V. FAKTOR FISIK PERTUMBUHAN MIKROBA TUJUAN 1. Memahami pola fase pertumbuhan bakteri Escherichia coli berdasarkan kurva pertumbuhan 2. Mengetahui Generation Time bakteri Escherichia coli berdasarkan kurva pertumbuhan 3. Menentukan persamaan kurva baku Saccharomyces cerevisiae berdasarkan kurva hasil pengamatan 4. Mengetahui korelasi antara jumlah sel mikroba dengan nilai absorbansinya.
5.1 KURVA PERTUMBUHAN PRINSIP DASAR Dinamika pertumbuhan mikroba dapat dipahami dari kurva pertumbuhannya, yang dibuat dengan cara mengukur tingkat pertumbuhan tiap selang waktu tertentu kemudian mengalurkan hasil pengukurannya dalam sebuah grafik yang menunjukkan hubungan antara biomasa pada suhu y versus periode waktu pengukuran pada sumbu x. Kurva pertumbuhan dalam sejumlah medium terbatas akan mengalami fase-fase sebagai berikut : fase lag (adaptasi), fase eksponensial, fase stasioner dan fase kematian. Selanjutnya selain mengetahui fase pertumbuhan juga dapat dihitung waktu generasi, yaitu waktu yang dibutuhkan untuk penggandaan jumlah sel dari jumlah awal yang diinokulasikan. Jumlah sel mikroba sangat banyak sehingga untuk memasukkan datanya dalam kurva pertumbuhan, digunakan angka hasil konversi logaritmik. Jika datanya tidak dikonversikan ke nilai log, kurva pertumbuhan dapat dibuat pada kertas logaritma. Penentuan atau penghitungan jumlah sel dapat dilakukan dengan metode langsung atau metode spektrofotometri dengan mengukur nilai OD (optical density = kepadatan bakteri yang terlihat sebagai kekeruhan medium). Waktu generasi dapat ditentukan menggunakan metode tak langsung dengan ekstrapolasi sederhana dari kurva pertumbuhan. Setelah kurva pertumbuhan terbentuk, pilihlah dua titik pada sumbu y (ordinat) yang merupakan nilai kelipatan dua, misalnya 0,2 dan 0,4. Buat garis lurus horizontal dari kedua titik ke arah kurva, lalu dari titik potong pada kurva ini tarik garis tegak lurus vertikal ke arah sumbu x (absis). Kedua titik potong pada absis menunjukkan interval waktu yang dibutuhkan oleh populasi sel untuk menggandakan populasinya yang disebut dengan “waktu generasi” atau `generation time`. GT = t (OD = 0,4) - t (OD = 0,2) GT : generation time T : waktu OD : optical density (tingkat kekeruhan)
Cara lain dapat diperoleh dari hasil penghitungan langsung hasil metode pengenceran menggunakan rumur sbb: 22
G
tLog2 Logb LogB
G : waktu generasi B : jumlah sel pada awal penghitungan b : jumlah sel pada akhir penghitungan T : interval waktu antara B dan b
Pembuatan kurva pertumbuhan sangat penting terutama dalam menentukan kapan kultur yang kita miliki mesti dipanen. Hal ini tergantung tujuan pemanenan. Untuk mendapatkan inokulum yang aktif pemanenan dilakukan pada fase eksponensial. Sedangkan untuk mendapatkan produk metabolit sekunder misalnya, maka pemanenan dilakukan pada fase stasioner. Dalam latihan ini anda akan melakukan latihan pengambilan data untuk pembuatan kurva pertumbuhan dalam selang waktu yang terbatas untuk mendapatkan beberapa fase dari pertumbuhan mikroba. Karena pertumbuhan secara keseluruhan sangat dipengaruhi oleh keberadaan nutrien, untuk itu jumlah medium yang dipakai adalah terbatas.
BAHAN DAN PERALATAN
Kultur E. coli umur 12 jam dalam medium kaldu nutrisi cair. Fase pertumbuhan ini dapat dipertahankan dengan menyimpannya dalam lemari es Medium kaldu cair steril dalam labu Erlenmeyer 250 ml Waterbath shaker incubator suhu 37C Spektrofotometer Pipet steril ukuran 1 ml dan 10 ml Lampu spiritus atau Bunsen.
