EKSPLORASI DAN ISOLASI ENZIM GLUKOSA OKSIDASE DARI FUNGI INPERFEKTI (GENUS Penicillium dan Aspergillus) INDIGENUS *)
Firman A.P I Nyoman P. Aryantha KPP Ilmu Hayati LPPM ITB Jalan Ganesha 10 Bandung 40132
ABSTRAK Telah dilakukan eksplorasi fungi imperfecti genus Pencillium dan Aspergillus indigenus yang dapat memproduksi enzim glukosa oksidase. Dari 93 isolat yang diuji (ditapis) secara kualitatif dengan metode uji tabung reaksi berisi medium glukosa dengan indikator bromcresol purple (BCP), diperoleh 11 isolat yang positif menghasilkan enzim glukosa oksidase. Ke 11 isolat tersebut adalah Aspergillus niger BT-I, Aspergillus niger BT-2, Aspergillus niger B-1, Aspergillus niger 15, Aspergillus niger III, Aspergillus niger DDL-1, Aspergillus niger 2, Aspergillus niger 3, Penicillium sp-3 dan Penicillium sp-M. Hasil isolasi dan uji aktivitas enzim dengan metode kolorimetri diperoleh 10 isolat yang aktif memproduksi enzim glukosa oksidase intrasel dengan aktivitas sebagai berikut: Aspergillus niger BT-1 (8,0 unit/mL), Aspergillus niger BT-2 (15,55 unit/mL), Aspergillus niger B-1 (15,72 unit/mL), Aspergillus niger 15 (2,87 unit/mL), Aspergillus niger III (14,81 unit/mL), Aspergillus niger DDL-1 (16,20 unit/mL), Aspergillus niger 2 (10,23 unit/mL), Aspergillus niger 3 (12,89 unit/mL), Penicillium sp-3 (14,01 unit/mL) dan Penicillium sp-M (2,15 unit/mL). Dari hasil-hasil tersebut menunjukkan bahwa isolat fungi imperfekti lokal (Penicillium dan Aspergillus) memiliki potensi sebagai penghasil enzim glukosa oksidase yang dapat dikembangkan lebih lanjut. Saat ini sedang dilakukan karakterisasi enzim glukosa oksidase dari masing-masing isolat terpilih. Kata kunci: Penicillium, Aspergillus niger, glukose oksidase -----------------------------------------------*) Makalah dibawakan dalam Pertemuan Ilmiah Tahunan (PIT) Perhimpunan Mikrobiologi Indonesia 2003 di Bandung, 29-30 Agustus 2003
1
BAB I PENDAHULUAN Indonesia termasuk salah satu negara yang memiliki bahan baku melimpah untuk digunakan dalam memproduksi berbagai bahan kimia dasar dan enzim termasuk enzim glukosa oksidase dan asam glukonat. Mikroba yang ada di alam Indonesia baru sebahagian kecil yang telah dimanfaatkan untuk memproduksi bahan hayati yang mempunyai nilai ekonomi tinggi. Potensi alam tersebut tersebut hingga saat ini belum dimanfaatkan secara optimal. Enzim glukosa oksidase dari A.niger termasuk salah satu jenis enzim yang dijual secara komersial. Enzim ini banyak digunakan dalam industri pangan dan analisis klinis untuk penentuan kadar glukosa darah. Berdasarkan data impor dari BPIS Tahun 2000, kebutuhan enzim termasuk glukosa oksidase setiap tahunnya meningkat. Penelitian enzim glukosa oksidase dari fungi isolat lokal (A.niger dan Penicillium notatum) telah dimulai sejak tahun 1979. Selanjutnya telah pula dilakukan penelitian isolasi enzim glukosa oksidase dari A.niger L 51 galur lokal Namun aktivitas dan perolehan enzim glukosa oksidase dari fungi tersebut di atas sangat rendah sehingga tidak efesien untuk diproduksi dengan skala industri (Firman dan Soedigdo, 1994). Studi keberadaan enzim glukosa oksidase dari fungi galur lokal khususnya genus Penicillium indigenous belum pernah dilaporkan, padahal produksi enzim glukosa oksidase dari fungi genus Penicillium lebih efisien dan menguntungkan
karena
enzimnya terdapat diluar sel (ekstraselular), relatif stabil sehingga mudah untuk dimurnikan. Pada penelitian ini telah dilakukan eksplorasi fungi inperfekti genus Penicillium dan Aspergillus galur indigenous yang dapat memproduksi enzim glukosa oksidase dengan aktivitas yang lebih tinggi dibandingkan dengan enzim glukosa oksidase dari isolat fungi galur lokal yang telah dilaporkan sebelumnya. Pada penelitian selanjutnya akan dilakukan kajian secara menyeluruh enzim glukosa oksidase dari isolat-isolat potensial tersebut.
