BAB I. PENDAHULUAN A. Latar Belakang Depresi merupakan masalah kesehatan masyarakat yang cukup serius. World Health Organization (WHO) tahun 2001 menyatakan bahwa depresi berada pada urutan keempat penyakit tersering di dunia. Depresi sering ditemui dalam gangguan jiwa. Prevalensi pada wanita diperkirakan 10-25% dan pada lakilaki 5-12%. Walaupun depresi lebih sering terjadi pada wanita, bunuh diri lebih sering terjadi pada laki- laki terutama usia muda dan usia tua. Manifestasi gejala depresi yang muncul dalam bentuk keluhan yang berkaitan dengan mood (seperti murung, sedih, rasa putus asa) membuat diagnosis depresi dapat dengan mudah ditegakkan, namun bila keluhan psikomotor dan somatik (seperti malas bekerja, lamban, lesu, nyeri ulu hati, sakit kepala yang terus- menerus) yang muncul depresi sering tidak terdiagnosis (Amir, 2005). Di negara maju Amerika, dibutuhkan dana lebih dari US$ 43 milyar per tahun untuk mengatasi depresi dan ini menjadi masalah kesehatan masyarakat yang cukup serius. Dari hasil survei WHO di seluruh dunia, angka kejadian depresi pada populasi sebesar 7-12% pada pria dan 20-25% pada wanita dan keluhan yang ditimbulkan akibat depresi seperti sulit berkonsentrasi, merasa gelisah, selalu tegang. Selain itu, kelainan mental yang timbul berupa suka menyendiri, merasa hidupnya tidak berguna, kehilangan semangat hidup dapat
1
menurunkan kualitas hidup dan produktivitas kerja penderitanya. Hal yang paling berbahaya adalah meningkatnya kejadian bunuh diri. Menurut WHO tahun 2006, angka kejadian kasus bunuh diri yang ditemukan sebesar 15-20% dan pada sebagian besar kasus, bunuh diri yang tidak direncanakan sebelumnya (WHO, 2011). Hal ini dapat dihindari jika penderita depresi mendapatkan terapi yang tepat. Terapi bagi penderita depresi adalah obat yang dapat meningkatkan mood atau yang lebih dikenal sebagi obat-obat anti depresan (Grollman, 1972). Depresi termasuk gangguan psikosomatik yang terjadi karena berkurangnya pembentukan norepinefrin atau serotonin atau keduanya yang menimbulkan gejala-gejala antara lain rasa sedih, tidak bahagia, putus asa dan sengsara serta penurunan kemauan untuk melakukan suatu pekerjaan (Guyton and Hall, 1997). Serotonin merupakan neurotransmitter monoamin yang terlibat dalam berbagai penyakit yang cukup luas cakupannya, meliputi penyakit psikiatrik: depresi, kecemasan, skizoprenia, dan gangguan obsesif konfulsif; sampai migrain. Penyakit tertentu dimana kekurangan neurotransmitter serotonin, antara lain depresi, dapat diatasi dengan peningkatan ketersediaan serotonin di tempat aksi dengan re-uptake. Contoh obat yang beraksi demikian adalah antidepresan golongan Selective Serotonin Reuptake Inhibitor (SSRI) seperti fluoksetin, fluvoksamin, paroksetin, dan sentralin. Obat golongan antidepresan trisiklik juga bekerja menghambat reuptake serotonin, namun tidak selektif karena juga terjadi penghambatan reuptake norepinefrin (Ikawati, 2006). Saat ini terus dikembangkan beberapa 2
