PCR - BIOTRENDS

BioTrends Vol.6 No.2 Tahun 2015

POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) : PERKEMBANGAN DAN PERANNYA DALAM DIAGNOSTIK KESEHATAN Bugi Ratno Budiarto M.Biotech Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI Jalan Raya Bogor Km. 46, Cibinong Science Center, Bogor, Jawa Barat

Pendahuluan

Bioteknologi modern dan seperti pangan, teknologi ini pun capaiannya dalam tiga dekade ini telah mampu berkontribusi nyata. PCR merupakan teknologi yang tidak lepas dari peran vital Perbaikan varietas-varietas padi mampu melipat gandakan secuplik teknologi PCR. Penemuan protein- melalui teknologi rekayasa fragmen DNA yang terdapat dalam protein baru yang penting melalui genetikatelah mampu komplek makromolekul genom teknologi DNA rekombinan seperti menciptakan padi dengan kualitas dari berbagai sumber (hewan, insulin, hormon faktor perumbuhan unggul baik dari sisi nutrisi yang tumbuhan, bakteri, dan dan antibodi adalah contoh nyata dikandungnya maupun daya n virus)menjadi 2 kali bagaimana teknologi ini sangat adaptasi yang lebih mumpuni lipatnyasecara enzimatis. signifikan perannya dalam proses dibandingkan padi sejenis hasil [8-10] Teknologi ini juga dikenal dengan pencapaian luar biasa umat perkawainan alami . Selain [3-5] tingkat sensitifitas yang cukup manusia .Berkat teknologi PCR aplikasi PCR yang semakin tinggi karena hanya membutuhkan pula pengurutan basa-basa DNA meluas, teknologi PCR pun terus secuplik sampel DNA saja untuk manusia berhasil dituntaskan menurus mengalami perbaikan mendapatkan jutaan kopi DNA dalam kurun waktu yang relatif dan modifikasi mengikuti baru. Sejak pertama kali singkat yang membawa dampak tantangan penelitian yang terus ditemukan oleh Kary Banks Mullis besar bagi dunia kedokteran yang berkembang dan dinamis dewasa [11,12] 32 tahun silam, teknologi PCR membawa arah pengobatan ini . telah merevolusi semua aspek berfokus pada individu pasien atau yang disebut dengan personal biologi molekular di seluruh Dari sisi ekonomi, penemuan luar [6,7] medicine . Disisi lain, bidang dunia.Para ilmuwan bersepakat biasa ini telah menjadi pendorong bahwa penemuan teknologi PCR pertanian terutama kaitannya bertumbuhnya industri-industri pantas disejajarkan dengan dengan kebutuhan pokok manusia bioteknologi dunia, seperti(Abbott penemuan utas DNA(Deoxyribonucleic acid) oleh James D. watson and Francis Crick pada 1953. Teknologi PCR mampu memberidampak cukup signifikan diawal dekade penemuannya terutamapada teknologi kloning gen yang semula tidak mungkin dilakukan menjadi kenyataan yang membawa era baru bioteknologi [1] kearah yang lebih modern . Signifikansi teknologi ini telah menyentuh seluruh ranah penelitian hayati (kesehatan, lingkungan, dan pertanian) yang kemudian berkat teknologi ini pula pengurutan kode genetika manusia berhasil diselesaikan, Gambar 1. Kary B. Mullis (kiri) saat menerima Nobel prize bidang kimia berbagai jenis obat-obatan baru Tahun 1993 (http://www.scienceguardian.com/blog/aditemukan, spesies-spesies baru reminder-as-to-who-kary-mullis-really-is-thank-god.htm) berhasil diidentifikasi dan penanganan penyakit-penyakit berbahaya seperti kankerdan penyakit menular bisa lebih dini [2] dideteksi .