2
BAB II TUJUAN DAN MANFAAT PENELITIAN Tujuan Penelitian Glukosa oksidase (GOD) termasuk salah satu enzim diagnostik yang mempunyai nilai ekonomi yang tinggi. Dilihat dari potensi alam serta keaneka ragaman hayati yang ada maka produksi enzim glukosa oksidase maupun enzim diagnostik lainnya sangat menguntungkan. Untuk mendapatkan mikroba potensial diperlukan penelitian penapisan mikroba lokal yang mampu menmproduksi enzim glukosa oksidase dengan aktivitas yang tinggi. Oleh karena itu penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi dan mengidentifikasi fungi genus Penicillium dan Aspergillus indigenus penghasil enzim glukosa oksidase serta mempelajari sifatsifat enzimnya. Manfaat Penelitian Penelitian ini dapat dimanfaatkan untuk produksi enzim glukosa oksidase dari fungi genus Penicillium dan Aspergillus indigenus. Hasil penelitian ini memberikan sumbangan terhadap pengembangan ilmu pengetahuan dan teknologi.
3
BAB III TINJAUAN PUSTAKA 3.1 Sifat-sifat enzim glukosa oksidase Glukosa oksidase (GOD: ß-D-glukosa O2 1-reduktase : EC.1.1.3.4) adalah enzim yang mengkatalisis oksidasi ß-D-glukosa menjadi glukono-lakton yang kemudian dengan adanya molekul air terhidrolisis menjadi asam glukonat dan peroksida. Reaksi oksidasi ß-D-glukosa oleh enzim glukosa oksidase dapat dituliskan sebagai berikut: GOD ß-D-glukosa
ß-D-glukonolakton FADH2
+
ß-D-glukonolakton + FADH2
+ FAD + H2O
Asam D-glukonat
O2
H2O2
+
FAD
-----------------------------------------------------------------------------------------ß-D-glukosa
+ H2O
Asam-D glukonat
+ H2O2
Enzim glukosa oksidase mempunyai keaktifan dan spesifisitas yang sangat tinggi terhadap ß-D-glukosa, merupakan glikoprotein dengan bobot molekul sekitar 160 kDa dan terdiri dari 2 subunit protein yang identik dengan bobot molekul 80 kDa. Setiap subunit memiliki memiliki molekul FAD sebagai gugus prostetiknya (Whitaker, 1972). Enzim glukosa oksidase dengan kemurnian sekitar 80 -90 % diperoleh dari perbenihan Aspergillus niger atau Penicillium notatum selama 72 jam pada suhu 20 22oC dalam media yang mengandung glukosa. Enzim glukosa oksidase dalam keadaan kering dan murni berwarna kuning pucat, pada suhu 0oC stabil selama 2 tahun. Pada penyimpanan suhu 25oC enzim glukosa oksidase hanya stabil selama 8 bulan. Aktivitas enzim glukosa oksidase hilang bila dipanaskan pada suhu diatas suhu 37oC . pH optimum enzim glukosa oksidase adalah 5,6. Larutan enzim glukosa oksidase stabil pada kisaran pH 3 - 8, di luar kisaran pH tersebut enzim mengalami kerusakan lebih cepat (Steven and Price, 1993). 4
Di dalam pustaka dilaporkan bahwa enzim glukosa oksidase diproduksi dari Aspergillus niger dan Penicillium sp. Dari genus Penicillium diproduksi glukosa oksidase secara ekstraselular, tidak ditemukan adanya glukosa oksidase intraselular. Beberapa spesies Penicillium yang memproduksi glukosa oksidase ekstraselular antara lain adalah P. purpurogenum, P. amagasakiense, P. funiculosum, dan P. variabile P 16 (Nakamatsu et al., 1975 ; Barker and Shirley, 1980 ; Anonym, 1990 ; Petruccioli and Federici, 1993). Sintesis glukosa oksidase dipengaruhi oleh sumber karbon, nitrogen, ion logam tertentu dan pH media fermentasi (Petruccioli dan Federici, 1993).
