyebabkan diare sangat sering ditemukan di seluruh dunia, dan diklasifikasikan oleh ciri khas sifat-sifat virulensinya (Jawetz et al, 1996). Bila pertahanan inang normal tidak mencukupi, E.coli dapat memasuki aliran darah dan menyebabkan sepsis. E.coli merupakan penyebab meningitis pada bayi, dan E.coli merupakan penyebab pada sekitar 40% kasus meningitis neonatal (Jawetz et al, 1996). 2. Staphylococcus aureus S.aureus adalah jenis bakteri yang berbentuk bulat, berdiameter kurang lebih 1 μ m, hidup bergerombol seperti buah anggur. Berdasar pengecatan gram, S.aureus termasuk gram positif yang ditunjukkan dengan warna ungu. S.aureus mempunyai ciri dapat memfermentasi manitol yang dapat memberikan warna kuning keemasan pada tes biokimiawi, memberi reaksi positif terhadap reaksi katalase dan koagulasi (Jawetz et al, 1996). S.aureus termasuk dalam genus Staphylococcus yang mempunyai ciri non motil, tidak mempunyai spora, dan bersifat fakultatif anaerob. Koloni dari Staphylococcus tidak tembus cahaya (opaque), berwarna putih atau krem, dan kadang berwarna kuning sampai orange, memberi reaksi negatif pada tes oksidasi, mereduksi nitrat menjadi nitrit. Staphylococcus sering ditemukan pada produk makanan, sampah, dan air (Holt et al, 2000). S.aureus sering menghemolisis darah dan mengkoagulasi plasma, densitas


16

kolonisasi antara lain pada kulit dan selaput lendir manusia, juga menginfeksi berupa bisul, impetigo, dan infeksi luka yang menimbulkan nanah (Jawetz et al, 1996). Pada suhu 300C pertumbuhannya sangat cepat, sedangkan pembentukan pigmen terbaik pada suhu 200C. Koloni pada pembenihan padat berbentuk bulat, halus, menonjol, dan berkilauan, membentuk pigmen warna kuning. S.aureus dapat menjadi resisten terhadap banyak zat antimikrobia dan menyebabkan masalah pengobatan menjadi sulit. Penanahan setempat adalah kekhususan infeksi S.aureus (Trihendrokesowo, 1986). F. Metode Pengujian Potensi Senyawa Antimikrobia Potensi antimikrobia dapat ditetapkan dengan berbagai cara antara lain : 1.

Metode Difusi Cara ini berdasarkan kemampuan obat untuk berdifusi dalam medium tempat mikrobia dapat berkembang biak secara optimal. Disk antibiotik diletakkan di atas agar atau bila dengan metode sumuran antibiotik dimasukkan dalam sumuran. Besarnya daerah difusi tergantung dengan daerah pertumbuhan atau hambatan mikrobia uji dan sebanding dengan kadar obat yang diberikan. Pada pelaksanaannya, metode difusi ada beberapa cara, yaitu: a.

Cara Kirby Bouwer Cara ini dilakukan dengan cara menggoreskan suspensi mikrobia tertentu, umumnya 106 Colony Forming Unit (CFU) per-ml pada permukaan medium hingga merata. Kertas disk yang mengandung


17

antibiotik diletakkan di atas medium lalu diinkubasikan pada suhu 37oC selama 18-24 jam, setelah itu dibaca hasilnya. Cara ini dikenal 2 macam zona, yaitu: 1).

Zona radikal adalah suatu daerah di sekitar disk yang sama sekali tidak ditemukan adanya pertumbuhan mikrobia.

2).

Zona irradikal adalah suatu daerah disekitar disk yang menunjukkan pertumbuhan mikrobia yang dihambat oleh antibiotik tersebut tetapi tidak dimatikan (Hugo & Russel, 1987; Anonim, 1986).

b.

Cara paper disc Cara ini adalah cara yang paling banyak digunakan untuk menentukan kepekaan mikrobia terhadap berbagai macam obat-obatan. Cara ini menggunakan cakram kertas saring atau tablet yang mengandung suatu obat dengan kekuatan tertentu yang diletakkan pada lempeng agar yang telah ditanami mikrobia yang akan diperiksa. Hambatan akan terlihat sebagai daerah yang tidak memperlihatkan adanya pertumbuhan mikrobia di sekitar cakram. Lebar hambatan ini tergantung pada daya resap obat ke dalam agar dan kepekaan mikrobia terhadap obat tersebut. Hasil dibaca setelah inkubasi selama 18-24 jam. Pada keadaan tertentu mungkin dapat dilakukan pembacaan pendahuluan setelah inkubasi selama 6-8 jam, untuk menguatkan kemudian diulang setelah 18-24 jam. Daerah hambatan diukur dalam satuan milimeter, dengan


18

mengukur seluruh garis tengah hambatan dan cakram (Bonang & Koeswardono, 1982). c.

Cara sumuran Penyiapan dilakukan seperti cara Kirby Bouwer. Setelah biakan siap, dibuat sumuran dengan diameter tertentu dan tegak lurus terhadap permukaan agar, ke dalam sumuran diteteskan larutan uji lalu diinkubasi selama 24 jam 37oC, setelah itu hasilnya dibaca seperti cara Kirby Bouwer (Hugo & Russel, 1987).

2.

Metode dilusi Metode ini menggunakan senyawa anti mikrobia dengan kadar menurun secara bertahap, baik dengan medium cair atau padat. Kemudian medium diinokulasikan mikrobia uji dan diinkubasi. Tahap akhir dilarutkan senyawa antimikrobia dengan kadar yang menghambat atau mematikan. Pada uji kepekaan cara dilusi agar memakan waktu dan penggunaannya dibatasi pada keadaan tertentu saja. Uji kepekaan cara dilusi cair dengan menggunakan tabung reaksi, tidak praktis dan jarang dipakai, namun kini ada cara yang sederhana dan banyak dipakai yakni menggunakan microdilution plate. Keuntungan mikrodilusi cair adalah bahwa uji ini memberi hasil kuantitatif yang menunjukkan jumlah antimikrobia yang dibutuhkan untuk mematikan mikrobia uji (Jawetz et al ,2001). G. Identifikasi Mikrobia Untuk identifikasi dan determinasi suatu biakan murni suatu mikrobia

hasil isolasi perlu ditentukan morfologi sel individual, morfologi koloni, dan sifat-


19

sifat biokimianya (fisiologi), patogenisitas dan serologinya (Jutono, Soedarsono, Hartadi, Kabirun, Suhadi & Soesanto,1980) Pada identifikasi mikrobia mula-mula diamati morfologi individual secara mikroskopik dan pertumbuhannya pada berbagai medium. Karena suatu bakteri tidak dapat dideterminasi hanya berdasar sifat-sifat morfologinya saja, maka perlu diteliti pula sifat-sifat biokimia dan faktor-faktor yang mempengaruhi pertumbuhannya. Mikrobia yang morfologinya sama mungkin berbeda dalam kebutuhan nutrisi serta persyaratan ekologi lainnya (temperatur, pH, dan sebagainya). Patogenesis mikrobia patogen dapat dipakai untuk membantu identifikasi dan determinasi bakteri tersebut. Apabila suatu bakteri memiliki sifat yang hampir sama (terutama yang patogen), maka perlu diselidiki sifat ekologinya (Jutono dkk,1980). Untuk determinasi bakteri digunakan buku panduan baku determinasi oleh Holt et al (2000), yang memuat sifat-sifat bakteri yang telah dikenal. 1. Sifat Morfologi a.

Morfologi sel individual, meliputi : 1) Ukuran, bentuk, dan rangkaian sel. 2) Ada tidaknya spora dan kedudukan spora. 3) Ada tidaknya flagella, kedudukan dan jumlah flagella. 4) Ada tidaknya kapsula. 5) Reaksi- reaksi pengecatan.

b.

Morfologi koloni, meliputi : pertumbuhan, bentuk, ukuran, tekstur, bau, konsistensi, kilat dan ciri- ciri optik dari isolat koloni bakteri pada


20

beberapa tipe medium yaitu medium agar miring, tegak dan cair. Pada medium agar miring koloni bakteri diinokulasikan sepanjang agar secara goresan dengan ose, pada medium agar tegak koloni bakteri diinokulasikan secara tusukan, dan pada medium cair koloni bekteri diinokulasikan langsung pada medium (Jutono dkk, 1980). 2. Sifat Biokimia Pengujian sifat biokimia meliputi : a.

Pembentukan asam sulfida (H2S) Uji ini bertujuan untuk menunjukkan adanya pembentukan H2S pada medium TSIA (Triple Sugar Iron Agar) (Jutono dkk, 1980).

b.

Dekarboksilase lisin Uji

ini

bertujuan

menunjukkan

kemampuan

bakteri

dalam

mendekarboksilasi berbagai asam amino (Lay, 1994). c.

Pembentukan Indol Uji pembentukan Indol menunjukkan adanya indol dan triptofan (Jutono dkk, 1980).

d.

Uji Methylen Red (MR) Uji Methylen Red digunakan untuk menentukan adanya fermentasi asam campuran (Lay, 1994).

e.

Uji Sitrat Uji sitrat digunakan untuk melihat mikrobia menggunakan sitrat sebagai satu- satunya sumber karbon dan energi. Digunakan medium Simmonsitrat berupa medium padat (Lay, 1994).


f.

21

Uji katalase Katalase adalah enzim yang mengkatalisasikan penguraian hidrogen peroksida ( H2O2 ) menjadi air dan O2. Pada bakteri yang bersifat katalase-positif terlihat pembentukan gelembung udara sekitar koloni (Lay, 1994)

g.

Tes oksidase Uji ini berfungsi untuk menentukan adanya oksidase sitokrom yang ditemukan pada mikrobia tertentu (Lay, 1994).

h.

Uji pencairan gelatin Gelatin adalah protein yang diperoleh dari tulang, tulang rawan atau tenunan ikat hewani lainnya. Hidrolisis gelatin oleh mikrobia tersebut dikatalisis oleh eksoenzim yang disebut gelatinase. Gelatin yang dicerna tidak mampu membentuk gel dan bersifat cair (Lay, 1994).

i.

Uji oksidasi fermentasi (OF) Uji ini bertujuan untuk menentukan kemampuan mikrobia untuk memetabolisme karbohidrat secara oksidasi atau fermentasi (Lay, 1994). H. Keterangan Empiris Setiap tanaman tingkat tinggi dapat mengandung beberapa mikrobia

endofit yang mampu menghasilkan senyawa biologi atau metabolit sekunder yang diduga sebagai transfer genetik (genetic recombination) dari tanaman inangnya ke dalam mikrobia endofit (Tan & Zou, 2001). A.annua L. telah diketahui merupakan tanaman yang menjadi inang untuk mikrobia endofit, pada tanaman ini diketahui bahwa ada suatu spesies

22


bakteri yang membentuk koloni dalam jaringan pada daerah batang sampai akar (Simanjuntak, dkk, 2004). Selain itu minyak essensial yang dihasilkan tanaman A.annua L. juga diketahui menunjukkan aktivitas antibiotik (Juteau et al, 2002). Bahan-bahan alam yang berpotensi sebagai obat dapat menjadi model atau prekursor dalam penemuan obat baru (Samuelsson, 2000). Untuk memperoleh antibiotik baru perlu dilakukan pencarian sumber penghasil antibiotik (Suwandi, 1989). Oleh karena itu, eksplorasi mikrobia endofit potensial merupakan alternatif untuk mendapatkan senyawa antibiotik baru. (Simanjuntak, dkk, 2004). Pengujian potensi antibakteri dari senyawa antibakteri dalam medium produksinya dilihat dengan mengukur diameter zona hambat. Data untuk identifikasi isolat bakteri endofit tersebut berupa data-data morfologi koloni, morfologi sel, dan sifat-sifat biokimianya. Data hasil identifikasi bakteri endofit kemudian dideterminasi dengan buku panduan determinasi bakteri (Holt et al, 2000) untuk mengetahui genus dari bakteri endofit yang diisolasi dari tanaman A.annua

L

tersebut.

Penelitian

ini

ditujukan

untuk

mengisolasi

dan

mengidentifikasi bakteri endofit dari batang tanaman A.annua L, dan untuk menguji potensi isolat bakteri endofit dari tanaman A.annua L terhadap E.coli dan S.aureus.


BAB III METODOLOGI PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian Penelitian ini termasuk jenis penelitian eksperimental murni dan bersifat eksploratif-deskriptif. Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma. B. Variabel dan Definisi Operasional 1. Variabel penelitian a.

Variabel bebas : senyawa antibakteri yang dihasilkan bakteri endofit yang diisolasi dari batang tanaman A. annua L.

b.

Variabel tergantung : diameter zona hambat (mm).

c.

Variabel pengacau terkendali : waktu inkubasi 24, 48, 72, 120 jam, suhu inkubasi 370C; medium kultur tanaman inang yaitu MS (MurashigeShoog) medium; medium isolasi bakteri endofit, medium pemeliharaan bakteri endofit, E.coli, dan S.aureus yaitu NA (Nutrient Agar); medium produksi senyawa antibakteri yang dihasilkan bakteri endofit yaitu NB (Nutrient Broth); batang tanaman A.annua L. yang sehat dan berumur 6 bulan; volume isolat bakteri endofit penghasil senyawa antibakteri yang diinokulasikan dalam paper disk sebanyak 40 μL; volume suspensi E.coli dan S.aureus setara dengan larutan standar Mc Farland II (6.108 CFU/ml) sebanyak 1 ml.


24

2. Definisi operasional a.

Artemisia annua L. diperoleh dari Balai Penelitian Tanaman Obat (BPTO) Tawangmangu dan diketahui bahwa ada suatu spesies bakteri yang membentuk koloni dalam jaringan vaskular daerah batang sampai akar tanaman A.annua L. ini.

b.

Senyawa antibakteri adalah substansi yang dihasilkan oleh isolat bakteri endofit dalam tanaman

A.annua L. yang mampu menghambat

pertumbuhan atau membunuh E. coli dan S.aureus. c.

Bakteri endofit dari tanaman A.annua L. adalah bakteri yang membentuk koloni dalam suatu sistem jaringan vaskular dari tanaman A.annua L. yang dapat ditumbuhkan di MS Medium dan dapat menghasilkan senyawa yang mempunyai potensi antibakteri terhadap E.coli dan S.aureus.

d.

Potensi antibakteri adalah kemampuan suatu zat atau substansi yang dihasilkan oleh bakteri endofit dari tanaman A.annua L. yang mampu menghambat atau mematikan bakteri E.coli dan S.aureus, ditandai dengan adanya area hambatan di sekitar paper disk.

e.

Eshericia coli ATCC 35218 dan Staphylococcus aureus ATCC 25923 dari Laboratorium

Mikrobiologi

Fakultas Kedokteran Universitas

Gadjah Mada, adalah bakteri uji, yaitu bakteri gram negatif dan bakteri gram positif yang bersifat patogen terhadap manusia. f.

MS (Murashige-Shoog) medium adalah medium kultur tanaman A.annua L. MS Medium mengandung garam-garam mineral yang cukup lengkap


25

untuk mendukung pertumbuhan eksplan ( batang tanaman A.annua L. ) dan mengandung senyawa nitrogen yang berguna dalam regenerasi sel eksplan. C. Bahan dan Alat Penelitian 1. Bahan penelitian a.

Tanaman Artemisia annua L. diperoleh dari Balai Penelitian Tanaman Obat (BPTO) Tawangmangu dan berumur 6 bulan.

b.

