ABSTRAK KAJIAN MEKANISME KERJA DAUN BINAHONG (ANREDERA CORDIFOLIA (TEN.) V. STEENIS) SEBAGAI ANTIHIPERTENSI Oleh
Afrillia Nuryanti Garmana NIM: 30712016 (Program Studi Doktor Farmasi)
Hipertensi merupakan penyakit kardiovaskular penyebab kematian utama ketiga di Indonesia dengan prevalensi sebesar 26,5%. Terapi hipertensi secara farmakologi dengan menggunakan obat antihipertensi dilakukan dalam jangka waktu lama sehingga beresiko menimbulkan efek samping. Untuk mencari obat yang lebih aman dan mempunyai khasiat antihipertensi, dapat digali potensi bahan alam, salah satu sumbernya yaitu tanaman binahong. Binahong memiliki banyak manfaat diantaranya dapat memperbaiki fungsi ginjal, mengobati diabetes, stroke, wasir, demam, sakit perut, radang, antimikroba, dan melancarkan peredaran darah. Binahong juga merupakan salah satu tanaman yang direkomendasikan untuk menurunkan tekanan darah. Penelitian ini bertujuan untuk menentukan mekanisme kerja ekstrak daun binahong dan fraksi aktifnya serta menentukan senyawa penanda pada fraksi aktif. Pengujian efek antihipertensi pada ekstrak etanol daun binahong (EEDB) dilakukan melalui pengujian efek diuretik dan saluretik serta pengujian antihipertensi pada model hewan yang diinduksi dengan adrenalin. Ekstrak kemudian difraksinasi sehingga dihasilkan tiga jenis fraksi yaitu fraksi nheksana (FH), fraksi etil asetat (FE), dan fraksi air (FA). Pada ekstrak dan fraksi dilakukan pengujian efek antihipertensi pada model hewan hipertensi yang diinduksi deksametason. Kajian mekanisme antihipertensi lebih lanjut dilakukan melalui pengujian efek peningkatan kadar oksida nitrat (NO) secara in vivo; pengujian efek perintangan reseptor alfa, vasodilatasi melalui jalur NO, dan perintangan kanal kalsium secara ex vivo; serta pengujian efek inhibisi angiotensin converting enzyme (ACE) secara in vitro. Penentuan senyawa penanda dilakukan secara kromatografi lapis tipis (KLT) dengan membandingkan profil fraksi dengan senyawa pembanding. Pada pengujian efek diuretik dan saluretrik serta efek antihipertensi pada model hewan yang diinduksi adrenalin, digunakan EEDB 50, 100, dan 200 mg/kg bb. Pengujian efek diuretik dilakukan dengan metode Lipschitz yang dimodifikasi. EEDB 200 mg/kg bb menunjukkan efek diuretik yang berbeda bermakna terhadap kelompok kontrol negatif pada pengamatan 24 jam (p<0,05) sedangkan efek saluretik terjadi pada dosis 50 mg/kg bb.
Peningkatan ekskresi natrium tidak diikuti dengan peningkatan ekskresi kalium. Pada model hewan yang diinduksi adrenalin, kecepatan denyut jantung diukur dengan Non-Invasive Blood Pressure (NIBP) controller ADInstrument®. EEDB 50 mg/kg bb menurunkan kecepatan denyut jantung akibat pemberian injeksi adrenalin secara signifikan dibandingkan dengan kontrol positif (p<0,05). Pada pengujian efek antihipertensi dengan model hewan yang diinduksi deksametason, digunakan EEDB 100 mg/kg bb; FH 0,02 mg/kg bb; FE 1,66 mg/kg bb; dan FA 40,73 mg/kg bb. Tekanan darah tikus diukur dengan menggunakan CODA® tail-cuff blood pressure system. Model hewan hipertensi terbentuk pada hari ketujuh setelah pemberian injeksi deksametason. EEDB, FE, dan FA dapat menurunkan tekanan darah sistolik secara signifikan pada hari ke-14 (7 hari pengobatan) dengan penurunan tekanan darah berturut-turut sebesar 26,8; 34,1; dan 40,5 mmHg. Tekanan darah diastolik mulai turun sejak hari ke-8 (1 hari pengobatan) pada kelompok EEDB dengan penurunan tekanan darah sebesar 24,1 mmHg. Pada kelompok FH, FE, dan FA, penurunan tekanan darah diastolik terjadi pada hari ke-14 (7 hari pengobatan) dengan penurunan tekanan darah berturut-turut sebesar 22,0; 24,5; dan 35,4 mmHg. Kadar NO diukur secara spektrofotometri uv-sinar tampak pada panjang gelombang 546 nm setelah sampel serum direaksikan dengan pereaksi Griess. Nilai absorbansi yang diperoleh sebanding dengan kadar NO yang dihitung melalui persamaan regresi linier kurva kalibrasi natrium nitrit. Kadar NO dalam serum tikus mengalami peningkatan yang signifikan terhadap kelompok kontrol (p<0,05) pada 90 menit setelah pemberian EEDB 100 mg/kg bb dan FA 40,73 mg/kg bb yaitu sebesar 48,5 dan 36,36 μM. Pemberian FE hanya meningkatkan kadar NO sebesar 19,89 μM. Pada pengujian ex vivo, digunakan aorta kelinci yang dipaparkan terhadap EEDB 1,57 mg/mL; FH 0,0003 mg/mL; FE 0,03 mg/mL; dan FA 0,64 mg/mL. Efek pemberian EEDB, FH, FE, dan FA diamati pada kimograf lalu dihitung persen relaksasi dan waktu relaksasi. Pada kontraksi yang diinduksi norepinefrin, EEDB, FH, FE, dan FA menunjukkan persen relaksasi berturutturut sebesar 60,9; 39,2; 48,2; dan 52,5%. Waktu relaksasi pada semua kelompok uji menurun secara signifikan terhadap kelompok yang diinduksi norepinefrin (p<0,05). Pada kontraksi yang diinduksi norepinefrin dengan pretreatmen metilen biru, persen relaksasi yang terjadi akibat pemberian EEDB, FH, FE, dan FA berturut-turut sebesar 21,4; 30,7; 21,6; dan 23,8% serta tidak terjadi penurunan waktu relaksasi. Pada kontraksi yang diinduksi KCl, persen relaksasi yang terjadi akibat pemberian EEDB, FH, FE, dan FA berturut-turut sebesar 42,2; 20,4; 49,1; dan 35,8%, akan tetapi tidak terjadi penurunan waktu relaksasi. Pengujian inhibisi ACE dilakukan dengan menggunakan Hip-His-Leu sebagai substrat dan mengukur produk yang terbentuk secara spektrofotometri uv-sinar tampak pada panjang gelombang 228 nm. Dari data
