Diagnóstico y caracterización de Salmonella spp

Manual de Procedimientos Diagnóstico y caracterización de Salmonella spp.

2008

AUTORES María Inés Caffer Raqurel Terragno Norma Binsztein

Departamento Bacteriología Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas A.N.L.I.S. “Dr. Carlos G. Malbrán” Centro Regional de Referencia del WHO Global Salm Surv para América del Sur

2

INDICE CAPÍTULO I- INTRODUCCIÓN

5

CAPÍTULO II- AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE SAMONELLA spp. 9 9

1.-EPECÍMENES 2.-PROCESAMIENTO

10

2.1.-AISLAMIENTO

10

Flujograma de aislamiento e identificación bioquímica de Salmonella spp 14

a partir de heces 2.2.-IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN BIOQUIMICA DE SALMONELLA spp.

15

2.2.1.- Pruebas Bioquímicas

22

Agar Hierro Tres Azúcares y Agar Kligler

22

Prueba de la β-Galactosidasa

23

Agar Lisina Hierro

25

Agar SIM

26

Test de Utilización de Azúcares

27

Test de Decarboxilasa-Dehidrolasa

29

Prueba del Malonato

32

Ensayo del Rojo de Metilo

33

Ensayo de Voges-Proskauer

35

Prueba de la Urea

36

Prueba del Indol

38

2.2.2.- Problemas de Diagnóstico Diferencial

40

2.3.-SEROTIPIFICACIÓN DE SALMONELLA spp.

42

Antígenos Somáticos

43

Antígenos Flagelares

44

Antígeno Capsular

45

Descripción del Esquema de Kauffmann-White

45

2.3.1. SEROTIPIFICACION SOMÁTICA O

49

2.3.2. SEROTIPIFICACION FLAGELAR H

51

Flujograma para Serotipificación de Salmonella spp.

3

56

CAPÍTULO III- PRECAUCIONES DE BIOSEGURIDAD

59

1.- NIVEL DE LABORATORIOS

59

2.-ELEMENTOS DE PROTECCIÓN.

60

3.- INSTRUCCIONES PARA EL TRABAJO.

61

4.- ACCIONES A REALIZAR EN CASO DE INCENDIO

61

5.- CENTROS PARA REQUERIR AYUDA

62

6.- TRANSPORTE DE MUESTRAS

62

CAPÍTULO IV- MEDIOS DE CULTIVO Y SOLUCIONES

64

Caldo Selenito

64

Caldo Tetrationato

64

Caldo Flagelar

65

Solución Salina

65

Agar Movilidad (Swarm Agar)

65

Agar Nutritivo

65

Agar Mueller-Hinton

66

Agar EMB

66

Agar McConkey

66

Agar SS

67

Agar Hektoen

68

Agar Verde Brillante

69

Agar XLD

69

CAPÍTULO V- PLANILLAS DE RESULTADOS

4

71

CAPÍTULO I - INTRODUCCIÓN El género Salmonella pertenece a la tribu Salmonelleae, de la familia Enterobacteriaceae. Los miembros del género Salmonella son bacilos gram-negativos, de 0,7-1,5 x 2,0-5µm, generalmente móviles por flagelos perítricos (excepto S. Gallinarum), anaerobios facultativos, no esporulados. El género Salmonella fue objeto de sucesivas modificaciones, a través de los años, en lo que respecta a su nomenclatura y taxonomía. Sin embargo, todavía siguen vigentes las ideas desarrolladas por P.R. Edwards y H.W. Ewing, en la década del 40, cuando definieron e identificaron las primeras cepas del género Salmonella y de otros miembros de la familia Enterobacteriaceae. Estudios del DNA mediante técnicas de hibridación mostraron que el género Salmonella está constituído por 2 especies: Salmonella enterica y Salmonella bongori. Salmonella enterica está compuesta por 6 subespecies: Salmonella enterica subespecie enterica, Salmonella enterica subespecie salamae, Salmonella enterica subespecie arizonae, Salmonella enterica subespcie diarizonae, Salmonella enterica subespespecie houtenae y Salmonella enterica subespecie indica. A su vez las subespecies de Salmonella enterica y la especie Salmonella bongori se dividen en más de 2400 serovariedades, que están definidas en función de diferentes asociaciones de factores antigénicos somáticos O y flagelares H. La mayoría de las serovariedades aisladas del hombre y de los animales de sangre caliente pertenecen a la subespecie enterica (subespecie I) y llevan un nombre por lo general relacionado con el lugar geográfico donde se la aisló por primera vez. Como las serovariedades no tienen nivel taxonómico de especie, sus nombres no siguen las reglas del “International Code of Nomenclature of Bacteria”, de manera que sus nombres se deben escribir en letras romanas (no itálicas) y con mayúscula; por ejemplo el nombre completo de Salmonella Typhimurium es Salmonella enterica subesp. enterica serovariedad Typhimurium. Como este nombre es muy largo, a los fines prácticos se usa directamente Salmonella Typhimurium

5

Las serovariedades pertenecientes a las subespecies restantes y a Salmonella bongori, de baja incidencia en patología humana o animal, se designan con el nombre de la subespecie, seguido de la fórmula antigénica, por ej: Salmonella subesp. IV 50: b : - (Salmonella enterica subesp. houtenae 50:b : -) Los nombres de todas las serovariedades están contenidos en el Esquema de KauffmannWhite, publicado por el “Centro Colaborador de la OMS de Referencia e Investigación de Salmonella”, del Instituto Pasteur de París (1). Los miembros del género Salmonella están ampliamente distribuidos en la naturaleza, se los encuentra como comensales y como patógenos en el tracto gastrointestinal de mamíferos domésticos y salvajes, reptiles, aves e insectos, causando un amplio espectro de enfermedades en el hombre y los animales. Los miembros del género se pueden clasificar en tres grupos: a) Los que no tienen preferencia por algún huésped en especial, por lo que infectan tanto al hombre como a los animales. En este grupo se encuentran la mayoría de las serovariedades responsables de las salmonelosis. b) Los que infectan sólo al hombre: Salmonella Typhi, Salmonella Paratyphi A y Salmonella Paratyphi C c) Los que están adaptados a un huésped animal: S. Abortusovis, a los ovinos; S. Abortusequi, a los equinos y S. Gallinarum, a las aves La salmonelosis es una zoonosis de distribución mundial. La tasa de incidencia de la infección es mayor en los lactantes y en niños de corta edad. Epidemiologicamente, las infecciones por Salmonella pueden causar pequeños brotes en la población en general, sin embargo el 60 80% de los casos son esporádicos; a veces se producen grandes brotes en hospitales, jardines maternales, geriátricos, restaurantes. Es una enfermedad fundamentalmente de origen alimentario, la fuente más frecuente de infección son los alimentos contaminados, incluido agua. También puede ocurrir la transmisión de persona a persona. A pesar de todos los controles que se han puesto en práctica, las infecciones por Salmonella debidas al consumo de alimentos contaminados continúa siendo un problema serio con millones de casos que ocurren anualmente en todo el mundo, provocando grandes pérdidas

6

económicas. En el 2003, se estimó que solamente en los Estados Unidos, el costo de las salmonelosis producidas por alimentos contaminados llegaba a la cifra de 3.000.000.000 dólares. La vigilancia de Salmonella spp. en todas las etapas de la cadena de procesamiento de los alimentos constituye un elemento importante en la investigación de la epidemiología de la salmonelosis transmitida por alimentos y en el desarrollo e implementación de estrategias eficientes de control de la misma. En programas de monitoreo y control es esencial contar con métodos de laboratorio eficientes para el aislamiento, identificación y tipificación de Salmonella spp. Se debe destacar que hay muchos procedimientos distintos para el aislamiento de Salmonella. El método ideal debe tener una alta sensibilidad y especificidad, y ser al mismo tiempo simple, rápido y económico. Ningún método cumple con todos criterios y ninguno es óptimo para todas las condiciones. Por lo tanto es aconsejable consultar la literatura antes de elegir un método para un determinado propósito y es recomendable la comparación frecuente de los métodos de cada laboratorio con los nuevos métodos que surjan. Los criterios para la identificación bioquímica de Salmonella spp. están ampliamente descritos, sin embargo estas pruebas dependen de la expresión fenotípica de las características analizadas y pueden verse afectadas por variaciones en los medios de cultivo y en las condiciones de incubación. Como una alternativa se están introduciendo cada vez más los métodos moleculares; que permiten un diagnóstico más rápido y pueden ser más simples de realizar, pero tienen la desventaja que son caros. El sistema de serotipificación de Salmonella spp. es probablemente el mejor sistema de tipificación fenotípica bacteriano. Tiene un alto poder discriminatorio y provee información con significado epidemiológico, desde el punto de vista de la vigilancia basada en laboratorio. La disponibilidad y el costo de antisueros de alta calidad es un problema en algunos países y regiones. La subtipificación molecular da información adicional, de mayor discriminación sin embargo no es un sustituto de la serotipificación. Los microorganismos del género Salmonellae son bacilos Gram negativos (0.7 a 1.5 x 5 µm), no fermentadores de lactosa. Son móviles por medio de flagelos peritricos, con la excepción de Salmonella Pullorum y Salmonella Gallinarum. Fermentan glucosa con producción de 7

ácido y gas (excepto S. Typhi). También fermentan L-arabinosa, maltosa, D-manitol, Dmanosa, L-ramnosa, D-sorbitol, trehalosa, D-xilosa y D-dulcita.