29


Laboratories (U.S.), Becton, Dickinson and Co. (U.S.), Bio-Rad Laboratories (U.S.), Qiagen (Netherlands), Promega (U.S.), Sigma-Aldrich (U.S.), Roche Diagnostics (Switzerland), Siemens Healthcare (Germany), dan Thermo Fisher Scientific (U.S.) dengan omset fantastis dimana keuntungan pasar hampir sebagian besarnya diperoleh dari penjualan enzim polymerase. Omset penjualan atas mesin dan produk-produk PCRdiprediksi akan mencapai angka yang cukup spektakular yaitu sebesar 13.4 miliar dolarpada tahun 2020 (http://www.genengnews.com/key wordsandtools/print/3/36590/). Atas penemuan yang revolusioner diabad 21inilah akhirnya Kary B. Mullis dihadiahi nobel kimia pada tahun 1993 (Gambar 1). Prinsip-prinsip Dasar PCR Ide cemerlang itu muncul secara spontan di dalam kepala Kary B. Mullis ketika berkendara dari San Francisco menuju Mendocin. Dua pasang fragmen oligonukleotida (primer) yang saling berlawanan dan berkomplemen terhadap masing-masing utas DNAnya dengan mengulang siklus (1) denaturasi dimana dua untas DNA dipisahkan secara fisik menggunakan suhu tinggi, (2) annealingdimana suhu diturunkan untuk memfasilitasi penempelan DNA polymerase secara spesifik pada untas tunggal DNA yang sudah berkomplementasi dengan primer spesifiknya, dan (3) polimerasidimana utas tunggal DNA dibaca oleh DNA polymerase dengan menambahkan basa-basa DNA komplemennya (Gambar 3) maka fragmen DNA dapat diperbanyak [13] secara eksponensial .Aplikasi dariprinsip dasar PCR ini terkendala ketika dicobakan diloratorium dikarenakan beberapa

hal berikut: (1) belum ditemukannya enzim DNA polimerase yang tahan panas menyebabkan harus dilakukan penambahan enzim baru setiap siklus polimerasi bertambah yang menyebabkan tidak efisiennya proses pengerjaan untuk mendapatkan jumlah kopi DNA yang ideal dan (2)penggunaan tiga water bath terpisah menyebabkan proses PCR secara teknis cukup [14] sulitdilakukan .Untunglah penemuan enzim DNA polimerase tahan panas dari mikroba Thermophilus aquaticusmengatasi kendalapada pada proses penambahan enzim sekaligus menurunkan biaya PCR yang [15] sebelumnya cukup besar . Tidak lama setelah itu, revolusi mesin PCRdimana suhu tiap-tiap langkah PCR (denaturasi, annealing, dan polimerasi) dikendalikan secara otomatis di dalam satu wadah reaksitertutup juga berhasil diciptakan dengan nama “Thermal [16] Cycler” . Otomatisasi ini selain memudahkan proses PCR hal inijuga berdampak padapemakaian tempat untuk mesin PCR menjadi lebih efisien (Gambar 2). Secara teknis perbanyakan DNA dengan PCR memerlukan tujuh komponen yaitu (1) template/cetakan DNA yang akan diperbanyak, (2) enzim DNA polimerase tahan panas, (3) satu pasang primer, (4) dNTP, (5)kofaktor MgCl2, (6) larutan penyangga dan (7) air. Ke-tujuh komponen tadi dicampurkan di dalam tubung ukuran 200 µL dalam kondisi dingin sebelum dilakukan PCR di dalam mesin thermal cycler. Metode konvensional perbanyakan DNA dengan PCR terdiri dari tiga langkah/stepyang diulang untuk suatu siklus tertentuyaitu (1) denaturasi cetakan/template DNA

30

o

pada suhu 94-95 C, (2) annealing/penempelan primerprimer pada segmen tertentu DNA menggunakan suhu spesifik (suhu spesifik ini didapatkan dari nilai o Tm primer dikurangi 5 C) dimana fragmen DNA akan diperbanyak, o dan (3) polimerasipada suhu 72 C yaitu suhu optimal enzim untuk memanjangkan primer-primer yang sudah menempel tadi.Adapun waktu yang dibutuhkan untuk berpindah dari satu langkah ke langkah selanjutnya dalam satu kali siklus PCR adalah bergantung pada mesin PCRtetapi secara umum durasi denaturasi biasanya paling lama 30 detik, durasi annealing sangat bergantung pada spesifikasi dan panjang primer yang dibuat tetapi untuk mudahnya durasi tidak kurang dari 15 detik dan tidak lebih lama dari 1 menit, sedangkan durasi polimerasi sangat ditentukan oleh panjang fragmen DNA yang dihasilkan dan secara kasar ditetapkan untuk memperbanyak fragmen DNA dengan ukuran 1 kb dibutuhkan durasi 1 menit tergantung pada jenis enzim [17] polimerase yang digunakan . Dari tujuh komponen PCR, perancangan primer yang baik adalah kunci keberhasilan dalam proses amplifikasi DNA dengan metode ini. Adapun pasangan primer yang optimal yaitu bila primer tersebut hanya menempel spesifik pada gen targetnya dan bila proses amplifikasi DNA selesai tidak terbentuk dimer [18] primer . Perancangan primer biasanya menggunakan software bioinformatika dan untungnya saat ini sudah banyak software gratis yang bisa diakses secara online seperti primer3plus (http://www.bioinformatics.nl/cgibin/primer3plus/primer3plus.cgi/).


