KIT ELISA RABIES PUSVETMA Petri Nandatina Saputri1, Dyah Estikoma1, Nur Sholichah1 1. Pusat Veteriner Farma, Jalan. A. Yani 68 – 70 Surabaya ABSTRACT Rabies is a viral disease that caused by virus neurotropic genus Lyssavirus family Rhabdoviridae, it is a major zoonosis for which diagnostic techniques have been standardized internationally. Antibody detection can be tested with mouse serum neutralization test (MNT), rapid fluorescent focus inhibition test (RFFIT) or enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). ELISA was used in this research in order to increase quality and to validate the method which used in KIT that produced by PUSVETMA. As a result, there are some alteration on conjugate dilution which is 16000 times, dilution of positive control, negative control and 1 EU/ml sera standar which is 1:100. Keywords: ELISA, Rabies, Pusvetma, Viral diseases PENDAHULUAN Rabies disebabkan oleh virus neurotropic genus Lyssavirus family Rhabdoviridae dan dapat ditularkan dari hewan ke hewan dan dari hewan ke manusia melalui gigitan. Karena bersifat zoonosis, maka semua material yang dicurigai terinfeksi harus ditangani dengan memperhatikan aspek keamanan sesuai dengan spesifikasi WHO (WHO, 1996). Vaksinasi merupakan tindakan pencegahan yang efektif dalam mengurangi kejadian rabies. Hasil vaksinasi Rabies harus memenuhi standar kebutuhan minimal sesuai dengan acuan OIE, yaitu sama atau lebih besar dari 0,5 Equivalent Unit (EU). (Hooper et al, 1998, WHO Expert Committee in Biological standards, 1985). Antibody netralisasi diyakini merupakan komponen utama dari respon imun melawan virus rabies. Gold standar uji adalah virus netralisasi. Pemeriksaan zat kebal (Antibodi) pada serum dapat dilakukan dengan cara Mouse Netralization (MN), Rapid Fluorecent Focus Inhibition Test (RFFIT) dan Enzyme Linked Immunosorbent Assays (ELISA) atau cara immunoenzimatik lainnya. ELISA merupakan salah satu uji untuk mendeteksi antibodi yang sangat berguna terkait dengan survey epidemiologi dalam populasi besar (Xu et al 2007). Pada saat ini, indirect ELISA telah dikembangkan sehingga didapatkan hasil yang relative cepat dan tidak memerlukan fasilitas laboratorium pendukung yang rumit, seperti fasilitas tissue culture, kandang hewan coba. Kit Indirect ELISA dikembangkan dengan menggunakan virus utuh (Whole Virus) virus rabies strain Pasteur 35321 (PV 35321). Pada beberapa sampel, penggunaan indirect ELISA memperlihatkan hasil yang sensitifitas dan spesifisitasnya sama dengan VN tes. ( Servat et al, 2007). Kajian tentang efikasi vaksinasi rabies menggunakan metode ELISA dan Fluorescent Antibody Virus Neuralization (FAVN) telah dilakukan oleh Hostnik et al., (2006). Sebelum digunakan, Spesifisitas dan sensitivitas uji ini harus dikonfirmasikan
terlebih dahulu.Uji ELISA ini sering kali juga dikombinasikan dengan tes konfirmasi lain seperti FAT atau virus isolasi. Dalam perjalanan produksinya Kit ELISA Rabies PUSVETMA telah mendapat perhatian dalam skala nasional dan internasional. Guna meningkatkan mutu dan kualitas Kit ini telah dilakukan Penelitian dan Pengembangan metode bekerjasama dengan DAFF Australia dalam hal ini AAHL-CSIRO pada kerangka proyek AIPEID. Untuk validasi metode juga bekerjasama dengan BPPV Regional II Bukittinggi selaku lab referens Rabies di Indonesia. Penelitian ini dilakukan dengan tujuan untuk mengkaji Kit ELISA Rabies dalam upaya peningkatan mutu dan pengembangan metode Kit ELISA RABIES di PUSVEMA METODE Peralatan yang digunakan, 2 buah Mikroplat 96 well tercoating dengan antigen rabies. (mikroplat stabil 2 minggu setelah sachet dibuka), Elisa