Son oxidasa negativo,

catalasa positivo, indol y Voges-Proskauer (VP) negativo, rojo de metilo y citrato de Simmons positivo, urea negativo y producen SH2. Los procedimientos siguientes servirán como guía para realizar los pasos necesarios para aislar adecuadamente Salmonella spp. de heces, efectuar la identificación bioquímica de Salmonella spp. y serotipificar los aislamientos utilizando antisueros somáticos y flagelares adecuados. Recolección y transporte de muestras •

Aislamiento de Salmonella spp. de heces.

•

Identificación bioquímica de Salmonella spp.

•

Serotipificación de Salmonella spp.

Bioseguridad Los procedimientos de laboratorio se realizan de acuerdo con las recomendaciones establecidas en “Biosefety in Microbiological and Biomedical Laboratories”, 4 th. CDC/NIH (Ver Capítulo III - Precauciones de Bioseguridad)

8

CAPÍTULO II– AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE SALMONELLA spp. 1.-. ESPECÍMENES Para el diagnóstico de Salmonella spp. se pueden usar muestras de materia fecal y fluidos (sangre, orina, bilis y pus de abscesos). a) Materia fecal: La muestra debe obtenerse en el período agudo de la enfermedad, antes de iniciar el tratamiento con antimicrobianos. Con un hisopo estéril, se recoge una pequeña cantidad de una evacuación espontánea reciente, seleccionando las partes mucosas o sanguinolentas. En caso de no poder obtener esta muestra, se hace un hisopado rectal. Las muestras que no se pueden procesar dentro de las dos horas, se deben colocar en medio de transporte. Como medio de transporte se usa Cary – Blair, que tiene la ventaja de ser estable hasta 18 meses después de su preparación, cuando las condiciones de almacenamiento son correctas. En este medio de transporte se puede conservar la muestra hasta 5 días, siempre en refrigeración. b) Sangre: La muestra se toma en el momento del pico de fiebre. Se siembran 10 ml de sangre en un frasco de hemocultivo de 100 ml (relación 1:10). Se incuba a 35 - 37ºC, durante 7 días, haciendo un control (en medio de agar sangre) a ciegas a las 8 horas de incubación y controles periódicos de acuerdo a la turbidez observada. El hemocultivo reviste un interés especial en el caso de fiebre tifoidea y paratifoidea; pero no es constantemente positivo. Los porcentajes de positividad, en ausencia de tratamiento antibiótico, son: 90% durante la primera semana de evolución, 75% en la segunda, 40% en la tercera y 10% en la cuarta. Los hemocultivos son negativos en los sindromes de infecciones transmitidas por alimentos por serovariedades como S. Typhimurium ó S. Enteritidis, sin embargo estas serovariedades causan septicemia en los inmunocomprometidos. c) Material de abscesos y orina: El pus y la orina se recogen en recipientes estériles y una alícuota se siembra directamente en los medios de cultivo.

9

2.- PROCESAMIENTO 2.1.- AISLAMIENTO Materiales y equipamiento •

Ansas descartables (10 µl)

•

Placas de Petri descartables (9 cm diámetro) estériles

•

Balanza

•

Estufas a 37oC

•

Mechero bunsen

•

Hisopos de algodón

Medios •

Caldo nutritivo

•

Caldo selenito

•

Agar hierro – tres azúcares (TSI)

•

Agar lisina – hierro (LIA)

•

Estrías de agar tripticas de soja (TSA)

•

Placas de agar Salmonella Shigella (SS)

•

Placas de agar MacConkey (MC)

Procedimiento

Comentarios

Día 1 Cultivo primario en placas de agar (Camino I) y enriquecimiento selectivo (Camino II) (Figura 1) •

• Para estas muestras se recomiendan dos

Resuspender el hisopo en 1 ml de

caminos simultáneos:

caldo nutritivo de manera de tener una suspensión homogénea de la materia fecal. •

• Cultivo directo en medios sólidos,

Sembrar con ansa una muestra de la

aislamiento e identificación de las colonias

suspensión de materia fecal, en placas de agar MC y SS (o XLD) (Camino I- Cultivo directo)

•

Subcultivar el hisopo en un tubo de

•

10

Enriquecimiento en caldo selectivo,

caldo selenito, (Camino II - Enrequicimiento

se usa para favorecer el aislamiento de los

para la detección de Salmonella spp)

microorganismos cuando se encuentran en muy bajo número en la muestra. La elección del

método

depende

del

número

de

microorganismos presentes en la materia fecal, que está en relación con el proceso diarreico o el estado de portador. • Si en el camino de aislamiento directo (Camino I) se identifica

y confirma

Salmonella spp., no es necesario continuar la vía del enriquecimiento (Camino II)

•

Incubar las placas del Camino I y el

tubo (con el hisopo incluido) del Camino II, a 37ºC, 18-24 horas Día 2 Subcultivo de las colonias sospechosas de ser Salmonella y

• En la placa de agar MC las colonias

características fenotípicas de las colonias

típicas son lactosa negativas e incoloras, y

aisladas en las placas de agar MC y de agar

en las de agar SS: las colonias típicas son

SS (Camino I).

incoloras, translúcidas con un centro negro

•

Observar

la

morfología

Anotar los resultados en la Planilla 1

debido a la producción de SH2. (Ver Tabla

Registro de Resultados: Aislamiento de

1: Características de las colonias en medios

Salmonella spp. Morfología en placas de

selectivos y diferenciales )

•

agar selectivo (Camino I)

•

Subcultivar 2 colonias sospechosas

•

El subcultivo de colonias sospechosas

de ser Salmonella de las placas de agar MC

de Salmonella en estrías de agar TSA al

y SS en estrías de agar TSA, agar TSI y agar

mismo tiempo que la inoculación en TSI y

LIA (Camino I).

LIA

11

permite

ganar

un

día

en

la

identificación y serotipificación

•

Sembrar con ansa una muestra del caldo

• Si se obtienen resultados por el Camino I,

selenito en placas de agar MC y SS. Incubar

no continuar adelante por el Camino II.

todos los medios a 37ºC, 18-24 horas. (Camino II) Día

3

Confirmación

bioquímica

y

serotipificación de Salmonella (Camino I) y subcultivo de colonias sospechosas de Salmonella provenientes del camino de enriquecimiento (Camino II) •

Leer las reacciones bioquímicas TSI

y LIA, si son compatibles con Salmonella spp.,

realizar

las

complementarias

pruebas y

la

bioquímicas

serotipificación

somática (Camino I). [Ver Procedimiento Identificación

y

caracterización

de

Salmonella spp (2.2) y Serotipificación de Salmonella spp. (2.3) ]

•

Subcultivar 2 colonias sospechosas

•

Si se obtienen resultados por el

de Salmonella de las placas de agar MC y

Camino I, no continuar adelante por el

SS provenientes del enriquecimiento en

Camino II

caldo selenito (Camino II), en estrías de agar TSA, agar TSI y agar LIA.

Día 4 •

Leer los resultados

de las pruebas

bioquímicas complementarias y realizar la serotipificación flagelar de Salmonella spp.

12

(Camino I) y/ o los resultados confirmación

bioquímica

de la

preliminar

y

realizar la serotipificación somática de Salmonella spp. (Camino II).

