Practica # 2. TECNICA HISTOLÓGICA y HEMATOXILINA-EOSINA. Presenta:
Altamirano Quintero Aydeè. Arrollo Villegas Josué J. Juan José Bravo Ojeda Franco Calderón Pablo Manuel Franco Reyes Urbano Jasso Herrera Oscar Velázquez Rodríguez Sergio GRADO: 5°
GRUPO: 530
Chapingo, México a 18 de septiembre de 2005.
OBJETIVOS DE LA PRÁCTICA. Ψ Ψ Conocer sobre la técnica histológica de Hematoxilina - Eosina y su empleo en el ámbito pecuario. Ψ Ψ Practicar la deshidratación y consecuente uso de alcoholes. Ψ Ψ Conocer y relacionarse con los tipos de fijadores, deshidratantes, colorantes y demás técnicas usadas en la práctica. INTRODUCCIÓN La técnica histológica abarca varios procedimientos, desde la preparación de tejidos para su estudio microscópico, esto se logra sometiendo todo o una parte de tejido previamente seleccionado a una serie de procesos: fijación, deshidratación, aclaración, inclusión, corte y tinción; hasta proporcionar los cortes como se conocen, montados bajo un cubreobjeto con imágenes de estructuras contrastadas, para su estudio bajo microscopia óptica o electrónica. Después de la extracción de un tejido del organismo o cuando se quita la irrigación, empieza a descomponerse a consecuencia de la ausencia de oxigeno y metabolitos esenciales, de la acumulación de dióxido de carbono y otros productos del metabolismo celular y de la acción de diversas enzimas. Por lo tanto, para conservar el estado natural de las células de los tejidos, es necesario detener cuanto antes los procesos de descomposición. Para ello se debe colocar el tejido extirpado en un volumen adecuado de solución fijadora. Otra razón por la cual la fijación es indispensable en cualquier técnica histológica es que si las células no fueron fijadas puede perderse la membrana externa que rodea el protoplasma fluido y consiste en una mezcla de solución verdadera y coloidal de sales, proteínas, carbohidratos, lípidos, ácidos orgánicos y enzimas. La técnica de PAS es una tinción indirecta, por lo que la acción del colorante se intensifica con algún otro agente, llamado mordiente, el colorante solo daría una tinción débil o nula. El mordiente puede añadirse a la solución colorante o utilizarse por separado; generalmente, facilita la combinación del colorante con los tejidos. Si hablamos de la naturaleza de las reacciones entre tejidos y colorantes, debemos mencionar que, en general se trata de reacciones químicas o de fenómenos de adsorción, estas reacciones pueden ser relativamente inespecíficas, como por ejemplo la tinción de nucleoproteínas ácidas por colorantes alcalinos, o de componentes citoplásmicos básicos por colorantes ácidos y pueden ser especificas de grupo como en la reacción de PAS. Se ha visto que dependía de ciertos grupos de átomos llamados cromóforos (en griego “portadores de color”), otros grupos llamados auxocromos (en griego “aumentadores”) y como pueden disociarse y formar compuestos, ayudan también a fijar el colorante a los tejidos; que al unirse a la molécula de colorante aumentan su color. En este caso actúan como donadores de electrones para el cromóforo.
