BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR I Métodos instrumentais de análise para o estudo de células e tecidos - Microscopia Objectivos: ◉ Listar e descrever as ferramentas de estudo da célula ◉ Definir e analisar a metodologia usada na: -Microscopia óptica e electrónica; -Microscopia de fluorescência; -Microscopia de contraste de fase; -Microscopia confocal; Microscopia Electrónica de Transmissão e de Varrimento. ◉ Listar e descrever a preparação do material biológico para a microscopia óptica e electrónica
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA
Poder de resolução
Microscopia depende de: - técnicas de preparação das amostras biológicas - poder de resolução dos microscópios
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA Algumas descobertas importantes na história da microscopia 1611 - Kepler sugere maneiras de construir 1 microsc composto
1683 - Leeuwenhoek visualiza pela 1ªx uma bactéria 1879 - Flemming descreve o comportamento dos cromossomas na mitose de cél animais. 1881 - Retzius, Cajal e outros desenvolvem técnicas de coloração e lançaram os fundamentos da anatomia microscópia 1882 a 1899 – Klebs e Pasteur utilizando variados corantes identificam importantes agentes patogénicos. 1886 – Zeiss constroi uma série de lentes q permite revelar estruturas nos limites teóricos da luz visível
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA Algumas descobertas importantes na histó história da microscopia 1898 – Golgi descreve pela 1ªx o aparelho de Golgi depois da coloração das células com nitrato de prata 1932 – Zernicke inventa o microscópio de contraste de fase Estes 2 microsc permitem que células vivas não coradas sejam vistas em detalhe pela 1ª vez 1981 – Allen e Inoué – aperfeiçoam o microscópio óptico de contraste com sistema de vídeo avançado 1988 – Microscópios confocais de varredura comerciais passam a ser amplamente utilizados
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA Detalhes revelados pelo microscópio óptico O limite máximo de resolução de 1 microscópio óptico é determinado pelo comprimento de onda da luz visível, q varia de 0,4 µm (violeta) a 0,7 µm (vermelho).
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA
Detalhes revelados pelo microscópio óptico Limite de resolução – é o limite de separação pelo qual 2 objectos podem ser distinguidos.
Limite de resolução depende de: - comprimento de onda da luz (λ λ) - abertura numérica do sistema de lentes (an)
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA Detalhes revelados pelo microscópio óptico
A abertura numérica – é a capacidade do sistema de lentes recolher a luz. - lentes secas - an não pode ser maior que 1 - lentes de imersão – an pode chegar a 1,4 Qto > a an > a resolução e > a luminosidade.
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA Preparação do material biológico para a microscopia óptica Fixação
A fixação
imobiliza, mata e preserva e endurece as células. torna-as permeáveis aos corantes e produz uma ligação cruzada entre as suas macromoléculas, permitindo que estas permaneçam estabilizadas nas suas posições naturais
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA Preparação do material biológico para a microscopia óptica Fixação Procedimentos antigos usavam ácidos e solventes orgânicos como o álcool. Diferentes poderes de penetração ∴ usados em combinações. Actualmente usam-se os aldeídos (formaldeído e glutaraldeído) que formam ligações covalentes com os grupos amino-livres das proteínas produzindo ligações cruzadas. Qualquer tratamento usado na fixação pode alterar a estrutura da célula ou das suas moléculas ∴ uma alternativa é o congelamento rápido. Vantagens- proteínas bem preservadas Desvantagens- estrutura fina da célula é destruída pelos cristais de gelo O tecido congelado é seccionado com um criostato (micrótomo mantido numa câmara a ↓ T)
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA Preparação do material biológico para a microscopia óptica Embebição
Mesmo após a fixação os tecidos são macios e frágeis e ceras MO precisam de ser embebidos em resinas,
ME
1º na forma líquida de seguida na forma sólida (por esfriamento ou polimerização).
O material biológico embebido é seccionado com um micrótomo/ultramicrótomo
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA Preparação do material biológico para a microscopia óptica Embebição
O micrótomo – é um aparelho com uma lâmina metálica afiada As secções: - de 1 a 10 µm de espessura, - colocadas sobre a superfície plana de uma lâmina de vidro
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA Preparação do material biológico para a microscopia óptica Coloração
Depois de fixado e seccionado, o material biológico tem que ser corado para poder ser observado ao microscópio.
Uma vez que que os corantes têm diferentes afinidades e poderes de penetração têm que ser utilizadas em combinações.