TABLA 1. Características de las colonias en medios selectivos y diferenciales Medio de cultivo Agar MC Agar EMB Agar SS Agar XLD Agar HK Agar BGA

Selectividad Baja Baja Alta Alta Alta Alta

Aspecto de las colonias Incoloras Incoloras Incoloras con centro negro Rojas con centro negro Verdes-azuladas con centro negro Rosadas pálidas

Ver Flujograma de aislamiento e identificación bioquímica (Figura 1)

13

FIGURA 1.- FLUJOGRAMA DE AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN BIOQUÍMICA DE SALMONELLA spp. A PARTIR HECES Camino II

Camino I

MATERIA FECAL (HISOPO)

1er. día

Suspensión en solución fisiológica

Aislamiento en medios selectivos y diferenciales (2)

Caldo de enriquecimiento (1) 18-24 hs, 37ºC Aislamiento en medios selectivos y diferenciales (2)

Colonias típicas (3)

2do. día TSI

LIA

Estría

18-24 hs, 37ºC

3er. día Serotip. O (6)

Lectura (4)

Colonias típicas (3)

P. bioq. (5) TSI

LIA

Estría

Caldo Flagelar

18-24 hs, 37ºC

Lectura (4)

Serotip. O (6)

Lectura

Serotip. H

4to. día P. bioq. (5)

(1) Caldo selenito (2) Agar MacConkey y agar SS, o agar Hektoen, o agar xilosa lisina desoxicolato, o agar verde brillante. (3) Se seleccionan de 2 a 3 colonias. (4) Si TSI y LIA dan resultados compatibles con Salmonella, se siembran Pruebas bioquímicas complementarias (P.bioq.) y se realiza la serotipificación O (Serotip. O) (5) Pruebas bioquímicas complementarias: RM-VP, decarboxilasas, dulcita, malonato. (6) Serotip: Serotipificación. Si la serotipificación somática O de las colonias obtenidas por ambos procedimientos de aislamiento diera igual, la serotipificación flagelar H debe hacerse en una sola de ellas.

14

2.2.- IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN BIOQUIMICA DE SALMONELLA spp.

Las probables colonias de Salmonella spp. en los medios de aislamiento utilizados se confirman mediante pruebas bioquímicas recomendadas por Le Minor y Richard: desarrollo en agar hierro-tres- azúcares (TSI), utilización de urea de Christensen, determinación de lisina y ornitina decarboxilasa y de arginina dehidrolasa, prueba de la beta-galactosidasa (ONPG), prueba del rojo de metilo, reacción de Voges-Proskauer, prueba de fermentación de la dulcita y utilización del malonato. La mayoría de las serovariedades (99,8%) de Salmonella aisladas del hombre y de los animales de sangre caliente pertenecen a Salmonella enterica subesp. enterica (I) y tienen propiedades bioquímicas características (Tabla 2), siendo excepciones las serovariedades S. Typhi y S. Paratyphi A. TABLA 2. Pruebas bioquímicas de Salmonella enterica subesp. enterica (I)

Pruebas bioquímicas

Salmonella enterica subep. enterica (I)

Lactosa *** ONPG Producción de SH2 Glucosa (fermentación) *** Dulcita (fermentación) *** Adonita (fermentación) *** Lisina decarboxilasa ** Ornitina decarboxilasa** Arginina dihidrolasa ** Urea (hidrólisis)** Indol Rojo de Metilo * Voges Proskauer * Citrato de Simmons ** Malonato (utilización)*

+ +/con gas + + + + + + -

*Lectura a los 2 días; ** Lectura hasta los 4 días; *** Lectura hasta los 7 días; **** Lectura hasta los 30 días

15

Las características bioquímicas que permiten diferenciar las distintas subespecies dentro de la especie S. enterica y la diferenciación con la especie S. bongori se indican en la Tabla 3. TABLA 3. Propiedades bioquímicas diferenciales de las subespecies de Salmonella spp.

S. enterica Pruebas subesp. bioquímicas Enterica (I) Dulcita + ONPG Malonato Gelatina Sorbita + KCN L(+) tartrato + Mucato + Salicina Lactosa Habitat de Animales las cepas de sangre caliente

S. enterica subesp. salamae (II) + + + + + -

S. enterica subesp. arizonae (IIIa) + + + + + - (75%)

S. S. S. enterica enterica enterica S. subesp. bongori subesp. subesp. diarizonae houtenae indica (V) (IIIb) (VI) (IV) d + + d + + + + + + + + + + - (70%) + + + + (75%) d -

Animales de sangre fría y medio ambiente

+ 90% ó más de los resultados positivos; - 90% ó más de los resultados negativos; d: diferentes reacciones

Es importante tener en cuenta la posibilidad de aislar más de una serovariedad de Salmonella de un alimento ó de un material patológico. Si bien esto no ocurre con frecuencia, hay que tenerlo presente cuando se trabaja con muestras de materia fecal o de ganglios mesentéricos y sobre todo en el caso de ciertos alimentos para consumo humano o animal, como huevos a granel, embutidos, harinas de carnes o huesos. Es por ello que se recomienda estudiar varias colonias simultáneamente. Materiales y equipamiento • Ansas descartables (1 µl) • Ansa aguja • Mechero Bunsen • Estufa a 37oC

16

Medios • Medio para la prueba de urea • Medio para la prueba de fenilalanina • Medio Citrato de Simmons •

Medio para la prueba de la lisina decarboxilasa (LDC)

•

Medio para la prueba de la ornitina decarboxilasa (ODC)

•

Medio para la prueba de la arginina dihidrolasa (ADH)

•

Medio control para las pruebas con aminoácidos.

•

Vaselina estéril

•

Medio base para azúcares

•

Solución madre de dulcita al 5%

•

Solución madre de salicina al 10%

•

Solución madre de sorbita al 10%

•

Solución madre de lactosa al 10%

•

Solución madre de adonita al 10%

•

Solución madre de glicerol al 10%

•

Slución madre de manita al 10%

•

Solución madre de glucosa al 10%

•

Solución madre de dulcita al 10%

•

Solución madre de ramnosa al 10%

•

Solución madre de silosa al 10%

•

Caldo Malonato

•

Discos de o-nitrofenil-β-D-galactopiranósido (ONPG) o reactivo para la prueba de la

β-galactosidasa •

Agar SIM

•

Reactivo de Erlich para la prueba de indol

•

Medio RM/VP para la prueba de Voges-Proskauer

•

Solución de KOH 40% para la prueba de Voges-Proskauer

•

Solución alcohólica de alfa-naftol para la prueba de Voges Proskauer

17

Cepas bacterianas •

Cepas de referencia para el control de calidad de los medios.

Procedimiento

Comentarios

Día 3 Siembra de las pruebas bioquímicas complementarias •

Inocular a partir de un cultivo en estrías de agar TSA, los medios para las siguientes pruebas: • Medio para la prueba urea. • Medio para la prueba de LDC, ADH y ODC y el medio control. Cubrir con una capa de vaselina estéril. • Medio para ONPG. • Medio RM/VP. • Agar SIM. • Dulcita • Caldo Malonato

• Incubar todas las pruebas bioquímicas a 37ºC por 18-24 horas.

• Test de la β-galactosidasa: Resuspender

• La

un ansa del cultivo proveniente del TSI en

inducible, y como la lactosa, presente en el

un tubo que contiene 0.5 ml de medio de

TSI, es uno de los inductores del operón

ONPG e incubar a 37°C. Se debe ver una

lactosa, la prueba se realiza a partir del

reacción positiva dentro de los 20 minutos

desarrollo en este medio.

pero usualmente la prueba se lee a las 3-4 horas o más. También se pueden usar discos de ONPG siguiendo las indicaciones del fabricante

18

β-galactosidasa

es

una

enzima

Día 4 Lectura de las pruebas bioquímicas complementarias • Prueba de urea.

• Si

se

presentan

resultados

no

• Prueba de LDC, ADH y ODC.

concordantes con los esperados para la

• Prueba de ONPG.

identificación bioquímica de Salmonella

• Prueba de RM/VP.

spp. se deben realizar pruebas diferenciales.

• Prueba de SIM.

Ver Problemas de Diagnóstico Diferencial,

• Fermentación de Dulcita

donde se presentan pruebas bioquímicas

• Utilización de Malonato

comparativas con otros géneros de la familia Enterobacteriaceae

• Agregar los reactivos correspondientes a las siguientes pruebas: • RM: agregar a 0,5 ml del caldo RM/VP 1 gota de rojo de metilo • VP: agregar a 1 ml del caldo RM/VP, • Agitar muy bien luego de la adición de

0,6 ml de la solución alcohólica de α-

cada reactivo

naftol y 0,2 ml de la solución de KOH. •

Indol: agregar 1 ml del reactivo de .

Erlich al medio SIM. • Leer los resultados de acuerdo a las Tablas 4, 5 y ver Pruebas Bioquímicas – Propiedades

e

Interpretación

de

los

Resultados. • Anotar los resultados en las planillas de registro.