Biakan murni Eschericia coli ATCC 35218 dan Staphylococcus aureus ATCC 25923 dari Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada.

c.

Medium kultur tanaman A.annua L yaitu MS (Murashige-Shoog) medium

dengan

komposisi

:

NH4NO3,

KNO3,

CaCl2.2H2O,

MgSO4.7H2O, KH2PO4, unsur hara mikro, sukrosa, agar, vitamin, hormon BAP dan 2,4 Diklorofenoksi Asetat, FeSO4.7H2O dan Na2 EDTA, d.

Medium isolasi bakteri endofit yaitu Nutrien Agar (Oxoid) takaran 28g/L dengan komposisi (g/L) : “Lab-lemco” powder 1,0; yeast extract 2,0; peptone 5,0; sodium chloride 5,0 agar 15,0.

e.

Medium produksi senyawa anti bakteri yaitu medium Nutrient Broth (Oxoid) takaran 37 g/L dengan komposisi (g/L) : “Lab-lemco” powder 1,0; yeast extract 2,0; peptone 5,0; sodium chloride 5,0.

f.

Medium pemeliharaan E. coli, S. aureus, bakteri endofit dan medium identifikasi bakteri endofit :


26

1) Nutrien Agar (Oxoid) takaran 28g/L dengan komposisi (g/L) : “Lablemco” powder 1,0; yeast extract 2,0; peptone 5,0; sodium chloride 5,0 agar 15,0. 2) Nutrien Broth (Oxoid) takaran 37 g/L dengan komposisi (g/L) : “Lablemco” powder 1,0; yeast extract 2,0; peptone 5,0; sodium chloride 5,0. g.

Bahan untuk uji biokimia : 1) Uji Oksidase : reagens tetramethyl-paraphenyldiamine. 2) Uji Katalase : reagens hydrogen peroksida (H2O2). 3) Uji hydrogen sulfida : medium TSIA (Triple Sugar Iron Agar) (Oxoid). 4) Uji Dekarboksilasi lisin : medium LIA (Lisin Iron Agar) (Oxoid). 5) Uji Indol : medium peptone water dan reagens Kovac. 6) Uji MR : medium MR – VP (Methyl Red – Voges Proskauer), methyl red. 7) Uji hidrolisis gelatin : dengan komposisi Nutrient Broth (Oxoid) dan 12% gelatin. 8) Uji Fermentasi karbohidrat : medium O-F (Difco). 9) Uji Sitrat : medium Simmon’s Citrate (Oxoid). 10) Uji Pergerakan mikrobia : Nutrient Broth (Oxoid), 0,2% – 0,4% Agar Bacteriologycal (Oxoid).


h.

27

Bahan untuk pengecatan bakteri : 1) Pengecatan Gram : kristal violet, larutan iodine, alkohol 95%, safranin. 2) Pengecatan Spora : Malachite green 5%, safranin. 3) Pengecatan Acid Fast : cat Ziehl Neelson Carbolfuchsin, methylen blue, alkohol 95%.

i.

Paper disc dengan diameter 6 mm.

j.

Kontrol positif : Amoxicilin untuk injeksi (Danoxilin®)

k.

Kontrol negatif yaitu medium Nutrien Broth tanpa inokulasi mikrobia endofit.

l.

Larutan standar Mc Farland II (setara dengan kepadatan bakteri 6.108 CFU/ml).

m. Aquadest steril. n.

Alkohol 70%.

o.

Minyak emersi.

p.

Sodium hipoklorit (Bayclin) untuk pembersihan batang A.annua L.

q.

Tween 80 sebagai wetting agent pada proses pembersihan batang A.annua L.

2. Alat penelitian Autoklaf (model KT-40, ALP Co. Ltd. Midorigouka Kamurashi, Tokyo, Japan), Microbioogical Safety Cabinet (lokal), Inkubator (Memmert, tipe BE 400, Swahabach FRG, Germany), Vortex (Stuart Scientific); Neraca analitik (Mettler Pc 2000); Sentrifuge (Heraeus Christ); Oven (WTC Binder);


28

Mikroskop cahaya (Olympus Type CH 30); mikropipet (Nichiryo 5000 DG), Shaker Resiprok (Imorius Utrecht); beker glass (Pyrex), lemari pendingin (Sharp, Japan), Cawan petri (Pyrex), kaca steril, pisau, botol kultur, Pipet volume, Pipet tetes, glass firm, Tabung sentrifuge, Tabung reaksi, kaca arloji, Erlenmeyer, Pinset, lampu spiritus, jarum inokulasi, penggaris, jarum ose, dan alat- alat gelas. D. Tahapan Penelitian 1. Determinasi Tanaman Artemisia annua L. Determinasi tanaman A.annua L. dilakukan oleh Balai Penelitian Tanaman Obat ( BPTO ), Tawangmangu, Karanganyar, Jawa Tengah, dengan menggunakan kunci determinasi menurut Backer ( 1968 ) 2. Pengumpulan Batang Artemisia annua L. Sampel batang yang sehat (bagus/ tidak rapuh) tanaman A.annua L. yang diperoleh dari Balai Penelitian Tanaman Obat ( BPTO ) Tawangmangu, Karanganyar, Jawa Tengah, dipilih yang telah berumur dewasa, yakni yang berumur 6 bulan. Sampel yang berupa batang disimpan di dalam kantong plastik untuk mengurangi penguapan selama perjalanan dan penyimpanan sementara. 3. Pembuatan MS Medium (Murashige-Shoog Medium) a. Penimbangan unsur makro Ditimbang bahan-bahan untuk unsur makro, antara lain

: 1,65 g

NH4NO3 ; 1,9 g KNO3 ; 0,44 g CaCl2.2H2O ; 0,37 g MgSO4.7H2O ; 0,17 g KH2PO4.


29

b. Pembuatan larutan stok 1) Pembuatan larutan stok hara mikro Ditimbang bahan-bahan untuk stok mikro, antara lain : 41,5 mg kalium iodida; 310,0 mg

asam borat; 845,0 mg mangansulfat-

tetrahidrat; 430,0 mg sengsulfat-heptahidrat; 1,25 mg tembaga (II) sulfat; 12,5 mg natriummolibdat-dihidrat; 1,25 mg kobalt (II) kloridaheksahidrat. Masing-masing bahan tersebut dimasukkan satu persatu ke dalam Beaker Glass 500 ml yang telah diisi dengan 300 ml aquadest, diaduk hingga larut. Kemudian dipindahkan ke dalam labu ukur 500 ml, diencerkan dengan aquadest sampai tanda. Untuk 1 liter medium dibutuhkan 5 ml larutan stok ini. 2) Pembuatan larutan stok besi Besi (II) sulfat-heptahidrat ditimbang sebanyak 139 mg dan 186,5 mg natrium etilen diamin tetra asetat. Dilarutkan dalam aquadest masing-masing 15 ml secara terpisah. Untuk natrium etilen diamin tetra asetat dibantu dengan pemanasan. Setelah larut dicampur dalam Erlenmeyer dan diaduk rata. Larutan tersebut kemudian dipindahkan ke dalam labu ukur 50 ml. Erlenmeyer tersebut dibilas dengan sisa aquadest dan masukkan dalam labu ukur tersebut sampai tanda. Untuk 1 liter medium dibutuhkan 5 ml stok ini.


30

3) Pembuatan larutan stok vitamin Erlenmeyer diisi dengan 50 ml aquadest, kemudian berturut-turut dimasukkan 250,0 mg asam nikotinat; 250,0 mg piridoksin; 50,0 mg tiamin; dan 100,0 mg glisin. Diaduk hingga jernih, kemudian dipindahkan ke dalam labu ukur 500 ml. Ditambahkan aquadest sampai tanda. Untuk 1 liter medium membutuhkan 5 ml larutan stok. 4) Pembuatan larutan stok mio-inositol Ditimbang 10,0 mg mio-inositol, kemudian dimasukkan ke dalam Beaker Glass satu liter yang terlebih dahulu telah diisi dengan 700 ml aquadest. Setelah larut, dipindahkan ke dalam labu ukur 1 liter dan diencerkan dengan aquadest sampai tanda. Untuk 1 liter medium dibutuhkan larutan stok sebanyak 10,0 ml. c. Pembuatan MS Medium (Murashige-Shoog Medium) Aquadest sebanyak kurang lebih 300 ml dipanaskan dalam Beaker Glass 1000 ml, kemudian bahan- bahan nutrisi makro dimasukkan ke dalam Beaker Glass, sambil terus diaduk dengan pengaduk stirer. Selanjutnya berturut-turut dimasukkan 5 ml larutan stok hara mikro; 5 ml larutan stok besi; 5 ml larutan stok vitamin; serta 10 ml larutan stok mioinositol dalam campuran medium. Kemudian dimasukkan campuran 30 g sukrosa dan 8-10 g agar. Aquadest ditambahkan sampai kurang lebih 1000 ml, diaduk, dan dipanaskan sampai jernih. Setelah jernih dan mendidih, Beaker Glass diangkat dari pemanas. Zat pengatur tumbuh golongan sitokinin yaitu BAP (Benzilaminopurin) ditambahkan sebanyak 1 ppm dan


31

medium dibagi menjadi tiga bagian untuk membuat variasi zat pengatur tumbuh. Kemudian ditambahkan zat pengatur tumbuh auksin (2,4-D). pH larutan medium diatur 5,2- 5,6. Jika terlalu alkali ditambahkan HCl 1N, tetapi jika terlalu asam ditambahkan KOH 1N. Larutan medium dipindahkan ke dalam botol kultur dengan ketebalan medium kurang lebih satu cm. Botol tersebut kemudian ditutup dengan aluminium foil, kemudian disterilisasi dengan autoklaf (121 °C, 15 menit). Medium yang telah disterilkan tersebut selanjutnya disimpan ke dalam inkubator. 4. Desinfeksi Batang Artemisia annua L. Batang dicuci dengan air mengalir selama ± 5-10 menit. Setelah itu, batang dicuci dalam 10 ml bayclin (commercial bleaching yang mengandung 5,3% sodium hypokhlorit) dan 20 tetes Tween 80, kemudian bilas dengan aquadest steril sampai bersih. 5. Penanaman Batang Artemisia annua L. pada MS Medium Batang tanaman Artemisia annua L. yang telah dibersihkan ditanam secara aseptis ke dalam MS medium. Penanaman dilakukan dengan menggunakan pinset steril dan batang yang telah dibersihkan dipotong sepanjang ± 0,5-0,8 cm dan ditanamkan ke permukaan MS medium dengan hati-hati. Penanaman batang dalam posisi horisontal dengan bekas potongan tertanam di permukaan MS medium, kemudian diinkubasikan selama 2-3 hari. Setelah inkubasi, akan tampak pertumbuhan bakteri endofit di sekitar batang A.annua L.


32

6. Isolasi Bakteri Endofit dengan Metode Streak Plate Setelah

didapatkan pertumbuhan bakteri endofit, kemudian dilakukan

isolasi bakteri endofit pada Nutrient Agar dalam cawan petri untuk mendapatkan biakan murni bakteri endofit. Satu ose mikrobia yang didapat diinokulasikan pada nutrient agar secara streak plate. Diinkubasikan pada suhu 37oC selama 24 jam. Akan didapat koloni- koloni bakteri yang terpisah. Koloni bakteri dari goresan terakhir diinokulasikan secara goresan ke dalam medium NA miring untuk stok mikrobia. 7. Pengujian Potensi Antibakteri dari Isolat Bakteri Endofit Terhadap E.coli dan S.aureus Secara Difusi Paper disc a. Pembuatan Suspensi Bakteri Uji Diambil ± 1 ose dari stok bakteri uji dari biakan murni E.coli ATCC 35218 dan S.aureus ATCC 25923, kemudian diinokulasikan pada Nutrien Broth (NB) 9 ml sampai konsentrasi 6 x 108 CFU/ml (Larutan Standar Mac Farland II). b. Skrining Bakteri Endofit yang Memiliki Potensi Antibakteri terhadap E.coli dan S.aureus Biakan murni bakteri endofit yang diperoleh dari tahap 6 diuji potensi antibakterinya terhadap E.coli dan S.aureus dengan metode Paper Disc Agar Diffusion Technique. Biakan bakteri endofit tersebut kemudian ditumbuhkan dalam medium Nutrient Broth dan digojog menggunakan shaker inkubator pada suhu 37° C dengan kecepatan 170 rpm selama 3-4 hari. Pemisahan biomassa sel dengan medium Nutrient Broth yang


33

mengandung metabolit sekunder bakteri endofit (supernatan) dilakukan dengan sentrifugasi pada kecepatan 5000 rpm selama 1 jam, supernatan dipakai untuk skrining bakteri endofit penghasil senyawa antibakteri. Sesudah supernatan disiapkan, paper disc steril diinokulasi 40 μl supernatan. Untuk mengurangi ekses air, paper disc dikeringanginkan di atas kaca arloji steril selama kurang lebih 1 jam. Mikrobia uji yaitu E.coli dan S.aureus ditumbuhkan dalam NA secara pour platting pada petri yang berbeda, yaitu dengan mengambil suspensi bakteri uji E.coli dan S.aureus sebanyak 1 ml kemudian diinokulasikan ke dalam 20 ml Nutrient Agar yang sedang mencair pada temperatur 50oC lalu dituang ke dalam cawan petri dan digoyang perlahan- lahan untuk mencampur kultur bakteri dengan agar. Setelah agar memadat, paper disc yang telah diinokulasi supernatan ditempatkan di permukaan medium. Inkubasi dilakukan pada suhu 37oC selama 24 jam atau sampai terbentuknya zona jernih di sekitar paper disc. Potensi penghambatan diukur dengan mengukur diameter zona jernihnya menggunakan penggaris. 8. Identifikasi Bakteri Endofit a. Morfologi sel 1) Pengecatan Gram Dibuat pulasan isolat bakteri endofit yang mempunyai potensi penghambatan paling baik pada tahap 7 dari kultur umur 48 jam, difiksasi di atas pembakar spiritus. Diteteskan cat kristal violet dan didiamkan selama 45 detik. Sisa cat dicuci dengan air mengalir lalu


34

ditetesi larutan iodine dan didiamkan selama 1,5 menit. Dicuci dengan air mengalir dan diberi larutan peluntur safranin, didiamkan selama 20 detik, kemudian dicuci dengan air mengalir, dikeringanginkan. Diamati dibawah mikroskop dengan perbesaran 1000X dengan menggunakan minyak immersi. Jika sel bakteri berwarna ungu berarti isolat bakteri endofit yang diisolasi termasuk bakteri gram positif. Tetapi jika sel bakteri berwarna merah berarti isolat bakteri endofit termasuk bakteri gram negatif. 2) Pengecatan Spora Dibuat pulasan isolat bakteri endofit yang mempunyai potensi penghambatan paling baik pada tahap 7 dari kultur umur 48 jam dan difiksasi di atas pembakar spiritus. Ditetesi dengan malachite green dan dipanasi selama 1 menit. Dicuci dengan air mengalir lalu diberi cat safranin dan didiamkan selama 30 detik kemudian dicuci di bawah air mengalir lalu dikeringanginkan dan diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran kuat 1000X dengan minyak immersi. Spora berwarna hijau dan sel vegetatif berwarna merah. 3) Pengecatan Acid Fast Dibuat pulasan isolat bakteri endofit yang mempunyai potensi penghambatan paling baik pada tahap 7 dari kultur umur 48 jam pada kaca obyek dan difiksasi di atas pembakar spiritus. Lalu ditutup dengan sepotong kertas filter, ditambah larutan carbolfuchsin dan dipanaskan di atas pembakar spiritus dengan nyala api kecil.