Gambar 2. Prinsip dasar perbanyakan fragmen DNA dengan teknologi PCR (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/probe/docs/techpcr/)

31


Gambar 3. Alat PCR (kiri) yang digunakan untuk Perbanyakan kopi DNA pada awal sebelum ditemukan mesin Thermal-Cycler PCR (kanan) (http://galleryhip.com/thermal-cycler-pcr.html) Perkembangan Teknologi PCR Teknologi PCR selalu mengalami inovasi mengikuti dan menjawab kebutuhan-kebutuhan di bidang riset maupun diagnostik dan inovasi tersebut terjadi pada komponen “software” yaitu enzim dan komponen kimia pendukungnya, komponen “technique” yaitu metodologi PCR dan komponen “hardware” yaitu mesin PCR.isolasi, kloning gen dan modifikasi dari enzim DNA

polimerase. Sampai tahun 2013 saja sudah diketahui ada 19 jenis DNA polimerase baik type A maupun B dengan karakteristik unik hasil pengisolasiandari berbagai jenis thermotolerant bakteri (genus Themus, Thermoccocus, dan Pyrococcus)sehingga tidak heran dewasa ini persaingan untuk memunculkan DNA polimerase dengan fungsi unggul sangat digencar dilakukan oleh berbagai peneliti di dunia.Pencarian

mikroorganisme-miroorganisme baru di ekosistem yang ekstrim serta modifikasi DNA polimeraseyang sudah ada dengan teknik mutagenesis dan rekayasa genetika merupakan bagian dari upaya untuk mendapatkan DNA polimerase terbarukan yang diharapkan memiliki aktivitas, spesifitas dan stabilitas tinggi sehingga bisa [19-21] meningkatkan efisiensi PCR .

Tabel 1. Jenis-jenisDNA polimerase yang sudah ada di pasar dan digunakan sebagai tools dalam biologi molekular berserta karakteristiknya Karakteristik Jenis Enzim Type DNA Referens Aktivitas Aktivitas Panambahan polimerase eksonukleas eksonukleas i Fidelity adenin pada e 5→3 e 3→5 ujung 3 DNA Taq: [22] Thermus √ Rendah √ aquaticus Tfl: Tidak Thermus Tipe A √ √ [23] diketahui flavus Tma: Thermotoga √ Sedang [24] maritima KOD: Thermococcu √ Tinggi [25] s Tipe B kodacaraensis Pfu: √ Tinggi [22] Pyrococcus

32


furiosus Pwo: Pyrococcus woesei

-

Metodologi PCR yang semula digunakan hanya untuk perbanyakaan DNA saja sekarang sudah jauh mengalami perkembangan yang cukup memukau mengikuti kebutuhan akan analisa berdasarkan kasus yang sedang terjadi. Inovasi terkait technique” PCR yang kini berkembang memiliki peranan

√

Tidak diketahui

cukup signifikan pada hasil-hasil penelitian dewasa ini terutama pada bidang kedokteran seperti prediksi suatu penyakti atau mengukur efektivitas suatu obat melalui perhitungan jumlah kopi gen, analisa keragaman gen pembawa penyakit atau analisa mutasi gen. Metode-metode itu antara lain COLD (Coamplification

-

[26]

at Low Denaturation [27] Temperature)-PCR , PNAC (Peptide Nucleic Acid [28] clamp)PCR ,Supression [29] PCR dan TETRA ARMS (AmplificationRefractory [30] MutationSystem)-PCR . Adapun prinsip dan aplikasi dari masingmasing metode tersebut dapat dilihat pada Tabel 2.

Tabel 2. Metode-metode PCR terkini Metode PCR COLD PCR

PNAC PCR

Supressio n PCR

TETRA ARMS PCR

Prinsip

Fungsi

Aplikasi

Denaturasi selektif missmatch/heterodu pleks DNA (campuran DNA tipe mutan dengan tipe wildnya) pada Tc (suhu critikal)

Pengayaan fragmen DNA yang mengandung mutasi pada populasi suatu sel sel dan deteksi mutasi gen

Penghambatan secara selektif perbanyakan fragmen DNA tipe wild menggunakan oligo peptida Ampflifikasi spesifik pada daerah SS loop dari hairpin DNA yang terbentuk dari ikatan komplemetari yang kuat pada ujung-ujung linker menggunakan primer spesifik gen Amplifikasi fragmen gen spesifik menggunakan sepasang primer pengamit (flanking primer) dan sepasang primer internal yang berposisi saling berlawanan arah

Deteksi mutasi gen

Ref.