La tinción con Hematoxilina puede ser de dos tipos (progresiva y regresiva), en la progresiva esta prosigue hasta lograr la intensidad deseada de la coloración en los distintos elementos tisulares. En la tinción regresiva, se aplica a los tejidos un exceso de colorante que se elimina después de forma selectiva, hasta lograr la intensidad deseada. FUNDAMENTOS DE LA TINCIÓN CON HEMATOXILINA. La hematoxilina es un colorante natural que se extrae del corazón o duramen del árbol Hematoxylon campechianum. Este árbol se encontró, por primera vez, en la región de Campeche en México, cuyos habitantes conocían bien sus propiedades colorantes. En la actualidad existen plantaciones comerciales, sobre todo en Jamaica. Cuando tienen unos 10 años los árboles se cortan, se quita la corteza y la madera alburente y el corazón se exporta en palos de alrededor de un metro, estos se cortan en pequeños trozos para la extracción y el colorante obtenido se utiliza no solo para microscopia sino también para teñir la seda y la lana. De hecho durante muchos años la única aplicación de la sustancia fue la industria textil, hasta que Waldeyer estableció firmemente su lugar en la histología en 1862. El extracto natural que se obtiene del árbol no es un colorante activo; primero debe ser oxidado para dar Hemateína. En este proceso de transformación oxidativa en hemateína el hematoxilón pierde dos átomos de hidrógeno, y uno de sus elementos se vuelve quinona, en solución alcohólica o acuosa, la oxidación espontánea es muy lenta, y puede requerir hasta un año. Este proceso de oxidación se llama maduración y se puede lograr casi instantáneamente con oxidantes químicos como el oxido de mercurio, el yodato de sodio, el permanganato de potasio, el peroxido de hidrógeno y el hipoclorito de calcio. Durante el proceso oxidativo se forman compuestos distintos de la hemateína, algunos también tienen propiedades colorantes, pero la hemateína es el principal ingrediente activo. Debe entenderse que un colorante de hematoxilina maduro es una mezcla de hematoxilina, hemateína, productos de oxidación activa de la hemateína y hematoxilón y productos de ultra oxidación inactivos. La oxidación demasiado prolongada da lugar a compuestos casi todos incoloros y sin utilidad. MORDIENTES Y HEMATEÍNA Sin mordiente la hemateína es casi inútil, pues un colorante ámbar claro que produce una tinción ámbar también, como un colorante básico en una solución ácida. Los mordientes son substancias cuya estructura fisicoquímica facilita la fijación del colorante sobre los tejidos. Son indispensables para la tinción con hematoxilina, con este colorante se utilizan siempre como mordientes sales bi o trivalentes o hidróxidos de metales. Probablemente se combinan con el colorante en forma de hidróxidos ocupando el lugar de un átomo de hidrógeno y el resto de sus valencias permite unir el complejo colorante-mordiente sobre la estructura tisular, principalmente los grupos fosfatos de los ácidos nucleicos, el complejo resultante de colorante, mordiente y tejido, se llama una “laca”. Pueden utilizarse como mordientes sales de aluminio, hierro, cobre, molibdeno y vanadio; también pueden utilizarse sales simples como sulfatos y cloruros, pero pueden preferirse los alumbre por que eran más fáciles de conseguir en un principio y representan ya toda una tradición. Además los mordientes como el alumbre de hierro oxidan a la hematoxilina, dando un compuesto soluble incoloro. Por consiguiente los elementos tisulares que
contienen la menor cantidad de colorante son los primeros en aclararse, y los que han fijado mucho colorante (cromatina nuclear) siguen intensamente teñidos. Esta tinción intensa de la cromatina se debe a que los complejos colorante-mordiente son alcalinos y se unen por preferencia a las estructuras nucleares ácidas, sobre todo si el mordiente es una sal de aluminio. La Eosina se utiliza como colorante de fondo o de contraste en unión con los colorantes de núcleos como la hematoxilina, la Eosina más utilizada es la Eosina Y 44% p/v en agua y 2% p/v en alcohol etílico. Las soluciones concentradas suelen prepararse al 1% p/v. La eosina es el colorante citoplásmico más utilizado en las técnicas de hematoxilina; pero se puede remplazar por floxina, eritrosina, azofloxina, escarlata de biebrich o anaranjado