BAB IV 5
METODE PENELITIAN 3.1 Skreening fungi genus Penicillium dan Aspergillus indigenus penghasil enzim glukosa oksidase Sebanyak 92 isolat fungi genus Penicillium dan Aspergillus diidentifikasi secara kualitatif adanya glukosa oksidase sebagai berikut: spora yang berumur 4 hari diinokulasi ke dalam tabung reaksi yang berisi medium glukosa dengan indikator bromocresol purple (BCP). Selanjutnya tabung-tabung reaksi tersebut disimpan pada suhu kamar. Aktivitas enzim glukosa oksidase ditandai dengan terjadinya perubahan warna indikator dari ungu menjadi warna kuning pada tabung uji. 3.2 Produksi enzim glukosa oksidase pada skala labu kocok Isolat yang diduga aktif memproduksi enzim glukosa oksidase berdasarkan hasil skrening atau penapisan ditumbuhkan dalam media cair dengan komposisi sebagai berikut (g/L): glukosa anhidrat 80, pepton 3, NaNO3 0,5 KH2PO4 1, dan CaCO3 35 (disterilkan terpisah). Kultur ditumbuhkan pada kecepatan aerasi 150 rpm suhu 30oC selama 72 jam. Miselium dipisahkan dari media perumbuhan dengan cara filtrasi menggunakan kertas saring, sisa media dicuci beberapa kali dengan air suling. Supernatan bebas sel diuji aktivitas enzim glukosa oksidase ekstraselular sedangkan enzim glukosa oksidase intraselular diuji setelah dilakukan pemecahan miselium dengan menggunakan pasir laut. 3.3 Isolasi dan Identifikasi enzim glukosa oksidase secara kuantitatif dengan metode kolorimetri Isolasi enzim glukosa oksidase intraselular dilakukan sebagai berikut: miselium digerus sampai halus dengan menggunakan pasir laut perbandingan 1 :2. Sel yang telah lisis ditambahkan dengan buffer fosfat 0,1 M pH 6,0 kemudian disentrifugasi pada kecepatan 12.000 rpm selama 20 menit (Firman dan Soedigdo, 1994). Aktivitas glukosa oksidase ditetapkan secara kolorimetri pada λ 505 nm (Trinder, 1966).
6
Prosedur uji aktivitas adalah sebagai berikut: ke dalam kuvet diisi larutan glukosa 18%, peroksidase 1 Unit dan amino-antipirin kemudian diinkubasi pada suhu 30oC selama 5 menit. Sebanyak 0,1 mL larutan glukosa oksidase dimasukkkan ke dalam kuvet tersebut kemudian diukur kenaikan serapan pada λ 505 nm selama 4 menit. Kadar protein enzim ditetapkan dengan metode Lowry et al, (1951).
7
BAB V HASIL DAN PEMBAHASAN 5.1 Skrining atau penapisan isolat fungi penghasil enzim glukosa oksidase Telah dilakukan eksplorasi fungi imperfecti genus Pencillium dan Aspergillus indigenus yang dapat memproduksi enzim glukosa oksidase. Dari 93 isolat yang diuji (ditapis) secara kualitatif dengan metode uji tabung reaksi berisi medium glukosa dengan indikator bromcresol purple (BCP), diperoleh 11 isolat yang positif menghasilkan enzim glukosa oksidase (Tabel 1). Ke 11 isolat tersebut adalah Aspergillus niger BT-I, Aspergillus niger BT-2, Aspergillus niger B-1, Aspergillus niger 15, Aspergillus niger III, Aspergillus niger DDL-1, Aspergillus niger 2, Aspergillus niger 3, Penicillium sp-3 dan Penicillium sp-M. Tabel 1. Hasil uji aktivitas enzim glukosa oksidase secara kualitatif dari fungi galur lokal Isolat Fungi A. niger BT-1
Waktu Fermentasi (Jam) 72
Aktivitas enzim (pembentukan warna kuning) ++
A.niger BT-2
72
+++
A.niger B-1
72
+++
A.niger 15
72
+++
A.niger III
72
+++
A.niger DDL
72
+++
A.niger 2
96
++
A.niger 3
96
++
Penicillium sp-1