golongan obat antidepresan yang baru seperti golongan Selective Serotonin Reuptake Inhibitor (SSRI), golongan Selective Serotonin Reuptake Enhancer (SSRE), golongan Serotonin Nor Ephinephrine Reuptake Inhibitor (SNRI), golongan Reversible Inhibitory Monoamine Oxidase type A (RIMA) dan golongan atipik (Trazodon, Nefazodon) (Mudjadid, 2006). Namun sampai saat ini efek samping obat-obat tersebut masih tinggi. Sebagai alternatif, kemudian dikembangkan terapi menggunakan tanaman obat yang berpotensi seba gai antidepresan yaitu tanaman kayu kuning (Arcangelisia flava (L.) Merr). Kayu kuning merupakan tumbuhan liana dan panjangnya dapat mencapai 20 meter. Di Indonesia, tumbuhan ini memiliki berbagai nama, antara lain tali kuning, oyod sirawan, dan katola (Heyne, 1950). Kandungan spesifik dari kayu kuning yaitu alkaloid yang terdiri dari berberin, jatrorrhizin, palmatin dan kolumbamin (Keawpradub et al., 2005). Hasil penelitian sebelumnya dibuktikan bahwa berberin memiliki kemampuan sebagai penghambat monoamine oxidase-A (MAO-A); enzim yang terlibat dalam reuptake norepinefrin dan serotonin (Kong et al., 2004). Pengukuran efek antidepresan biasanya digunakan metode forced swim test. Metode ini dilakukan dengan cara menghitung lama immobility time yang lebih singkat dibandingkan dengan kelompok uji yg tidak diberikan obat antidepresan atau ekstrak yang berfungsi sebagai antidepresan. Immobility time pada hewan uji diartikan sebagai keadaan putus asa pada manusia yang merupakan salah satu penyebab dari terjadinya depresi (Porsolt et al., 1977). 3
Atas dasar latar belakang tersebut, maka dilakukan penelitian dalam rangka pengujian keefektifan ekstrak larut air kayu kuning yang mengandung berberin terhadap kemampuan berenang. Hasil penelitian ini diharapkan dapat bermanfaat sebagai tambahan informasi bahwa ekstrak larut air kayu kuning yang mengandung berberin klorida dapat bermanfaat sebagai antidepresan dan acuan penelitian selanjutnya. B. Perumusan Masalah Berdasarkan latar belakang di atas dapat dirumuskan beberapa permasalahan yaitu: 1. Apakah ekstrak larut air kayu kuning yang didalamnya terkandung berberin klorida mampu memberikan efek antidepresan pada mencit putih jantan galur balb-c dengan metode forced swim test? 2. Pada dosis berapakah dari ekstrak larut air kayu kuning yang menunjukkan efek antidepresan paling baik? C. Tujuan Penelitian Tujuan dari penelitian ini antara lain : 1. Mengetahui adanya efek antidepresan pada ekstrak larut air batang kayu kuning terhadap mencit putih jantan galur balb-c dengan metode forced swim test. 2. Mengetahui dosis efektif dari ekstrak larut air batang kayu kuning yang dapat berefek sebagai antidepresan.
4
D. Tinjauan Pustaka 1. Uraian Tumbuhan a. Nama Lain Arcangelisia flava (L) Merr dikenal sebagai aruey ki koneng di daerah sunda, sedangkan di jawa lebih dikenal dengan sebutan Oyod sirawan, peron kebo, peron sapi, sirawan susu, atau sirawan tai (Heyne, 1950). b. Distribusi Terdapat di dataran rendah sampai 800 meter dari permukaan air laut dan terdapat sebagai tanaman menjalar kayu kuning merupakan tumbuhan asli asia tenggara yang tumbuh di hutan-hutan tropis, antara lain di Sumatera, Kalimantan, Jawa, Sulawesi, Maluku, dan Irian Jaya (Supriadi, 2001). c. Kandungan Kimia Batang ta naman Arcangelisia flava mengandung senyawa berberin klorida, jatrorrhizin, 8- hidroksiberberin, limasin dan palmatin (Siwon, 1982).