35

Didinginkan, dicuci dengan air mengalir dan dikeringanginkan. Dicuci dengan larutan peluntur sambil digoyang- goyangkan sampai seluruh warna dari carbolfuchsin tidak tampak. Dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan. Setelah itu ditambahkan dengan metylen biru selama 2030 detik. Dicuci kembali dan diamati dengan perbesaran kuat 1000X. Bakteri yang tidak tahan terhadap pencucian asam akan berwarna biru sedangkan bakteri yang tahan asam akan berwarna merah. 4) Uji pergerakan Isolat bakteri endofit yang mempunyai potensi penghambatan paling baik pada tahap 7 dari kultur umur 48 jam diinokulasi dengan cara tusukan dalam agar tegak dengan kandungan agar 0,2% – 0,4%. Akan tampak pergerakan bakteri yang berupa serabut- serabut halus disekitar tusukan, pergerakan bakteri ini disebabkan karena bakteri memiliki flagela. b. Morfologi Koloni Diinokulasikan biakan bakteri endofit yang mempunyai potensi penghambatan paling baik pada tahap 7 ke dalam medium cair ( Nutrient Broth), NA tegak dengan menggunakan jarum inokulasi secara tusukan, dan NA miring secara goresan dengan jarum ose. Diinkubasikan pada suhu 37oC selama 24 jam. Pada medium cair diamati pertumbuhan pada permukaan, endapan yang terjadi, bau, dan kekeruhan. Pada NA tegak diamati tingkat pertumbuhan dan bentuk pertumbuhan pada bekas tusukan. Pada NA miring diamati tingkat pertumbuhan, bentuk pertumbuhan pada


36

bekas tusukan, kilat, topografi, warna, ciri- ciri optik, bau, konsistensi dan warna medium. c. Uji biokimia 1) Uji pembentukan H2S Diinokulasikan kultur isolat bakteri endofit yang mempunyai potensi penghambatan paling baik pada tahap 7 dari kultur umur 48 jam dengan jarum inokulasi secara tusukan pada medium TSIA miring dan pada permukaan medium diinokulasi secara goresan dengan menggunakan ose. Diinkubasikan selama 48 jam pada suhu 37oC. Pengamatan uji H2S dilakukan dengan cara membandingkan medium yang diinokulasi isolat bakteri endofit terhadap kontrol (tanpa inokulasi bakteri endofit). Pembentukan H2S ditunjukkan dengan terbentuknya endapan hitam yang berarti bakteri mampu menghasilkan senyawa desulfurase, selain itu dapat digunakan untuk mengamati fermentasi gula. Jika pada bagian bawah medium berwarna kuning sedang bagian atas berwarna merah berarti terjadi fermentasi glukosa. Jika baik pada bagian atas ataupun bawah medium berwarna kuning dan kadangkala disertai pembentukan gas berarti laktosa atau sukrosa atau keduanya difermentasikan. Dan jika seluruh medium berwarna merah berarti ketiga macam gula tidak difermentasikan. 2) Uji dekarboksilasi lisin Diinokulasikan kultur isolat bakteri endofit yang mempunyai potensi penghambatan paling baik pada tahap 7 dari kultur umur 48


37

jam dengan cara tusukan dalam medium Lysin Iron Agar (LIA) kemudian diinkubasikan pada suhu 37oC selama 24 jam dan 48 jam. Pengamatan uji dekarboksilasi lisin dilakukan dengan membandingkan medium LIA yang diinokulasikan isolat bakteri endofit terhadap kontrol (tanpa inokulasi bakteri endofit) yang berwarna ungu. Hasil diamati, positif bila terjadi perubahan warna dari ungu menjadi kuning pada umur 24 jam dan kemudian berwarna ungu kembali. Perubahan warna menjadi kuning menandakan bakteri dapat melakukan fermentasi dan kembali berwarna ungu yang berarti lisin mengalami dekarboksilasi. 3) Uji Indol Diinokulasikan 1 ose kultur isolat bakteri endofit yang mempunyai potensi penghambatan paling baik pada tahap 7 dari kultur umur 48 jam dalam masing- masing tabung reaksi yang berisi medium tripton water. Inkubasi pada suhu 37oC selama 48 jam. Setelah itu ditambahkan reagen Kovac. Pengamatan uji Indol dilakukan dengan membandingkan medium yang diinokulasikan isolat bakteri endofit terhadap kontrol (tanpa inokulasi bakteri endofit). Memberikan hasil positif apabila terbentuk cincin merah yang tidak larut pada permukaan medium. Hal ini dikarenakan bakteri dapat menghasilkan enzim triptofanase.


38

4) Uji Methyl Red Diinokulasikan kultur isolat bakteri endofit yang mempunyai potensi penghambatan paling baik pada tahap 7 dari kultur umur 48 jam dengan jarum inokulasi pada masing- masing tabung yang berbeda berisi medium MR-VP. Diinkubasi pada suhu 37oC selama 48 jam. Pengamatan uji Methyl Red dilakukan dengan membandingkan medium yang diinokulasikan isolat bakteri endofit terhadap kontrol (tanpa inokulasi bakteri endofit). Pada uji MR ditambah reagen methyl red. Bakteri yang tidak dapat memfermentasikan gula akan merubah warna menjadi merah pada uji MR. Sedangkan apabila terjadi fermentasi gula, medium akan berubah menjadi kuning. 5) Uji sitrat Diinokulasikan 1 ose kultur isolat bakteri endofit yang mempunyai potensi penghambatan paling baik pada tahap 7 dari kultur umur 48 jam pada medium simmon’s citrate secara miring. Diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam. Pengamatan uji sitrat dilakukan dengan membandingkan medium simmon’s citrate yang diinokulasikan isolat bakteri endofit terhadap kontrol (tanpa inokulasi bakteri endofit). Perubahan warna dari hijau menjadi biru menunjukkan bahwa bakteri mampu menggunakan sitrat sebagai satu- satunya sumber karbon. 6) Uji katalase Satu ose kultur isolat bakteri endofit yang mempunyai potensi penghambatan paling baik pada tahap 7 diletakkan pada gelas benda.


39

Ditambahkan 1 tetes 30% H2O2. diamati dengan melihat terjadi atau tidaknya pembentukan gelembung udara di sekitar koloni bakteri endofit setelah diberi reagens 30% H2O2 dan dibandingkan dengan kontrol (tanpa inokulasi bakteri endofit). jika terjadi gelembung udara berarti bakteri memiliki enzim katalase. 7) Uji Oksidase Pada kertas saring diteteskan reagens tetrametil paraphenildiamin. Pada kertas saring yang diberi reagens diletakkan 1 ose kultur isolat bakteri endofit yang mempunyai potensi penghambatan paling baik pada tahap 7 dari kultur umur 48 jam. Diamati hasilnya dengan melihat apakah terjadi perubahan warna koloni bakteri menjadi ungu tua setelah diberi reagens dan dibandingkan dengan kontrol (tanpa inokulasi bakteri endofit). Jika terjadi warna ungu tua setelah didiamkan selama 10 menit berarti hasil positif bahwa bakteri uji memiliki enzim oksidase sitokrom. Sedangkan hasil negatif ditandai dengan tidak terjadinya perubahan warna. 8) Uji hidrolisis gelatin Diinokulasi kultur isolat bakteri endofit yang mempunyai potensi penghambatan paling baik pada tahap 7 dari kultur umur 48 jam secara tusukan pada medium dengan komposisi gelatin 12% dan nutrient broth dengan takaran 13 gram/L kemudian diinkubasikan selama 72 jam. Setelah 72 jam, tabung dimasukkan ke dalam lemari es selama 30 menit. Diamati apakah terjadi pencairan gelatin atau tidak dan


40

dibandingkan dengan kontrol (tanpa inokulasi bakteri endofit). Apabila terjadi pencairan gelatin berarti bakteri mampu menghasilkan eksoenzim gelatinase. 9) Uji fermentasi karbohidrat Dua tabung berisi medium O-F diinokulasi dengan kultur isolat bakteri endofit yang mempunyai potensi penghambatan paling baik pada tahap 7 dari kultur umur 48 jam menggunakan jarum inokulasi secara tusukan dan dua tabung sebagai kontrol (tanpa inokulasi bakteri endofit), tabung pertama ditetesi parafin dan tabung kedua tanpa ditetesi parafin kemudian diinkubasikan pada suhu 37o selama 48 jam. Hasil diamati dengan melihat perubahan warna medium O-F. Warna awal medium O-F adalah hijau. Jika pada medium yang ditutup paraffin tetap berwarna hijau sedangkan yang tidak ditutup paraffin warna mediumnya berubah menjadi kuning berarti bakteri endofit mampu memetabolisme karbohidrat secara oksidasi. Tetapi jika pada tabung dengan medium O-F yang ditutup paraffin ataupun tidak ditutup paraffin, warna mediumnya berubah menjadi kuning berarti bakteri endofit mampu memetabolisme karbohidrat secara fermentasi. E. Analisis Hasil Medium yang digunakan untuk isolasi bakteri endofit dari batang Artemisia annua L. adalah MS (Murashige-Shoog) medium. Isolat bakteri endofit kemudian dilakukan reisolasi secara streak plate pada Nutrient Agar dalam petri supaya didapatkan kultur murni bakteri endofit. Potensi antibakteri isolat bakteri endofit


41

penghasil senyawa antibakteri diujikan pada S aureus dan E.coli menggunakan metode difusi dengan paper disk, potensi antibakteri diketahui dengan cara mengukur zona hambat yang terbentuk di sekitar paper disk dengan menggunakan penggaris. Identifikasi bakteri endofit dilakukan dengan melihat sifat morfologi sel, morfologi koloni dan pengujian sifat biokimia. Dari sifat- sifat tersebut dapat diidentifikasi bakteri endofit yang bersifat antibakteri terhadap S.aureus dan E.coli dengan buku panduan determinasi bakteri (Holt et al, 2000) sehingga dapat ditentukan genus dari bakteri endofit tersebut. Seluruh data pengamatan dideskripsikan dengan dilengkapi foto dan gambar mikrofotografi.


42

Pengumpulan batang tanaman Artemisia annua L. Pembersihan batang tanaman Artemisia annua L. Penanaman batang tanaman Artemisia annua L pada MS medium untuk isolasi bakteri endofit Isolasi dan Reisolasi bakteri endofit secara streak plate Isolat murni bakteri endofit Skrining bakteri endofit dengan metode paper disk Identifikasi bakteri endofit

Morfologi sel : - sifat gram - rangkaian sel - bentuk sel - pergerakan

Morfologi koloni : Medium cair (NB) - tekstur permukaan - kekeruhan - bau - endapan Medium padat (NA) - bentuk pertumbuhan - konsistensi - warna

Sifat biokimia : - H2S - dekarboksilasi lisin - indol - MR - sitrat - katalase - oksidase - gelatin - fermentasi

Determinasi isolat bakteri endofit menggunakan panduan baku Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology (Holt et al, 2000) Genus isolat bakteri endofit Gambar1. Skema Kerja Penelitian


BAB IV HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN

1. Determinasi Tanaman Artemisia annua L. Identifikasi tanaman (disebut juga dengan determinasi tanaman) adalah penentuan nama ilmiah suatu tanaman yang didasarkan pada acuan suatu sistem klasifikasi tanaman (Stace, 1989). Determinasi tanaman bertujuan untuk memastikan kebenaran tanaman yang digunakan untuk penelitian. Tanaman yang akan digunakan dalam penelitian adalah Artemisia annua L. yang dideterminasi sampai tingkat spesies. Determinasi tanaman dilakukan oleh Balai Penelitian Tanaman Obat (BPTO), Tawangmangu, dengan menggunakan kunci determinasi menurut Backer (1968) (Lampiran 1). Berdasarkan determinasi hingga kategori spesies tersebut, maka tanaman yang digunakan dalam penelitian ini adalah Artemisia annua L. (Lampiran 2). Artemisia annua L. merupakan anggota familia Asteraceae (sinonim Compositae) (Backer & Brink,1965). 2. Pengumpulan Batang Tanaman Artemisia annua L. Batang tanaman yang akan digunakan untuk penelitian diperoleh dari Balai Penelitian Tanaman Obat ( BPTO ), Tawangmangu, dan dipilih tanaman A.annua L. yang berumur dewasa dan sehat ( berumur ± 6 bulan ). Mikrobia endofit tumbuh di jaringan vaskular dari tanaman inangnya (Stone et al, 2000). Jaringan vaskular (pembuluh) terdapat di seluruh tubuh tanaman, mengangkut zat-zat antara akar dan tunas. Kedua jenis jaringan vaskular


44

tersebut adalah xilem, yang mengirim air dan mineral yang terlarut ke atas dari akar ke tunas, dan floem, yang mengangkut makanan yang dibuat di daun yang sudah dewasa ke akar dan ke bagian-bagian sistem tunas (Campbell et al, 2002). Pada tanaman yang terlalu muda, jaringan vaskular yang terbentuk belum sempurna sehingga kemungkinan munculnya bakteri endofit kecil karena nutrien yang diperlukan untuk tumbuhnya bakteri endofit kurang. Apabila batang tanaman yang dipilih kurang sehat kemungkinan jaringan tanaman di dalam batang tersebut sudah ada yang rusak sehingga tidak dapat menghasilkan nutrien secara maksimal untuk tumbuhnya bakteri endofit. Jaringan tanaman yang sehat dapat menghasilkan nutrien yang cukup untuk tumbuhnya bakteri endofit (Pudaritadesantamaria, 2004). Nutrien adalah substansi yang digunakan untuk biosintesis dan sebagai sumber energi untuk mendukung pertumbuhan mikrobia (Prescott, Harley & Klein, 1999). Digunakan batang tanaman A.annua L. karena dalam batang A.annua L. terdapat jaringan vaskular sebagai tempat tumbuh bakteri endofit. 3. Pembuatan MS Medium (Murashige-Shoog Medium) Medium tumbuh pada kultur jaringan sangat besar pengaruhnya terhadap pertumbuhan dan perkembangan eksplan. Macam-macam medium kultur telah ditemukan sehingga jumlahnya cukup banyak. Nama-nama medium tumbuh untuk eksplan ini biasanya sama dengan nama penemunya, antara lain adalah: Medium Murashige dan Skoog (MS), Medium Gamborg, Medium Vacin Went (VW), Medium Woody Plant Medium (WPM), dan lainnya. Medium tumbuh untuk eksplan berisi kualitatif komponen bahan kimia yang hampir


sama, hanya agak berbeda dalam besarnya

kadar

untuk

45

tiap-tiap

persenyawaan. Jaringan tanaman yang dikultur memerlukan unsur hara makro dan unsur hara mikro dari dalam medium tumbuh, dari dalam medium kultur juga harus ada bahan-bahan lain yang berguna untuk merangsang pertumbuhan

serta

perkembangan

sel

jaringan

yang

dikulturkan

(Hendaryono,1994). Agar supaya batang tanaman A.annua L. tetap tumbuh, berkembang dan menyokong pertumbuhan dari bakteri endofit pada saat proses isolasi bakteri endofit diperlukan lingkungan yang cocok untuk batang tanaman A.annua L. tersebut, karena itu diperlukan proses kultur jaringan untuk

batang tanaman A.annua L. Batang tanaman A.annua L ini dapat

disebut juga eksplan, yaitu bagian kecil jaringan atau organ yang dikeluarkan atau dipisahkan dari tanaman induk kemudian dikulturkan (Katuuk,1989). Pemisahan batang tanaman A.annua L. dari tanaman induk menyebabkan perubahan biosintesa dalam batang tanaman A.annua L. tersebut, sehingga pemberian unsur hara ke dalam medium kultur untuk membantu batang tanaman A.annua L. supaya dapat tumbuh dan berkembang. Bahan-bahan itu adalah bahan organik yang meliputi karbohidrat, vitamin, asam amino, serta zat yang mengatur pertumbuhan. MS medium merupakan medium yang paling banyak digunakan untuk induksi kalus (Katuuk, 1989). Medium yang digunakan untuk kultur batang tanaman A.annua L adalah MS medium. MS Medium dipilih sebagai medium kultur batang tanaman A.annua L karena MS Medium mengandung garam-garam mineral yang cukup lengkap untuk mendukung pertumbuhan eksplan dan mengandung senyawa nitrogen yang


