KULIAH 7 TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN.PDF

Teknologi DNA Rekombinan

Kapas biasa

Kapas-Bt 1

Tomat biasa Tidak tahan hama

Tomat-Bt Tahan hama

► Tanaman

kapas-Bt dan tomat-Bt tahan terhadap serangan hama karena menghasilkan toksin yang dapat membunuh hamanya.

► Toksin

pada kapas-Bt dan tomat-Bt disandikan oleh gen yang berasal dari bakteri Bacillus thuringiensis (Bt = Bacillus thuringiensis)

Tanaman kapas-Bt dan tomat-Bt = tanaman transgenik 2

Organisme transgenik: organisme yang membawa gen yang berasal dari jenis organisme lainnya. Organisme transgenik dihasilkan melalui Rekayasa Genetika Rekayasa Genetika menggunakan Teknologi DNA Rekombinan Teknologi DNA Rekombinan : kumpulan teknik atau metoda yang digunakan untuk mengkombinasikan gen-gen secara buatan. (Proses: rekombinasi; Hasil: rekombinan) Teknologi DNA Rekombinan meliputi: - Teknik untuk mengisolasi DNA. - Teknik untuk memotong DNA. - Teknik untuk menggabung atau menyambung DNA. - Teknik untuk memasukkan DNA ke dalam sel hidup sehingga DNA rekombinan dapat bereplikasi dan dapat diekspresikan. 3

Teknologi DNA Rekombinan berdasarkan mekanisme yang ada pada bakteri:

4

Percobaan Lederberg dan Tatum (1946) menunjukkan: bakteri mempunyai mekanisme seksual: - menyebabkan terbentuknya kombinasi gen-gen yang berasal dari dua sel yang berbeda. - merupakan pertukaran DNA atau gen dari satu sel ke sel lainnya. Mekanisme seksual pada bakteri ini tidak bersifat reproduktif (tidak menghasilkan anak atau zuriat). Lihat konjugasi !

DNA dapat masuk ke dalam sel bakteri melalui 3 cara: 1. Konjugasi 2. Transformasi 3. Transduksi 5

1. Konjugasi : perpindahan DNA dari satu sel (sel donor) ke dalam sel bakteri lainnya (sel resipien) melalui kontak fisik antara kedua sel. DNA sel donor

DNA sel resipien

Pili seks Sel donor (sel jantan)

Sel resipien (sel betina)

2. Transformasi : pengambilan DNA oleh bakteri dari lingkungan di sekelilingnya. DNA asing

Kromosom bakteri (DNA bakteri)

6

3. Transduksi : cara pemindahan DNA dari satu sel ke dalam sel lainnya melalui perantaraan fage. DNA fage Kromosom bakteri

DNA yang masuk ke dalam sel bakteri： a. dapat berintegrasi dengan DNA atau kromosom bakteri sehingga terbentuk DNA rekombinan atau kromosom rekombinan. Kromosom DNA asing Kromosom bakteri rekombinan

Sel Bakteri b. tidak dapat berintegrasi dengan DNA atau kromosom bakteri

By Aris Tj

7

Perangkat utama yang digunakan pada pembentukan DNA rekombinan: •plasmid •enzim restriksi •DNA ligase •bakteri ¾ Plasmid: ƒ ƒ ƒ ƒ

Terdapat pada bakteri DNA selain kromosom Berbentuk sirkuler Umumnya berukuran kecil (lebih kecil dari ukuran kromosom bakteri) ƒ Jenis, jumlah, dan ukurannya bervariasi antar sel dan antar jenis bakteri 8

¾ Enzim Restriksi untuk memotong DNA: Contoh: Enzim EcoRI telah diisolasi pertama kali oleh Herbert Boyer pada tahun 1969 dari E.coli. Enzim EcoRI memotong pada bagian antara basa G dan A pada sekuens GAATTC.