Gambar 1. Struktur berberin klorida (Kametani, 1969)
5
d. Manfaat Akar kuning mempunyai berbagai manfaat diantaranya untuk pengobatan penyakit kuning, sebagai obat cacing, obat sariawan, dan di Ambon digunakan sebagai plester pada penyakit cacar (Heyne, 1950). Batang dan akar dari tanaman ini telah banyak digunakan dalam pengobatan tradisional sebagai tonik pahit untuk mengobati berbagai penyakit diantaranya sakit kuning (jaundice) dan beberapa penyakit infeksi seperti diare dan abses kulit (Perry and Metzger, 1980). Dari penelitian lain, diketahui bahwa berberin yang merupakan alkaloid isokinolin yang terkandung dalam tanaman kayu kuning ini memiliki banyak aktivitas farmakologi yaitu sebagai antihipertensi, antiinflamasi, antidepresan, antikanker, antimikroba, hipolipidemik, hepatoprotektif dan antidiabetik (Singh et al., 2010). 2. Metode Ekstraksi Ekstraksi adalah proses penarikan zat aktif dalam tumbuhan dengan menggunakan pelarut tertentu. Metode ekstraksi yang tepat tergantung pada tekstur dan kandungan bahan tumbuhan yang akan diekstraksi. Umumnya jaringan tanaman perlu dimatikan untuk mencegah oksidasi enzim atau hidrolisis. Cara yang paling sering digunakan adalah dengan memasukkan jaringan tanaman segar dalam etanol mendidih beberapa saat. Etanol adalah pelarut serbaguna yang baik untuk ekstraksi pendahuluan (Harborne, 1984).
6
Infusa adalah sediaan cair yang dibuat dengan cara mengekstrak simplisia nabati dengan air pada suhu 90ºC selaam 10-15 menit ya ng dihitung sejak air mendidih (Depkes RI, 1995). Jika bahan yang digunakan untuk membuat dekok berasal dari bahan bertekstur keras, bahan yang digunakan dalam infusa berasal dari bahan yang lunak (simplisia, daun dan bunga) seperti daun kumis kucing, daun meniran, daun pegagan, bunga mawar, bunga melati, dan daun sambiloto. Cara membuat infusa hampir sama dengan merebus teh dengan cara simplisia kering 25-30 gram atau bahan segar 75-90 gram. Bahan tersebut direbus dala m air mendidih 500 cc selama 15 menit atau sampai volumenya menjadi 250 cc atau dapat disesuaikan dengan kebutuhan. Setelah direbus airnya disaring dan hasil penyaringan ini disebut infusa. Teknik infusa mempunyai beberapa keuntungan bila dibandingkan dengan teknik pembuatan ekstrak yaitu karena teknik infusa lebih murah, lebih cepat, dan alat serta caranya sederhana. Sedangkan dalam pembuatan ekstrak, kandungan dari bahan tumbuhan dan pelarut yang paling tepat untuk masing- masing kandungan harus diketahui lebih dahulu. Dengan zat pelarut yang tepat, zat aktif yang diinginkan akan terpisah dari bahan aslinya dan bercampur dengan pelarut yang digunakan. Selanjutnya pemisahan zat aktif dari pelarutnya dengan lebih mudah dilakukan untuk memperoleh zat aktif yang benar-benar murni. Metodenya dengan menggunakan alat percolator dan countercurrent screw extractor yang dikenal dengan nama soklet. Dari sini jelas terlihat bahwa metode
7
soklet lebih rumit dan mahal dibandingkan dengan metode infusa (Santoso, 1993). Selain karena alasan tersebut, ekstraksi menggunakan infusa dilakukan karena disesuaikan dengan cara pembuatan yang dilakukan oleh masyarakat pembuat obat tradisional (Larisu, 2010). 