Purifikasi dan Karakterisasi Protease Yang Dihasilkan Lactobacillus acidophilus dalam Fermentasi Susu Sapi Perah (Purification and Characterization of Protease Lactobacillus acidophilus in Fermented Milk)
Oleh: Wendry Setiyadi Putranto,SPt.,MSi.
Disampaikan pada: Seminar Nasional Bioteknologi “ Capturing Opportunities through Biotechnology” Pusat Penelitian Bioteknologi – LIPI 15-16 November 2006
Purifikasi dan Karakterisasi Protease Yang Dihasilkan Lactobacillus acidophilus dalam Fermentasi Susu Sapi Perah (Purification and Characterization of Protease Lactobacillus acidophilus in Fermented Milk) Wendry Setiyadi Putranto Fakultas Peternakan Universitas Padjadjaran, Bandung
ABSTRAK Enzim protease dengan aktivitas proteolitik yang rendah telah dimurnikan dengan kromatografi yang konvensional dari Lactobacillus acidophilus. Enzim tersebut memiliki aktivitas optimum pada pH 5,5 pada suhu 370C. Pemurnian enzim dengan pengendapan amonium sulfat 45% dan kromatographi kolom dengan Sephadex G-100. Aktivitas protease dihambat oleh pengkelat logam dengan konsentrasi 1 mM dan 5 mM ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA). Berat molekul diukur dengan sodiumdodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis adalah 72 kD. Kata kunci
:
aktivitas proteolitik, pemurnian,
ABSTRACT A proteolytic with low activation was purified by conventional chromatographic techniques from Lactobacillus acidophilus. The pH optimum of the enzymes was 5,5 at 370C. The enzymes was purified using 45% ammonium sulfate precipitation and column chromatography using Sephadex G-100. The protease activity was inhibited by chelating agent at the concentrations as follows: 1 mM and 5 mM ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA). The molecular weight value as determined by sodiumdodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis was 72 kD. Key words : proteolytic activation, purification
Pendahuluan Protease merupakan enzim yang sangat penting dalam industri pangan maupun non pangan. Pemanfaatan protease dalam industri pangan diantaranya adalah untuk mengurangi kekeruhan dalam industri bir, mengurangi gluten pada industri roti, dan untuk menggumpalkan susu pada industri keju. Enzim protease dapat diperoleh dari jaringan tanaman, hewan, maupun mikroba. Keterbatasan kemampuan hewan dan tumbuhan dalam memenuhi permintaan protease, telah mendorong berkembangnya protease mikroba. Mikroba memiliki peran penting sebagai penghasil protease karena memiliki beberapa keunggulan antara lain, mikroba memiliki siklus hidup yang singkat, efisiensi waktu dan tempat, produktivitas tinggi dan memudahkan kita untuk melakukan manipulasi genetik (melalui rekayasa genetika mikroba) maupun manipulasi dalam proses fermentasi (rekayasa bioproses). Mikroba yang telah dikembangkan secara komersial sebagai penghasil protease antara lain Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus pumilus, Aspergillus oryzae, dan Aspergillus niger. Lactobacilus acidopillus merupakan kelompok bakteri asam laktat (BAL) “friendly bacteria” yang merupakan kelompok bakteri yang banyak dimanfaatkan dalam industri fermentasi susu, baik dalam pembuatan yoghurt maupun keju. Bakteri tersebut mempunyai kemampuan menghidrolisis kasein yang ada pada susu dengan mengekskresikan enzim proteolitik. Beberapa penelitian telah dilakukan untuk mengetahui karakter biokimia protease intra seluler dari beberapa bakteri asam laktat seperti Lactobacillus bulgaricus dan Streptococcus thermophilus, sedangkan karakter biokimia protease intra seluler maupun ekstraseluler dari Lactobacilus acidopillus belum banyak dilakukan terutama untuk isolat yang berasal dari Indonesia. Berdasarkan uraian diatas, peneliti merasa tertarik untuk mengkaji lebih jauh tentang karakter biokimia dari protease ekstraseluler dari acidopillus PAGE.
secara kuantitatif maupun kualitatif
Lactobacilus
menggunakan metoda SDS
Metode Penelitian Strain Bakteri Asam Laktat yang digunakan adalah Lactobacilus acidopillus, media propagasi menggunakan MRS broth, sedangkan media produksi menggunakan susu sapi perah.