9

Setiap enzim restriksi (endonuklease restriksi) mengenal sekuen pemotongan yang khas dan memotong DNA pada situs pemotongan yang khas. Nama Enzim EcoRI HindIII HhaI TaqI BsuRI BalI NotI BamHI SmaI

Sekuens Pengenal G↓AATTC A↓AGCTT GCG↓C T↓CGA GG↓CC TGG↓CCA GC↓GGCCGC G↓GATCC CCC↓GGG

Organisme asal Escherichia coli Haemophilus influenzae Haemophilus haemolyticus Thermus aquaticus Bacillus subtilis Brevibacterium albidum Nocardia otidiscaviarum Bacillus amyloliquefaciens Serratia marcescens 9

¾Enzim DNA ligase untuk menyambung DNA

10

Menggunakan enzim restriksi dan DNA ligase: Jackson, Simon & Berg (1972) berhasil membuat DNA rekombinan.

12

Bagaimana menyisipkan, memperbanyak dan mengekspresikan informasi genetik dengan menggunakan teknologi DNA rekombinan?

Bakteri

Isolasi Plasmid Kromosom bakteri

Plasmid

Penyisipan gen

Gen yang diinginkan

Plasmid rekombinan

Memasukkan plasmid ke dalam sel bakteri

Bakteri rekombinan

Perbanyakan sel bakteri

Copy gen Gen disisipkan pada tanaman

Isolasi gen

Sel berisi gen yang diinginkan

Copy protein Klon bakteri rekombinan

Gen untuk mengubah bakteri agar dapat membersihkan limbah

Protein untuk membuat salju

Protein untuk melarutkan gumpalan darah dalam terapi serangan jantung 13

Fungsi Plasmid pada pembentukan DNA rekombinan: a. digunakan sebagai vektor untuk mengklonkan gen atau mengklonkan fragmen DNA atau mengubah sifat bakteri. b. untuk memperbanyak gen (copy gene) yang telah disisipkan dengan bantuan sel bakteri

¾ Bagaimana menyimpan seluruh informasi genetik dari suatu organisme?? Pustaka Genom digunakan untuk menyimpan gen atau fragmen DNA yang telah diklonkan. ƒ Isolasi gen menggunakan pendekatan “shotgun” dapat menghasilkan ribuan potongan DNA (fragmen DNA) ƒ Potongan disimpan untuk sementara waktu di dalam pustaka plasmid atau pustaka fage

15

Bagaimana mendeteksi DNA atau fragmen DNA? Teknik Elektroforesis digunakan untuk memisahkan fragmen-fragmen DNA berdasarkan ukurannya. Campuran molekul DNA dengan berbagai ukuran Ｍｏｌｅｋｕｌ berukur besar

Sumber listrik

Gel

Ｍｏｌｅｋｕｌ berukur kecil

(+)

Fragmen DNA yang lebih besar bergerak lebih lambat, fragmen yang lebih kecil bergerak lebih cepat.

16

¾ Bagaimana membuat dan menyisipkan DNA rekombinan pada tanaman: Bakteri Agrobacterium tumefaciens untuk menyisipkan gen ke dalam genom tanaman. Prinsip: 9 Agrobacterium tumefaciens strain liar (galur alami) memiliki plasmid Ti. Pada plasmid Ti terdapat T-DNA yang mengandung gen penyebab tumor. 9 Pada waktu menginfeksi tanaman, Agrobacterium tumefaciens menyisipkan T-DNA ke dalam kromosom sel tanaman sehingga sel-sel tanaman yang terinfeksi membentuk tumor. T-DNA

Plasmid Ti

Kromosom bakteri Agrobacterium

T-DNA

Kromoso m tanaman

17

9 Gen yang diinginkan dimasukkan ke dalam sel tanaman dengan cara menitipkannya (menyisipkan) pada T-DNA. 9 Agrobacterium yang digunakan untuk menginfeksi sel tanaman adalah Agrobacterium yang sudah tidak patogen Agrobacterium DNA mengandung gen yang diinginkan Plasmid-Ti