Reader, Elisa Washer, Vorteks/stirrer, Mikro pipet volume ≤ 10 µl, 50 µl, 300 µl, dan 1000 µl, Freezer, Refrigerator, Mikroplate, Inkubator 37°C, 2 buah Plastik adsorben, Pereaksi yang digunakan, 100 µl Kontrol positif serum anjing mengandung antibody rabies dan Thimerosal 0,01% dengan konsentrasi 4 EU, 100 µl Kontrol negatif serum anjing yang negatif antibodi rabies, 100 µl Serum Standar 1 EU/ml, 20 µl Konjugat Peroksidase-rec-protein A, larutan stabil 2 jam setelah dilarutkan, 30 ml Larutan ABTS siap digunakan dan sudah mengandung H2O2, PBST Konsentrat 10X. Digunakan sebagai pelarut Kontrol Positif, Kontrol Negatif, Konjugat, sampel dan proses pencucian, larutan stabil selama 1 bulan setelah dilarutkan, 30 ml Larutan stopper. Tempat penelitian dilakukan di Pusat Veterinaria Farma Surabaya – Jawa Timur – Indonesia, BPPV Regional II Bukittinggi – Sumatera Barat – Indonesia, AAHL – CSIRO – Geelong – Australia. Pembuatan pereaksi, Pengenceran PBS-T 1 kali dengan cara pengenceran, yaitu PBST konsentrat 50 ml ditambah aquades 450 ml. Pengenceran Kontrol Positif dilakukan pengenceran seperti diagram dibawah ini, gunakan vortex/mixer untuk menghomogenkan (Gambar 1) K Pos 10µl
500 µl
500 µl
500 µl
500 µl
500 µl
PBST 990 µl
500 µl
500 µl
500 µl
500 µl
500 µl
K 4 EU
K 2 EU
K 1 EU
K 0,5 EU
K 0,25 EU K 0,125 EU
Gambar 1. Teknik pengenceran PBS-T satu kali Protokol pengerjaan, Dilakukan pengenceran 10µl Kontrol positif ke dalam 990 µl PBST sebagai K 4 EU dan homogenkan, dilakukan seperti Gambar 1. Ditambahkan 500 µl K 4 EU ke 500µl PBST sebagai K 2 EU. Ditambahkan 500µl K 2 EU ke 500µl PBST sebagai K 1 EU. Dilakukan pengenceran yang sama untuk K 0,5 EU: K 0,25 EU: dan K 0,125 EU, Dilakukan penjagaan jangan menyentuh cairan dan selalu mengganti fintip pada pengenceran berikutnya.
Kontrol ST 1 EU Encerkan2,5 µl Kontrol ST 1 EU kedalam 247,5 µl PBST dan homogenkan
Kontrol ST 1 EU
2, 5µl PBST 247,5 µl
Kontrol Negatif Encerkan 2,5 µl Kontrol Negatif kedalam 247,5 µl PBST dan homogenkan, Pada sumuran H11 – H12 sebagai blank, tambahkan diisi PBST 100 µl
Sampel Encerkan 2,5 µl kedalam 247,5 µl PBST dan homogenkan
Kontrol Negatif
2,5µl PBST 247,5 µl
Sampel 2,5 µl PBST 247,5 µl
Konjugat Protein A Encerkan 16.000 x Encerkan 2 µl ke dalam 30 ml PBST dan homogenkan
Konjugat Protein A 2 µl PBST 30 ml
Protokol, Serum Kontrol Positif K 4 EU, K 2 EU , K 1 EU, K 0,5 EU, K 0,25 EU dan K 0,125 EU; serum kontrol ST 1 EU, serum kontrol negatif dan serum sampel yang sudah diencerkan ke dalam sumur mikroplate sebanyak 100 µl (duplo) sesuai urutan. Pada sumuran H11 – H12, tambahkan diisi PBST 100 µl sebagai blank. Tutup mikroplate dengan platik penutup dan inkubasikan pada suhu 37oC selama 60 menit. Buka tutup plastik adsorben dan buang cairan pada Mikroplat, lakukan pencucian dengan volume minimal 200 µl/sumuran sebanyak 4 -5 kali dan tapping hingga tidak ada gelembung air di dalam sumuran. Tambahkan Konjugat Protein A pengenceran 1:16000 sebanyak 100 µl pada semua sumur di mikroplat. Tutup mikroplate dengan platik penutup dan inkubasikan pada suhu 37oC selama 60 menit. Buka tutup plastik adsorben. Buang cairan pada Mikroplat, lakukan pencucian dengan volume minimal 200 µl PBST setiap sumuran sebanyak 4 -5 kali dan tapping hingga tidak ada gelembung air di dalam sumuran. Tambahkan larutan Substrat 100 µl setiap sumuran dan tempat gelap selama 10 menit (Tambahkan larutan stopper bila terjadi perubahan warna dengan cepat, waktu dapat diperpanjang
jika reaksi berjalan lambat) Tambahkan larutan stopper 100 µl kemudian baca dengan alat ELISA Reader pada panjang gelombang 405 nm.