Lactobacilus acidopillus
diinokulasikan pada media propagasi
dari media padat
MRS broth (10 ml) inkubasi 37 0C,
dilakukan pengamatan pertumbuhannya pada dengan spektrofotometer (600 nm) Selanjutnya sebanyak 2% (v/v) diinokulasikan pada media susu sapi perah (UHT). Pengambilan sampel dilakukan tiap jam terhadap kedua media produksi tersebut, dilakukan pengamatan pertumbuhan mikrobanya, dan pengukuran aktivitas protease (Walter,1984) serta kadar protein (Bradford,1978). Pengukuran densitas bakteri pada media produksi susu sapi perah. Sebanyak 1 ml sampel ditambahkan 9 ml EDTA (2g/l,pH 12) selanjutnya dilihat absorbansinya pada 600 nm ( Metoda Kanasaki ) Isolasi protease intra seluler Lactobacilus acidopillus Sampel disentrifugasi 12000 g, pada suhu 40C, selama 15 menit. Supernatan yang didapat merupakan enzim protease kasar selanjutnya dianalisis kadar protein dan aktivitas proteplitiknya. Isolasi protease ekstraseluler Lactobacilus acidopillus Crude extract ektraseluler protease diperoleh dengan memisahkan media (susu sapi perah) dengan sel bakteri, dialkukan sentrifugasi 12000 g, supernatant yang diperoleh dilakukan pengukuran aktivitas protease (Walter,1984) serta kadar protein (Bradford,1978). Pengendapan dengan Amonium sulfat Untuk menggumpalkan protein, supernatan hasil sentrifugasi
ditambahkan
ammonium sulfat sedikit demi sedikit sambil diaduk dengan magnetic stirrer dengan konsentrasi (30%, 40%, 45%, 60%) dan dibiarkan selama satu malam
pada suhu 40C. Selanjutnya disentrifugasi 10000 rpm, suhu 4 0C, selama 15 menit. Pelet yang diperoleh diresuspensikan dengan buffer Tris-HCl 10 mM pH 8, kemudian dilakukan pengujian aktivitas proteasenya dengan metode Walter (1984) dan penentuan kadar proteinnya dengan metode Bradford (1976). Dialisis Dialisis dilakukan untuk menghilangkan kadar garam yang tersisa dari proses pengendapan dengan ammonium sulfat menggunakan kantong dialisis. Kantong diikat dengan benang jahit, lalu dimasukkan 10 ml larutan enzim, dan kemudian ujung lain diikat dengan benang. Kantung dimasukkan dalam larutan Tris HCl 20 mM dengan volume 100 kali volume filtrat dan diagitasi secara perlahan pada suhu 40C selama 1 jam. Setelah 30 menit bufer diganti dengan bufer segar. Enzim hasil dialisis dipekatkan menjadi setengah volume dengan freeze dryer dan disimpan pada suhu 40C untuk segera dilakukan kromatografi filtrasi gel. Kromatografi Filtrasi Gel Kolom kromatografi filtrasi gel
Sephadex G-100
diekuilibrasi dengan
mengalirkan bufer Tris HCL 10 M sebanyak 200 ml dan didiamkan selama semalam pada suhu 4 0C. Larutan protease sebanyak 2 ml dimasukkan dengan pipet secara perlahan kedalam kolom tepat di atas permukaan gel.