3. Depresi Depresi merupakan satu masa terganggunya fungsi manusia yang berkaitan dengan alam perasaan yang sedih dan gejala penyertanya, termasuk perubahan pada pola tidur dan nafsu makan, psikomotor, konsentrasi, anhedonia, kelelahan, rasa putus asa dan tidak berdaya, serta bunuh diri (Kaplan et al., 1997). Timbulnya depresi dihubungkan dengan peran beberapa neurotransmiter aminergik. Neurotransmiter yang paling banyak diteliti ialah serotonin. Konduksi impuls dapat terganggu apabila terjadi kelebihan atau kekurangan neurotransmiter di celah sinaps atau adanya gangguan sensitivitas pada reseptor neurotransmiter tersebut di post sinaps sistem saraf pusat. Pada penelitian dibuktikan bahwa terjadinya depresi disebabkan karena menurunnya pelepasan dan transmisi serotonin (menurunnya kemampuan neurotransmisi serotogenik). Beberapa peneliti menemukan bahwa selain serotonin terdapat pula sejumlah neurotransmiter lain yang berperan pada timbulnya depresi yaitu norepinefrin, asetilkolin dan dopamin. Sehingga depresi terjadi jika terdapat defisiensi relatif satu atau beberapa neurotransmiter
8
aminergik pada sinaps neuron di otak, terutama pada sistem limbik (Willner, 1997). Penurunan jumlah dari serotonin dapat mencetuskan terjadinya gangguan depresi, dan beberapa pasien dengan percobaan bunuh diri atau mengakhiri hidupnya mempunyai kadar cairan cerebrospinal yang mengandung kadar serotonin yang rendah dan konsentrasi rendah dari uptake serotonin pada platelet (Kaplan et al., 1997). Pada gangguan ini, sela in serotonin dan norepinefrin, dopamin juga mempunyai peran. Dopamin merupakan neurotransmitter yang disekresikan oleh neuron dari substansi gria mid brain. Dopamin pada posisi lain mengaktivitasi protein Gi yang berikatan dengan reseptor alfa 2, kondisi ini akan menghambat adenil siklase sehingga cAMP menurun. Hal ini sebagai umpan balik kanal ion K. Dalam kondisi stress dalam mensekresikan dopamine yang berlebihan sehingga aktivasi protein Gi meningkat dan aktivasi kanal ion K pun meningkat. Hal ini menyebabkan ion K dalam jumlah berlebih akan keluar dari kanal ion sehingga terjadi hiperpolarisasi dan penghambatan transmisi potensial aksi yang berlebihan hingga terjadi hipereksitabelitas jaringan dan mendepresikan susunan syaraf pusat (Ikawati, 2006). 4. Antidepresan Antidepresan merupakan obat-obat yang efektif pada pengobatan depresi, meringankan gejala gangguan depresi. Ada beberapa golongan obat antidepresan
9
yang beredar saat ini yaitu: obat antidepresan golongan trisiklik (TCA) , inhibitor monoamine oksidase (MAOI), serta inhibitor reuptake serotonin selektif (SSRI). Antidepresan trisiklik adalah kelompok obat yang banyak diresepkan (misal: amitriptilin, klomipramin, dll). TCA bekerja dengan cara menghambat pengambilan neurotransmitter 5-hidroksitriptamin (serotonin) dan noradrenalin (norepinefrin). Obat ini efektif dalam waktu 2-4 minggu dan memiliki efek samping yang tidak menyenangkan yang meliputi pandangan kabur, mulut kering, konstipasi dan retensi urine (Brooker, 2006). Obat lini kedua dalam mengobati gangguan depresi mayor adalah Monoamine Oxidase Inhibitors. MAO Inhibitors meningkatkan ketersediaan neurotransmitter dengan cara menghambat aksi dari Monoamine Oxidase, suatu enzim yang normalnya akan melemahkan atau mengurangi neurotransmitter dalam sambungan sinaptik (Nevid et al., 2005). MAOIs sama efektifnya dengan Tricyclic Antidepressants tetapi lebih jarang digunakan karena secara potensial lebih berbahaya (Reus and Osborne , 2000). Selective Serotonine Reuptake Inhibitors (SSRI) mempunyai struktur yang hampir sama dengan Tricyclic Antidepressants, tetapi SSRI mempunyai efek yang lebih langsung dalam mempengaruhi kadar serotonin. Pertama SSRI lebih cepat mengobati gangguan depresi mayor dibandingkan dengan obat lainnya. Pasienpasien yang menggunakan obat ini akan mendapatkan efek yang signifikan dalam penyembuhan dengan obat ini.