1. Pengayaan gen KRAS [31][32] dan gen P53 yang membawa mutasi yang jumlahnya sedikit pada kanker paru 2. Deteksi mutasi DNA BRAF dan K-ras pada kolon kanker 3. meningkatkan akurasi deteksi mutasi K-ras dengan metode analisa kurva leleh (melting curve) Deteksi mutasi KRAS [33] pada kanker kolon dengan tingkat sensitivtas dan spesifitas yang cukup tinggi

Deteksi keragaman gen

Deteksi type alele gen [34] thrombin III, interleukin 1α, insulin like growth factor II, aldolase B, alfa microglobulin, Low Density Lipoprotein

Deteksi keragaman gen dan mutasi

Deteksi mutasi gen PI3KCA exon 9 dan 20 pada kanker payudara

33

[35]


[43]

Berkat teknologi PCR pula pengurutan basa-basa DNA manusia berhasil dituntaskan dalam kurun waktu yang relatif singkat yang membawa dampak besar bagi dunia kedokteran yang membawa arah pengobatan berfokus pada individu pasien atau yang disebut dengan personal medicine Inovasi “hardware” PCR setidaknya pada saat ini terdapat empat jenis mesin PCR yang sudah dikembangkandan digunakan pada penelitian dan diagnostik yaitu (1) mesin PCR konvensional biasa (2) mesin PCR konvensional dengan programgradient temperature, (3) Real-Time PCR,dan (4) droplet digital PCR. Mesin PCR yang dilengkapi dengan gradient temperaturememiliki fungsi utama yaitu optimasi suhu annealing primer secara paralel pada pemakainya untuk mendapatkan suhu annealing terbaik yang akan diterapkan pada perbanyakan DNA selanjutnya. Pengguna tinggal memilih suhu annealing yang diingikan yang mengacu pada nilai Tm (Melting Temperature) primer o [36] dikurangi5 C . Real-Time PCR dengan teknologi komputerisasi yang handal dimana feature yang [37] tawarkan sudah sangat lengkap termasuk program gradient temperature. Real Time PCR memiliki keunggulan dalam hal (1) kemampuan dalam menghitung secara tepat jumlah DNA yang diperbanyak tiap siklusnya yang memungkinkan material genetika yang terdapat pada sampel dapat dihitung secara tepat pula, (2),

perbanyakan DNA selama proses PCR berlangsung bisa diamati secara langsung (Real-Time), (3) menawakan beragam jenis deteksi seperti mutasi, genotyping, perhitungan jumlah sel dan ekspresi gendan (4) mengeliminasi keharusan analisa [38] lebih lanjut seperti elektroforesis yang merupakan keterbatasan dari PCR konvesional. Teknologi terkini dari mesin PCR yaitu droplet digital PCR yang dikembangkan oleh perusahaan ternama Bio-Rad-Ltd. Alih-alih proses amplifikasi DNA dilakukan dalam sistem aquoes, dalam droplet digital PCR sintesis DNA dilakukan secara enkapsulasi air yang teremulsi dalam minyak. Metode partisi ini menyebabkan perhitungan atau analisa DNA dengan droplet digital PCR begitu tinggi ketepatannya. PCR jenis ini memberikan keunggulankeunggulan luar biasa untuk berbagai tujuan penelitian maupun diagnostik seperti (1) analisa [39] keragaman jumlah kopi DNA , (2) deteksi mutasi DNA yang [40] langka , (3) ekspresi gen dan [41] analisa microRNA , (4) aplikasinya dalam Next [42] Generation Sequencing (NGS) dan (5) analisa aktivitas enzim dengan resolusi skala sel tunggal