19

TABLA 4. Pruebas bioquímicas: interpretación de los resultados

Medio TSI

TSI TSI TSI LIA

Resultados

Reacciones/enzimas Producción de ácido (si el fondo es amarillo y la estría es roja, (la producción de ácido es sólo a partir de glucosa). Producción de ácido a partir de lactosa y/o sacarosa. Producción de gas

Negativo

Positivo

Fondo rojo

Fondo amarillo

Estría roja

Estría amarilla

No hay burbujas en el fondo No hay color negro

Burbujas de aire en el fondo Color negro

Botón purpura/Superficie amarilla

Botón púrpura/Superficie púrpura

LIA Urea LDC

Producción de H2S La decarboxilación de la lisina produce una reacción alcalina (color violeta) a través del medio. Los organismos que no decarboxilan la lisina producen una estría alcalina y un fondo ácido (color amarillo). Producción de H2S Ureasa Lisina decarboxilasa

No hay color negro Amarillo Color amarillo/marrón

ODC test

Ornitina decarboxilasa

Color amarillo/marrón

ADH test

Arginina dihidrolasa

Color amarillo/marrón

ONPG Voges Proskauer Indol SIM agar SIM agar SIM agar

β-Galactosidasa Producción de acetoína

Permanece incoloro Permanece incoloro

Color negro Rosa/Cereza Color púrpura y color amarillo/marrón en el medio control. Color púrpura y color amarillo/marrón en el medio control Color púrpura y amarillo/marrón en el medio control Amarillo Color rojo/rosado

Producción de Indol Producción de H2S Producción de indol Movilidad

anillo amarillo No color negro Anillo amarillo Desarrollo solo a lo largo de la línea de punción

20

anillo rojo/rosado Color negro anillo rojo/rosado Muestra un crecimiento difuso que se disemina a partir del punto de inoculación

TABLA 5. Resultados de las pruebas bioquímicas para Salmonella spp. Prueba1) TSI glucosa (ácido) TSI glucosa (gas) TSI lactosa TSI sacarosa TSI sulfuro de hidrógeno LIA agar SIM agar (H2S) SIM agar (indol) SIM agar (movilidad) Utilización de urea Lisina decarboxilasa Ornitina decarboxilasa Arginina dihidrolasa Reacción de β-galactosidasa Reacción de Voges-Proskauer Reacción de indol Utilización del Malonato Fermentación de Dulcita

Reacción positiva o negativa + + + + + + + + + +

1)

% de aislamientos de Salmonella que muestran la reacción2) 100 91.93) 99.24) 99.5 91.6 98 97 98.9 97 99 94.65) 97 70 98.44) 100 98.9 100 96

Ewing W. H. and Ball M. M., The biochemical reactions of members of the genus Salmonella. National Communicable Disease Center, Atlanta, Georgia, USA (1966). 2) Estos porcentajes indican solo que no todas las cepas de Salmonella muestran las reacciones marcadas + o -. 3) Salmonella Typhi es anaerogénica. 4) Salmonella (subgénero) subespecie III (Arizona) da reacciones + o – para lactosa pero es siempre βgalactosidasa positiva. Salmonella (subgénero) subespecie II da una reacción negativa para lactosa y una reacción negativa para β-galactosidasa, (Antigenic Formulas of the Salmonella serovars, 2001). Para el estudio de las cepas, puede ser útil realizar pruebas bioquímicas complementarias. 5) S. Paratyphi A es negativa.

21

2.2.1.- PRUEBAS BIOQUÍMICAS

Agar Hierro Tres Azúcares (TSI) y Agar Kligler I. Principio El medio fue diseñado para determinar la habilidad de las bacterias de fermentar hidratos de carbono y producir sulfuro de hidrógeno (SH2). El medio contiene 1 parte (0.1%) de glucosa y 10 partes (1.0%) de lactosa y sacarosa. El indicador de pH es el rojo fenol y el sulfato ferroso pone en evidencia la formación de SH2. Si el microorganismo fermenta glucosa, tanto la punción como la estría aparecerán de color amarillo. Si el organismo fermenta lactosa y/o sacarosa, la estría permanecerá ácida (amarilla). Si no fermenta lactosa, la estría se vuelve alcalina (roja). Los organismos que no fermentan glucosa no producen cambios en el pH del medio o producirán productos alcalinos y el medio TSI permanecerá rojo. La producción de SH2 se manifiesta por un ennegrecimiento del medio. El agar de Kligler contiene dos azúcares: lactosa (1%) y glucosa (0.1%). Este medio puede reemplazar al TSI, la diferencia entre ambos es la ausencia de sacarosa. Los fundamentos bioquímicos y la interpretación de los resultados son los mismos para ambos medios. II. Materiales El medio está disponible comercialmente. Disolver en agua destilada y dispensar volumenes de 5.0 ml en tubos con tapa a rosca; autoclavar a 121ºC por 15 minutos y enfriar inclinado dejando un fondo de 5 a 10 mm. El sustrato es estable por 3 meses. Rotular indicando fecha de preparación y de expiración. Guardar en heladera; si hay cambio de color no usar. II. Resultados A. Estría ácida/fondo ácido (amarillo/amarillo): fermentación de glucosa, sacarosa y/o lactosa (E. coli). B. Estría alcalina/fondo ácido (rojo/amarillo): fermentación de glucosa solamente (Shigella spp.). C. Estría alcalina/fondo alcalino (rojo/rojo): no fermentador (Pseudomonas aeruginosa). D. Precipitado negro en el fondo: producción de SH2 (Salmonella spp). 22

E. Burbujas o roturas: producción de gas (E. coli, Salmonella spp.). III. Control de Calidad Bacteria Salmonella Typhi

Punción Ac

Estria

Sh2

Alc

+ (*)

Salmonella Paratyphi A Ac/g

Alc

-

Salmonella spp.

Ac

Alc

+

Shigella spp.

Ac

Alc

-

Enterobacter aerogenes Ac/g

Ac

-

Enterobacter cloacae

Ac/g

Ac

-

Escherichia coli

Ac/g

Ac

-

Citrobacter

Ac/g

Ac

+

Klebsiella

Ac/g

Ac

-

Proteus vulgaris

Ac/g o Ac

Ac

+(sucio)

Proteus mirabilis

Ac/g o Ac

Alc

+ (sucio)

Klebsiella pneumoniae

Ac/g o Ac

Alc

-

(*) sólo en la parte superior de la punción o formación de un anillo. Para el control de calidad selecionar entre aquellos microorganismos disponibles.

Prueba de la β-galactosidasa I. Principio La fermentación de la lactosa requiere dos enzimas; mientras

la permeasa facilita la

penetración de la molécula de lactosa dentro de la célula bacteriana, la β-galactosidasa hidroliza la lactosa para formar galactosa y glucosa. Las bacterias no fermentadoras de lactosa carecen de ambas enzimas, sin embargo hay bacterias que tienen β-galactosidasa pero no permeasa. El o-nitrofenil-β-D-galactósido (ONPG) es un compuesto incoloro estructuralmente similar a la lactosa. En presencia de β-galactosidasa, ONPG se rompe en galactosa y onitrofenil, un compuesto color amarillo. Como la familia Enterobacteriaceae se agrupan de acuerdo a su habilidad de fermentar lactosa, este test es útil en la identificación de fermentadores de lactosa.

23

II. Materiales A. Solución de ONPG Disolver 80.0 mg de ONPG en 15.0 ml de agua destilada a 37º C, agregar 5.0 ml del buffer fosfato, ajustar a pH 7.0 y esterilizar por filtración. La solución es estable por 6 meses. Guardar refrigerada (4 a 8º C), en recipientes de color caramelo o envueltos en papel de aluminio. Rotular la solución, indicando fecha de preparación y de expiración. B. Buffer fosfato de sodio 1M (pH 7.0) Disolver 6,9 gr de NaHPO4.H2O en 45.0 ml de agua destilada. Agregar 3.0 ml de una solución de NaOH al 30% (w/v) y ajustar el pH a 7.0. Llevar el volumen a 50.0 ml con agua destilada y guardar a 4º C.III. Procedimiento A. A partir de un cultivo en TSI, hacer una suspensión espesa del organismo a ensayar en 0.5 ml de solución salina. El volumen no tiene mayor importancia porque es una prueba basada en la observación de un cambio de color. B. Agregar un disco o dos gotas de solución de ONPG. C. Incubar la mezcla a 37ºC y examinar cambio de color hasta 24 horas. IV. Resultados Ensayo positivo: desarrollo de color amarillo. Ensayo negativo: no hay desarrollo de color. V. Control de calidad Escherichia coli (+) Salmonella (-) VI. Consideraciones A. Se puede partir de estrías de agar nutritivo con 1% de lactosa, cuando no se dispone de TSI. B. La solución de ONPG preparada debe ser incolora antes de su empleo.