10
Kedua, SSRI juga mempunyai efek samping yang lebih sedikit dibandingkan dengan obat-obatan lainnya. Ketiga, obat ini tidak bersifat fatal apabila overdosis dan lebih aman digunakan dibandingkan dengan obat-obatan lainnya. Dan yang keempat SSRI juga efektif dalam pengobatan gangguan depresi mayor yang disertai dengan gangguan lainnya seperti: gangguan panik, binge eating, gejala-gejala pramenstrual (Reus and Osborne, 2000) 5. Uji Efek Antidepresan Uji efek antidepresan dapat dilakukan dengan beberapa metode antara lain uji berenang paksa (forced swim test), uji penggantungan ekor (tail suspension test), dan uji roda berputar (rotate road test). Uji berenang paksa (forced swim test), dengan cara hewan coba yang telah dibuat stres dengan cara dimasukkan kedalam wadah yang telah diisi air dengan ketinggian 25 cm selama 6 menit dan dilakukan pengukuran immobility time. (Porsolt et al., 1977). Pengukuran immobility time dilakukan dengan mengakumulasi waktu hewan coba saat diam atau mengambang bergerak di dalam air, hanya membuat gerakan-gerakan diperlukan untuk menjaga kepala di atas air. Penurunan durasi immobility time dapat diambil sebagai ukuran antidepresan (Zomkowski et al., 2004). Uji penggantungan ekor (tail suspension test) dilakukan dengan cara hewan uji yang akan digunakan dibuat stres dengan cara menggantung ekor tikus pada tiang setinggi 50 cm selama 3 menit setiap hari, perlakuan ini dilakukan
11
selama 10 hari (Porsolt et al., 1977). Yang dinilai dari tes ini adalah immobility time hewan uji (Cryan et al., 2005). Uji roda berputar (rotate road test) dilakukan dengan cara hewan uji diletakkan pada alat rotarod yang terdapat batang dengan diameter 3cm yang berputar dengan kecepatan 10 rpm. Kemudian diukur waktu reaksinya. Waktu reaksi yang dihitung mulai mencit diletakkan pada roda berputar sampai waktu hewan coba jatuh dari batang tersebut (Murni, 2006). 6. Uji Berenang Paksa (forced swim test) Forced swim test adalah salah satu metode yang biasa digunakan untuk mengukur efek suatu obat antidepresan pada hewan uji. Khasiat dari suatu obat antidepresan diukur melalui lama immobility time yang lebih singkat dibandingkan dengan kelompok uji yang tidak diberikan obat antidepresan atau ekstrak yang berfungsi sebagai antidepresan. Kemampuan bertahan (immobility time) pada hewan uji diartikan sebagai keadaan putus asa pada manusia yang merupakan salah satu penyebab dari terjadinya depresi (Porsolt et al., 1977). Pengukuran immobility time dilakukan dengan cara memaksa mencit untuk berenang dalam tabung terbuka (diameter 10 cm, tinggi 25 cm) yang berisi air dengan ketinggian 15 cm. Tes ini berdurasi selama 6 menit, dan dinilai pada saat hewan uji tidak bergerak di dalam air. Setiap hewan uji itu dinilai tidak bergerak ketika berhenti berjuang dan tetap mengambang bergerak di dalam air, hanya membuat gerakan-gerakan diperlukan untuk menjaga kepala di atas air.
12
Penurunan durasi
immobility time selama forced swim test (FST) itu dapat
diambil sebagai tanda ukuran antidepresan (Zomkowski et al., 2004). Pada penelitian yang dilakukan oleh Peng et al., (2007), senyawa berberin murni (dosis 20 mg/kg) dapat berkhasiat untuk antidepresan dilihat dari durasi immobility time yang paling singkat dibanding dengan dosis lain. E. LANDASAN TEORI Depresi adalah masalah kesehatan yang banyak dijumpai di masyarakat. Saat ini sejumlah antidepresan telah tersedia yang bekerja melalui mekanisme yang berbeda-beda seperti serotonergik, norefinergik maupun dopaminergik. Senyawa aktif yang ditemukan dalam pada ba tang kayu kuning adalah berberin, jatrorrhizin, 8-hidroksiberberin, dan palmatin (Siwon, 1982). Pada masyarakat, air rebusan batang kayu kuning digunakan untuk obat diare berdarah (Larisu, 2011). Berdasar pada penelitian yang dilakukan oleh Peng et al., (2007), senyawa berberin murni berkhasiat untuk antidepresan, sehingga ekstrak larut air Arcangelisia flava (L.) Merr yang mengandung berberin klorida dapat diprediksi menjadi antidepresan.