34

(single cell) . Tidak tertutup kemungkinan beberapa tahun lagi dari sekarang dengan semakin canggihnya teknologi komputer dan berkembangannya ilmu material dan bioteknologi bisa terwujudnya mesin portable PCR dengan dimensi fisik yang cukup kecil tetapi tetap memilikifeaturefeaturetercanggih didalamnya sehingga dengan mesin PCR seperti ini akan sangat membantu bagi para penggunayang dinamis (peneliti kepurbakalaan, petugas kesehatan dan petugas konservasi)yang mengharuskanproses PCR dan olah data di lapangan sehingga data yang didapatkan akan lebih cepat dan akurat. Peranan PCR dalam Diagnostik Kesehatan Diagnostik klasik,sebelum PCR dipopulerkan sebagai metode deteksi dalam klinis, menggunakan metode analisa protein sebagai sarana dalam melakukan deteksi suatu penyakit. Tidak mengejutkan bahwa sistem deteksi yang banyak dipakai atau ditawarkan pada suatu institusi kesehatan seperti rumah sakit pada umumnya menggunakan metode yang mengacu pada prinsip-prinsipimunokimia, sebagai contoh yang terkenal yaitu deteksi human papiloma virus mengunakan tes Pap Smear atau deteksi kelainan sel menggunakan metode imunohistokimia.Namun terkadang, deteksi semacam itu riskan akan terjadinya kesalahan dalam penafsiran hasil dikarenakan rendahnya sensitifitas metode yang mungkin terjadi karenarusaknya antibodi yang digunakan (misalkan salah proses penyimpanan atau kadaluarsa) atau rendahnya kualitas sampel jaringan akibat proses [44] penyimpanan yang terlalu lama . Untuk mengkonfirmasi salah penafsiran data maka diperlukan suatu metode mumpuni baik sifatnya sebagai metode tunggal deteksi atau komplemen untuk mengatasi batasan tadi. Aplikasi PCR dalam diagnostik kesehatan telah banyak dilakukan dewasa ini


yang sudah diakui sebagai gold standard dalam diagnostik klinis seperti FISH (Flouresence In Situ [46] Hybdridization) yang menggunakan prinsip kerja yaitu pelabelan DNA target pada jaringan secara in situ menggunakan probe berflourensensi, IHC [47] (ImmunoHistoChemistry) yang menggunakan prinsip yaitu deteksi protein menggunakan antibodi Secara teknis, metode PCR dapat spesifik yang sudah ditempelkan probe khusus, maupun sanger dipakai sebagai metode [48] komplemen terhadap metode baku sequensing yang menggunakan dengan tingkat sensitifitas dan [45] spesifitas yang cukup tinggi . Oleh sebab ituwajar jika teknologi ini cukup mumpuni dalam mendeteksi mikroorganism berbahaya yang titernya cukup kecil sekalipun dalam beragam sampel, mendeteksi suatu mutasi gen tertentu pada pasien penderita kanker, dan mendeteksi kelainan gen-gen bawaan.

prinsip kerja yaitu pengurutan basa-basa DNA oleh DNA polymerase dengan memasangkan basa-basa DNA yang sudah dimodifikasi secara kimia hanya dengan melibatkan penggunaan satu primer.Dibawah ini adalah tabel 3 kompilasi dari beberapa hasil penelitian beserta aplikasi klinis PCR dalam diagnostik kesehatan terkait deteksi penyakit berbahaya, penyakait turunan dan penyakit kanker.

Tabel 3. Aplikasi metode PCR dalam deteksi berbagai macam penyebab penyakit Aplikasi PCR Diagnost ik penyeba b Penyakit berbaha ya

Diagnost ik penyakit turunan

Deteksi Salmonella sp. pada pangan Mycobacteri um tuberculosis pada darah dan urin Plasmodium sp. pada darah

Lokus ttrRSBCA

Down’s syndrome

Duplikasi gen TTC3 pada kromosom 21 dan KDM2A pada kromosom 11 kromosom sex

48,XXYY syndrome

Diagnost ik kanker

Gen/krom osom

IS6110

18s RNA

Ret syndrome

MEPC2

Otak

Hati

EGFR, TP53, KRAS, dan Neurofibro min 2 dan NF2p.R57 P16

Payudara

Her-2

Metode pembandin g Metode kultur bakteri

Keampuhan metode PCR Sensitifita Spesifisitas s *** ***

Referensi

-

**

**

[50]

Multiplex RealTime PCR Quantitai ve RealTime PCR

Blood smear menggunaka n Microskopi

***

***

[51]

Analisa karyotipe kromosom

***

***

[52]

Quantitati ve flouresce nce PCR Quantitati ve real time PCR Droplet Digital PCR

Anilsa karyotipe kromosom

***

***

[53]

DHPLC, DGGE, dan SSCP Sequencing

***

***

[54]

***

***

[55]

MetilasiPCR

Deteksi stabilitas mikrosatelite DNA atau deteksi mutasi P53 IHC (ImmunoHys toChemistry)

**

**

[56]

***

***

[57]

Metode RealTime PCR NestedPCR

RealTime PCR

*** sangat tinggi** tinggi* sedang

35

[49]