absorbansi, dihitung persen inhibisi enzim dan ditentukan nilai IC50. Nilai IC50 pada pemberian EEDB, FH, FE, dan FA berturut-turut sebesar 20,76; 198,13; 115,77; dan 88,41 μg/mL. Hasil pengujian dengan KLT menunjukkan bahwa asam ursolat dapat digunakan sebagai senyawa penanda pada FH, senyawa apigetrin dapat digunakan sebagai senyawa penanda pada FE, sedangkan pada FA senyawa penanda merupakan suatu senyawa flavonoid. Dari hasil seluruh percobaan tersebut, EEDB terbukti secara praklinis memiliki efek antihipertensi melalui beberapa mekanisme kerja yaitu sebagai diuretik dan saluretik, antagonis reseptor beta, vasodilatasi melalui jalur NO (ex vivo dan in vivo), inhibisi kanal kalsium, serta inhibisi ACE. Mekanisme kerja yang dominan dari ekstrak etanol daun binahong sebagai antihipertensi adalah sebagai vasodilator melalui jalur NO dan antagonis reseptor β1. Fraksi air menunjukkan efek vasodilatasi melalui jalur NO (ex vivo dan in vivo) serta inhibisi ACE (lemah), tetapi tidak menunjukkan efek inhibisi kanal kalsium. Fraksi etil asetat menunjukkan efek vasodilatasi melalui jalur NO (ex vivo), inhibisi kanal kalsium (lemah), serta inhibisi ACE (lemah). Hasil pengujian pada fraksi n-heksana tidak menunjukkan efek inhibisi kanal kalsium dan inhibisi ACE, tetapi menunjukkan efek vasodilatasi melalui jalur NO (ex vivo). Kata kunci: binahong, Anredera cordifolia, antihipertensi, vasodilator, oksida nitrat, antagonis beta-1
ABSTRACT MECHANISM STUDY OF MADEIRA VEIN (ANREDERA CORDIFOLIA (TEN). V. STEENIS) LEAVES AS ANTIHYPERTENSIVE AGENT By
Afrillia Nuryanti Garmana NIM: 30712016 (Doctoral Program in Pharmacy)
Hypertension is the cardiovascular disease that the third leading cause of death in Indonesia with a prevalence of 26.5%. Pharmacological treatment of hypertension by using antihypertensive drugs is a long term therapy, hence there is a risk of adverse effect. Natural source can be explored to find a safer drug which has antihypertensive effect, one of the sources is madeira vein. Madeira vein has many benefits including treatment kidney damage, diabetes, stroke, hemorrhoids, fever, abdominal pain, inflammation, antimicrobial, and improving blood circulation. Madeira vein is also one of the recommended plants for lowering blood pressure. This study aims to determine the mechanism of binahong leaves extract and its active fraction, determine marker compound in the active fraction. Antihypertensive effect of ethanolic extract of madeira vein leaf (EEMV) were performed by testing diuretic and saluretic effects as well as antihypertensive effect testing in adrenaline-induced hypertensive animal model. The extract was fractionated and yielded three fractions, namely n-hexane fraction (HF), ethyl acetate fraction (EF), and water fraction (WF). On the extract and fractions, antihypertensive effect was examined in dexamethasone-induced hypertensive animal model. Further studies of antihypertensive mechanisms were carried out by testing the increasement level of nitric oxide (NO) in vivo; alpha blockers activity, vasodilation effect through NO pathways, and calcium channel blocker activity ex vivo; and also angiotensin converting enzyme inhibition activity in vitro. Determination of marker compound was done by thin layer chromatography (TLC) by comparing fraction profile with standard compound. In the examination of diuretic, saluretric and antihypertensive effects in adrenalineinduced animal models, EEMV 50, 100, and 200 mg/kg bw were used. The diuretic effect was performed using the modified Lipschitz method. EEMV 200 mg/kg bw showed significantly different diuretic effect compare to negative control group in 24 hours observation, whereas saluretic effect occurred at 50 mg/kg bw. Increasement of sodium ion excretion was not followed by increasement potassium ion. In the adrenaline-induced animal model, heart rate was measured by ADInstrument® Non-Invasive Blood Pressure (NIBP) controller. EEMV 50 mg/kg bw decreased heart rate caused by adrenaline injection significantly compared to positive control (p<0.05).