13
F. HIPOTESIS Ekstrak larut air batang kayu kuning (Arcangelisia flava L.Merr) yang mengandung senyawa alkaloid berberin klorida dengan kadar tertentu, yang diberikan secara per oral dapat berefek sebagai antidepresan terhadap mencit putih jantan galur balb-c yang diuji dengan uji berenang paksa (forced swim test ).
14
BAB II. METODE PENELITIAN A. Alat dan Bahan yang digunakan 1. Alat Penelitian a. Pembuatan serbuk dan ekstrak air batang akar kayu kuning : pisau, grinder, oven, alat-alat gelas, neraca digital, penangas, panci infusa, kompor elektrik, dan corong. b. Uji ketahanan berenang : toples tanpa tutup, stopwatch, gelas ukur, kandang plastik, ember. c.
Alat identifikasi kandungan senyawa dalam ekstrak air batang akar kayu kuning : penangas, alat-alat gelas, tabung reaksi, druple plate, bejana KLT, mikro pipet 5-10 µL, white tip, flakon, TLC scanner (CAMAG TLC Scanner 3), lampu UV 254 nm dan UV 366 nm, pinset, cawan porselen, neraca digital.
2. Bahan Penelitian Pembuatan ekstrak air batang kayu kuning : serbuk batang akar kayu kuning, diperoleh dari hutan di Kabupaten Sorong, Papua Barat, Irian Jaya a. Uji ketahanan berenang: Ekstrak air batang akar kayu kuning, Amitriptilin tablet 25 mg, mencit galur balb-c berumur 2-3 bulan dengan berat 30-45
15
gram (Laboratorium Farmakologi Fakultas Farmasi UGM), air PAM, Air suling (General Labora). b. Identifikasi kandungan senyawa dalam ekstrak air batang akar kayu kuning : plat KLT silika gel 60 F254 (Merck), kertas saring, n-butanol, asam asetat, etanol p.a, air suling, dan Dragendorff. B. Jalan Penelitian 1. Pengumpulan bahan Batang kayu kuning diperoleh dari salah satu hutan di Kabupaten Sorong, Papua Barat, Irian Jaya pada bulan April 2013. 2. Identifikasi tumbuhan Batang kayu kuning dideterminasi di Laboratorium Farmakognosi, Bagian Biologi Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas Gadjah Mada. Identifikasi ini dilakukan untuk pemastian kebenaran bahan yang digunakan. 3. Preparasi sampel Sebelum batang kayu kuning yang akan digunakan dicuci dengan air mengalir untuk mengurangi kontaminan biotik maupun abiotik; kemudian batang dipotong-potong dan diserut untuk mempercepat proses pengeringan. Proses pengeringan dilakukan dengan menggunakan oven dengan suhu 50ºC. Pengeringan dengan menggunakan oven dimaksudkan agar suhu lebih stabil dibanding dengan menggunakan sinar matahari langsung. Proses ini dilakukan
16
selama 1minggu. Setelah batang tersebut kering kemudian diserbuk dengan menggunakan grinder dengan ukuran 0,75 cm. 4. Penentuan dosis ekstrak dan dosis Amitriptilin Penentuan dosis ekstrak berdasarkan dosis empiris, yaitu pemakaian masyarakat 0,6 gram (Larisu, 2011), untuk manusia dewasa dengan berat 70kg, konversi dosis ke mencit dengan 20gram, faktor konversi 0,0026. JUDP î
JUDP ?
= = =
J%%
JUDP ? NJ %%
PJ ? NJ %%
selanjutnya dibuat orientasi dosis dengan faktor pengali 2 dan 4 JUDP ? NJ %%[
JUDP ? NJ %%=
JUDP ? NJ %%[
P J ? NJ %%
JUDP ? NJ %%=
P J ? NJ %%
Stok sediaan yang dibuat dalam 200ml, setiap pemberian sebanyak 0,5 ml / 25gBB , sehingga untuk dosis adalah a.
P J ? NJ%%
Konsentrasi
= P J ? NJ%%
Konsentrasi
JUDP ?
= =
b.
JUDP ?