24

Agar Lisina Hierro (LIA) I. Principio La decarboxilación de la lisina a cadaverina produce una alcalinización del medio y un viraje al violeta del indicador púrpura de bromocresol. Como la reacción tiene lugar en medio ácido, es necesaria la fermentación previa de la glucosa. Los microorganismos que no decarboxilan lisina, pero fermentan la glucosa producen un viraje al amarillo en todo el medio. La formación de SH2 produce una coloración negra debido al sulfuro de hierro producido. Las bacterias del grupo Proteus-Providencia, con excepción de Morganella morganii, desaminan la lisina a ácido α-cetocarbónico que forma compuestos pardo-rojizos en el medio de cultivo con la sal de hierro y en aerobiosis. II. Materiales El medio está disponible comercialmente. Disolver el polvo en agua destilada y dispensar en volúmenes de 3 ml en tubos con tapa a rosca. Esterilizar a 121ºC por 15 minutos. Enfriar de manera de tener estría y fondo. Guardar en heladera. II. Resultados Los microorganismos que descarboxilan la lisina producen un viraje al violeta. Los microorganismos que no descarboxilan la lisina y fermentan glucosa producen un viraje al amarillo. La formación de SH2 se indica por la aparición de una coloración negra.

25

III. Control de Calidad Bacteria

Punción

Estria

Sh2

Salmonella sp.

Violeta

Violeta

+

Proteus mirabilis

Amarilla

Pardo-rojiza

+

Proteus vulgaris

Amarilla

Pardo-rojiza

+

Morganella morganii

Amarilla

Pardo-rojiza

-

Prov. rettgeri

Amarilla

Pardo-rojiza

-

Providencia spp.

Amarilla

Pardo-rojiza

-

Citrobacter spp.

Amarilla

Violeta

+

Escherichia coli

Amarilla

Violeta

-

Shigella spp.

Amarilla

Violeta

-

Klebsiella

Violeta

Violeta

-

Para el control de calidad seleccionar entre aquellos microorganismos disponibles. Agar SIM I. Principio Es un medio que se usa para determinar la formación de sulfuro de hidrógeno, la producción de indol y la movilidad en el diagnóstico de Enterobacterias. II. Materiales El medio está disponible comercialmente. Disolver en agua destilada, calentar suavemente hasta su disolución y dispensar en volumenes de 5 ml en tubos con tapa a rosca. Autoclavar a 121ºC, 15 minutos; enfriar en posición vertical y guardar en heladera. III. Procedimiento A.Con un ansa tomar material de una colonia y sembrar por punción. B.Incubar a 37ºC por 18 a 24 horas. IV. Resultados A. Para la producción de SH2 Ensayo positivo: ennegrecimiento del medio. 26

Ensayo negativo: no hay ennegrecimiento. B. Para la movilidad Ensayo positivo: hay una turbidez difusa del medio. Ensayo negativo: sólo hay crecimiento a lo largo de la punción. C. Para la producción de indol Ensayo positivo: aparición de color rojo cuando se agrega el reactivo de Erlich. Ensayo negativo: no hay aparición de color. V. Control de Calidad Escherichia coli: SH2 -, indol +, movilidad + Klebsiella pneumoniae: SH2 -, indol -, movilidad Proteus vulgaris: SH2 +, indol +, movilidad + VI. Consideraciones Un organismo que produce sulfuro de hidrógeno puede mostrar ennegrecimiento en SIM pero no en TSI por la presencia de sacarosa en este último medio. La utilización de la sacarosa puede suprimir los mecanismos enzimáticos responsables de la producción del sulfuro de hidrógeno. Test de Utilización de Azúcares I. Principio Es un ensayo para determinar la capacidad de un microorganismo de fermentar un hidrato de carbono con producción de ácido o ácido y gas. El patrón de utilización de azúcares ayuda en la diferenciación e identificación de muchas bacterias. En este ensayo, determinados azúcares se agregan a un medio basal estéril. La producción de ácido se manifiesta por un cambio de color del indicador. La elección del medio y del indicador depende del camino metabólico del organismo y de la claridad visual del cambio de pH. II. Materiales A. Medio base •

Peptona

10.0 g

•

Extracto de carne

1.0 g 27

•

Cloruro de sodio

5.0 g

•

Azul de bromotimol

10.0 ml

•

Indicador de Andrade

5.0 ml

•

Agua destilada

1000 ml

Rehidratar los ingredientes con agua destilada, calentando suavemente si es necesario; ajustar el pH a 7.1-7.2 (7.4). Autoclavar a 121ºC por 15 minutos y enfriar en baño de agua a 50ºC. Fraccionar el medio base en alícuotas y agregar los azúcares esterilizados por filtración en concentraciones de: 0.5% para dulcita y salicina y 1.0% para los otros azúcares. Dispensar en volumenes de 4-5 ml en tubos con tapa a rosca, estériles. El medio se guarda en heladera y es estable por 3 meses. Para la glucosa y glicerol, el medio base se dispensa en tubos con campanita de Durham antes de autoclavar. La campanita se llenará con el medio y luego se agrega el azúcar en forma estéril después de enfriar a 50º C. B. Indicador de Andrade Disolver 0.5 gr de fucsina ácida en 100 ml de agua destilada, agregar 15.0 ml de NaOH 1N (4%); mezclar bien y dejar descansar a temperatura ambiente durante 24 horas, agitando frecuentemente. El color rojo se debe transformar en un color castaño. Si no se produce una decoloración suficiente agregar 1.0 ml de NaOH 1N (4%). III. Procedimiento 1) Con un ansa estéril tomar material de un cultivo en medio sólido. 2) Sumergir el ansa en cada tubo de hidrato de carbono. Para una batería de 8 a 10 azúcares, es suficiente un único inóculo, no hay necesidad de flamear el ansa entre tubo y tubo. La posibilidad de transportar el hidrato de carbono de tubo a tubo es infinitesimal y no afectará los resultados. Para una batería grande (15 a 20) de azúcares, puede ser necesario emplear 2 a 3 inóculos, flameando el ansa antes de tomar nueva muestra. 3) Incubar a 37º C y examinar día por día por 4 a 5 días. Para algunos microorganismos puede ser necesario una incubación más prolongada (7 días), registrando los resultados día por día. 4) En laboratorios de referencia las lecturas se deben prolongar hasta 30 días.

28

IV. Resultados Ensayo positivo: viraje del indicador al rojo-rosado por acidificación del medio. Ensayo negativo: no hay cambio de color. V. Control de calidad Con distintos microorganismos que fermenten los azúcares, como por ejemplo: Escherichia coli: glucosa + Klebsiella: lactosa + Yersinia enterocolitica: sacarosa + VI. Consideraciones A. Inocular un medio basal sin azúcar para cada microorganismo. B. La campanita de Durham se usa en el tubo con glucosa. C. Como cualquier indicio de gas, aún una burbuja pequeña, es evidencia de producción de gas, observar cuidadosamente la campanita antes de inocular. D. La campanita de Durham se agrega únicamente al medio con glucosa porque si el microorganismo produce gas con glucosa producirá gas con los otros azúcares. No obstante, si se sabe que el microorganismo en estudio no fermenta glucosa, es aconsejable agregar campanita a otros azúcares, pero hay que tener en cuenta que todas las Enterobacterias son fermentadoras de glucosa por definición, entonces sólo se pone campanita al medio con glucosa.