PROSEDUR KERJA 1. Masukkan (inokulasikan) 5 ml kultur E. coli menggunakan pipet ke dalam kaldu nutrisi cair steril 2. Ukur OD dari hasil inokulasi tersebut sesegera mungkin pada = 600 m menggunakan spektrofotometer (OD awal biasanya berkisar 0,08 – 0,1) 3. Letakkan kultur pada waterbath shaker inkubator 37C 4. Ulangi pemeriksaan OD setiap 30 menit sekali. Nilai OD pada setiap kali pemeriksaan harus pada nilai 0,05 – 0,5. Jika terlalu pekat, cuplikan kultur yang akan diperiksa OD-nya harus diencerkan dengan medium cair steril sesuai keperluan. 5. Hasil pengukuran OD diplot pada kurva dengan OD sebagai ordinat dan waktu sebagai absis. 6. Hitung waktu generasinya
23
5.2 KURVA BAKU PRINSIP DASAR Kurva baku (standar) sering kita butuhkan untuk memudahkan pekerjaan yang berulang dalam penghitungan sel mikroba. Dengan membuat kurva baku sekali saja, selanjutnya persamaan kurva baku tersebut dapat dipergunakan seterusnya dalam penghitungan sel yang sama yang sifatnya berulang. Pembuatan kurva baku melibatkan penghitungan langsung (direct count) dengan ‘plating’ atau dengan alat haemocytometer dan pengukuran nilai OD. Angka penghitungan langsung akan berkorelasi langsung dengan nilai OD yang didapat yang selanjutnya dapat dinyatakan dalam persamaan garis lurus. BAHAN DAN PERALATAN :
Kultur Saccharomyces cerevisiae umur 12 jam dalam medium kaldu nutrisi cair sebagai inokulum. Fase pertumbuhan ini dapat dipertahankan dengan menyimpannya dalam lemari es Medium kaldu nutrisi cair steril 100 ml dalam labu Erlenmeyer 250 ml Agar nutrisi dalam tabung steril @ 15 ml Akuades steril + NaCl 0,85% dalam 4 buah labu Erlenmeyer 250 ml steril @ 99 ml Akuades steril + NaCl 0,85% dalam 4 tabung steril @ 9 ml Cawan Petri steril 8 buah, 8 pipet steril ukuran 1 ml, dan inkubator 37 C.
PROSEDUR KERJA 1. Beri label Erlenmeyer yang berisi 99ml NaCl 0,85% steril dengan 10-2, 10-4, 10-6, dan 10-8. 2. Beri label tabung yang berisi 9ml NaCl 0,85% steril dengan 10-3, 10-5, 10-7, dan 10-9 3. Encerkan kultur inokulum hingga mencapai konsentrasi 10 -9 dengan memipet sebanyak 1 ml secara bertahap dari pengenceran rendah ke yang lebih tinggi. Pengenceran dilakukan dengan NaCl 0,85% steril. 4. Periksalah OD kultur hasil pengenceran inokulum pada = 600 m menggunakan spektrofotometer. 5. Cairkan agar nutrisi dan jaga suhunya 40-45C 6. Pipet 1 ml dari pengenceran 10-5 - 10-9 ke cawan Petri dan pada saat bersamaan dimasukkan medium yang masih cair untuk melakukan metoda ‘pour plate’. 7. Pengenceran 10-2 -10-4 masing-masing diencerkan kembali sampai ke pengenceran 10-6. Kemudian lakukan pour plate seperti di atas terhadap pengenceran 10 -6 saja. 8. Buatlah kurva dengan memplot hasil pengukuran OD terhadap jumlah bakteri pada kertas logaritma atau tanpa kertas logaritma tetapi data penghitungan langsung dikonversikan dulu ke nilai log. Jumlah bakteri dinyatakan sebagai ordinat, sementara OD sebagai absis. 9. Dengan regresi linier cari persamaan garis hubungan antara absorbansi dengan jumlah sel. 10. Persamaan ini selanjutnya dapat dipakai untuk mengkonversikan data absorbansi ke jumlah sel mikroba per ml yang sebenarnya.
24