Kebutuhan diagnostik kesehatansaat inikaitannya dengan metode molekular yaitu tersedianya metode molekular yang memenuhi kriteria (1) akurat, (2) cepat, dan (3) murah. Akurasi metode PCR sangat ditentukan oleh kemampuan kita dalam hal (1) merancang pasangan primer spesifik dari gen yang akan diperbanyak, (2) pemilihan gennya, (3) beserta pemilihan metode PCR yang akan dipakai. Pemilihan gen untuk diagnostik menggunakan PCR akan ditentukan oleh kebutuhan dari jenis deteksi. Untuk deteksi bakteri biasanya menggunakan 16sRNA, deteksi jamur menggunakan 18sRNA atau ITS, deteksi kanker menggunakan onkogen spesifik kanker. Pemilihan metode PCR mana yang dipakai tergantung seberapa besar tingkat deteksi yang diinginkan. Deteksi jenis mikroba pada suatu jaringan misalkan, cukup digunakan metode PCR biasa yang digabungkan analisa post-PCR dengan sanger [58] seqeuncing . Sedangkan untuk deteksi mutasi gen pada jaringan kanker yang memerlukan tingkat akurasi tinggi maka biasanya digunakan metode PCR yang telah dimodifikasi seperti telah dipaparkan sebelumnya pada tabel 2.Beberapa hasil penelitian membuktikan metode-metode tersebut memiliki akurasi bervariasi namun secara umum tingkat deteksi mutasi meningkat sebesar 10-100 kalinya jika dibandikan dengan deteksi mutasi dengan metode sanger sequensingdimana produk PCRnya hasil dari perbanyakan metode konvensional PCR. Untuk kecepatan dalam proses mendapatkan hasil, pengolahan sampel (ektrasi DNA, proses pencampuran komponen PCR, proses PCR dan analisa hasil) dengan metode PCR jauh lebih cepat dibandingkan dengan pengolahan sampel yang sama dengan metode IHC hal ini disebabkan karena kompleksitas prosedur IHC dan sulitnya penafsiran hasil pewarnaan yang mengharuskan adanya personel

khusus yang sudah terlatih.Lebih Souriau, Christelle, and Peter J. lanjut, diagnostik gen Hudson. "Recombinant menggunakan metode PCR sudah antibodies for cancer banyak dipakai di rumah sakit dan diagnosis and therapy." Expert opinion on biological pusat-pusat diagnostik sehingga therapy 3.2 (2003): 305-318. dengan pemeriksaan rutin dan masif akan berdampak pada ongkos pemeriksaan yang murah Wilson, Brenda J., and Stuart G. dan tentu itu akan tergantung Nicholls. "The Human pada teknologi PCR yang Genome Project, and recent digunakan semakin sensitif advances in personalized genomics." Risk management metode yang dipakai maka ongkos and healthcare policy 8 diagnostik yang ditawarkanakan sedikit lebih mahal. (2015): 9. Kesimpulan Teknologi PCR akan terus mengalami inovasi seiring dengan perkembangan ilmu pengetahuan hayati yang dewasa ini begitu dinamis dan kompleks. Inovasi teknologi PCR mencakup tiga komponen utama yaitu ‘software”, “hardware” dan “technique”. Penemuan-penemuan baru pada ketiga komponen tersebut telah memperkuat PCR sebagai salah satu tools bioteknologi yang mumpuni dalam menjawab tantangan penelitian maupun diagnostik kedepan. Daftar Pustaka Bartlett, John MS, and David Stirling. "A short history of the polymerase chain reaction." PCR protocols. Humana Press, 2003. 3-6. Gibbs, Richard A. "DNA amplification by the polymerase chain reaction." Analytical Chemistry 62.13 (1990): 1202-1214.

Lunshof, Jeantine E., et al. "Personal genomes in progress: from the human genome project to the personal genome project." Dialogues in clinical neuroscience 12.1 (2010): 47. Ma, Xujun, Qian Qian, and Dahai Zhu. "Expression of a calcineurin gene improves salt stress tolerance in transgenic rice." Plant molecular biology 58.4 (2005): 483-495. Singh, Anil K., et al. "Raising salinity tolerant rice: recent progress and future perspectives." Physiology and Molecular Biology of Plants 14.1-2 (2008): 137-154. Key, Suzie, Julian KC Ma, and Pascal MW Drake. "Genetically modified plants and human health." Journal of the Royal Society of Medicine 101.6 (2008): 290-298.

Garibyan, Lilit, and Nidhi Avashia. "Research Techniques Made Ladisch, Michael R., and Karen L. Simple: Polymerase Chain Reaction (PCR)." The Journal Kohlmann. "Recombinant human insulin." Biotechnology of investigative dermatology progress 8.6 (1992): 469-478. 133.3 (2013): e6. Robson, Martin C., Thomas A. DeGraves, Fred J., Dongya Gao, Mustoe, and Thomas K. Hunt. and Bernhard Kaltenboeck. "The future of recombinant "High-sensitivity quantitative PCR platform." Biotechniques growth factors in wound healing." The American 34.1 (2003): 106-115. journal of surgery 176.2 (1998): 80S-82S. Shampo, Marc A., and Robert A. Kyle. "Kary B. Mullis—Nobel Laureate for procedure to

36


replicate DNA." Mayo Clinic Proceedings. Vol. 77. No. 7. Elsevier, 2002. Mullis, K. B., et al. "Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction." Biotechnology Series (1992): 17-17.