G, que se emplean en concentraciones similares y siguiendo los mismos pasos técnicos. Reactivos: Hematoxilina de Heidenhain para teñir: 10 ml de solución madre de hematoxilina más 90 ml de agua destilada. La solución madre está hecha de 10 gr de hematoxilina en 100 ml de alcohol de 96º, envejecida en frasco ambar, a temperatura ambiente, al menos durante 3 meses. Mezcla diferenciadora: 1/3 de alcohol de 70º y 2/3 de solución saturada de ácido pícrico en alcohol de 70º (Gabe, 1968; Martoja & Martoja, 1967). RESULTADOS Con hematoxilina de Harris: núcleos de pardo negrusco a azul negro. Hueso y calcio, semejante al núcleo pero mas pardo y menos intenso. Eritrocitos, músculos, gránulos eosinófilos, rojo brillante. Citoplasma, proteínas del líquido de adema, etc., rosa pálido. APÉNDICE: Laminilla Histológica: Superficie plana y delgada en donde se encuentra montada una preparación de tejido permanente. Se compone de tres partes: PORTAOBJETOS CORTE O TEJIDO CUBREOBJETOS FUNDAMENTOS QUÍMICOS DE LA COLORACIÓN La EOSINA es un colorante ácido y sus propiedades tintoriales pueden ser explicadas sobre la base de lo que se sabe acerca de la acción de las anilinas ácidas. La HEMATOXILINA aunque no es un colorante básico, posee propiedades muy semejantes a las anilinas básicas. Un colorante básico es una molécula de anilina que tiene una o más cargas positivas en su porción coloreadas y su fórmula general se representa: ANILINA+ ClLos COLORANTES BÁSICOS reaccionan con los GRUPOS ANIÓNICOS de los componentes texturales, que son los grupos fosfato de los ácidos nucleicos (ADN y RNA), los grupos SULFATO de los glucosaminoglucanos y los GRUPOS CARBOXILO de las proteínas. La reacción de estos grupos varía según el pH.
Como ya se menciono, la Hematoxilina no es un colorante básico en sentido estricto. Se la utiliza con un Mordiente (Intermediario), entre el componente textural y la anilina, y es debido a este que la coloración con hematoxilina se asemeja a la tinción que produce un colorante básico. La unión en el complejo TEJIDO – MORDIENTE – HEMATOXILINA, no consiste en un simple enlace, y cuando la Hematoxilina se coloca en agua no se disocia del tejido, sino que permanece firmemente adherida. A causa de esto, la Hematoxilina se presta para aquellos procedimientos tintoriales en los que a ella le sigue la Eosina u otros colorantes ácidos. Los colorantes básicos verdaderos no suelen usarse en secuencia en donde el colorante básico es seguido por uno ácido, por que la anilina básica tiende a disociarse del tejido durante los lavados posteriores en soluciones acuosas. Un COLORANTE ÁCIDO lleva una carga negativa en la porción coloreada de la molécula y su fórmula general se representa: Na+ ANILINACualquier componente de los tejidos que reaccione con un colorante básico (o con Hematoxilina) se dice que es BASÓFILO y que presenta BASOFILIA. Hematoxilina: Es un colorante vegetal. Para ser utilizada debe ser oxidada previamente. Los agentes oxidantes pueden ser: el aire (varios meses de exposición) u oxidantes artificiales (óxido de mercurio, permanganato de potasio, dicromato potásico, etc.) Es un colorante directo, pero en la práctica se lo utiliza en forma de lacas hematoxilínicas (se utiliza alumbre de potasio o de sodio como mordiente para preparar la solución colorante), comportándose en este caso como un colorante indirecto. Eosina: Es un colorante artificial (se trata de derivados hidroxixanténicos halogenados con tres grupos arilo). Presenta auto-fluorescencia espontánea. Se la emplea tanto en soluciones acuosas como alcohólicas. CONCLUSIÓN. Ψ Ψ La técnica Hematoxilina-Eosina es una técnica histológica que permite identificar o diferenciar las pastes de un tejido. Ψ Ψ Hoy en día es muy útil para estudiar los tejidos de los órganos y observar anormalidades como es el caso del cáncer cérvico uterino (Papanicolau). Ψ Ψ En el estudio de la anatomía animal es muy importante ya que permite observar los tejidos de los diferentes órganos y diferenciar las estructuras de los tejidos. BIBLIOGRAFÍA. Ψ Ψ Ψ Ψ Ψ Ψ
M. J. LYNCH. METODOS DE LABORATORIO. VOL.2 . 2 ª EDICION. NUEVA EDITORIAL INTERAMERICANA S.A.DE C.V. MEXICO, D. F. 1988. http://www.monografias.com/trabajos11/intecnic/intecnic.shtml# http://www.monografias.com/trabajos11/intecnic/intecnic.shtml#RESUM