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA Preparação do material biológico para a microscopia óptica Coloração Há uma relativa falta de especificidade dos corantes a nível molecular que tem levado ao desenvolvimento de procedimentos de coloração mais selectivos e racionais, particularmente a métodos que revelem proteínas específicas ou outras macromoléculas na célula. Assim algumas enzimas podem ser localizadas nas células através da sua actividade catalítica. Regiões mais sensíveis fluorocromos
podem ser avaliadas
através de
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA Microscopia
de
Fluorescência
Moléculas fluorescentes absorvem luz a 1 determinado λ e emite um λ + longo, visualizado através de 1 filtro contra um fundo escuro
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA Microscopia
de
Fluorescência
Os fluorocromos são detectados em microsc de fluorescência q difere dos normais por ter uma luz + potente q passa por 2 conjuntos filtros:
O 1º permite a passagem de λ q excitem determinados fluorocromos
O 2º permite passagem de λ emitidos qdo o corante fluoresce
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA Microscopia
de
Fluorescência
A fluoresceina emite fluorescência verde qdo excitada com luz azul A rodamina “ “ vermelha “ “ “ “ amarel/verde
Imagem de FISH com fluorescein e rodamina
As 2 cores são vistas separada/ alternando conjuntos de filtros
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA Microscopia Qdo se fixa 1a cél
de Contraste
de Fase
ela perde alguns componentes ou são simples/ distorcidos
∴ a forma + correcta de examinar as células seria quando estas ainda estivessem vivas, sem as fixar ou congelar. Qdo a luz atravessa 1a cél viva a fase do λ é alterado de acordo com o índice de refracção da cél. A luz ao passar através do núcleo é retardada e deslocada em relação à luz que atravessam áreas + delgadas. O microsc de contraste de fase explora os efeitos da interferência qdo estes 2 conjuntos de ondas se recombinam, criando uma imagem da estrutura da célula
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA Microscopia
As partes coradas da cél Reduzem a amplitude e ∴ A imagem colorida da cél é vista
de Contraste
de Fase
A luz q passa através de 1a cél não corada sofre pouca alteração de amplitude e ∴ os detalhes das estruturas não se conseguem ver
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA Microscopia
Confucal
Para a microscopia óptica 1 tecido tem q ser cortado em secções q, qto + fina a secção + nítida é a imagem. Neste processo a informação 3D é perdida. Com o Mic confucal de varrimento a partir de 1a série de secções tiradas em ≠s profundidades e armazenadas em computador é fácil reconstruir a imagem 3D o Mic confucal de varrimento é para o microscopista o que o CAT scanner é para o radiologista. Ambos fornecem imagens seccionadas detalhadas do interior de uma estrutura intacta.
Gastrula – Drosophila mic convencional e de fluorescênc confucal
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA Microscopia Electró Electrónica de Transmissão (TEM) TEM – ‘Transmissiom Electron Microscope’ Microscope’ Teorica/ tem 1a resolução 10 000x > q o MO e 1 poder de resolução - 1Å Na prática tem 1a resolução 100x > q o MO e 1 poder de resolução 20Å Porquê?
Devido a problemas na preparação da amostra Contraste e Danos causados pela radiação
No TEM os electrões atravessam a amostra para formar a imagem
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA Algumas descobertas importantes na histó história da microscopia electró electrónica 1897 – J. Thompson anuncia a existência de partículas carregadas –va/ + tarde denominadas “electrões” 1931– Ruska et al constróem o 1º TEM 1935 – Knoll demonstra a viabilidade do mic electrónico de varredura 1939 - Siemens produz o 1º TEM para fins comerciais 1945 – Porter, Claude e Fullam, usam o TEM para examinar célula em cultura depois de fixadas e contrastadas com OsO4 1948 – Pease e Baker, preparam secções de mat biológico de 0,1 a 0,2 µm 1952 – Palade, Porter e Sjöstrand desenvolvem métodos de fixação e corte q possibilitam pela 1ªx a visualização de várias estruturas intracelulares
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA Algumas descobertas importantes na histó história da microscopia electró electrónica 1953 – Porter e Blum desenvolvem o 1º ultramicrótomo 1956 – Glauert et al propõem a resina epoxi araldite como agente de inclusão. 1961 – Luft introduz a resina Epon 1957 – Robertson descreve a estrutura trilaminar da membrana celular vista pela 1ªx no TEM 1959 – Singer usa anticorpos acopolados à ferratina para detectar moléculas da célula 1965 – Cambridge instruments produz o 1º microscópio de varrimento 1968 – De Rosier e Klug descrevem técnicas para a reconstituição de estruturas 3D a partir de micrografias electrónicas
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA Preparação do material biológico para a microscopia electrónica Fixaç Fixação 1º com gluteraldeído que faz com que as moléculas de proteínas façam ligações covalente/ cruzadas com os seus vizinhos 2º com tetróxido de ósmio q se liga e estabiliza as bicamadas lipídicas assim como as proteínas Desidrataç Desidratação Como a amostra é exposta ao vácuo mto forte não pode ser analisada viva, com H2O, ∴ é feita a desidratação numa série crescente de alcoóis
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA Preparação do material biológico para a microscopia electrónica Embebiç Embebição Feita com uma resina q se polimeriza formando 1 bloco sólido de plástico Corte Cortes ultrafinos (na ordem dos 50 a 100nm de espessura) feitos num ultramicrótomo e colocados numa grelha Contrastaç Contrastação Feito com sais de metais pesados como o urânio e o chumbo
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA Preparação do material biológico para a microscopia electrónica
mitocôndria vacúolo
nucléolo
ribossomas
Golgi RE
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA Microscopia
Electró Electrónica de Varrimento
Secções finas obtidos por TEM são pedaços bidimensionais de tecidos e não transmitem de imediato a organização 3D dos componentes celulares
Este é conseguido usando o microscópio electrónico de varrimento, q é num aparelho <, + simples e + barato do q um TEM.
Utiliza os electrões q são dispersos ou emitidos da superfície da amostra ∴
somente características da superfície
podem ser examinadas e a resolução atingível não é mto alta
macrófago
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA Microscopia
A amostra é
Electró Electrónica de Varrimento
fixada, desidratada e coberta com uma camada fina de metal pesado de seguida varrida por um feixe de electrões.
Cílio do ouvido interno do boi
A quantidade de electrões emitidos é medido para controlar a intensidade de um 2º feixe, q se move em sincronia com o 1º e forma a imagem num écran. Como a imagem tem brilhos e sombras dá 1a aparência 3D.