In the examination of antihypertensive effects in dexamethasone-induced animal model, EEMV 100 mg/kg bw; HF 0.02 mg/kg bw; EF 1.66 mg/kg bw; and WF 40.73 mg/kg bw were used. The rat’s blood pressure was measured by CODA® tail-cuff blood pressure system. Hypertensive rat model was occured on day 7 after administration of dexamethasone injection. EEMV, EF, and WF could significantly reduce systolic blood pressure (SBP) at day 14 (7 days of treatment) (p<0.05) with decreasement of SBP were 26.8; 34.1; and 40.5 mmHg, respectively. Diastolic blood pressure (DBP) began to decrease from day 8 (1 day treatment) in the EEMV group with DBP reduction of 24.1 mmHg. In the HF, EF, and WF groups, decreasement of DBP occurred on day 14 (7 days of treatment) with decreasement 22.0; 24.5; and 35.4 mmHg, respectively. NO level was measured using uv-visible spectrophotometry at wavelength of 546 nm after serum sample was reacted with a Griess reagent. The absorbance value was linear with NO content which was calculated through linear regression equation of calibration curve of sodium nitrite standard. NO level in rat’s serum was significantly increased at 90 minutes after administration of EEMV 100 mg/kg bw and WF 40.73 mg/kg bw, respectively, 48.5 and 36.36 μM. administration of EF only increase NO level 19.89 μM. In the ex vivo experiment, rabbit aortic rings were exposed to EEMV 1.57 mg/mL; HF 0.0003 mg/mL; EF 0.03 mg/mL; and WF 0.64 mg/mL. The respond of aortic rings to EEMV, HF, EF, and WF were observed in the kymograph, then percentage of relaxation and relaxation time were calculated from the graph obtained. In norepinephrine-induced contraction, EEMV, HF, EF, and WF showed percentage of relaxation 60.9; 39.2; 48.2; and 52.5%, respectively. Relaxation time of all groups were significantly decrease compared to norepinephrine group (p<0.05). In norepinephrine-induced contraction with methylene blue pretreatment, the percent of relaxation were 21.4; 30.7; 21.6; and 23.8%, respectively for EEMV, HF, EF, and WF, and there was no reduction in relaxation time. In KCl-induced contraction, the percentage of relaxation of EEMV, HF, EF, and WF were 42.2; 20.4; 49.1; and 35.8%, respectively, but no reduction in relaxation time. ACE inhibitor activity test was performed using Hip-His-Leu as the substrate and measured the formed product using uv- visible spectrophotometry at wavelength 228 nm. From the absorbance data, percentage of enzyme inhibition was calculated and IC50 value was determined. IC50 of EEMV, HF, EF, and WF were 20.76, 198.13, 115.77, and 88.41 μg/mL, respectively. The TLC profile showed that ursolic acid could be a marker compound in HF, apigetrin could be a compound marker in EF, while in WF marker compound was a flavonoid compound. Based on the experiments, EEMV was proved preclinically had antihypertensive effects with mechanism of action(s) as diuretic and saluretic, adrenergic receptor blocker, vasodilator through NO pathway (in vivo and ex vivo), calcium channel blocker, and also inhibitor ACE. The major mechanisms are vasodilator through
NO pathway and beta-1 receptor antagonist. Water fraction showed antihypertensive effect by vasodilation through NO pathway (ex vivo and in vitro) and ACE inhibition but not through calcium channel blockade. Ethyl acetate fraction showed vasodilation through NO pathway (ex vivo), ACE inhibition, and calcium channel blockade. N-hexane fraction showed vasodilation through NO pathway (ex vivo). Key words: madeira vein, Anredera cordifolia, antihypertensive, vasodilator, nitric oxide, beta-1 antagonist