100 µl
A B C D E F G H
1 K 4 EU K 2 EU K 1 EU K 0,5 EU K 0,25 EU K 0,125 EU ST 1EU Kontrol Negatif
2 K 4 EU K 2 EU K 1 EU K 0,5 EU K 0,25 EU K 0,125 EU ST 1 EU Kontrol Negatif
S = sampel
3 S1 S2 S3 S4
4 S1 S2 S3 S4
5 6 7 8 S9 S9 S17 S17 S10 S10 S18 S18 S11 S11 S19 S19 S12 S12 S20 S20
9 S25 S26 S27 S28
10 S25 S26 S27 S28
11 S33 S34 S35 S36
12 S33 S34 S35 S36
S5
S5
S13 S13 S21 S21
S29
S29
S37
S37
S6
S6
S14 S14 S22 S22
S30
S30
S38
S38
S7
S7
S15 S15 S23 S23
S31
S31
S39
S39
S8
S8
S16 S16 S24 S24
S32
S32
BL
BL
BL = Blank
Menggunakan Persamaan garis (Excel): Cara membuat Kurva: X= nilai Equivalen Unit K 4 EU ; K 2 EU ; K 1 EU ; K 0,5 EU ; K 0,25 EU ; K 0,125 EU, Y= nilai Optical Dencity rata2 Kontrol Positif. Blok X dan Y. Arahkan kursor pada chart wizart,klik. Pilih XY (Scater), Pilih gambar grafik “Scatter with smooth line and markers”. Arahkan kursor pada grafik, klik kanan. Pilih “Add Trendline”. Pilih “Logarithmic” pada Trend/Regretion Type. Pilih “Display Equation on chart”, dan “Display R-squared value on chart”. Keluar persamaan garis mis: Y=0,367 Ln(X) +0,900 dan R= 0,9683 ; Persamaan garis dapat diterima apabila R2 mendekati angka 1 (antara 0,9 – 1). Persamaan garis Y- 0,900 =0,367 Ln(X). Ln X = (Y- 0,900) / 0,367. X = Exp (Inverse Ln X) (Gambar 2).
1.6
y = 0.683ln(x) + 1,363 R² = 0.967
1.4 1.2 1
Series1
0.8
Log. (Series1)
0.6 0.4 0.2 0 0
2
4
6
Gambar 2. Kurva Optical Dencity Kontrol Positif Vs EU Kriteria awal diterima: OD maksimum (OD K4 EU) = 1,5 EU ≤ OD K4 EU ≤ 2.5 EU, Nilai R2 = 0,9 – 1, OD kontrol negatif < OD K 0,5 EU, OD PBST Blank ≤ 0,1.