46

berguna dalam regenerasi sel eksplan. Bakteri endofit dalam batang tanaman A.annua L. dapat tumbuh karena mendapat nutrien dalam jaringan vaskular batang tanaman A.annua L. (Stone et al, 2000). Jaringan vaskular berfungsi untuk transportasi nutrien tanaman A.annua L., jadi nutrien yang digunakan tanaman A.annua L. untuk tumbuh digunakan juga oleh bakteri endofit tersebut untuk tumbuh, sehingga diharapkan bakteri endofit tersebut juga dapat tumbuh dalam MS medium. 4. Desinfeksi Batang Tanaman Artemisia annua L. Pembersihan batang tanaman A.annua L. dilakukan untuk menghilangkan menghilangkan kotoran dan mikrobia kontaminan dari permukaan batang tanaman A.annua L., sehingga pada tahap isolasi bakteri endofit dari batang A.annua L. akan diperoleh isolat murni bakteri endofit. Cara pembersihannya yaitu batang dicuci dengan air mengalir selama ± 5-10 menit kemudian batang dicuci dalam 10 ml bayclin® (commercial bleaching yang mengandung 5,3% sodium hypokhlorit) dan 20 tetes Tween 80, kemudian dibilas dengan aquadest steril sampai bersih. Bayclin® berfungsi sebagai desinfektan untuk menghilangkan kotoran, bakteri dan fungi yang ada pada batang sehingga ketika batang ditanam pada medium tidak tumbuh fungi atau bakteri kontaminan di sekitarnya. Tween 80 merupakan suatu surfaktan yang berfungsi untuk menaikkan kontak desinfektan (Bayclin® ) dengan batang tanaman A.annua L., sehingga dapat membersihkan batang A.annua L. dari kotoran dan mencegah adanya kontaminasi fungi dan bakteri. Tujuan pembilasan dengan aquadest steril adalah untuk menghilangkan busa Tween


47

80 yang masih menempel pada batang yang dapat mengganggu pertumbuhan bakteri endofit. 5. Penanaman Batang Artemisia annua L. pada MS Medium Batang yang telah dibersihkan kemudian dipotong menggunakan pisau steril sepanjang ± 0,5-0,8 cm dan ditanam menggunakan pinset steril secara aseptis ke permukaan medium MS. Penanaman batang dalam posisi horisontal dengan bekas potongan tertanam di permukaan MS medium, kemudian diinkubasikan selama 2-3 hari. Setelah inkubasi, tampak pertumbuhan bakteri endofit di sekitar batang A.annua L. (Lampiran 3). Bakteri endofit ini hanya akan tumbuh di sekitar batang A.annua L. karena bakteri endofit ini pada awalnya memperoleh nutrien dari batang A.annua L.. Pertumbuhan bakteri endofit di MS Medium akan tampak berbeda dengan mikrobia kontaminan. Mikrobia kontaminan akan memenuhi seluruh permukaan MS Medium setelah inkubasi. Munculnya bakteri endofit tersebut karena terdapat hubungan simbiosis antara bakteri endofit dan tanaman A.annua L., di mana bakteri endofit memperoleh nutrien dan pelindungan dari tanaman A.annua L.. Peran nutrien yang diperoleh dari tanaman A.annua L. bagi bakteri endofit adalah sebagai sumber energi sesuai kebutuhan sel bakteri endofit, dan sebagai bahan pembangun sel bakteri endofit. Sebagai timbal baliknya, tanaman A.annua L. memperoleh substansi dari bakteri endofit yang berguna untuk mendukung pertumbuhan

tanaman

A.annua

L..

Bakteri

endofit

memproduksi

phytohormones seperti indole-3-acetic acid (IAA), cytokines, dan substansi


48

lainnya yang mendukung pertumbuhan tanaman (Tan & Zou, 2001). Bakteri endofit juga memberikan perlindungan kepada tanaman inang dari berbagai mikrobia patogen dengan cara kompetisi, menghasilkan senyawa antibiotik, atau menginduksi ketahanan tanaman. Bakteri endofit yang diisolasi dari akar pisang telah diketahui dapat menghambat pertumbuhan Fusarium oxysporum penyebab

penyakit

layu

Fusarium

pada

tanaman

pisang

(Pudaritadesantamaria, 2004). Bakteri endofit mengkoloni jaringan vaskular dari tanaman A.annua L., sehingga bakteri endofit tersebut hidup di lingkungan yang kaya akan nutrien, oleh karena itu transpor nutrien dari tanaman A.annua L. ke dalam bakteri endofit dapat terjadi dengan mekanisme difusi pasif dan difusi terfasilitasi. Difusi pasif adalah proses berpindahnya molekul dari konsentrasi yang tinggi menuju konsentrasi rendah, kecepatan dari difusi pasif dipengaruhi oleh besarnya gradien kadar dari molekul. Kecepatan dari difusi nutrien menembus membran sel dapat ditingkatkan dengan menggunakan protein carrier yang terdapat dalam plasma membran sel, mekanisme ini disebut difusi terfasilitasi. Protein carrier menyerupai enzim yang spesifik untuk setiap nutrien yang akan ditransportkan (Prescott, 1999). Bakteri endofit dalam batang A.annua L dapat memproduksi senyawa metabolit sekunder sesuai dengan tanaman inangnya, metabolit sekunder yang berpotensi sebagai antibiotik ini diduga sebagai hasil transfer genetik (genetic recombination) dari A.annua L. ke dalam bakteri endofit. Mekanisme transfer genetik bakteri endofit dengan A.annua L. secara alami belum diketahui


49

secara pasti. Bioteknologi dapat dijadikan pendekatan untuk mengetahui bagaimana proses transfer genetik ini berlangsung. Praktek-praktek dalam bioteknologi selalu mengandalkan proses genetik alami, seperti mutasi dan rekombinasi genetik (Campbell et al, 2002). Proses transfer genetik antara bakteri endofit dengan tanaman A.annua L diduga berlangsung dengan melibatkan plasmid dari bakteri endofit. Plasmid adalah molekul DNA kecil, sirkular, dan dapat bereplikasi sendiri di dalam sitoplasma sel bakteri (Campbell et al, 2002). 6. Isolasi Bakteri Endofit dengan Metode Streak Plate Isolasi adalah memisahkan suatu mikrobia dari lingkungan di alam dan menumbuhkannya sebagai biakan murni dalam medium biakan (Jutono, dkk, 1980). Setelah didapatkan pertumbuhan bakteri endofit, kemudian dilakukan isolasi bakteri endofit pada Nutrient Agar dalam cawan petri untuk mendapatkan biakan murni bakteri endofit. Diinokulasikan 1 ose bakteri endofit yang tumbuh di sekitar batang A.annua L. Pada MS Medium secara streak plate ke permukaan Nutrient Agar dalam cawan petri. Diinkubasikan pada suhu 37oC selama 24 jam, kemudian didapat koloni- koloni bakteri yang terpisah. Dari tahap reisolasi ini diperoleh koloni- koloni bakteri terpisah yang berbentuk circulair, berwarna putih kekuningan, dan terpisah satu sama lain (Lampiran 4). Kemudian diambil 4 koloni (masing-masing diberi kode Bakteri Endofit A, B, C, dan D) dan masing- masing koloni ditumbuhkan dalam medium NA miring untuk stok bakteri endofit yang akan diuji potensi penghambatannya terhadap S.aureus dan E.coli. Digunakan medium agar


50

miring untuk memperoleh permukaan yang lebih luas untuk pertumbuhan bakteri endofit. Stok bakteri endofit menggunakan Nutrien Agar (Oxoid) karena di dalam medium ini terkandung nutrien yang berguna untuk pertumbuhan bakteri endofit. Nutrien adalah substansi anorganik dan organik yang diperoleh dari lingkungan, diperlukan pada biosintesis dan produksi energi dari sel, dan digunakan sebagai sumber energi untuk mendukung pertumbuhan mikrobia (Prescott et al, 1999) Nutrien Agar (Oxoid) ditinjau secara kimiawi termasuk dalam medium sintetik, dalam Nutrien Agar terkandung nutrien yang mendukung pertumbuhan bakteri. Yeast extract (ekstrak khamir) merupakan suatu sumber yang amat kaya akan vitamin B, juga mengandung Nitrogen organik dan senyawa-senyawa karbon. Pepton merupakan sumber utama Nitrogen organik, dapat pula mengandung vitamin dan karbohidrat. Karbon digunakan oleh bakteri untuk memproduksi karbohidrat dan senyawa-senyawa organik lain yang digunakan sebagai makanan. Vitamin berfungsi membentuk subtansi yang mengaktivasi enzim (bagian dari koenzim). Agar digunakan sebagai bahan pemadat medium, agar bukan merupakan sumber nutrien bagi bakteri (Pelczar & Chan, 1986). Koloni terpisah bakteri isolat endofit kode A, kode B, kode C, kode D yang telah ditumbuhkan dalam medium NA miring diinkubasi pada suhu 370 C selama 24 jam. Setelah proses inkubasi, ternyata yang dapat tumbuh dengan baik hanya bakteri endofit kode B dan kode D. Bakteri endofit kode A dan kode C terhambat pertumbuhannya. Hal ini dapat disebabkan karena


51

persyaratan nutrien maupun kondisi fisik dari medium biakan kurang sesuai untuk mendukung pertumbuhan bakteri endofit kode A dan kode C. Untuk mendapatkan media tumbuh yang baik untuk bakteri endofit, diperlukan media pra-pengayaan dan media pengayaan. Nutrien yang pada umumnya diperlukan bakteri adalah macroelements dan microelements. Macroelements meliputi karbon, oksigen, hidrogen, nitrogen, sulfur, fosfor, potassium, kalsium, magnesium, dan besi. Microelements meliputi mangan, zinc, kobalt, molybdenum,

dan

nikel.

Persyaratan

fisik

yang

dibutuhkan

untuk

pertumbuhan bakteri meliputi suhu, tekanan atmosfer, dan pH. Beberapa jenis bakteri mempunyai persyaratan tambahan untuk dapat tumbuh dengan optimum. Pertumbuhan bakteri tertentu dapat dipengaruhi oleh keadaan tekanan osmotik (tenaga atau tegangan yang terhimpun ketika air berdifusi melalui suatu membran) atau tekanan hidrostatik (tegangan zat alir). Tidak ada satu pun perangkat kondisi yang memuaskan bagi kultivasi semua bakteri di laboratorium. Bakteri amat beragam baik dalam persyaratan nutrien maupun fisiknya. Beberapa bakteri mempunyai persyaratan nutrien yang sederhana, sedangkan yang lain mempunyai persyaratan yang rumit (Pelczar & Chan, 1986). Dari hasil pengamatan, bakteri endofit kode B dan kode D dapat tumbuh dengan baik di medium biakan, oleh karena itu bakteri endofit kode B dan kode D digunakan untuk langkah kerja selanjutnya yaitu pengujian potensi antibakteri isolat bakteri endofit terhadap S.aureus dan E.coli


52

7. Pengujian Potensi Antibakteri dari Senyawa Antibakteri yang Dihasilkan Isolat Bakteri Endofit kode B dan kode D Terhadap S.aureus dan E.coli Secara Difusi Paper disc a. Pembuatan suspensi bakteri uji Suspensi S.aureus dan E.coli dipersiapkan dengan cara mengambil biakan murni E.coli ATCC 35218 dan S.aureus ATCC 25923 ± 1 ose yang telah diinkubasi 37oC selama 24 jam untuk disuspensikan ke dalam 9 ml Nutrien Broth. Menurut Koneman et al (1997), kekeruhan suspensi inokulum disesuaikan dengan kekeruhan larutan standar Mc Farland II sehingga diperoleh kepadatan bakteri uji setara kepadatan bakteri 6 x 108 CFU/ ml. Larutan standar Mc Farland II digunakan untuk mengetahui jumlah sel bakteri, sehingga diharapkan suspensi S.aureus dan E.coli yang digunakan sebagai bakteri uji, mempunyai kepadatan bakteri 6 x 108 CFU/ ml. Tujuan disamakannya kepadatan bakteri uji setara larutan standar Mc Farland II adalah untuk mendapatkan kepadatan bakteri uji yang sama untuk setiap replikasi. Pengujian potensi antibakteri isolat bakteri endofit terhadap S.aureus dan E.coli ini dilakukan dengan tiga kali replikasi. b. Skrining Bakteri Endofit yang Memiliki Potensi Antibakteri Terhadap S.aureus dan E.coli Pengujian potensi antibakteri dilakukan dengan metode difusi menggunakan paper disk (Paper Disc Agar Diffusion Method). Untuk uji ini, isolat bakteri endofit B dan endofit D ditumbuhkan dalam medium Nutrient Broth (NB). Medium tersebut kemudian dishaker selama empat


53

hari (96 jam) dengan tujuan untuk aerasi dan diharapkan mendapat biomassa sel secara optimal. Pemilihan waktu empat hari (96 jam) berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Wahyuningsih (2006), pada hari keempat (96 jam) umumnya bakteri telah mencapai fase stasioner dan menghasilkan metabolit sekunder. Metabolit sekunder inilah yang menurut Betina (1983) sering diistilahkan sebagai antibiotik. Dari penelitian yang dilakukan oleh Wahyuningsih (2006) digunakan kecepatan shaker 170 rpm sehingga penelitian ini ditetapkan menggunakan kecepatan shaker 170 rpm. Penggojogan dilakukan dengan tujuan agar seluruh nutrisi yang dikandung medium dapat digunakan oleh bakteri secara optimal sebagai bahan untuk proses metabolismenya sehingga senyawa antibakteri dapat dihasilkan dengan optimal. Selain itu penggojogan dengan kecepatan 170 rpm dimaksudkan agar bakteri mampu mensekresikan senyawa antibakteri yang dihasilkannya ke dalam medium biakan secara optimal. Hal ini sesuai dengan Suwandi (1989) bahwa kebanyakan metabolit sekunder disekresikan ke dalam medium biakan. Setelah digojog, kemudian medium disentrifuge dengan kecepatan 5000 rpm selama 1 jam agar terjadi pemisahan antara supernatan dengan biomassa sel yang mengendap. Supernatan yang telah didapat kemudian diinokulasikan ke paper disk steril sebanyak 40μL. Selanjutnya paper disk yang telah diinokulasikan supernatan dikeringkan di atas kaca arloji steril untuk menghilangkan ekses air, kemudian paper disk yang telah diinokulasi supernatan diletakkan di permukaan lempengan medium NA yang telah diinokulasi


54

bakteri uji S.aureus dan E.coli. Perlakuan yang sama juga dilakukan pada kontrol positf dan kontrol negatif. Tujuan dari penyamaan volume 40μL ini adalah untuk mendapat hasil yang dapat dibandingkan dengan kontrol. Sebagai kontrol positif digunakan salah satu antibiotik yang beredar di pasaran, yaitu Amoksisilin dalam injeksi (Danoxilin®). Dipilih bentuk sediaan injeksi untuk mendapatkan Amoksisilin murni tanpa bahan tambahan yang dapat mempengaruhi proses difusi Amoksisilin. Antibiotik ini dapat menghambat dan mematikan pertumbuhan penyebab

penyakit

bisul.