Test de Decarboxilasa-Dehidrolasa I. Principio La descarboxilación es un proceso en el cual las decarboxilasas atacan el extremo carboxilo de los aminoácidos, formando la correspondiente amina. Los tres aminoácidos que se ensayan en la identificación de Enterobacterias son arginina, lisina y ornitina. La decarboxilación de lisina y ornitina da cadaverina y putrescina (diaminas), mientras que arginina da citrulina por acción de una dihidrolasa. El test se debe acompañar con un tubo control que contiene el medio base sin aminoácido. Como la decarboxilación es una reacción anaeróbica, se debe cubrir el medio con una capa de aceite mineral estéril. El proceso ocurre en dos etapas: por fermentación de la glucosa se produce una acidificación del medio (pH < 6.0), apareciendo color amarillo. La 29

acidificación es necesaria para que ocurra la decarboxilación. Este último proceso de lugar a la formación de las aminas que elevan el pH con el consiguiente viraje del indicador al color violeta. La prueba de la lisina ayuda en la diferenciación de Edwardsiella (+), y Salmonella (+) de Citrobacter (-); de Enterobacter aerogenes (+) de Enterobacter cloacae (-) y Enterobacter agglomerans (-) La prueba de ornitina ayuda a diferenciar Klebsiella (-), Proteus mirabilis (+) de Proteus vulgaris (-); Morganella morganii (+) de Providencia rettgeri (-); Yersinia enterocolitica (+) de Yersinia pestis y Yersinia pseutuberculosis (-). II. Materiales El medio basal más utilizado es el medio de decarboxilasa de Moeller. El medio contiene peptona 5.0 g, extracto de carne 5.0 g, glucosa 0.5 g, bromocresol púrpura 0.01 g, rojo cresol 0.005 g piridoxal 0.005 g pero está disponible comercialmente. Las concentraciones de aminoácidos a usar son: 1% para la forma L y 2% para la forma DL. Fraccionar el medio base en 4 porciones de 250 ml cada una. Agregar los aminoácidos a 3 porciones del medio. El pH de la fracción que lleva ornitina se debe reajustar después de agregar el aminoácido y antes de esterilizar. Fraccionar en volumenes de 3 a 4 ml en tubos con tapa a rosca y autoclavar a 121ºC por 10 minutos. El sustrato es estable por 3 meses. Rotular los tubos, indicando fecha de preparación y de expiración y guardar en heladera. Al aceite mineral se le agrega 1 ml de agua por cada 100 ml de vaselina, y se autoclava a 121ºC por 45 minutos. III. Procedimiento A. Tomar material con un ansa e inocular el tubo control y los tubos con los aminoácidos. B. Cubrir todos los tubos con una capa de vaselina estéril. C. Incubar a 37ºC D. Efectuar las lecturas día por día hasta 4 días, registrando los resultados día por día. IV. Resultados Ensayo positivo: medio turbio y púrpura a púrpura amarillento.

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Ensayo negativo: color amarillo Tubo control: permanece con su color original o se vuelve amarillo si el organismo es un fermentador de glucosa (se debe ver turbidez en el tubo). V. Control de calidad Bacteria

Arginina

Lisina

Ornitina

Proteus vulgaris

-

-

-

Morganella morganii

-

-

+

Enterobacter cloacae

+

-

+

Enterobacter

-

+

+

S. Typhimurium

+

+

+

Klebsiella

-

+

-

aerogenes

VI. Consideraciones A. Inocular siempre un tubo control. B. Debe haber desarrollo para que el resultado sea válido. C. Si se observan capas de color amarillo y violeta, agitar suavemente el tubo antes de interpretar la reacción. D. Comparar todos los tubos positivos con el tubo control. Un color grisáceo puede indicar reducción del indicador más que formación de productos alcalinos. Se debe agregar más indicador antes de interpretar el resultado. E. Si la reacción es difícil de interpretar, comparar el tubo con un tubo sin inocular. Luego de 24 horas cualquier traza de color púrpura indica un resultado postivo. F. Si se usa el medio de Moeller, se debe incubar por lo menos 18 horas ante de interpretar los resultados. G. Si no se agrega el aceite mineral, las reacciones se deben leer sólo a las 24 horas. H. Un pequeño precipitado floculento en la ornitina no interfiere con su uso.

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Prueba del Malonato I. Principio El ensayo pone en evidencia la capacidad de las bacterias de utilizar malonato como fuente de carbono. Las cantidades mínimas de glucosa del medio, permiten el desarrollo de organismos que no pueden usar malonato o sales de amonio, sin embargo esos organismos no pueden mantener un pH alcalino. La producción de ácido por la fermentación de la glucosa impide una posible alcalinización. Solamente los microorganismos que pueden usar simultáneamente malonato de sodio como fuente de carbono y sulfato de amonio como fuente de nitrógeno son capaces de ejercer una acción buffer produciendo hidróxido de sodio. El aumento de la alcalinidad resultante hace que el azul de bromotimol cambie

de verde a azul. Los

microorganismos malonato negativos que fermentan glucosa hacen que el indicador cambie de verde a amarillo. La mayoría de las especies de Enterobacter y Klebsiella utilizan malonato de sodio. El ensayo también sirve para separar Salmonella arizonae (+) de otras especies de Salmonella (-). II. Materiales El medio contiene: extracto de lavadura 1.0g, sulfato de amonio 2.0g, fosfato dipotásico 0.6g, fosfato monopotásico 0.4g, ClNa 2.0g, malonato de sodio3.0g, glucosa 0.25g, azul de brotimol (1g/500ml) 12.5g . Disolver en 1000 ml de agua destilada, dispensar 3 ml en tubos con tapa a rosca y autoclavar a 121ºC por 15 minutos. Enfriar antes de usar; el sustrato es estable por 2 a 3 meses. Rotular los tubos, indicando fecha de preparación y de expiración y guardar en heladera. Si hay cambio de color en el medio no usar. III. Procedimiento A. Con ansa estéril tomar material e inocular el medio. B. Incubar a 37ºC por 24 a 48 horas. C. Continuar incubando los tubos negativos hasta 4 días, registrando los resultados día por día.

IV. Resultados Ensayo positivo: reacción alcalina (azul).

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Ensayo negativo: no hay cambio de color (verde). Ensayo negativo: reacción ácida, sólo fermentación de glucosa (amarillo). V. Control de Calidad Enterobacter aerogenes + Escherichia coli VI. Consideraciones A. Algunos organismos malonato (+) producen una ligera alcalinidad, que hace la interpretación difícil. Cuando hay duda comparar con un tubo sin inocular. Cualquier vestigio de color azul denota una prueba positiva luego de una incubación de 48 horas. No se debe hacer una interpretación final negativa hasta no haber incubado los tubos durante 48 horas. B. A veces es necesario agregar extracto de levadura y glucosa para estimular el crecimiento de algunos organismos. C. Algunas cepas malonato (-) dan color amarillo por la fermentación de la glucosa solamente. Esto produce una disminución del pH y el viraje del indicador al amarillo. Ensayo del Rojo de Metilo I. Principio El test se usa para determinar la presencia de iones hidrógeno cuando un microorganismo fermenta glucosa. Todos los miembros de la familia Enterobacteriaceae convierten glucosa en ácido pirúvico por el camino de Embden-Meyerhof. Los organismos que metabolizan ácido pirúvico producen ácido y bajan el pH a menos de 4.4. Los organismos que utilizan, en cambio, el camino del butilenglicol producen acetoína y butanodiol (diacetilo). El indicador del medio, rojo de metilo, es rojo a pH < 5.0 y amarillo a pH > 5.8. El test es útil para la diferenciación de Escherichia coli (rojo metilo positivo) de Klebsiella (rojo metilo negativo). La mayoría de las Enterobacteriaceae tienen uno u otro camino metabólico, pero raramente ambos. II. Materiales A. Preparación del medio

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El medio está disponible comercialmente. Disolver en agua destilada, dispensar 5 ml en tubos con tapa a rosca y autoclavar a 121ºC por 15 minutos. El sustrato es estable por 2 a 3 meses. Rotular los tubos, indicando fecha de preparación y de expiración. Guardar en heladera. B. Preparación del reactivo Disolver 0.1 gr de rojo de metilo en 300 ml de etanol y diluir con 200 ml de agua destilada, para alcanzar un volumen total de 500 ml. El reactivo es estable por 1 año. Rotular indicando fecha de preparación y de expiración. Guardar en heladera. III. Procedimiento A. Con un ansa estéril tomar material e inocular un tubo con caldo RM/VP. B. Incubar a 35º C por un mínimo de 48 horas. C. Transferir 2.5 ml de la suspensión a un tubo. D. Agregar 5 gotas del indicador y observar si hay cambio de color. IV. Resultados Ensayo positivo: el reactivo permanece rojo. Ensayo negativo: el reactivo se torna amarillo-naranja. Si el resultado es negativo continuar la incubación de la bacteria por 24 horas más. V. Control de Calidad Escherichia coli + Enterobacter aerogenes VI. Consideraciones A. Variaciones en la cantidad de peptona del medio puede afectar el resultado. B. Aumentando la concentración de glucosa en el medio no se acelera la reacción del rojo de metilo. C. No sobreinocular, el crecimiento bacteriano se inhibe cuando el inóculo es grande. D. Una incubación de 48 horas es suficiente para la mayoría de los cultivos; pero el ensayo no se debe realizar con cultivos que tengan menos de 48 horas de incubación.