Interpretasi Hasil : EU Titer EU Sampel ≥ 0,5 EU EU Sampel < 0,5 EU
Interpretasi Nilai Titer serum cukup Nilai Titer serum tak cukup
Hasil Positif Negatif
DISKUSI DAN KESIMPULAN Peningkatan mutu dan validasi metode Kit ELISA Pusvetma meliputi berbagai segi dalam manual ELISA Rabies . Pengujian kontrol positif, kontrol negatif dan serum standar yang sebelumnya menggunakan SN tes, telah dilakukan oleh laboratorium independen (AAHL-CSIRO) dengan metode FAVN. Metode uji FAVN dan SN merupakan gold standard uji untuk uji Rabies. Perubahan pengenceran serum Kontrol Positif , Negatif dan sampel serum menjadi pengenceran 1:100, pada kit lama kontrol Positif 4EU tidak diencerkan dan serum sampel diencerkan 1: 50. Perubahan pengenceran, serum kontrol positif dan serum kontrol negatif, diikuti dengan perubahan pengenceran konjugat HRP Protein A yang semula 8000x. Pengujian dilakukan terhadap beberapa variabel pengenceran,dan hasil yang baik terdapat pada pengenceran 1:16.000, seperti terlihat pada Tabel 1, Tabel 2, Tabel 3, Tabel 4 (Gambar 3) berikut ini. Berdasarkan hasil kurva terlihat bahwa pengenceran 12.000x, 15.000x dan 16.000x memberikan nilai rasio yang baik, namun berdasarkan nilai OD pada tabel di atas maka pengenceran 16.000x memberikan hasil yang baik, dan pada nilai 0,5 hasil lebih rendah dibandingkan seri pengenceran lain. Diharapkan dengan berbagai perubahan dan peningkatan mutu kit ELISA Rabies ini akan diperoleh hasil uji yang lebih valid. Tabel 1. Seri Pengenceran Konjugat HRP Protein A
4 2 1 0.5 0.25 0.125 negatif
8000 3.159 2.815 2.535 1.7715 0.957 0.41 0.161
Seri Pengenceran Konjugate 12000 15000 16000 20000 2.36 2.2295 2.3525 2.1985 2.00 1.8115 1.8745 1.667 1.40 1.306 1.195 1.0245 0.77 0.7015 0.636 0.514 0.37 0.382 0.2605 0.2245 0.22 0.2165 0.1185 0.099 0.43 0.39 0.38 0.31
Tabel 2. Perbedaan Kit Elisa Baru dan Lama Bahan Pengujian Kontrol Positif Pengenceran
Kit ELISA Lama Dengan mengunakan Serum Netralisasi Test dengan serum standar International WHO 4 iu langsung tidak
Kit ELISA Baru (Perbaikan AAHL) Dengan menggunakan Florescent Antibody Netralisation Test dengan serum standar OIE 4 iu diencerkan 1:100
Kontrol Positif Pengenceran Serum sampel Pengenceran Konjugate Protein A Aqua yang dipakai
diencerkan 1:50
1:100
1:8000
1:16.000
Aquades vetma
Aqua demin
Tabel 3. Perbedaan Panduan Cara Kerja
1.
2. 3.
4. 5. 6.
7.
Cara Kerja Lama Serum Kontrol Positif K 4 EU; K 2 EU; K 1. 1 EU; K 0,5 EU; K 0,25 EU dan K 0,125 EU; serum Kontrol Negatif tidak diencerkan, serum Sampel yang sudah diencerkan 1:50 dimasukkan kedalam sumuran mikroplat sebanyak 100 µl (duplo) sesuai urutan Tutup mikroplat dengan plastic adsorben dan 2. o inkubasikan pada suhu 37 C selama 60 menit Buka tutup plastik adsorben dan buang cairan 3. dalam mikroplat, lakukan pencucian dengan volume minimal 200 µl PBST setiap sumuran sebanyak 4-5 kali dan tapping hingga tidak ada gelembung udara di dalam sumuran Tambahkan Konjugat Protein A pengenceran 4. 1:8.000 sebanyak 100 µl pada semua sumuran di mikroplat Tutup mikroplat dengan plastik penutup dan 5. inkubasikan pada suhu 37oC selama 60 menit Buka tutup plastic penutup. Buang cairan pada 6. mikroplat, lakukan pencucian dengan volume minimal 200 µl PBST setiap sumuran sebanyak 4-5 kali dan tapping hingga tidak ada gelembung udara di dalam sumuran Tambahkan larutan Substrat 100 µl setiap 7. sumuran dan tempat gelap selama 10 menit (tambahkan stopper bila terjadi perubahan warna dengan cepat, waktu dapat diperpanjang jika reaksi lambat) Tambahkan larutan Stopper 100 µl setiap sumuran kemudian baca dengan alat ELISA Reader dengan panjang gelombang 405 nm.