Digunakan

Amoksisilin

bakteri S.aureus murni

dengan

konsentrasi 20 mg/ml untuk bakteri uji S.aureus dan konsentrasi 25 mg/ml untuk bakteri uji E.coli. Konsentrasi yang berbeda dipilih karena menurut Lateef, Oloke, & Gueguim-Kana (2004) MIC (Minimum Inhibitory Concentrations) dari amoxicilin berada di range antara 10-20 mg/ml untuk S.aureus dan antara 10-25 mg/ml untuk E.coli. Kontrol negatif menggunakan medium NB tanpa diinokulasi isolat bakteri endofit, yang diberi perlakuan sama dengan NB yang diinokulasikan dengan bakteri endofit kode B dan kode D. Paper disk diletakkan di atas lempengan medium NA yang telah diinokulasi dengan S.aureus dan

E.coli.

Kemudian di inkubasi selama 24 atau sampai terbentuk zona hambat disekitar paper disc dengan suhu 37oC. 8. Pengujian Potensi Antibakteri dari Senyawa Antibakteri yang Dihasilkan Isolat Bakteri Endofit dengan Bakteri Uji S.aureus


55

Senyawa antibakteri yang dihasilkan isolat bakteri endofit kode B dan kode D yang diperoleh dari tahap 6, diuji potensi antibakterinya dengan bakteri uji S.aureus. Setelah inkubasi 24 jam, terlihat adanya zona jernih di sekitar paper disc, hal ini menunjukkan bahwa pertumbuhan bakteri S.aureus dihambat oleh senyawa antibakteri yang dihasilkan Bakteri Endofit kode B. Berdasarkan hasil pengukuran diameter zona hambat dengan waktu inkubasi 24 jam, rata-rata diameter zona hambat yang dihasilkan sebesar 9,6 mm dan rata-rata zona hambat pada amoksisilin (kontrol positif) adalah 25 mm, sedangkan pada kontrol negatif (medium NB tanpa inokulasi bakteri endofit) tidak memberikan zona hambat (Gambar 2, Tabel I).

Gambar 2. Hasil Pengujian Potensi Senyawa Antibakteri yang Dihasilkan Bakteri Endofit kode B Terhadap S.aureus dengan Waktu Inkubasi 24 Jam K- : Medium Nutrient Broth tanpa inokulasi bakteri endofit P : Senyawa antibakteri yang dihasilkan Bakteri Endofit kode B K+ : Amoksisilin konsentrasi 20 mg/ml


Tabel I.

56

Hasil Pengukuran Diameter Zona Hambat dari Senyawa Antibakteri yang Dihasilkan Bakteri Endofit kode B Terhadap S.aureus dengan Waktu Inkubasi 24 Jam Diameter Zona Hambat (mm) Senyawa

Kontrol Positif

Kontrol Negatif

antibakteri yang

Amoksisilin

Nutrient broth

dihasilkan Bakteri

(Konsentrasi 20

(Tanpa Inokulasi

Endofit kode B

mg/ml)

Bakteri Endofit)

1

9

24

0

2

10

26

0

3

10

25

0

Rata-rata ± SD

9,6 ± 0,47

25 ± 0,82

0±0

Ulangan

Rata-rata diameter zona hambat senyawa antibakteri yang dihasilkan Bakteri Endofit kode D terhadap S.aureus dengan waktu inkubasi 24 jam sebesar 10,3 mm dan rata-rata diameter zona hambat kontrol positif (Amoksisilin) sebesar 24,7 mm, sedangkan pada kontrol negatif (medium NB tanpa inokulasi bakteri endofit) tidak memberikan zona hambat. Hal ini menunjukkan bahwa isolat bakteri endofit kode D pada medium NB dapat tumbuh dengan optimal dan dapat mensekresikan senyawa antibakteri ke dalam medium dengan jumlah yang cukup (Gambar 3,Tabel II).


57

Gambar 3. Hasil Pengujian Potensi Senyawa Antibakteri yang Dihasilkan Bakteri Endofit kode D Terhadap S.aureus dengan Waktu Inkubasi 24 Jam K- : Medium Nutrient Broth tanpa inokulasi bakteri endofit P : Senyawa antibakteri yang dihasilkan Bakteri Endofit kode D K+ : Amoksisilin konsentrasi 20 mg/ml Tabel II. Hasil Pengukuran Diameter Zona Hambat dari Senyawa Antibakteri yang Dihasilkan Bakteri Endofit kode D Terhadap S.aureus dengan Waktu Inkubasi 24 Jam Diameter Zona Hambat (mm) Senyawa antibakteri

Kontrol Positif

Kontrol Negatif

yang dihasilkan

Amoksisilin

Nutrient broth

Bakteri Endofit kode

(Konsentrasi 20

(Tanpa Inokulasi

D

mg/ml)

Bakteri Endofit)

1

10

25

0

2

11

25

0

3

10

24

0

Rata-rata ± SD

10,3 ± 0,48

24,7 ± 0,47

0±0

Ulangan

Dari hasil pengujian potensi senyawa antibakteri yang dihasilkan bakteri endofit kode B dan endofit kode D terhadap S.aureus dengan waktu inkubasi 24 jam, dapat diketahui bahwa senyawa antibakteri yang dihasilkan bakteri endofit kode D memberikan zona hambat yang lebih besar dari senyawa


58

antibakteri yang dihasilkan bakteri endofit B. Hal ini menunjukkan bahwa isolat bakteri endofit kode D pada medium NB dapat tumbuh lebih optimal dan dapat mensekresikan senyawa antibakteri ke dalam medium dengan jumlah cukup. Senyawa yang dihasilkan bakteri endofit kode B dan kode D yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri uji S.aureus bersifat sebagai antibakteri. Mekanisme kerja antibakteri dari senyawa yang dihasilkan endofit kode B dan kode D yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri uji E.coli belum diketahui dengan baik, dan diduga terlibat dalam perusakan membran sel oleh senyawa lipofilik. Untuk mengetahui mekanisme penghambatan dari senyawa antibakteri yang dihasilkan bakteri endofit kode B dan kode D terhadap S.aureus, perlu dilakukan karakterisasi senyawa antibakteri tersebut, sehingga dapat diprediksikan mekanisme penghambatan dari senyawa antibakteri yang dihasilkan bakteri endofit kode B dan kode D terhadap S.aureus. Dari hasil pengamatan, dipilih bakteri endofit kode D yang merupakan bakteri penghasil senyawa antibakteri yang lebih optimal daripada bakteri endofit kode B. Bakteri endofit kode D lebih potensial dalam menghambat pertumbuhan bakteri uji S.aureus daripada bakteri endofit kode B, ditunjukkan dengan diameter zona hambat yang dihasilkan isolat bakteri endofit kode D lebih besar daripada bakteri endofit kode B. Hal ini berarti senyawa antibakteri yang dihasilkan bakteri endofit kode D lebih spesifik untuk bakteri uji E.coli daripada senyawa antibakteri yang dihasilkan bakteri endofit kode


59

B. Bakteri endofit kode D digunakan untuk langkah kerja selanjutnya yaitu identifikasi dan determinasi bakteri endofit tersebut. 9. Pengujian Potensi Antibakteri dari Senyawa Antibakteri yang Dihasilkan Isolat Bakteri Endofit dengan Bakteri Uji E.coli Senyawa antibakteri yang dihasilkan isolat bakteri endofit kode B dan kode D yang diperoleh dari tahap 6, diuji potensi antibakterinya dengan bakteri uji E.coli. Setelah inkubasi 24 jam, terlihat adanya zona jernih di sekitar paper disc, hal ini menunjukkan bahwa pertumbuhan bakteri E.coli dihambat oleh senyawa antibakteri yang dihasilkan Bakteri Endofit kode B. Berdasarkan hasil pengukuran diameter zona hambat dengan waktu inkubasi 24 jam, rata-rata diameter zona hambat yang dihasilkan sebesar 9,7 mm dan rata-rata diameter zona hambat pada amoksisilin (kontrol positif) adalah 39,7 mm sedangkan pada kontrol negatif (medium NB tanpa inokulasi bakteri endofit) tidak memberikan zona hambat (Gambar 4,Tabel III).


60

Gambar 4. Hasil Pengujian Potensi Senyawa Antibakteri yang Dihasilkan Bakteri Endofit B Terhadap E.coli dengan Waktu Inkubasi 24 Jam K- : Medium Nutrient Broth tanpa inokulasi bakteri endofit P : Senyawa antibakteri yang dihasilkan Bakteri Endofit kode B K+ : Amoksisilin konsentrasi 25 mg/ml Tabel III. Hasil Pengukuran Diameter Zona Hambat dari Senyawa Antibakteri yang Dihasilkan Bakteri Endofit kode B Terhadap E.coli dengan Waktu Inkubasi 24 Jam Diameter Zona Hambat (mm) Senyawa antibakteri

Kontrol Positif

Kontrol Negatif

yang dihasilkan

Amoksisilin

Nutrient broth


(Konsentrasi 25

(Tanpa Inokulasi

B

mg/ml)

Bakteri Endofit)

1

10

40

0

2

10

39

0

3

9

40

0

Rata-rata ± SD

9,7 ± 0,48

39,7 ± 0,32

0±0

Ulangan

Rata-rata diameter zona hambat senyawa antibakteri yang dihasilkan Bakteri Endofit kode D terhadap E.coli dengan waktu inkubasi 24 jam sebesar 8,7 mm dan rata-rata diameter zona hambat kontrol positif (Amoksisilin) sebesar 24,7 mm, sedangkan pada kontrol negatif (medium NB tanpa inokulasi bakteri endofit) tidak memberikan zona hambat. Hal ini


61

menunjukkan bahwa isolat bakteri endofit kode D pada medium NB dapat tumbuh dengan optimal dan dapat mensekresikan senyawa antibakteri ke dalam medium dengan jumlah yang cukup (Gambar 5,Tabel IV).

Gambar 5. Hasil Pengujian Potensi Senyawa Antibakteri yang Dihasilkan Bakteri Endofit kode D Terhadap E.coli dengan Waktu Inkubasi 24 Jam K- : Medium Nutrient Broth tanpa inokulasi bakteri endofit P : Senyawa antibakteri yang dihasilkan Bakteri Endofit kode D K+ : Amoksisilin konsentrasi 25 mg/ml Tabel IV. Hasil Pengukuran Diameter Zona Hambat dari Senyawa Antibakteri yang Dihasilkan Bakteri Endofit kode D Terhadap E.coli dengan Waktu Inkubasi 24 Jam Diameter Zona Hambat (mm) Senyawa antibakteri

Kontrol Positif

Kontrol Negatif

yang dihasilkan

Amoksisilin

Nutrient broth


(Konsentrasi 25

(Tanpa Inokulasi

D

mg/ml)

Bakteri Endofit)

1

9

40

0

2

8

38

0

3

9

39

0

Rata-rata ± SD

8,7 ± 0,58

24,7 ± 1

0±0

Ulangan


62

Dari hasil pengujian potensi senyawa antibakteri yang dihasilkan bakteri endofit kode B dan endofit kode D terhadap E.coli dengan waktu inkubasi 24 jam, dapat diketahui bahwa senyawa antibakteri yang dihasilkan bakteri endofit kode B memberikan zona hambat yang lebih besar dari senyawa antibakteri yang dihasilkan bakteri endofit kode D. Hal ini menunjukkan bahwa isolat bakteri endofit kode B pada medium NB dapat tumbuh lebih optimal dan dapat mensekresikan senyawa antibakteri ke dalam medium dengan jumlah cukup. Senyawa yang dihasilkan bakteri endofit kode B dan kode D yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri uji E.coli bersifat sebagai antibakteri. Mekanisme kerja antibakteri dari senyawa yang dihasilkan endofit kode B dan kode D yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri uji E.coli belum diketahui dengan baik, dan diduga terlibat dalam perusakan membran sel oleh senyawa lipofilik. Untuk mengetahui mekanisme penghambatan dari senyawa antibakteri yang dihasilkan bakteri endofit kode B dan kode D terhadap E.coli, perlu dilakukan karakterisasi senyawa antibakteri tersebut, sehingga dapat diprediksikan mekanisme penghambatan dari senyawa antibakteri yang dihasilkan bakteri endofit kode B dan kode D terhadap E.coli. Dari hasil pengamatan, dipilih bakteri endofit kode B yang merupakan bakteri penghasil senyawa antibakteri yang lebih optimal daripada bakteri endofit kode D. Bakteri endofit kode B lebih potensial dalam menghambat pertumbuhan bakteri uji E.coli daripada bakteri endofit kode D, ditunjukkan dengan diameter zona hambat yang dihasilkan isolat bakteri endofit kode B


63

lebih besar daripada bakteri endofit kode D. Hal ini berarti senyawa antibakteri yang dihasilkan bakteri endofit kode B lebih spesifik untuk bakteri uji E.coli daripada senyawa antibakteri yang dihasilkan bakteri endofit kode D. Bakteri endofit kode B digunakan untuk langkah kerja selanjutnya yaitu identifikasi dan determinasi bakteri endofit tersebut. Dari hasil pengujian potensi antibakteri dari senyawa antibakteri yang dihasilkan isolat bakteri endofit kode B dan kode D terhadap S.aureus dan E.coli secara difusi paper disc, didapatkan hasil bahwa senyawa antibakteri yang dihasilkan isolat bakteri endofit kode B dan kode D dapat menghambat pertumbuhan S.aureus dan E.coli. Senyawa antibakteri yang dihasilkan isolat bakteri endofit kode B dan kode D dapat menjadi model atau prekursor dalam penemuan senyawa antibiotik baru yang potensial dalam menghambat pertumbuhan dari bakteri patogen. Eksplorasi mikrobia endofit potensial merupakan alternatif untuk mendapatkan senyawa antibiotik baru. Dengan menyelidiki hubungan struktur dan aktifitas dari senyawa antibakteri yang dihasilkan isolat bakteri endofit dengan potensinya sebagai antibiotik, diharapkan akan didapatkan senyawa antibiotik baru dengan efek farmakologis yang diiginkan (Samuelsson, 1999). 10. Identifikasi Bakteri Endofit kode B dan Bakteri Endofit kode D Dari skrining potensi antibakteri, didapatkan hasil senyawa antibakteri yang dihasilkan bakteri endofit kode B lebih berpotensi menghambat E. coli daripada senyawa antibakteri yang dihasilkan bakteri endofit kode D. Sedangkan senyawa antibakteri yang dihasilkan bakteri endofit kode D lebih


64

berpotensi menghambat S.aureus daripada senyawa antibakteri yang dihasilkan bakteri endofit kode B. Selanjutnya dilakukan identifikasi kedua isolat bakteri endofit tersebut. Identifikasi bakteri dilakukan dengan mengetahui sifat morfologi sel, sifat morfologi koloni dan sifat biokimia. a. Pengamatan Morfologi Sel Isolat Bakteri Endofit kode B dan Bakteri Endofit kode D 1. Pewarnaan Gram Pewarnaan Gram merupakan pewarnaan diferensial yang sangat berguna

dan

paling

banyak

digunakan

dalam

laboratorium

mikrobiologi. Pewarnaan ini merupakan tahap penting dalam pencirian dan identifikasi bakteri (Lay, 1994) Pewarnaan Gram memilahkan bakteri menjadi kelompok Grampositif dan Gram-negatif. Bakteri Gram-positif berwarna ungu karena tetap mengikat kompleks zat warna kristal violet-yodium meskipun diberi larutan pemucat (alkohol 95%). Bakteri Gram-negatif berwarna merah karena kompleks kristal violet-yodium larut sewaktu pemberian larutan pemucat, dan dapat diwarnai oleh cat lawan yang berwarna merah (safranin). Hal ini disebabkan karena dinding sel bakteri Gramnegatif mempunyai kandungan lipida yang lebih tinggi dibandingkan dinding sel bakteri Gram-positif. Lipida ini akan larut dalam larutan pemucat, sehingga pori-pori dinding sel membesar dan meningkatkan daya larut kompleks kristal violet-yodium bakteri Gram-negatif. Fungsi cat lawan (safranin) hanyalah sebagai pembeda (kontras)


65

terhadap cat warna kristal violet. Dari hasil yang didapatkan, isolat bakteri endofit kode B dan isolat bakteri endofit kode D sama-sama merupakan bakteri Gram-positif (warna ungu). Sebagian besar dinding sel bakteri endofit kode B dan bakteri endofit kode D terdiri dari peptidoglikan (ciri bakteri Gram-positif). Pada bakteri endofit kode B dan bakteri endofit kode D akan terbentuk persenyawaan kompleks kristal violet-yodium ribonukleat, hal ini menyebabkan bakteri endofit tetap berwarna ungu karena kompleks persenyawaan kompleks kristal violet-yodium ribonukleat pada bakteri endofit tidak larut dalam larutan pemucat (alkohol 95%). Penambahan cat lawan (safranin) tidak menyebabkan perubahan warna pada bakteri endofit, karena persenyawaan kompleks kristal violet-yodium tetap terikat pada dinding sel bakteri endofit, sehingga bakteri endofit kode B dan isolat bakteri endofit kode D tetap berwarna ungu.