Penyisipan gen

T-DNA

Situs restriksi

Introduksi ke dalam sel tumbuhan

Plasmid-Ti rekombinan

Regenerasi tanaman

T-DNA membawa gen baru pada kromosom tumbuhan

Tanaman dengan sifat baru 18

Manfaat Teknologi DNA rekombinan telah memberikan manfaat di bidang ilmu pengetahuan maupun di bidang terapan. Contoh: A. Bidang Kesehatan: A1. Insulin manusia telah diproduksi secara massal menggunakan bakteri E.coli dan telah diperdagangkan untuk mengobati penyakit diabetis. Merek dagang: HumulinR A2. Vaksin hepatitis B digunakan untuk mencegah infeksi virus hepatitis. Telah diproduksi secara komersial menggunakan S.cereviciae dalam skala industri A3. Hormon tumbuh manusia (GH) diproduksi menggunakan E.coli dan digunakan untuk mengobati kelainan pertumbuhan (misal: cebol).

19

A4. Therapi gen untuk penyakit dilakukan dengan menggantikan gen yang mengalami kerusakan dengan gen yang normal, digunakan untuk mengobati penyakit-penyakit keturunan (genetic disorders) dan penyakit lain yang disebabkan oleh kerusakan gen (misal: kanker)

Klon gen (alel normal)

Penyisipan normal gen pada vektor

DNA rekombinan Vektor retrovirus

Infeksi sel bone marrow DNA rekombinan menyisip ke kromosom Sel bone marrow dari pasien

Sel Bone marrow mengandung stem sel yang mampu miningkatkan semua sel-sel darah dan sistem imun

Injeksi sel ke pasien

20

B. Bidang Pertanian: B1. Bakteri Ice- (ice minus): bakteri yang telah direkayasa sehingga tidak membeku pada suhu rendah. Digunakan (disemprotkan) pada tanaman agar tanaman tidak membeku di musim dingin. Telah diperdagangkan dengan merek FrostbanR. B2. mikroba pendegradasi limbah. B3. Tanaman tahan hama, misal kapas Bt, tomat Bt B4. Tanaman tahan herbisida.

21

B 5. Peningkatan nilai nutrisi Tanaman

Penambahan nutrisi

Keuntungan

Rice

Provitamin

Vitamin A supplement

Tomato

Flavonoid

Antioxidant

Sugar beet

Fructants

Low calori

Rice

Iron

Iron supplement

22

Bioteknologi Kelautan • Penggunaan hormon pertumbuhan untuk meningkatkan ukuran ikan

23

Penanda (marker)

Tersangka 2

vagina korban

Pelaku kejahatan dapat diidentifikasi dengan menggunakan analisis Sidik Jari DNA misalnya: kasus perkosaan

Penanda (marker) Tersangka 1

C. Bidang Hukum:

•pola pita DNA pada darah pelaku ke 2 sama dengan pola pita yang diperoleh dari tempat kejadian-Æ orang ke 2 adalah pelaku kajahatannya

24

Hubungan keluarga berdasarkan DNA Fingerprint

Bagaimana mencari siapa ibu kita? -DNA mitokondriaÆ diwariskan melalui ibu

Perbedaan pada urutan DNA dapat diketahui dengan teknik RFLP (restriction fragment length polymorfism) - untuk menentukan keturunan, -perbedaan antar satu organisme dengan yang lain.

Pemotongan dengan enzim restriksi

Ｍｏｌｅｋｕｌ berukuran besar Ｍｏｌｅｋｕｌ berukuran kecil

DNA yang berasal dari kromosom

D. Bidang pengembangan ilmu pengetahuan: D1. Membantu upaya memahami terjadinya kelainan pada manusia (penyakit genetik) misalnya kanker payudara, Huntington’s disease. Huntington’s disease disebabkan oleh gen dominan • Gejala sakit mulai terlihat setelah usia pertengahan • Gejalanya antara lain: kemunduran mental, gerakan tubuh tak terkontrol, kesulitan bicara. Biasanya meninggal 10 – 20 tahun setelah timbul gejala. D2. Kemajuan Teknologi DNA telah mendorong para ilmuwan (konsorsium ilmuwan internasional) untuk mewujudkan proyek genom manusia dan genom organisme lainnya

25

Teknologi DNA Rekombinan juga mengandung resiko. Penyebaran pollen berpotensi menyebarkan gen yang diintroduksi dalam tanaman transgenik ke dalam tumbuhan lainnya

22