Technology 40.6 (2007): 1475-1483. Cline, Janice, Jeffery C. Braman, and Holly H. Hogrefe. "PCR fidelity of Pfu DNA polymerase and other thermostable DNA polymerases." Nucleic acids research 24.18 (1996): 35463551.

Saiki, Randall K., et al. "Primerdirected enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase." Science 239.4839 (1988): 487-491.

detection assay for colorectal cancer micrometastases in lymph nodes." International journal of cancer 111.3 (2004): 409-414. Kaur, Manjit, and G. Mike Makrigiorgos. "Novel amplification of DNA in a hairpin structure: towards a radical elimination of PCR errors from amplified DNA." Nucleic acids research 31.6 (2003): e26-e26.

Kaledin, A. S., A. G. Sliusarenko, and S. I. Gorodetskiĭ. "[Isolation and properties of DNA polymerase from Machnicki, Marcin M., et al. extreme thermophylic "ARMS-PCR for detection of bacteria Thermus aquaticus BRAF V600E hotspot YT-1]." Biokhimiia (Moscow, Weier, Heinz Ulrich, and Joe W. mutation in comparison with Russia) 45.4 (1980): 644-651. Gray. "A programmable Real-Time PCR-based techniques." Acta Biochimica system to perform the Polonica 60.1 (2013): 57-64. polymerase chain reaction." Diaz, R. S., and E. C. Sabino. DNA 7.6 (1988): 441-447. "Accuracy of replication in the polymerase chain reaction. Mancini, Santucci., et al. “The use van Pelt-Verkuil, Elizabeth, Alex Comparison between of COLD-PCR and highVan Belkum, and John P. Thermotoga maritima DNA resolution melting analysis Hays. Principles and technical polymerase and Thermus improves the limit of detection aspects of PCR amplification. of KRAS and BRAF mutations aquaticus DNA polymerase." Brazilian journal of medical in colorectal cancer. Journal Springer Science & Business and biological research 31.10 of Molecular Diagnostics. Media, 2008. (1998): 1239-1242. 12.5 (2010): 705- 711. He, Q., et al. "Primers are decisive Takagi, Masahiro, et al. for sensitivity of PCR." "Characterization of DNA Castellanos-Rizaldos E, Liu P., et Biotechniques 17.1 (1994): polymerase from Pyrococcus al. “Temperature-Tolerant 82-84. sp. strain KOD1 and its COLD-PCR reduces application to PCR." Applied Kim, Kee Pum, et al. "Improved temperature stringency and and environmental thermostability and PCR enables robust mutation microbiology 63.11 (1997): enrichment. Clinical efficiency of Thermococcus Chemistry. 58.7 (2012): 1130celericrescens DNA 4504-4510. polymerase via site-directed 1138. mutagenesis." Journal of Dąbrowski, Sławomir, and Józef biotechnology 155.2 (2011): Kur. "Cloning and Expression Taback B, Bilchik AJ., et al. 156-163. inEscherichia coliof the ”Peptide nucleic acid clamp PCR: A novel K-ras mutation Recombinant His-Tagged Lee, Jong Il, et al. DNA Polymerases detection assay for colorectal "Characterization and PCR fromPyrococcus cancer micrometastases in application of a thermostable furiosusandPyrococcus lymph nodes. International woesei." Protein expression DNA polymerase from Journal of Cancer. 111 and purification 14.1 (1998): Thermococcus pacificus." (2004): 409-414. Enzyme and Microbial 131-138. Technology 47.4 (2010): 147Broude NE, Zhang L., et al. 152. Carotenuto, Pietro, et al. “Multiplex allel-specific target "Detection of KRAS mutations amplification based on PCR supression. Protocol National Song, Jung Min, et al. in colorectal cancer with Fast COLD-PCR." International of Academic Science. 98.1 "Characterization and PCR journal of oncology 40.2 performance of a family B(2001): 206-211. type DNA polymerase from (2012): 378-384. the hyperthermophilic Harle A, Lion M., et al. “Analysis of PIK3CA exon 9and 20 crenarchaeon Taback, Bret, et al. "Peptide Staphylothermus marinus." nucleic acid clamp PCR: A mutations in breast cancers Enzyme and Microbial using PCR HRM and PCRnovel K‐ras mutation

37


ARMS: correlation with clinicophatological criteria. Oncology Reports. 29 (2013): 1043-1052. Danssaert, J., et al. "RoboCycler 96 cyclers: Higher throughput with 96-well format." Strategies 7 (1994): 66-67. Deepak, S. A., et al. "Real-time PCR: revolutionizing detection and expression analysis of genes." Current genomics 8.4 (2007): 234.