96
+
Penicillium sp-3
72
+++
Penicillium sp-M
96
++
Keterangan: +++ (lebih kuning)
8
5.2. Identifikasi, isolasi dan uji aktivitas enzim glukosa oksidase secara kuantitatif dengan metode kolorimetri Hasil identifikasi, isolasi dan uji aktivitas enzim dengan metode kolorimetri menunjukkan dari 11 isolat yang diidentifikasi enzimnya ternyata 10 isolat yang aktif memproduksi enzim glukosa oksidase intrasel (Tabel 2). Aktivitas enzim glukosa oksidase dari masing-masing isolat adalah sebagai berikut: Aspergillus niger BT-1 (8,0 unit/mL), Aspergillus niger BT-2 (15,55 unit/mL), Aspergillus niger B-1 (15,72 unit/mL), Aspergillus niger 15 (2,87 unit/mL), Aspergillus niger III (14,81 unit/mL), Aspergillus niger DDL-1 (16,20 unit/mL), Aspergillus niger 2 (10,23 unit/mL), Aspergillus niger 3 (12,89 unit/mL), Penicillium sp-3 (14,01 unit/mL) dan Penicillium sp-M (2,15 unit/mL). Tabel 2. Hasil pengukuran aktivitas enzim glukosa oksidase dari beberapa isolat fungi galur lokal
Aspergillus niger BT-1
6,0
Aktivitas Enzim glukosa oksidase (Unit/mL) 8,00
Aspergillus niger B-1
4,2
15,72
Aspergillus niger BT-2
5,5
15,55
Aspergillus niger 15
6,4
1,47
Aspergillus niger III
4,9
14,81
Aspergillus niger DDL
5,0
16,20
Aspergillus niger 2
5,5
10,23
Aspergillus niger 3
5,8
12,89
Penicillium sp-1
5,0
-
Penicilllium sp-3
6,5
14,01
Penicillium sp-ML
4,6
2,15
Isolat fungi
pH media
9
Isolat Aspergillus niger DDL yang diisolasi dari dodol yang telah berjamur memproduksi enzim glukosa oksidase dengan aktivitas yang paling tinggi (16,20 Unit/mL) diikuti dengan isolat Aspergillus niger B-1 (aktivitas enzimnya 15,72 Unit/mL) sedangkan isolat Aspergillus niger BT-2 yang diisolasi dari tanah berkapur memproduksi enzim glukosa oksidase dengan aktivitas 15,55 Unit/mL. Dari ketiga isolat tersebut yang menarik untuk dikaji lebih lanjut adalah enzim glukosa oksidase yang diisolasi dari Aspergillus niger BT-2. Diduga enzim glukosa oksidase dari Aspergillus niger BT-2 lebih stabil terhadap pH basa dibandingkan dengan enzim glukosa oksidase yang telah dilaporkan dalam pustaka. Dari hasil penelitian ini terungkap pula bahwa isolat fungi imperfekti lokal (Penicillium dan Aspergillus) memiliki potensi sebagai penghasil enzim glukosa oksidase dengan aktivitas yang cukup tinggi melebihi isolat yang diketahui sebelumnya. Di dalam pustaka dilaporkan bahwa enzim glukosa oksidase hanya diproduksi dari Aspergillus niger dan Penicillium sp. Kelompok fungi genus Penicillium yang dapat memproduksi enzim glukosa oksidase ekstraselular antara lain: P. purpurogenum, P. amagasakiense, P. funiculosum, dan P. variabile P 16 (Nakamatsu et al., 1975 ; Barker and Shirley, 1980 ; Anonym, 1990 ; Petruccioli and Federici, 1993). Tabel 3 Sintesis enzim glukosa oksidase pada berbagai waktu pertumbuhan yang diisolasi dari Aspergillus niger BT-2 Waktu pertumbuhan (jam) 24
Aktivitas enzim glukosa oksidase (Unit/mL) 14,37
48
10,95
72
12,24
96
8,00
110
4,65
Keterangan: inokulum yang digunakan berumur 24 jam
10