Gambar 6. Pengecatan Gram Isolat Bakteri Endofit kode B Keterangan Gambar: Sel bakteri ditunjukkan dengan warna ungu (Gram positif), berbentuk.batang (basil), garis lurus menunjukkan panjang 32,2 μm.


66

Gambar 7. Pengecatan Gram Isolat Bakteri Endofit kode D Keterangan Gambar: Sel bakteri ditunjukkan dengan warna ungu (Gram positif), berbentuk. batang (basil), garis lurus menunjukkan panjang 30,2 μm. 2. Pengecatan Spora Menurut Lay (1994) spora pada bakteri merupakan struktur yang tahan panas dan tahan bahan kimia. Spora dibentuk oleh bakteri tertentu untuk mengatasi lingkungan yang tidak menguntungkan bagi bakteri. Spora terbentuk dalam sel sehingga seringkali disebut sebagai endospora, dalam sel bakteri hanya terdapat 1 spora. Spora ini tidak berfungsi untuk reproduksi. Semua endospora bakteri mengandung sejumlah besar asam dipikolinat, substansi ini tidak terdeteksi pada sel vegetatif. Sejumlah besar kalsium juga terdapat dalam endospora, dan diduga bahwa lapisan korteks spora ( lapisan yang menutupi spora ) terbuat dari kompleks Ca2+-asam dipikolinat-peptidoglikan (Pelczar & Chan, 1986). Lapisan luar spora merupakan penahan yang baik terhadap bahan kimia, sehingga spora sukar diwarnai. Spora bakteri dapat diwarnai dengan dipanaskan. Pemanasan dengan api bunsen menyebabkan


67

lapisan luar spora mengembang, sehingga zat warna Malachite green dapat masuk ke dalam spora. Setelah dingin warna hijau ini akan terperangkap di dalam spora. Pencucian preparat dengan air akan mencuci zat warna Malachite green dari sel vegetatif, namun tidak dapat mencuci zat warna Malachite green dalam spora. Pada penambahan zat warna safranin, preparat tidak perlu dipanaskan. Zat warna safranin termasuk zat warna basa, sehingga akan mengikat muatan negatif yang terdapat pada permukaan sel. Safranin tidak akan masuk ke dalam spora, dan

sel vegetatif akan terlihat merah,

sedangkan spora berwarna hijau. Dari hasil yang diperoleh bakteri endofit kode B dan D membentuk spora, ditunjukkan dengan anak panah berwarna merah, dan sel vegetatif bakteri endofit kode B dan D ditunjukkan dengan anak panah berwarna biru.

Gambar 8. Pengecatan Spora Isolat Bakteri Endofit kode B Keterangan Gambar: Spora ditunjukkan dengan anak panah berwarna merah, sel vegetatif ditunjukkan dengan anak panah berwarna biru, garis lurus menunjukkan panjang 27,8 μm


68

Gambar 9. Pengecatan Spora Isolat Bakteri Endofit kode D Keterangan Gambar: Spora ditunjukkan dengan anak panah berwarna merah, sel vegetatif ditunjukkan dengan anak panah berwarna biru, garis lurus menunjukkan panjang 28,8 μm. 3. Pengecatan Acid Fast Pewarnaan tahan asam digunakan untuk memilahkan kelompok Mycobacterium dan Nocardia dari bakteri lainnya. Kelompok bakteri ini disebut tahan asam karena dapat mempertahankan zat warna pertama yaitu carbolfuchsin sewaktu dicuci dengan larutan pemucat yang mengandung asam dan alkohol. Bakteri tahan asam memiliki keistimewaan, karena dinding selnya mengandung lipida yang terlihat sebagai lapisan lilin. Kandungan lipida ini sangat tinggi, pada beberapa spesies, lipida ini dapat mencapai sampai 60% dari berat dinding sel. Kandungan lipida yang tinggi ini menyebabkan sel bakteri sulit diwarnai, karena zat warna tidak dapat menembus lapisan lilin ini. Sifat tahan asam berkaitan dengan kandungan lipida dinding sel, oleh karena itu digunakan pemanasan sehingga zat warna dapat masuk ke dalam sel bakteri yang diliputi oleh lipida. Jika bakteri tahan asam


69

diwarnai dengan zat warna pertama (carbolfuchsin), maka zat warna ini tidak mudah dilunturkan oleh larutan pemucat. Metylen biru sebagai zat warna kedua tidak akan menyebabkan perubahan warna merah (dari carbolfuchsin) pada bakteri tahan asam. Sebaliknya pada bakteri yang tidak tahan asam, larutan pemucat akan melarutkan cat warna pertama sehingga bekteri tidak berwarna. Setelah penambahan cat warna kedua yaitu metylen biru, bakteri yang tidak tahan asam akan berwarna biru (Lay, 1994). Dari hasil yang diperoleh bakteri endofit kode B dan kode D merupakan bakteri yang tidak tahan asam karena sel berwarna biru.

Gambar 10. Pengecatan Acid Fast Isolat Bakteri Endofit kode B Keterangan Gambar: Bakteri endofit kode B merupakan bakteri yang tidak tahan asam, ditunjukkan dengan sel berwarna biru, Perbesaran 1000x.


70

Gambar 11. Pengecatan Acid Fast Isolat Bakteri Endofit kode D Keterangan Gambar: Bakteri endofit kode D merupakan bakteri yang tidak tahan asam, ditunjukkan dengan sel berwarna biru, Perbesaran 1000x. 4. Motilitas Pergerakan bakteri (motilitas) diamati dengan membuat agar tegak yaitu Nutrient Broth ditambah dengan 0,2% - 0,4% agar. Tujuan dari penambahan agar adalah untuk diperoleh medium semi padat sehingga pertumbuhan bakteri di sekitar tusukan akan terlihat. Bakteri endofit kode B dan bakteri endofit kode D yang berumur 48 jam diinokulasi dengan cara tusukan dalam agar tegak tersebut. Dari hasil pengamatan untuk bakteri endofit kode B dan kode D, di sekitar arah tusukan ada pertumbuhan seperti serabut- serabut tipis ke arah luar tusukan sehingga bakteri endofit kode B dan kode D dapat dikatakan mengalami pergerakan (Lampiran 5) Pada pengamatan morfologi sel isolat bakteri endofit kode B, dapat diketahui bahwa isolat bakteri endofit kode B memiliki ciri sel berbentuk. batang, bersifat gram positif, membentuk spora, tidak tahan asam dan bergerak (motil).


71

Pada pengamatan morfologi sel isolat bakteri endofit kode D, dapat diketahui bahwa isolat bakteri endofit kode D memiliki ciri sel berbentuk. batang, bersifat gram positif, membentuk spora, tidak tahan asam dan bergerak (motil). b. Pengamatan Morfologi Koloni Isolat Bakteri Endofit kode B dan Bakteri Endofit kode D. Pada tahap pengamatan morfologi koloni digunakan beberapa medium yaitu: medium NA miring, Medium NA tegak dan medium Nutrient Broth. 1. Medium Nutrient Broth Medium Nutrient Broth ditinjau dari konsistensinya berbentuk cair, sehingga dapat digunakan untuk mengetahui kebutuhan bakteri endofit terhadap O2. Setelah isolat bakteri bakteri endofit kode B dan bakteri endofit kode D diinkubasi 24 jam pada medium Nutrient Broth, tampak pertumbuhan bakteri endofit sebagian besar di permukaan medium, serta ada pula pertumbuhan di dasar tabung membentuk endapan berwarna putih. Bakteri endofit kode B dan bakteri endofit kode D pada medium NB mempunyai ciri berbau tidak enak, tingkat kekeruhan sedang bila dibandingkan dengan kontrol Nutrient Broth tanpa inokulasi bakteri endofit yang berwarna kuning jernih. Hal ini menunjukkan bahwa bakteri endofit kode B dan bakteri endofit kode D bersifat fakultatif anaerob, karena bakteri endofit kode B dan bakteri endofit kode D dapat tumbuh di dasar dan juga di permukaan medium (Lampiran 6)


72

2. Medium Nutrient Agar Tegak Tabung yang berisi Nutrient Agar dibiarkan tegak hingga memadat, agar tegak ini digunakan untuk pengamatan morfologi koloni bakteri endofit secara tusukan. Bakteri endofit kode B dan bakteri endofit kode D dalam medium NA tegak pertumbuhannya lebih baik pada bagian permukaan medium, berwarna putih susu, pertumbuhan mengikuti arah tusukan jarum, bentuk pertumbuhan pada bekas tusukan tampak tebal dan seperti rambut (villous) (Lampiran 7) 3. Medium Nutrient Agar Miring Nutrient Agar miring dibuat dengan memiringkan tabung yang berisi NA pada kemiringan 30-450, dan dibiarkan memadat. NA miring memiliki permukaan yang luas sehingga dapat digunakan untuk pengamatan morfologi koloni bakteri endofit. Bakteri endofit kode B dan bakteri endofit kode D dalam medium NA miring terlihat bentuk pertumbuhan koloni sepanjang bekas inokulasi bergerigi atau berbintik-bintik

(echinulate),

berwarna

putih

susu,

tingkat

pertumbuhan sedang, elevasi tipis merata (effuse), mengkilat, topografi permukaan licin (smooth), konsistensi seperti lendir (slimmy), ciri optik tidak tembus cahaya (opaque), berbau tidak enak dan warna medium tidak mengalami perubahan (Lampiran 8)


73

c. Uji Biokimia Untuk mengidentifikasi bakteri tidak hanya berdasarkan sifat-sifat morfologi sel dan koloni saja, tetapi juga perlu diteliti sifat biokimianya. Uji Biokimia didasarkan pada berbagai hasil metabolisme yang disebabkan oleh daya kerja enzim (Lay, 1994). Uji biokimia yang dilakukan meliputi uji katalase, uji oksidase, uji oksidasi-fermentasi (O-F), penggunaan sitrat, uji dekarboksilase lisin, hidrolisis gelatin, pembentukan asam sulfida ( H2S ), pembentukan indol, uji Methyl Red ( MR ), uji urease. Pengamatan uji biokimia dilakukan dengan membandingkan perlakuan dengan kontrol (medium tanpa inokulasi bakteri), penambahan reagen (bila diperlukan) dilakukan pada kedua medium tersebut. 1. Uji Asam Sulfida (H2S) Uji H2S bertujuan untuk mengetahui terbentuknya H2S yang ditunjukkan dengan adanya warna hitam sepanjang garis inokulasi. Pembentukan asam sulfida (H2S) oleh mikroorganisme menunjukkan adanya penguraian asam amino yang mengandung sulfur, asam amino ini dihasilkan sewaktu protein dihidrolisiskan untuk memenuhi kebutuhan

zat

hara

mikroorganisme.

Mikroorganisme

yang

menghasilkan desulfurase sewaktu dibiakkan dengan medium yang kaya dengan asam amino yang mengandung sulfur akan membentuk H2S. Fe++ yang terdapat dalam medium biakan akan bereaksi dengan H2S dan menghasilkan senyawa FeS yang berwarna hitam dan tidak larut dalam air.


74

Pada uji H2S, medium yang digunakan adalah TSIA (Triple Sugar Iron Agar). Medium TSIA mengandung 3 macam gula, yaitu glukosa, laktosa,

sukrosa,

indikator

merah

fenol

dan

FeSO4

untuk

memperlihatkan pembentukan H2S yang ditunjukkan dengan adanya endapan hitam. Pada medium TSIA ini H2S akan bereaksi dengan Fe menjadi FeS yang berwarna hitam. Uji H2S dilakukan dengan cara membandingkan medium yang diinokulasi isolat bakteri endofit terhadap kontrol (tanpa inokulasi bakteri endofit). Cara inokulasi, pada medium TSIA bagian atas yang disebut slant secara goresan, dan pada bagian bawah yang disebut butt secara tusukan (Lay, 1994). Kemudian diinkubasikan selama 24 jam dan dilakukan pengamatan. Dari hasil pengamatan bakteri endofit kode B, medium yang telah diinokulasi isolat bakteri endofit berwarna merah muda pada bagian slant, dan pada bagian butt berwarna kuning, sedangkan pada bagian bawah tempat inokulasi secara tusukan terbentuk warna hitam. Ini berarti hanya glukosa saja yang difermentasikan. Selain itu adanya warna hitam menunjukkan terbentuknya H2S sehingga terjadi penguraian asam amino yang mengandung sulfur. Pada pengamatan bakteri endofit kode D seluruh medium yang telah diinokulasi isolat bakteri endofit berwarna kuning dan pada bagian bawah tempat inokulasi secara tusukan terbentuk warna hitam.