Ramos-Vara, J. A. "Technical aspects of immunohistochemistry." Veterinary Pathology Online 42.4 (2005): 405-426. Reizenstein, E. "Diagnostic polymerase chain reaction." Developments in biological standardization 89 (1996): 247-254.

Sun, Lei, et al. "Rapid detection of Down's syndrome using quantitative real-time PCR (qPCR) targeting segmental duplications on chromosomes 21 and 11." Gene 552.2 (2014): 272-276. 1.

Poppert, Sven, et al. "Rapid diagnosis of bacterial meningitis by real-time PCR and fluorescence in situ hybridization." Journal of Valasek, Mark A., and Joyce J. clinical microbiology 43.7 Repa. "The power of real-time PCR." Advances in (2005): 3390-3397. physiology education 29.3 (2005): 151-159. Watson, Natasha, et al. "Heterogeneous staining for Ruelle, Jean, et al. "Validation of mismatch repair proteins an ultrasensitive digital during population-based droplet PCR assay for HIV-2 prescreening for hereditary plasma RNA quantification." nonpolyposis colorectal Journal of the International cancer." The Journal of AIDS Society 17.4 (2014). Molecular Diagnostics 9.4 (2007): 472-478. Zhu, Guanshan, et al. "Highly Sensitive Droplet Digital PCR Wang, Wei, et al. "Molecular Method for Detection of Genotyping of Human EGFR-Activating Mutations in Rhinovirus by Using PCR and Plasma Cell–Free DNA from Sanger Sequencing." Rhinoviruses. Springer New Patients with Advanced Non– Small Cell Lung Cancer." The York, 2015. 39-47. Journal of Molecular Diagnostics 17.3 (2015): 265- Malorny, Burkhard, et al. 272. "Diagnostic real-time PCR for detection of Salmonella in food." Applied and Heredia, Nicholas J., et al. Environmental Microbiology "Droplet Digital™ PCR quantitation of HER2 70.12 (2004): 7046-7052. expression in FFPE breast cancer samples." Methods Cruz, Heidi Lacerda Alves da, et 59.1 (2013): S20-S23. al. "Evaluation of a nestedPCR for Mycobacterium White, Richard A., et al. "Digital tuberculosis detection in PCR provides sensitive and blood and urine samples." Brazilian Journal of absolute calibration for high throughput sequencing." BMC Microbiology 42.1 (2011): genomics 10.1 (2009): 116. 321-329. Ludlow, Andrew T., et al. "Quantitative telomerase enzyme activity determination using droplet digital PCR with single cell resolution." Nucleic acids research 42.13 (2014): e104-e104.

clinical microbiology 42.12 (2004): 5636-5643.

Rougemont, Mathieu, et al. "Detection of four Plasmodium species in blood from humans by 18S rRNA gene subunit-based and species-specific real-time PCR assays." Journal of

38

Zhang, Qiu-Shi, and Dong-Zhi Li. "A case of 48, XXYY syndrome detected prenatally by QF-PCR." Journal of Maternal-Fetal and Neonatal Medicine 22.12 (2009): 12141216.

Ariani, Francesca, et al. "Real‐time quantitative PCR as a routine method for screening large rearrangements in Rett syndrome: Report of one case of MECP2 deletion and one case of MECP2 duplication." Human mutation 24.2 (2004): 172-177. Pan, Wenying, et al. "Brain Tumor Mutations Detected in Cerebral Spinal Fluid." Clinical chemistry (2015): clinchem-2014. Wong, Ivy HN, et al. "Detection of aberrant p16 methylation in the plasma and serum of liver cancer patients." Cancer research 59.1 (1999): 71-73. Mendoza, Gretel, Amelia Portillo, and Jorge Olmos-Soto. "Accurate breast cancer diagnosis through real-time PCR her-2 gene quantification using immunohistochemicallyidentified biopsies." Oncology letters 5.1 (2013): 295-298. Viljoen, Gerrit J., Louis H. Nel, and John R. Crowther, eds. Molecular diagnostic PCR handbook. Springer Science & Business Media, 2005.

PCR - BIOTRENDS

Recommend Documents