Sintesis enzim glukosa oksidase yang diisolasi dari fungi pada berbagai waktu pertumbuhan antara lain dapat dilihat pada Tabel 3 - 4. Pada Tabel 3 terlihat bahwa sintesis enzim glukosa oksidase pada waktu pertumbuhan 24 jam telah menunjukkan aktivitas yang cukup tinggi. Setelah waktu pertumbuhan 96 jam aktivitas enzim turun drastis. Sementara itu sintesis enzim glukosa oksidase pada berbagai waktu pertumbuhan dari Aspergillus niger III dapat dilihat pada Tabel 4. Pada waktu pertumbuhan 46 jam enzim glukosa oksidase menunjukkan aktivitas yang cukup tinggi dan aktivitas enzim tertinggi berlansung pada waktu pertumbuhan 96 jam. Sintesis enzim glukosa oksidase dari Penicillium sp-ML pada berbagai waktu pertumbuhan dapat dilihat pada Tabel 5. Hasil eksperimen menunjukkan bahwa sintesis enzim glukosa oksidase tertinggi tercapai pada waktu pertumbuhan 24 jam dengan aktivitas sebesar 16,70 Unit/mL. Pada waktu pertumbuhan 46 jam aktivitas enzim menurun dan kemudian meningkat lagi pada waktu pertumbuhan l Tabel 4 Sintesis enzim glukosa oksidase pada berbagai waktu pertumbuhan yang diisolasi dari Aspergillus niger III Waktu pertumbuhan (jam) 24
Aktivitas enzim glukosa oksidase (Unit/mL) 9,60
48
13,23
72
13,50
96
18,12
110
13,11
Keterangan: inokulum yang digunakan berumur 24 jam
11
Tabel 5 Sintesis enzim glukosa oksidase pada berbagai waktu pertumbuhan yang diisolasi dari Penicillium sp-ML Waktu pertumbuhan (jam) 24
Aktivitas enzim glukosa oksidase (Unit/mL) 3,66
48
16,70
72
7,68
96
11,19
110
15,36
Keterangan: inokulum yang digunakan berumur 24 jam
12
BAB VI KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan 1. Fungi genus Aspergillus galur lokal memproduksi enzim glukosa oksidase dengan aktivitas berkisar antara 1,47 Unit/mL - 16,20 Unit/mL. 2. Isolat Aspergillus niger BT-2, Aspergillus niger B-1 dan Aspergillus niger DDL mensintesis enzim glukosa oksidase dengan aktivitas yang cukup tinggi masingmasing sebesar 15,55 Unit/mL, 15,72 Unit/mL dan 16,20 Unit/mL. 3. Isolat Penicillium sp-ML dan Penicillium sp-3 masing-masing mensintesis enzim glukosa oksidase dengan aktivitas sebesar 2,15 Unit/mL dan 14,01 Unit/mL. 4. Isolat genus Aspergillus dan Penicillium berpotensi untuk dikembangkan sebagai sumber enzim glukosa oksidase Saran 1. Perlu dilakukan kajian biokimia enzim glukosa oksidase yang dihasilkan dari Aspergillus niger BT-2 dan Penicillium sp-3 2. Perlu dikembangkan produksi enzim glukosa oksidase dengan skala yang ditingkatkan (skala produksi)
13
DAFTAR PUSTAKA Anonymous, (1992), Biotechnology in ASEAN, Asean-Australia Biotechnology proyect. July, 1990 -june 30, 1992. Barker and Shirley. (19980), Glucose oxidase, glucose dehydrogenase, glucose isomerase, galactosidase and invertase. In Microbial Enzyme and Bioconversion, ed Rose, A.H. 173-226, London: Academic Press. Firman and P. Soedigdo. (1994), Pembuatan preparat glukosa oksidase dari A.niger L 51 untuk pereaksi penentuan kadar glukosa. Thesis Program Magister Institut Teknologi Bandung. Petrucioli, M and F. Federicci. (1993), Glucose oxidase production by Penicillium variabile P 16: effect of medium composition. J. of Applied Bacteriology, 75, 369-372 Whitaker, R.J. (1972), Principle of enzymology for the food science. Mergel Dekker Inc, New York, 561-570. Nakamatsu, T., T. Akamatsu, R. Niyajima and I. Shiio. (1975), Microbial production glucose oxidase. Agricultural and Biological Chemistry. 63, 51 – 58. Steven, L., W.C. Price. (1992), Fundamental of enzymology, Second Edition, Oxford University, New York.
14