=
= = =
JUDP ?
J%% PO PO
0,39 %
JUDP ? JUDP ?
JUDP ?
J%% PO PO
17
= c.
P J ? NJ%%
Konsentrasi
0,78 % JUDP ?
=
JUDP ?
=
JUDP ?
= =
J%% PO PO
1,56 %
Dosis Amitriptilin yang digunakan adalah dosis 1 kali pemakaian yaitu 25 mg, untuk manusia dewasa dengan berat 70 kg, dikonversi ke dosis mencit dengan berat 20gram (faktor konversi 0,0026) PJî
= =
PJ ?
J%%
PJ ? NJ %%
selanjutnya dibuat stok sediaan dalam 50 ml, tiap pemberian sebanyak 0,5ml / 25gBB, sehingga untuk dosis : PJ ? NJ%%
Konsentrasi
= = = = =
PJ ?
PJ ?
PJ?P O
JUDP ?
J%% PO
PO
0,01625 %
5. Pembuatan ekstrak larut air kayu kuning dan larutan pembanding Ekstrak larut air kayu kuning dibuat dengan cara infusa 3,12% dengan pelarut air (digunakan sebagai lautan stok). Sebanyak 3,12 gram serbuk
18
dipanaskan dalam 100 ml air suling selama 15 menit dengan suhu 90ºC. Hasil yang didapat kemudian disaring dengan kain sampai didapatkan filtrat sebanyak 100 ml; kemudian dilanjutkan dengan uji organoleptis. 6. Analisis kualitatif dan kuantitatif Metode analisis kualitatif yang dilakukan adalah kromatografi lapis tipis untuk mengetahui keberadaaan senyawa alkaloid yang terdapat pada sampel. Selanjutnya untuk menetapkan kadar senyawa digunakan KLT densitometri dengan pengukuran kerapatan bercak dari senyawa pada sampel yang sebelumnya telah dipisahkan dengan cara KLT dan dideteksi dengan TLC Scanner. Sebanyak 5 µL larutan ekstrak ditotolkan pada lempeng KLT silika gel 60 F254 menggunakan mikro pipet, kemudian totolan dielusi dengan menggunakan fase gerak n-butanol- asam asetat-air (3:1:1 v/v/v); setelah dielusi, bercak diamati pada UV254 nm, UV366 nm dan sinar tampak dan kemudian
nilai
hRf
dihitung,
kemudian
dilakukan
analisis
secara
spektrodensitometrik untuk diketahui pola kromatogram sediaan uji. Scanning dilakukan dari panjang gelombang 200-700 nm. Untuk analisis kuantitatif sediaan uji, dibuat larutan stok terlebih dahulu dengan kadar 5 mg/mL dengan senyawa baku berberin klorida yang dilarutkan dalam metanol. Larutan kadar 250 ; 200 ; 100 ; 50 ; dan 25 µg/mL dengan cara pengenceran larutan stok yang telah dibuat. Selanjutnya pada plat
19
KLT silika gel 60 F254, masing-masing ditoto lkan pada plat yang telah diaktifkan sebelumnya dengan cara dipanaskan dalam oven selama 10 menit. Volume penotolan sebanyak 5 µL dan dielusi dengan n-butanol-asam asetatair (3:1:1 v/v/v). Setelah terelusi kemudian diukur luas area (AUC) bercak yang diduga merupakan senyawa alkaloid dengan densitometer pada panjang gelombang maksimum. Kemudian untuk menentukan persamaan kurva baku, dihitung regresi dari kadar (µg) vs luas area, dan didapatkan y = bx+a , dengan x sebagai kadar dalam µg dan y sebagai luas area. Sehingga kadar alkaloid dalam sampel dapat dihitung sebagai berberin klorida. 7. Perlakuan pada hewan uji dan uji ketahanan berenang Mencit dibagi dalam 5 kelompok, dengan 2 kelompok kontrol yaitu kontrol positif (+) dan kontrol negatif (-) serta 3 kelompok perlakuan (P1, P2, dan P3). Mencit diadaptasi dengan pemberian pakan secara ad libitum selama 1 minggu. Setelah itu mencit dibuat stres dengan cara merenangkan secara paksa seperti pada prosedur forced swim test selama masing- masing 6 menit pada tabung dengan diameter 10 cm; tinggi 25 cm; ketinggian air 15 cm dengan suhu ± 25ºC pada hari pertama hingga sampai dengan hari ke-14. Kemudian mulai hari ke-15 sampai dengan hari ke-28, setiap hari secara per oral, kelompok kontrol positif (+) diberi amitriptilin, kelompok kontrol negatif (-) diberi plasebo berupa air suling, kelompok P1 diberi larutan sediaan uji dengan
dosis 78 • ? ? •?