75

Ini berarti laktosa, glukosa dan sukrosa difermentasikan dan juga terbentuk H2S (Lampiran 9). 2. Uji Dekarboksilasi lisin Dekarboksilasi merupakan proses penguraian gugus karboksil dari suatu molekul organik. Proses dekarboksilasi asam amino seringkali juga digunakan untuk menetralisasi lingkungan asam. Pada waktu proses fermentasi, mikroorganisme seringkali menghasilkan hasil sampingan yang bersifat asam yang dapat menghambat pertumbuhan mikroorganisme. Enzim dekarboksilase mengenyahkan gugus asam dari asam amino dan menghasilkan amina

yang menyebabkan

medium pertumbuhan bersifat basa (Lay, 1994) Proses dekarboksilasi lisin dapat diketahui dengan menumbuhkan isolat bakteri endofit dalam medium LIA (Lisin Iron Agar) yang mengandung lisin, karbohidrat yang dapat difermentasikan (glukosa), dan indikator pH brom cresol purple (BCP). Asam yang dihasilkan dalam proses fermentasi glukosa akan menurunkan pH medium LIA dan menyebabkan perubahan warna dari indikator pH dari ungu menjadi kuning. Dalam suasana asam ini proses dekarboksilasi lisin dapat

berlangsung

sehingga

terjadi

pembentukan

amin

yang

menetralisasikan suasana asam medium LIA tersebut. Proses netralisasi ini terlihat sebagai perubahan warna dari kuning menjadi ungu

seperti

sediakala,

perubahan

warna

menjadi

menunjukkan bahwa lisin mengalami dekarboksilasi.

ungu

ini


Pengamatan

uji

dekarboksilasi

lisin

dilakukan

76

dengan

membandingkan medium LIA yang diinokulasikan isolat bakteri endofit terhadap kontrol (tanpa inokulasi bakteri endofit) yang berwarna ungu. Cara inokulasi dengan teknik tusukan. Setelah diinokulasi medium tersebut diinkubasikan selama 24 jam dan dilakukan pengamatan. Dari hasil pengamatan diketahui terjadi perubahan warna dari ungu menjadi kuning pada waktu inkubasi 24 jam dan 48 jam. Hal ini berarti endofit kode B dan bakteri endofit kode D tidak mampu mendekarboksilasi asam amino lisin (Lampiran 10). 3. Uji indol Indol merupakan zat yang berbau busuk yang dihasilkan oleh bakteri yang ditumbuhkan dalam medium yang mengandung triptofan. Asam amino triptofan merupakan komponen asam amino yang lazim terdapat pada protein, sehingga asam amino ini dengan mudah dapat digunakan oleh mikroorganisme akibat penguraian protein. Dalam medium biakan, indol menumpuk sebagai produk buangan, sedangkan bagian lainnya dari molekul triptofan (asam piruvat dan NH4+ ) dapat digunakan untuk memenuhi zat hara mikroorganisme (Lay, 1994). Adanya indol dapat ditentukan dengan cara menambahkan reagen Kovac yang mengandung para-dimetil-aminobenzaldehida pada medium tripton water yang mengandung triptofan. Menurut Koneman et al (1997), uji indol berdasarkan pada pembentukan kompleks merah saat indol bereaksi dengan aldehid dari reagen Kovac.


77

Cara inokulasi bakteri pada medium tripton water dengan tusukan, kemudian diinkubasi selama 24 jam dan dilakukan pengamatan. Saat pengamatan diberikan penambahan diberikan penambahan 5 tetes reagen Kovac pada medium tersebut. Setelah 30 menit, pada medium uji tripton water terbentuk cincin merah di permukaan medium. Hal ini terjadi karena pembentukan kompleks reagen kovac dan indol yang disebut rosindol. Pada pengamatan bakteri endofit kode B dan bakteri endofit kode D setelah didiamkan selama 30 menit tidak terbentuk cincin berwarna merah sehingga dapat diketahui bahwa bakteri endofit B dan bakteri endofit D tidak dapat membentuk indol (Lampiran 11). 4. Uji Methylen Red (MR) Uji Methylen Red digunakan untuk menentukan adanya fermentasi asam campuran. Beberapa bakteri memfermentasikan glukosa dan menghasilkan beberapa produk yang bersifat asam sehingga akan menurunkan pH medium pertumbuhannya menjadi 5,0 atau lebih rendah. Penambahan indicator pH methyl red dapat menunjukkan adanya perubahan pH menjadi asam. Methyl red berwarna merah pada lingkungan dengan pH 4,4 dan berwarna kuning dalam lingkungan dengan pH 6,2 (Lay, 1994). Bila terjadi fermentasi asam campuran, medium akan tetap berwarna merah. Bila tidak terjadi fermentasi asam campuran maka medium berubah menjadi kuning setelah penambahan reagen Metil Red. Dari hasil pengamatan, bakteri endofit B dan bakteri


78

endofit D tidak mampu memfermentasikan asam campuran karena medium berubah menjadi kuning (Lampiran 12). 5. Uji Sitrat Menurut Lay (1994) uji sitrat digunakan untuk melihat mikrobia menggunakan sitrat sebagai satu- satunya sumber karbon dan energi. Digunakan medium Simmon-Sitrat Agar berupa medium padat. Simmon-Sitrat Agar merupakan medium sintetik dengan Na sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon, NH4+ sebagai sumber N dan brom thymol blue sebagai indikator pH. Bila mikrobia mempu menggunakan sitrat, maka asam akan dihilangkan dari medium biakan sehingga menyebabkan peningkatan pH dan mengubah warna medium dari hijau menjadi biru. Dari hasil pengamatan diketahui bahwa bakteri endofit kode B dan bakteri endofit kode D tidak mengalami perubahan warna sehingga bakteri endofit kode B dan bakteri endofit kode D tidak mampu menggunakan sitrat sebagai satu- satunya sumber karbon (Lampiran 13). 6. Uji katalase Katalase adalah enzim yang mengkatalisasikan penguraian hidrogen peroksida (H2O2) menjadi air dan O2. Hidrogen peroksida bersifat toksik terhadap sel karena bahan ini menginaktivasikan enzim dalam sel. Hidrogen peroksida terbentuk sewaktu metabolisme aerob, sehingga mikrobia yang tumbuh dalam lingkungan aerob harus


79

menguraikan bahan toksik tersebut (Lay, 1994). Uji ini dilakukan dengan menambahkan 1 tetes pereaksi 30% H2O2 pada koloni yang diletakkan ditengah obyek gelas. Pada bakteri yang bersifat katalase positif terlihat pembentukan gelembung udara di sekitar koloni. Dari hasil pengamatan, disekitar koloni bakteri endofit kode B dan bakteri endofit kode D tidak tampak adanya gelembung udara. Adanya gelembung udara disebabkan karena bakteri mampu menghasilkan enzim katalase yang mengkatalisis penguraian hidrogen peroksida menjadi air dan O2. Dapat diketahui bahwa bakteri endofit B dan bakteri endofit D sifat katalase negatif (Lampiran 14). 7. Uji Oksidase Menurut Lay (1994) uji oksidase dilakukan untuk menentukan adanya oksidase sitokrom pada mikrobia. Bila koloni bakteri yang bersifat

oksidase-positif

diberi

reagen

oksidase

tetramethyl-

paraphenyldiamine maka warna koloni akan berubah menjadi ungu kehitaman dalam 30 menit. Perubahan warna ini disebabkan oksidase sitokrom mengoksidasi larutan reagens. Uji oksidase dilakukan dengan menambahkan 2-3 tetes reagen tetramethyl-paraphenyldiamine pada koloni yang sudah diteteskan pada permukaan kertas saring. Berdasarkan hasil pengamatan tidak terjadi perubahan warna, maka bakteri endofit kode B dan bakteri endofit kode D bereaksi negatif terhadap uji oksidase (Lampiran 15).


80

8. Uji Gelatin Gelatin adalah protein yang diperoleh sewakti merebus tulang, tulang rawan, atau tenunan ikat hewani lainnya. Protein ini bila didinginkan membentuk gel. Beberapa mikrobia tertentu mampu menguraikan molekul sehingga asam amino yang dihasilkan dapat digunakan sebagai zat hara (Lay, 1994). Uji pencairan gelatin bertujuan untuk mengetahui terjadi atau tidaknya proses hidrolisis gelatin yang dikatalisasi oleh eksoenzim yang disebut gelatinase. Uji pencairan gelatin dilakukan dengan membandingkan medium gelatin yang diinokulasi bakteri terhadap kontrol (tanpa inokulasi bakteri endofit). Inokulasi bakteri dilakukan dengan teknik tusukan. Setelah medium diinokulasi bakteri endofit, kemudian diinkubasi selama 72 jam. Setelah diinkubasi, kedua medium tersebut dimasukkan ke dalam lemari es dengan suhu 20oC, dalam keadaan tegak selama 30 menit. Dari hasil pengamatan diketahui bahwa kontrol negatif membeku dan medium gelatin yang diinokulasi bakteri endofit kode B dan bakteri endofit kode D juga membeku. Hal tersebut menandakan bakteri endofit kode B dan bakteri endofit kode D tidak mampu mencerna gelatin, sehingga medium gelatin tetap membeku saat dikeluarkan dari lemari es. Maka dapat dikatakan bahwa bakteri endofit kode B dan bakteri endofit kode D tidak mengalami pencairan gelatin (Lampiran 16).


81

9. Uji Oksidasi-Fermentasi (OF) Pengujian ini bertujuan untuk mengetahui apakah bakteri mampu menggunakan glukosa sebagai sumber energi. Oksidase akan terjadi pada organisme aerob yaitu pada tabung yang tidak ditutup dengan paraffin. Hasil positif jika terbentuk warna kuning. Sedangkan fermentasi terjadi pada bakteri anaerob yaitu tabung yang ditutup dengan paraffin. Hasil positif ditunjukkan dengan terbentuknya warna kuning. Bakteri fakultatif dapat dilihat dari terbentuknya warna kuning pada kedua tabung. Pengujian ini dilakukan dengan menginokulasikan dengan cara tusukan. bakteri ke dalam 2 tabung yang berisi medium O-F. Setelah dilakukan penginokulasian, salah satu tabung ditutup dengan paraffin. Pengamatan untuk uji OF dengan membandingkan medium OF dengan atau tanpa paraffin yang diinokulasi bakteri endofit terhadap medium kontrol yang berwarna hijau. Dari hasi pengamatan diapatkan bahwa endofit B dan bakteri endofit D pada medium yang ditutup paraffin dan yang tidak ditutup parafin dihasilkan perubahan medium dari hijau menjadi kuning. Maka endofit B dan bakteri endofit D dapat digolongkan dalam bakteri anaerob fakultatif (Lampiran 17 dan 18).


82

Tabel V. Hasil Uji Biokimia Bakteri Endofit Kode B dan Endofit Kode D Hasil Uji Biokimia Uji

Bakteri Endofit Kode B Bakteri Endofit Kode D

H2S

Positif ( + )

Positif ( + )

Dekarboksilasi Lisin

Negatif ( - )

Negatif ( - )

Indol

Negatif ( - )

Negatif ( - )

Methyl Red

Negatif ( - )

Negatif ( - )

Sitrat

Negatif ( - )

Negatif ( - )

Katalase

Negatif ( - )

Negatif ( - )

Oksidase

Negatif ( - )

Negatif ( - )

Pencairan Gelatin

Negatif ( - )

Negatif ( - )

OF-Parafin

Positif ( + )

Positif ( + )

OF tanpa Parafin

Positif ( + )

Positif ( + )

Berdasarkan hasil identifikasi morfologi sel, morfologi koloni, dan uji biokimia isolat bakteri endofit kode B dan bakteri endofit kode D terdapat kesamaan sifat morfologi dan biokimia, sehingga dapat disimpulkan bakteri endofit kode B dan bakteri endofit kode D berasal dari genus yang sama. Hasil menunjukkan bahwa sel berbentuk batang, rangkaian sel tunggal, bersifat gram positif, bergerak (motil), fakultatif anaerob, warna koloni putih, tidak tembus cahaya (opaque), positif terhadap uji H2S dan uji OF parafin maupun tanpa parafin.


83

Hasil pengamatan identifikasi bakteri endofit kode B dan bakteri endofit kode D yang dicocokkan dengan buku panduan determinasi bakteri (Holt et al, 2000) menunjukkan ciri genus Amphibacillus. Genus Amphibacillus adalah kelompok bakteri batang gram positif. Dalam Holt et al (2000) dijelaskan bahwa bakteri genus Amphibacillus mempunyai ciri-ciri sel berbentuk batang, rangkaian sel tunggal atau berpasangan dan kadang membentuk rantai pendek, gram positif, terdapat endospora, fakultatif anaerob, katalase negatif, oksidase negatif, dan motil. Bakteri endofit penghasil senyawa antibakteri terhadap E.coli dan S.aureus yang diisolasi dari batang tanaman A.annua L. pada penelitian ini termasuk dalam genus Amphibacillus. Pada penelitian isolasi dan identifikasi artemisinin dari hasil kultivasi mikrobia endofit dari tanaman A.annua L yang dilakukan oleh Simanjuntak dkk (2004), diketahui bahwa bakteri endofit dalam penelitian tersebut adalah Bacillus polymixa yang termasuk dalam genus Bacillus. Genus Amphibacillus dan genus Bacillus mempunyai kesamaan ciri, yaitu ciri sel berbentuk batang, gram positif, fakultatif anaerob, membentuk endospora, dan motil. Perbedaan dari kedua genus tersebut adalah genus Amphibacillus bersifat katalase negatif, sedangkan genus Bacillus bersifat katalase positif (Holt et al, 2000).


84

Tabel VI. Hasil Identifikasi Isolat Bakteri Endofit Kode B, Bakteri Endofit Kode D, dan Bakteri Genus Amphibacillus Ciri - Ciri

Identitas Isolat Bakteri

Identitas Bakteri Dari

Endofit Kode B dan

Genus Amphibacillus

Bakteri Endofit Kode D

(Holt et al, 2000)

Bentuk sel

Berbentuk batang

Berbentuk batang

Sifat gram

Gram positif

Gram positif

Endospora

Terdapat endospora

Terdapat endospora

Kebutuhan akan O2

Fakultatif anaerob

Fakultatif anaerob

Katalase

Katalase negatif

Katalase negatif

Oksidase

Oksidase negatif

Oksidase negatif

Pergerakan

Motil

Motil


BAB V KESIMPULAN DAN SARAN A. Kesimpulan 1.

Diperoleh isolat bakteri endofit yang dapat diisolasi dari batang A.annua L.

2.

Isolat bakteri endofit yang diperoleh dari batang A.annua L. mempunyai potensi antibakteri terhadap E. coli dan S.aureus.

3.

Isolat bakteri endofit dari batang A.annua L. penghasil senyawa antibakteri terhadap E.coli dan S.aureus diduga termasuk dalam genus Amphibacillus. B. Saran

1.

Perlu dilakukan karakterisasi senyawa antibakteri yang dihasilkan oleh bakteri endofit dari tanaman A.annua L. dalam rangka penemuan antibiotik baru di masa depan.

2.

Perlu dilakukan optimalisasi faktor- faktor pertumbuhan isolat bakteri endofit dari tanaman A.annua L. untuk mendapatkan produksi senyawa antibakteri yang optimal.


86

DAFTAR PUSTAKA Anonim, 1986, Dasar- Dasar Pemeriksaan Mikrobiologi, Jilid I, 15-24,110-111, Fakultas Kedokteran Universitas Gajah Mada, Yogyakarta. Anonim, 1992, Dasar-Dasar Pemeriksaan Mikrobiologi, Jilid II, 110-114, Fakultas Kedokteran Universitas Gajah Mada, Yogyakarta. Anonim, 1999, Inventaris Tanaman Obat Indonesia, Jilid V, 17-18, Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan, Departemen Kesehatan, Jakarta. Anonim, 2005, Isolation of Endophytic Fungi, Available from www.google.isolation of endophytic fungi.com Di akses pada 27 Maret 2006. Anonim, 2006, Staphylococcus aureus, Available from www.wikipedia.com. Di akses pada 1 Oktober 2007. Backer, C.A, & Brink, R. C., 1965, Flora of Java, Spermatophytes Only, Vol II, 362, NVP Noordhoff, Groningen, Netherland. Bonang, G. & Koeswardono, E.S., 1982, Mikrobiologi Kedokteran, Untuk Laboratorium dan Klinik, 135-137, Penerbit PT Gramedia, Jakarta. Campbell, N.A., Reece, J.B., Mitchell, L.G., 2002, Biology, Fifth Edition (Biologi, Edisi Kelima), hal 6, 352-357, Diterjemahkan oleh Lestari, dkk, Jilid 1, Penerbit Erlangga, Jakarta. Castillo, U.F., Strobel, G.A., Ford, E.J., Hess, W.M., Poter, H., Jenson, J.B., Albert, H., Robinson, R., Condron, M.A., Teplow, D.B., Stevens, D., & Yaver, D., 2002, Munumbicins, wide spectrum antibiotics produced by Streptomyces NRRL 30562, endophytic on Kennedia nigriscans, Microbiology 148: 2675-2685. Hendaryono, D.P.S. & Wijayani, A., 1994, Teknik Kultur Jaringan, hal 26-35, Penerbit Kanisius, Yogyakarta. Holt, J.G., Krieg, N.R., Sneath, P.H.A., Staley, J.T., Williams, S.T., 2000, Bergey’s Manual® of Determinative Bacteriology, Ninth Edition, hal 347, 559, Lippincott William & Wilkins, Philadelphia, USA. Horn, W.S., Simmonds, M.S.J., Schartz, R.E., Blaney, W.M., 1995, Phomopsichalasin, a novel antimicrobial agent from endophytic Phomopsis spp., Tetrahedron 14: 3969-3978.