Enzim
dibiarkan mengalir perlahan sampai seluruh enzim berada dibawah permukaan gel. Kolom diisi dengan pengelusi yaitu bufer Tris HCl 10 mM pH 8. Fraksinasi sebanyak 20 fraksi sebanyak 70 tetes pada masing-masing fraksi menggunakan fraction collector. Setiap fraksi diukur aktivitas protease dan kadar proteinnya. Pengukuran konsentrasi protein (Bradford, 1976) Konsentrasi protein diukur dengan menggunakan standar protein Bovine Serum Albumin (BSA) dengan konsentrasi 0,1 hingga 1 mg/ml. Sebanyak 100 l sampel ditambah 5 ml pereaksi Bradford, selanjutnya dihomogenkan dan diinkubasi selama 5 menit pada suhu 370C dan kemudian diukur absorbansinya dengan spektrofotometer pada 595 nm. Pengukuran Aktivitas Protease (Walter,1984)
pH optimum Ditentukan dengan cara mengubah bufer universal yang digunakan sesuai dengan pH yang diinginkan pada suhu 50 0C. Nilai pH yang diuji anatar 6- 10. Aktivitas enzim diukur dengan metode Walter (1984). Pengaruh inhibitor (Chaotropic agent) Ditentukan dengan penambahan Phenyl Methil Sulfonil Flouride (PMSF) dan Ethylena Diamina Tetra Acetat (EDTA) yang ditambahkan pada konsentrasi 1mM dan 5 mM. Aktivitas enzim diukur dengan metode Walter (1984). SDS-PAGE Protein hasil pemurnian dianalisa dengan Sodium Dodecyl Sulphate polyachrilamide Gel Electroforesis (SDS-PAGE). Peralatan elektroforesis yang digunakan adalah tipe vertikal. Elektroforesis SDS-PAGE menggunakan sistem gel diskontinue yang terdiri dari stacking gel dan separating gel. Marker yang digunakan adalah High molecular Weight
Hasil dan Pembahasan Pertumbuhan Lactobacillus acidophilus aktivitas proteolitiknya Pertumbuhan dan produksi protease Dilakukan pengamatan terhadap data turbiditas suspensi sel (panjang gelombang 600 nm) yang diukur tiap selang waktu tertentu, disamping itu pula dilakukan pengambilan suspensi sel untuk
Absorbansi 600 nm
0.7
0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0
0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0
5
10
15
20
25
Aktivitas spesifik (U/mg)
pengukuran aktivitas protease dan kadar proteinnya.
30
Jam ke Absorbansi 600 nm Aktivitas spesifik protease (U/mg)
Gambar.1. Pertumbuhan Lactobacillus acidophilus dan aktivitas spesifik protease yang dihasilkannya pada fermentasi susu sapi perah. Berdasarkan data pada Gambar 1. terlihat bahwa kurva pertumbuhan diawali dengan fase awal (lag) yang merupakan masa penyesuaian mikroba. Pada fase tersebut terjadi sintesis enzim oleh sel yang dipergunakan untuk metabolisme metabolit.
Setelah fase awal selesai, baru mulai terjadi reproduksi selular.
Konsentrasi selular meningkat, mula-mula perlahan kemudian makin lama makin meningkat sampai pada suatu saat laju pertumbuhan atau reproduksi seluler mencapi titik maksimal dan terjadi pertumbuhan secara logaritmik atau eksponesial.
Selanjutnya setelah subtrat atau persenyawaan tertentu yang
diperlukan untuk pertumbuhan bakteri dalam media biakan mendekati habis dan terjadi penumpukan produk-produk penghambat , maka terjadi penurunan laju pertumbuhan bakteri tersebut. Fase penurunan ditandai oleh berkurangnya jumlah
sel hidup (viable) dalam media akibat terjadinya kematian (mortalitas). (Mangunwidjaja,et al.1994). Lactobacillus acidophilus
mengekskresikan protease
dengan aktivitas tertinggi adalah pada saat jam ke- 18
ektraseluler
( 0,752 U/mg) masa
pertumbuhan bakteri tersebut (fase logaritma pertumbuhan).