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Ensayo de Voges-Proskauer I. Principio El piruvato es un intermediario en el metabolismo de la glucosa. A partir del ácido pirúvico un microorganismo puede seguir varios caminos. Algunos lo rompen para formar como productos finales ácidos láctico, acético o fórmico. Otros metabolizan el piruvato por el camino del butilenglicol para formar como productos finales acetoína (acetilmetilcarbinol) y 2,3-butanodiol (diacetilo). El ensayo de Voges-Proskauer (VP) detecta estos productos metabólicos. En presencia de oxígeno e KOH, la acetoína se oxida a diacetilo, que da un complejo rojo. La sensibilidad del ensayo se aumenta por el agregado de α-naftol antes del agregado de KOH. II. Materiales A.Preparación del medio El medio está disponible comercialmente. Para la preparación del caldo RM/VP, ver el procedimiento indicado para el test de rojo de metilo. B. Preparación de solución de α-naftol Disolver 5.0 gr de α- naftol en una pequeña cantidad de alcohol absoluto y luego llevar el volumen a 100 ml. La solución debe ser incolora. El reactivo es estable por 1 año. Rotular indicando fecha de preparación y de expiración. Guardar en heladera en frascos color caramelo. C. Preparación de la solución de KOH Disolver los pellets de KOH en agua destilada y luego llevar el volumen final a 100 ml (trabajar sobre baño de agua fría para evitar recalentamiento). El reactivo es estable por 1 año. Rotular indicando fecha de preparación y de expiración. III. Procedimiento A. Con un ansa estéril tomar material e inocular un tubo de caldo RM/VP. B. Incubar a 37ºC por un mínimo de 48 horas. C. Transferir 2.5 ml de la suspensión a otro tubo. D. Agregar 0.6 ml del reactivo de α-naftol.

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E. Agregar 0.2 ml del reactivo de KOH. F. Agitar el tubo y dejar descansar 10 a 15 minutos. G. Observar la formación de un color rosado a rojo. IV. Resultados Ensayo positivo: desarrollo de color rojo dentro de los 15 minutos. Ensayo negativo: no hay desarrollo de color. V. Control de Calidad Klebsiella pneumoniae – Escherichia coli + VI. Consideraciones A. Cuando hay una incubación prolongada (más de 3 días) algunos organismos VP + pueden producir un aumento de la acidez del medio, dando reacciones positivas débiles o falsas reacciones negativas. B. La mayoría de los miembros de la familia Enterobacteriaceae dan reacciones opuestas entre el rojo de metilo y VP, sin embargo algunos organismos como Hafnia alvei pueden dar ambas reacciones positivas. C. Los reactivos se deben agregar en el orden indicado. Una inversión del orden puede dar un resultado positivo débil o un falso negativo. D. No se debe agregar KOH en exceso, porque se puede enmascarar una reacción positiva débil por la formación de un color cobrizo por la reacción del KOH con el α-naftol. No leer el ensayo después de 1 hora; puede aparecer una coloración cobriza dando un resultado falso positivo. Prueba de la Urea I. Principio La urea es una diamida del ácido carbónico, cuya hidrólisis por acción de la ureasa da 2 moléculas de amoníaco. La ureasa es una enzima constitutiva que se sintetiza independientemente de la presencia o no de la urea. La prueba determina la capacidad de la bacteria de desdoblar la urea, con la consiguiente alcalinización del medio. Es una actividad

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característica de especies de Proteus y se usa para diferenciar Klebsiella (+) de Escherichia (-) y Proteus (+ rápido) de Providencia (-); Yersinia pseudotuberculosis (+) de Yersinia pestis (-) II. Materiales El medio base está disponible comercialmente, es el medio base de urea de Christensen, que contiene peptona 1.0 g, glucosa 1.0 g cloruro de sodio 5.0 g, fosfato monopotásico 5.0 g, solución de rojo fenol al 0.2% 6 ml. Se disuelve medio en agua destilada y esterilizar a 121ºC por 15 minutos. Enfriar a 50ºC y agregar 5 ml de una solución de urea al 40% por cada 100 ml de medio. Mezclar y fraccionar en volumenes de 2.5 ml en tubos estériles. Guardar en heladera. La urea se pesa asepticamente, se disuelve en agua y se calienta a 70ºC por 20 minutos, se guarda en frascos estériles con cloroformo (igual que para los azúcares). III. Procedimiento A) Con un ansa estéril se toma abundante material y se inocula por punción B) Se incuba a 37ºC y se efectúan lecturas a las 2, 4, 6 y 18 horas. Los tubos negativos se observan diariamente por 4 a 7 días para detectar reacciones tardías que dan ciertos miembros de la familia, registrando los resultados día por día. IV. Resultados Ensayo positivo: aparición de color rojo en el medio por una alcalinización del mismo. Ensayo negativo: no hay cambio de color. V. Control de Calidad Enterobacter aerogenes – Escherichia coli – Proeus vulgaris +

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Prueba del Indol I. Principio El indol es uno de los productos del metabolismo del aminoácido triptofano. Con un medio rico en triptofano, el indol se puede detectar por su habilidad para combinarse con ciertos aldehidos para formar un compuesto coloreado. El ensayo constituye un método rápido para detectar organismos productores de indol. Como indicador de la presencia del aldehído se usa el reactivo de Erlich. Es especialmente útil en la identificación preliminar de Escherichia coli, y para diferenciar Edwardsiella (+) de Salmonella (-). II. Materiales A. Caldo triptofano •

Peptona

20.0 gr

•

Cloruro de sodio

5.0 gr

•

Agua destilada

1000 ml

A este caldo se le incorpora triptofano en una concentración del 1%. El medio se esteriliza a 121ºC durante 15 minutos y luego se ajusta el pH a 7.5. Dejar enfriar antes de su empleo y guardar a 4-10ºC para su conservación. B. Reactivo de Erlich •

p-dimetilaminobenzaldehido

1.0 g

•

alcohol etílico, 95%

95.0 ml

•

ácido clorhidríco, concentrado

20.0 ml

Se disuelve el aldehído en el alcohol (puede requerir un calentamiento suave), luego se agrega lentamente el ácido. El reactivo de color amarillo es estable por un año. Identificar el reactivo con una etiqueta donde conste la fecha de preparación y de expiración. Guardar refrigerado en botellas color caramelo. III. Procedimiento 1) Con un ansa tomar material de una colonia aislada e inocular el caldo que contiene triptofano. 2) Incubar a 37ºC por 18 a 24 horas.

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3) Transferir 2 ml de la suspensión de caldo a un segundo tubo. 4) Agregar 5 gotas del reactivo de Erlich por la pared del tubo. 5) Agitar el tubo y observar un color rosado en la interfase entre el caldo y el reactivo. 6) Si el ensayo es negativo, el cultivo se debe reincubar otras 24 horas. IV. Resultados Ensayo positivo: desarrollo de un color rojo en la interfase del reactivo y el caldo, segundos después de agregar el reactivo. Ensayo negativo: no hay cambio de color o hay un color amarillo en la interfase. V. Control de Calidad Cualquiera de los reactivos debe ser controlado con cultivos positivos y negativos conocidos, antes de su empleo general. Como controles resultan convenientes cepas de fácil obtención y que su conservación en cultivos madre no ofrezca problemas. Escherichia coli + Enterobacter aerogenes Klebsiella pneumoniae – VI. Consideraciones 1) El pH óptimo para la actividad de la triptofanasa es ligeramente alcalino (7.4-7.8). La disminución del pH provoca una reducción en la producción de indol y una reacción falsamente negativa o débilmente positiva. 2) Los cultivos a los cuales se les efectúa la prueba del indol deben ser incubados aerobicamente. El descenso en la tensión de oxígeno disminuye la producción de indol. 3) No debe emplearse un medio de peptona que contenga glucosa porque la elevada acidez producida por la fermentación del azúcar puede inhibir la actividad de la triptofanasa. El agregado de triptofano estimula la producción de indol, mientras que la glucosa la inhibe.

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2.2.2.-PROBLEMAS DEL DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL

A) Salmonella Typhi y Salmonella Paratyphi A, pueden diferenciarse de otras Salmonella spp, por las siguientes pruebas bioquímicas: TABLA 6. Pruebas bioquímicas diferenciales entre Salmonella Typhi, Salmonella Paratyphi A y Salmonella spp. P. Bioquímicas

S. Typhi

S. Paratyphi A

Salmonella spp.