87

Hugo, W.B & Russel, A.D., 1987, Pharmaceutical Microbiology, 20-21, Blackwel Scientific Publication, Oxford. Juteau, F., Masotti, V., Bessiere, JM.., Dherbomez, M., Viano J., 2002, Antibacterial and antioxidant activities of Artemisia annua essential oil. Available from www.pubmed.gov Di akses pada 19 Februari 2006. Jutono, Sudarsono, Hartadi, Suhadi, Susanto, 1980, Pedoman Praktikum Mikrobiologi Umum (Untuk Perguruan Tinggi), 24-25, 90-115, Departemen Mikrobiologi, Fakultas Pertanian Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta. Jawetz, E., Melnick, J.L., Adelberg, E.A., 1986, Review of Medical Microbiology (Mikrobiologi Untuk Profesi Kedokteran), Edisi 16, 107-108, 288, 239, 384, Diterjemahkan oleh Bonang, , Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta. Jawetz, E., Melnick, J.L., Adelberg, E.A., 1996, Mikrobiologi Kedokteran, Edisi XX, 128, 239, 240, Diterjemahkan oleh Nugroho, E., dan Maulany, R.F., Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta Katuuk, J.R.P., 1989, Teknik Kultur Jaringan dalam Mikropropagasi Tanaman, hal 1-4,37,46. Departemen pendidikan dan Kebudayaan, Jakarta. Lateef, A., Oloke, J.K., & Gueguim-Kana, E. B, 2004, Antimicrobial Resistance of Bacterial Strains Isolated From Orange Juice Product, Available from www.pubmed.gov Di akses pada 21 Mei 2006. Lay, B., 1994 Analisis Mikrobia di Laboratorium, 79-101, 129-132, Manajemen PT Grafindo Persada, Jakarta. Mucciarelli, M., Scannerini, S., Bertea, C.M., Maffei, M., 2001, An ascomycetous endophyte isolated from Mentha piperita L.: biological features and molecular studies, Available from www.mycologia.org Di akses pada 21 Mei 2006. Pelczar, M.J & E.C.S Chan, 1986, Dasar-Dasar Mikrobiologi, hal 131-154, Diterjemahkan oleh Ratnasari, dkk, Edisi I, UI Press, Jakarta. Pelczar, M.J & E.C.S Chan, 1988, Dasar-Dasar Mikrobiologi, Diterjemahkan oleh Ratnasari, dkk, Edisi II, 511, UI Press, Jakarta. Prescott, L.M, Harley, J.P, Klein, D.A, 1999, Microbiology, fourth edition, hal 97100, 255, WCB / McGraw-Hill, USA. Pudaritadesantamaria, W., 2004, Potensi Bakteri Rizofer dan Endofit pada Akar Pisang dalam Pengendalian Penyakit Layu Fusarium, Hayati Vol.11 No.2, 67-71.


88

Radji, M., 2005, Peranan Bioteknologi dan Mikroba Endofit Dalam Pengembangan Obat Herbal, Majalah Ilmu Kefarmasian, Vol. II, No.3, 113126. Samuelsson, G., 1999, Drugs of Natural Origin, a Textbook of Pharmacognosy, 4th Revised Edition, Swedish Pharmaceutical Press, Stockholm, Sweden. Santoso, U. & Fatimah N., 2001, Kultur Jaringan Tanaman, UMM Press, Malang. Simanjuntak, P., Bustanusallam, Malini, Otovina, Rahayuningsih & Said, 2004, Isolasi dan Identifikasi artemisinin dari hasil kultivasi mikroba endofit dari tanaman Artemisia annua,. Majalah Farmasi Indonesia, Vol. 15 No.2, 68-74. Sjahrurachman, A., 1996, Resistensi Bakteri terhadap Aminoglikosida, Cermin Dunia Kedokteran No. 108, hal 49. Stace, C. A., 1989, Plant Taxonomy and Biosystematics, 2nd edition, hal17, Arnold, London, UK. Strobel, G.A., & Daisy, B., 2003, Bioprospecting for Microbial Endophytes and Their Natural Products, Microbiol. And Mol. Biology Rev. 67 (4): 491-502. Strobel, G.A., Miller, R.V., Miller, C., Condron, M., Teplow, D.B., & Hess, W.M., 1999, Cryptocandin, a potent antimycotic from endophytic fungus Cryptosporiopsis quercina. Microbiology 145: 1919-1926. Stone JK, Bacon CW, White JF Jr., 2000, An overview of endophytic microbes: endophytism. Microbial endophytes. New York: Marcel Dekker, Inc. 3–29 Suwandi, U., 1989. Mikrobia Penghasil Antibiotika, Cermin Dunia Kesehatan, Vol. 58, 37. Tan, R. X., & W. X. Zou, 2001, Endophytes : a rich source of functional metabolites, The Royal Society of Chemistry, Available from www.natural product.com, Di akses pada 24 Februari 2006. Tjahjoleksono, A., 2005, Teknologi DNA Rekombinan, Available from www.natural product.com, Di akses pada 1 Oktober 2007. Trihendrokesowo, 1986, Dasar-Dasar Pemeriksaan Mikrobiologi, 7-42, Fakultas Kedokteran UGM, Yogyakarta. Wahyuningsih, P.E.R., 2006, Isolasi dan Identifikasi Bakteri Endofit Dalam Akar Talinum triangulare (Jacq) Wild yang Mempunyai Potensi Sebagai


89

Antibakteri Terhadap Staphylococcus Aureus, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta. Worang, R.L., 2003, Fungi Endofit Sebagai Penghasil Antibiotika, Available from www.google.fungi.endofit.com. Di akses pada 19 Februari 2006. Yusnita, 2003, Kultur Jaringan : Cara Memperbanyak Tanaman secara Efisien, Agromedia Pustaka, Jakarta.


90

Lampiran 1 : Surat Keterangan Determinasi Tanaman Artemisia annua L.


91


92

Lampiran 2 :

Tanaman Artemisia annua L.

Lampiran 3 :

Isolasi Bakteri Endofit pada MS Medium dengan Waktu Inkubasi 3 hari


93

Lampiran 4 :

Isolasi Kembali Bakteri Endofit dengan Metode Streak Platting dengan Waktu Inkubasi 24 Jam

Lampiran 5 :

Hasil Uji Motilitas Bakteri Endofit kode B dan Bakteri Endofit kode D pada Medium Semi Solid

Keterangan : A : Bakteri endofit kode B mengalami pergerakan, di sekitar arah tusukan ada pertmbuhan seperti serabut-serabut tipis ke arah luar tusukan B : Bakteri bakteri endofit D mengalami pergerakan, di sekitar arah tusukan ada pertmbuhan seperti serabut-serabut tipis ke arah luar tusukan C : Kontrol medium semi solid tanpa inokulasi bakteri endofit


Lampiran 6 :

94

Hasil Uji Morfologi Koloni Bakteri Endofit kode B dan Bakteri Endofit kode D pada Nutrient Broth

Keterangan : A : Terlihat pertumbuhan bakteri endofit kode B rata pada seluruh medium. Pada permukaan dan dasar medium terlihat pertumbuhan seperti selaput B : Terlihat pertumbuhan bakteri endofit kode D rata pada seluruh medium. Pada permukaan dan dasar medium terlihat pertumbuhan seperti selaput C : Kontrol medium Nutrient Broth tanpa inokulasi bakteri endofit

Lampiran 7 :

Hasil Uji Morfologi Koloni Bakteri Endofit kode B dan Bakteri Endofit kode D pada Nutrient Agar Tegak


95

Keterangan : A : Terlihat pertumbuhan bakteri endofit kode B di sepanjang garis inokulasi, tebal dan seperti rambut (villous) B : Terlihat pertumbuhan bakteri endofit kode D di sepanjang garis inokulasi, tebal dan seperti rambut (villous) C : Kontrol medium Nutrient Agar Tegak tanpa inokulasi bakteri endofit Lampiran 8 :

Hasil Uji Morfologi Koloni Bakteri Endofit kode B dan Bakteri Endofit kode D pada Nutrien Agar Miring

Keterangan : A : Medium NA miring yang diinokulasi bakteri endofit kode B, bentuk pertumbuhan koloni echinulate dan berwarna putih susu. B : Medium NA miring yang diinokulasi bakteri endofit kode D, bentuk pertumbuhan koloni echinulate dan berwarna putih susu. C : Kontrol medium NA miring tanpa inokulasi bakteri endofit Lampiran 9 : Hasil Uji Asam sulfida (H2S)


96

Keterangan : A : Medium TSIA yang diinokulasi bakteri endofit kode B berwarna merah muda pada bagian slant, dan pada bagian butt berwarna kuning, pada bagian bawah terbentuk warna hitam. Inkubasi 24 jam B : Medium TSIA yang diinokulasi bakteri endofit kode D berwarna kuning pada bagian slant dan butt, pada bagian bawah terbentuk warna hitam. Inkubasi 24 jam C : Kontrol medium TSIA tanpa inokulasi bakteri endofit

Lampiran 10 :

Hasil Uji Dekarboksilasi Lisin

Keterangan : A : Medium LIA yang diinokulasi bakteri endofit kode B tetap berwarna kuning setelah inkubasi 24 jam B : Medium LIA yang diinokulasi bakteri endofit kode D tetap berwarna kuning setelah inkubasi 24 jam C : Kontrol medium LIA tanpa inokulasi bakteri endofit


Lampiran 11 :

97

Hasil Uji Indol

Keterangan : A : Medium Tripton Water yang diinokulasi bakteri endofit kode B tidak terbentuk cincin warna merah setelah inkubasi 24 jam B : Medium Tripton Water yang diinokulasi bakteri endofit kode D tidak terbentuk cincin warna merah setelah inkubasi 24 jam C : Kontrol medium Tripton Water tanpa inokulasi bakteri endofit

Lampiran 12 :

Hasil Uji Methylen Red (MR)


Keterangan : A : Medium MR yang diinokulasi bakteri endofit kode B, ditambah reagen metil merah medium menjadi berwarna (Inkubasi 24 jam) B : Medium MR yang diinokulasi bakteri endofit kode D, ditambah reagen metil merah medium menjadi berwarna (Inkubasi 24 jam) C : Kontrol medium MR tanpa inokulasi bakteri endofit

Lampiran 13 :

98

setelah kuning setelah kuning

Hasil Uji Sitrat

Keterangan : A : Medium Simmon’s Citrate yang diinokulasi bakteri endofit kode B, medium tetap berwarna hijau setelah Inkubasi 24 jam B : Medium Simmon’s Citrate yang diinokulasi bakteri endofit kode D, medium tetap berwarna hijau setelah Inkubasi 24 jam C : Kontrol medium Simmon’s Citrate tanpa inokulasi bakteri endofit


Lampiran 14 :

99

Hasil Uji Katalase

Keterangan : Tidak terdapat gelembung udara pada koloni bakteri endofit kode B ( A ) dan bakteri endofit kode D ( B ) setelah ditetesi pereaksi H2O2 30%

Lampiran 15 :

Hasil Uji Oksidase

Keterangan : Tidak muncul warna ungu setelah koloni bakteri endofit kode B ( A ) dan bakteri endofit kode D ( B ) ditetesi reagen tetramethyl-paraphenyldiamine. Warna yang terjadi sama dengan kontrol ( C )


Lampiran 16 :

100

Hasil Uji Gelatin

Keterangan : A : Tidak terjadi pencairan gelatin pada medium NB + gelatin yang diinokulasi bakteri endofit kode B B : Tidak terjadi pencairan gelatin pada medium NB + gelatin yang diinokulasi bakteri endofit kode D C : Kontrol medium NB + gelatin tanpa inokulasi bakteri endofit.

Lampiran 17 :

Hasil Uji Oksidasi-Fermentasi (OF) tanpa Paraffin


101

Keterangan : A : Terjadi perubahan warna medium OF yang diinokulasi bakteri endofit kode B tanpa paraffin dari hijau menjadi kuning. B : Terjadi perubahan warna medium OF yang diinokulasi bakteri endofit kode D tanpa paraffin dari hijau menjadi kuning. C : Kontrol medium OF tanpa paraffin dan tanpa inokulasi bakteri endofit

Lampiran 18 :

Hasil Uji Oksidasi-Fermentasi (OF) dengan Paraffin

Keterangan : A : Terjadi perubahan warna medium OF yang diinokulasi bakteri endofit kode B dan ditutup paraffin dari hijau menjadi kuning. B : Terjadi perubahan warna medium OF yang diinokulasi bakteri endofit kode D dan ditutup paraffin dari hijau menjadi kuning. C : Kontrol medium OF tanpa inokulasi bakteri endofit dan ditutup paraffin.


102

BIOGRAFI PENULIS

Penulis bernama Antonius Alfian Yuan Dias Priharta dilahirkan di Klaten pada tanggal 26 Juli 1985. Penulis anak pertama dari 2 bersaudara, dari pasangan Bernardinos Dias Sidharta dan Caecilia Enita Amarwati. Jenjang pendidikan penulis : TK Mater Dei Marsudirini Yogyakarta (1990-1991), SD Marsudirini Yogyakarta (1991-1997), SLTP Negeri 1 Yogyakarta (1997-2000), SMU Kolese de Britto Yogyakarta (2000-2003). Pada tahun 2003, penulis melanjutkan studi jenjang S1 di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Penulis menjadi Asisten Dosen pada mata kuliah Praktikum Mikrobiologi tahun ajaran 2005/2006 dan 2006/2007, dan Praktikum Analisis Sediaan Obat Tradisional tahun ajaran 2007/2008. Penulis aktif berorgansiasi di ISMAFARSI, menjabat sebagai Komisaris ISMAFARSI Komisariat USD periode 2005/2006. Penulis menjadi delegasi pada RAKERNAS Universitas Pakuan Bogor 2005, PIMFI Universitas Sanata Dharma Yogyakarta 2005, PRAMUNAS Universitas Jendral Achmad Yani Bandung 2006, dan pada event-event regional ISMAFARSI DIY-Jateng. Penulis juga menjadi panitia pada kegiatan Pelepasan Wisudawan 2004, Sumpahan Apoteker 2005, TITRASI 2005, REAKSI 2005, KIO 2006, Seminar SCL 2007, dan Diskusi Panel APOTEKER 2007.

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI BAKTERI ENDOFIT

Recommend Documents