Data waktu
produksi tersebut dapat kita gunakan untuk melakukan produksi enzim dalam skala yang lebih besar. Selanjutnya dilakukan pengendapan amonium sulfat 45% dan pemurnian dengan kromatografi filtrasi gel
SDS-PAGE Tingkat kemurnian enzim dapat diketahui dengan menggunakan teknik elektroforesis gel poliakrilmida, SDS-PAGE. Gel disusun oleh akrilamida dan N,N’-metilen – bis – akrilamida yang berpolimerisasi melalui mekanisme radikal bebas dengan bantuan katalisator N,N,N’,N’,- tetrametilen diamina (TEMED) dan inisiator amoniumpersulfat (APS) (Dunn,1989). Prinsip analisis SDS-PAGE yaitu pemisahan protein berdasarkan ukuran molekul.
75 kD
Gambar 2. SDS-PAGE protease Lactobacillus acidophilus
Pada sumur no. 4 dan 5 adalah hasil pemurnian dengan kolom Sephadex G-100 yang menunjukan satu pita dengan berat molekul 75 kD. Sedangkan sumur 6 dan 7 merupakan ekstrak kasar protease, dan sumur 8 adalah marker.
Aktivitas spesifik protease (U/mg)
Penentuan pH Optimum 14 12 10 8 6 4 2 0 0
2
4
6
8
10
pH Aktivitas spesifik protease (U/mg)
Gambar.3. Pengaruh pH terhadap aktivitas protease Lactobacillus acidophillus pada suhu 370C.
Perubahan pH pada skala deviasi kecil dapat menyebabkan turunnya aktivitas enzim karena dengan perubahan ionisasi gugus-gugus fungsionilnya. Gugus ionik berperan penting dalam menjaga konformasi sisi aktif enzim untuk mengikat dan mengubah substrat menjadi produk. Pada perubahan skala deviasi besar, perubahan pH akan mengakibatkan enzim mengalami denaturasi karena adanya gangguan terhadap berbagai interaksi nonkovalen yang menjaga kestabilan struktur tiga dimensi enzim (Hames,et al.2000)
Pengaruh EDTA terhadap aktivitas protease Tabel.3. Pengaruh EDTA terhadap aktivitas protease Lactobacillus acidophillus Konsentrasi EDTA (mM)
Aktivitas spesifik protease (U/mg)
1
8,6
5
1,5
Penggunaan EDTA menunjukkan penuruan aktivitas yang signifikan. Hal ini menunjukan bahwa EDTA merupakan inhibitor bagi aktivitas enzim tersebut.
Kesimpulan dan Saran Protease Lactobacillus acidophilus memiliki aktivitas yang sangat rendah (0,752 U/mg). Karakterisasi biokimia dari protease tersebut meunujukkan pH optimum 5,5, serta dihambat oleh pengkelat logam EDTA. Hasil pemurnian dengan kolom Sephadex G -100 menunjukkan satu pita pada SDS-PAGE dengan ukuran berat molekul sekitar 75 kD Berdasarkan hasil karakterisasi dapat memberikan informasi untuk penelitian lebih jauh dalam bidang bioteknologi pangan dan disarankan untuk mengkaji lebih jauh tentang karakter gen yang menyandikan protease tersebut.
Ucapan Terimakasih Penulis ucapkan terimaksih sebesarnya kepada semua pihak yang berperan demi terselesainya penelitian ini, khususnya bagi Lembaga Penelitian Universitas Padjadjaran yang memberikan pendanaan.
DAFTAR
PUSTAKA
Bradford,MM.1976.A rapid and sensitive method for quantitation of protein utilization. The principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72:248-254 Dunn MJ.1989.Electrophoretic analysis methods. Di dalam E.L.V. Harris ELV,Angal S,editor. Protein Purification Methods. A Practical Approach. Oxford:IRL Press.hlm 18-40. Hames BD, Hooper NM.2000, Biochemistry.The instant Notes. Ed ke-2. Hongkong: Spinger,Verlag.hlm.83-84. Laemmli UK.1970 Cleavage of structural protein during the assembly of head of bacteriophage T-4. Nature:227:680-685 Mangunwidjaja.D,Suryani.A,1994.Teknologi Bioproses.Penebar Swadaya.Jakarta Walter HE.1984.Method with haemoglobin, casein, and azocoll as substrate In. Bergmeyer. HU (ed). Methods of enzymatic analysis. Verlag Chemie. Deerfield Beach Florida Basel.