Cara Kerja Baru . Serum Kontrol Positif K 4 EU; K 2 EU; K 1 EU; K 0,5 EU; K 0,25 EU dan K 0,125 EU; serum Kontrol Negatif dan serum Sampel yang sudah diencerkan 1:100 dimasukkan kedalam sumuran mikroplat sebanyak 100 µl (duplo) sesuai urutan Tutup mikroplat dengan plastic adsorben dan inkubasikan pada suhu 37oC selama 60 menit Buka tutup plastik adsorben dan buang cairan dalam mikroplat, lakukan pencucian dengan volume minimal 200 µl PBST setiap sumuran sebanyak 4-5 kali dan tapping hingga tidak ada gelembung udara di dalam sumuran Tambahkan Konjugat Protein A pengenceran 1:16.000 sebanyak 100 µl pada semua sumuran di mikroplat Tutup mikroplat dengan plastik penutup dan inkubasikan pada suhu 37oC selama 60 menit Buka tutup plastic penutup. Buang cairan pada mikroplat, lakukan pencucian dengan volume minimal 200 µl PBST setiap sumuran sebanyak 4-5 kali dan tapping hingga tidak ada gelembung udara di dalam sumuran Tambahkan larutan Substrat 100 µl setiap sumuran dan tempat gelap selama 10 menit (tambahkan stopper bila terjadi perubahan warna dengan cepat, waktu dapat diperpanjang jika reaksi lambat) Tambahkan larutan Stopper 100 µl setiap sumuran kemudian baca dengan alat ELISA Reader dengan panjang gelombang 405 nm.
Tabel 4. Hasil Duration Of Immunity Dengan menggunakan Kit ELISA baru
0,5 EU An j No 1 An j No 2 An j No 3 An j No 8
0, 89 2
8 bl n V2 0, 89 2
9 bl n V2 0, 89 2
2, 12 2
2, 08 4
2, 10 9
1,5 48
1, 54 6
1, 74 8
0,8 65
1,8 21
1, 82 4
0,6 43
0,4 14
0, 53 1
Pre Vak
1 bln V2
2 bln V2
3 bln V2
4 bln V2
5 bln V2
0,8 92
0,8 92
0,8 92
0,8 92
0,8 92
0,8 92
0,4 29
1,5 54
1,5 21
1,6 17
1,6 5
2,1 07
0,4 29
0,9 33
0,9 43
0,4 25
0,5 43
0,4 29
0,9 91
0,9 67
0,7 29
0,4 29
0,4 74
0,5 66
0,4 03
6 bl n V2 0, 89 2
7b ln V2
15 bl n V2 0, 89 2
18 bl n V2 0, 89 2
19 bl n V2 0, 89 2
2,0 75
2, 24 1
1, 96 7
2, 34 4
2,0 18
2, 06 6
1, 95 2
2,1 6
2, 18 8
1,8 07
1, 80 9
2, 18 1
1,9 47
1, 97 8
1,8 96
1, 89 9
1, 60 4
10 bln V2
11 bln V2
12 bln V2
13 bln V2
14 bln V2
15 bln V2
0,8 92
0,8 92
0,8 92
0,8 92
0,8 92
0,8 92
1, 84
1,7 8
1,7 11
1,7 84
1,8 36
1,8 71
2,2 51
2, 21
1, 64 3
1, 65 6
1,6 77
1,5 22
1,5 74
1,6 88
1,7 51
2,3 26
1, 84
1, 83 2
1, 69 8
1,6 88
1,2 86
1,3 25
1,4 69
1,6 41
1, 69 3
1, 65 3
1, 15 1
1,2 31
0,8 99
0,8 88
2,0 35
1,7 61
17 bln V2 0,8 92
DOI Rabivet Supra 92 1-19 bln Kit Pusvetma 2.5 2 1.5 1 0.5 0
0,5 EU
10 Pre 1 bln 2bln 3bln 4bln 5bln 6bln 7bln 8bln 9 bln bln Vak V2 V2 V2 V2 V2 V2 V2 V2 V2 V2
11 13 15 17 19 12bl 14bl 15bl 18bl bln bln bln bln bln n V2 nV2 n V2 n V2 V2 V2 V2 V2 V2