, kelompok P2 diberi dosis
20
156 • ? ? •?
, kelompok P3 diberi dosis 312 • ? ? •?
. Pada hari ke-29
semua kelompok diberi perlakuan berenang secara paksa (forced swim test) selama 6 menit dan diukur immobility time-nya. Immobility time dinilai pada saat hewan uji tidak bergerak di dalam air. Setiap hewan uji itu dinilai tidak bergerak ketika berhenti berjuang dan tetap mengambang bergerak di dalam air, hanya membuat gerakan-gerakan diperlukan untuk menjaga kepala di atas air.
Gambar 2. Perlakuan pada hewan uji (force swim test)
C. Analisis Hasil 1. Analisis Kualitatif dan Kuantitatif dengan KLT a. Analisis kualitatif Bercak yang muncul pada plat silika gel 60 F254 setelah terelusi, diamati warnanya pada sinar tampak, di bawah sinar UV 254 nm dan 366 nm. Kemudian dihitung hRf. Warna yang muncul dibandingkan dengan yang
21
terdapat pada literatur.
Selanjutnya dilakukan analisis terhadap adanya
senyawa alkaloid berberin dalam larutan sampel dilakukan dengan cara membandingkan pola spektrum sampel dengan pola spektrum standar pada panjang gelombang 200-700 nm. b. Analisis kuantitatif Analisis kuantitatif dilakukan dengan menggunakan alat TLC scanner. Plat yang telah terelusi tadi di-scan pada panjang gelombang 348 nm, yaitu panjang gelombang maksimal dari standar berberin klorida, kemudian didapat data luas area serta hRf yang terlihat pada pola kromatogram dari senyawa yang terdeteksi. Selanjutnya data luas area yang didapatkan dari standar berberin klorida dibuat kurva baku dengan persamaan regresi linier. Kemudian diperoleh: y = Ax + B, di mana: y = luas area (AUC) x = kadar senyawa A = tetapan regresi B = koefisien regresi Setelah diperoleh persamaan kurva baku, data yang didapat dari sediaan uji dihitung kadarnya dengan cara dimasukkan dalam persamaan kurva baku sehingga didapatkan kadar berberin klorida yang terdapat dalam sediaan uji.
22
2. Perhitungan immobility time dan analisisnya Sete lah didapat data immobility time dari masing- masing kelompok, kemudian dianalisis dengan software SPSS 17.0 pada taraf kepercayaan 95%. Untuk melihat distribusi data yang diperoleh, diuji dengan uji Shapiro-Wilk. Apabila data terdistribusi normal (p > 0,05), analisis data dilanjutkan dengan one-way ANOVA dan dilanjutkan dengan Post Hoc Scheffe Test untuk mengetahui perbedaan antar kelompok perlakuan apabila data berbeda signifikan (Ho ditolak, jika probabilitas < 0,05).
23
D. Skema Penelitian Batang akar kayu kuning Perlakuan pasca panen Simplisia Serbuk simplisia Ekstrak larut air
Standarisari ekstrak
Penentuan dosis
Perhitungan kadar (densitometer)
Pembuatan sediaan
Perlakuan pada hewan uji 1. Pembagian kelompok dan dosis 2. Adaptasi selama 7 hari 3. Perlakuan (forced swim test) pada hari ke-1 - 14 4. Pemberian sediaan uji pada hari ke-15 - 28 5. Uji ketahanan berenang (perhitungan immobility time) pada hari ke-29 Pengumpulan data Analisis data Gambar 3. Skema penelitian
24