0.892 0.892 0.892 0.892 0.892 0.892 0.892 0.892 0.892 0.892 0.892 0.892 0.892 0.892 0.892 0.892 0.892 0.892 0.892 0.892
Anj No1 0.429 1.554 1.521 1.617 1.65 2.107 2.122 2.084 2.109 1.84 1.78 1.711 1.784 1.836 1.871 2.251 2.21 2.075 2.241 1.967 Anj No2 0.429 0.933 0.943 0.425 0.543 1.548 1.546 1.748 1.643 1.656 1.677 1.522 1.574 1.688 1.751 2.326 2.344 2.018 2.066 1.952 Anj No3 0.429 0.991 0.967 0.729 0.865 1.821 1.824 1.84 1.832 1.698 1.688 1.286 1.325 1.469 1.641 2.16 2.188 1.807 1.809 2.181 Anj No 8 0.429 0.474 0.566 0.403 0.643 0.414 0.531 1.693 1.653 1.151 1.231 0.899 0.888 2.035 1.761 1.947 1.978 1.896 1.899 1.604
Gambar 3. Perbedaan teknik lama dan teknik baru masa kekebalan vaksin
Kesimpulan kit ELISA metode baru ini telah digunakan untuk menguji hasil penelitian mengenai Duration of Imunity dari vaksin Rabivet Supra ’92, dengan hasil terlihat pada tabel 4 beserta grafik. Perlu dilakukan pengecekan pH air yang akan digunakan sebelum mengencerkan PBST. Perlu dilakukan kajian penggunaan antigen rekombinan untuk mendapatkan hasil yang lebih konsisten dan stabil. DAFTAR PUSTAKA HOOPER D.C., MORIMOTO K., BETTE M., WEIHE E., KOPROWSKI H. & DIETZSCHOLD B. (1998). Collaboration of antibody and inflammation in clearance of rabies virus from the central nervous system. J. Virol., 72, 3711– 3719. Hostnik P, Pavlinic MS, Stezinar SL, Kragelj LZ. 2006. Vaccination againts rabies and protective antibodies – comparison of ELISA and Fluorescent Antibody Virus Neutralization (FAVN) assay. Slovenia: Medical Faculty University of Ljbljana. OIE, 2011, Terestrial Manual, Rabies, Chapter 2.1.13. WORLD HEALTH ORGANISATION (1996). Laboratory Techniques in Rabies, Fourth Edition, Meslin F.-X., Kaplan M.M. & Koprowski H., eds. WHO, Geneva, Switzerland. WORLD HEALTH ORGANIZATION EXPERT COMMITTEE ON BIOLOGICAL STANDARDS. THIRTY-FIFTH REPORT (1985). World Health Organisation Technical Report Series No. 725. WHO, Geneva, Switzerland. SERVAT A., FEYSSAGUET M., BLANCHARD I., MORIZE J.L., SCHEREFFER J.L., BOUÉ F. & CLIQUET F. (2007). A quantitative indirect ELISA to monitor the effectiveness of rabies vaccination in domestic and wild carnivores. J.Immunol. Methods, 318, 1–10. XU G., WEBER P., HU Q., XUE H., AUDRY L., LI C., WU J. & BOURHY H. (2007). A simple sandwich ELISA (WELYSSA) for the detection of lyssavirus nucleocapsid in rabies suspected specimens using mouse monoclonal antibodies. Biologicals, 35, 297–302.