Trazas

-

+

Lisina decarboxilasa

+

-

+

Ornitina decarboxilasa

-

+

+

Arginina dihidrolasa

-

-

+

Glucosa (gas)

-

+

+

Citrato Simmons

-

-

+

SH2 (TSI)

+ 90% ó más de los resultados positivos; - 90% ó más de los resultados negativos

B) Algunas cepas de Salmonella spp.

se pueden confundir con otras enterobacterias

productoras de SH2 como Proteus mirabilis y Citrobacter freundii que son comensales del aparato digestivo del hombre y de los animales de sangre caliente, pero que no son enteropatógenos. TABLA 7. Caracteres bioquímicos diferenciales entre Salmonella subesp. enterica (I) Proteus mirabilis y Citrobacter freundii

Pruebas bioquímicas

Salmonella enterica subesp. enterica (I)

Citrobacter freundii

Proteus mirabilis

SH2 (TSI)

+

+

+

Urea (hidrólisis)

-

d

+

Fenilalanina deaminasa

-

-

+

Lisina decarboxilasa

+

-

-

Ornitina decarboxilasa

+

d

+

Lactosa (fermentación)

-

d

-

Dulcita (fermentación)

+

d

-

ONPG

-

+

-

+ 90% ó más de los resultados positivos; - 90% ó más de los resultados negativos; d: diferentes reacciones

40

C) Las cepas de Citrobacter freundii suelen ser identificadas por error como S. enterica subesp. arizonae (IIIa) (serovariedades monofásicas) y S.enterica subesp. diarizonae (IIIb) (serovariedades difásicas), (ex-género Arizona), en razón de compartir caracteres bioquímicos tales como: SH2 (TSI) +, ONPG + y un perfil de fermentación de hidratos de carbono muy parecido. TABLA 8. Caracteres bioquímicos diferenciales entre Salmonella subesp. enterica IIIa y IIIb y Citrobacter freundii Pruebas bioquímicas

Salmonella subesp. enterica

Citrobacter freundii

IIIa y IIIb Lisina decarboxilasa

+

-

Ornitina decarboxilasa

+

- (con excepciones)

Glicerol (fermentación)

-

+

Malonato (utilización)

+

-

+ (lenta)

-

Gelatina (hidrólisis)

+ 90% ó más de los resultados positivos; - 90% ó más de los resultados negativos

D) Muy raramente Salmonella pueden confundirse con otras entrobacterias productoras de SH2, como E. coli SH2 + o Edwardsiella tarda TABLA 9. Caracteres bioquímicos diferenciales entre Salmonella enterica subesp. enterica (I), Edwarsiella tarda y Esherichia coli SH2 + P. Bioquímicas

S. enterica subesp. enterica (I)

E. tarda

E. coli SH2 +

Indol

-

+

+

Citrato Simmons

+

-

-

Lisina decarboxilasa

+

+

+

Arginina dihidrolasa

+

-

-/+

Manita (fermentación)

+

-

+

Dulcita (fermentación)

+

-

+/-

Ramnosa (fermentación)

+

-

+

Xilosa (fermentación)

+

-

+

ONPG

-

-

+

+ 90% ó más de los resultados positivos; - 90% ó más de los resultados negativos

41

E) Puede suceder que dos o más serovares tengan la misma fórmula antigénica global, por lo que su diferenciación se hace en base a pruebas bioquímicas. TABLA 10. Caracteres diferenciales de las serovariedades S.Cholerasuis, S. Typhisuis y S. Paratyphi C. Pruebas Bioquímicas

Cholerasuis

Paratyphi C

Typhisuis

-

+

+

Citrato deSimmons

+ o (+)

+

-

Arginina dihidrolasa

-

+o-

-

Lisina decarboxilasa

+

+

-

Ornitina decarboxilasa

+

+

+

+o-

+

-

Arabinosa

-

+

+

Dulcita

-

+

-

Sorbita

+ o (+)

+

-

SH2

Tartrato de Jordan

+ 90% o más de los resultados positivos; - 90% o más de los resultados negativos; (+) reacciones positivas después de 3 o más días.

2.3.- SEROTIPIFICACIÓN DE SALMONELLA spp. La serotipificación constituye un importante complemento de la identificación bioquímica y desde el punto de vista epidemiológico permite determinar la prevalencia de una serovariedad en distintas zonas geográficas, como así también es de utilidad para el estudio de brotes y para conocer la fuente de infección y las vías de transmisión. El uso de reacciones antígeno – anticuerpo para la serotipificación de las bacterias se basa en que los microorganismos presentan diferencias en su constitución antigénica, aún entre grupos de microorganismos relacionados. Los microorganismos expresan una gran variedad de antígenos (Ags): componentes estructurales de la célula (pared, cápsula, fimbrias); productos de excreción (exotoxinas, enzimas extracelulares). Químicamente, los Ags pueden ser proteínas, hidratos de carbono y complejos de polipéptidos y carbohidratos. Como son moléculas complejas tienen más de una subestructura que puede servir como determinante antigénico. Debido a esto en los sueros inmunes se encuentran anticuerpos que reaccionan contra distintos determinantes antigénicos de la misma molécula.

42

La base de la serotipificación para todas las enterobacterias es similar: se pone en evidencia la presencia de antígenos somáticos, flagelares y capsulares. La serotipificación de cepas de Salmonella enterica involucra la identificación de antígenos somáticos de superficie (LPS, antígenos O) y antígenos flagelares (proteínas, antígenos H). La mayoría de las cepas de Salmonella expresan dos fases flagelares pero también se conocen variantes afásicas, monofásicas y trifásicas. La identificación de las serovariedades surge como consecuencia de la combinación antigénica de factores somáticos O y flagelares H, con el agregado del antigeno capsular Vi para unas pocas serovariedades y se presenta en el “Esquema de Kauffmann-White” (Popoff, M.Y., 8ª Ed, WHO Centre for Referente and Research on Salmonella, Instituto Pasteur, París, Francia, 2001). A) Antígenos somáticos (Ags O) Están compuestos por complejos de fosfolípidos y polisacáridos; su composición es aproximadamente: 60% polisacáridos, 20-30% lípidos y 3,5-4% hexosamina. Son cadenas laterales de polisacáridos del lipopolisacárido de envoltura (LPS) que se encuentra en todos los microorganismos gram-negativos. La cadena de polisacáridos del Ag O es un polímero de unidades repetidas de oligosacáridos (de 3 a 5 azúcares) lineales o ramificados. La naturaleza de los grupos terminales y el orden en que se encuentran las unidades repetidas de la cadena determina la especificidad antigénica somática de la bacteria. Como esta estructura difiere ampliamente entre las distintas serovariedades, hay diferencias en la especificidad antigénica O. Estos antígenos son termoestables y resistentes a ácidos diluidos y alcohol. La estructura somática se denomina con la letra O seguida de números arábigos separados por comas, por ej. S. Typhimurium O:1,4,5,12; S. Enteritidis O:1,9,12

43

Los Ags O se pueden clasificar de la siguiente manera: 1) Factores mayores, que identifican el grupo antigénico O; por ej., el factor O:4, el factor O:9 2) Factores menores, que pueden ser: a) Los que tienen poco o ningún valor discriminativo porque siempre están asociados a otro factor; por ej., O:12 que siempre está asociado con O:2, O:4 y O:9, como se presenta en S. Paratyphi A O: 1,2,12; S. Typhimurium O: 1,4,5,12 y S. Enteritidis O: 1,9,12 b) Los que surgen como consecuencia de una modificación química de los Ags mayores; por ej., O:5 resulta de la acetilación de la abecuosa presente en las unidades repetidas del polisacárido responsable de la especificidad O:4,12; O:1 resulta de la inserción de un residuo de glucosa en la galactosa de la cadena de polisacárido, como es el caso de la serovariedad S. Typhimurium O:1,4,5,12 B) Antígenos Flagelares (Ags H) El flagelo es una estructura compleja que consiste en un cuerpo basal, un segmento de unión (“hook”) y un filamento. El cuerpo basal ancla el flagelo a la envoltura de la célula y el “hook” une el cuerpo basal con el filamento. En la serotipificación flagelar de Salmonella se usa solamente la especificidad antigénica del filamento. El filamento esta constituido por flagelina, proteína de alto peso molecular. En Salmonella se han encontrado más de 60 especificidades antigénicas flagelares. Las diferencias antigénicas surgen debido a variaciones en la estructura primaria (contenido en aminoácidos y orden de ubicación) de las distintas moléculas de flagelina. Estos antígenos son sensibles al calor. Unas pocas serovariedades de Salmonella poseen una sola fase flagelar, esas cepas se llaman monofásicas, por ej. Salmonella Enteritidis (9,12:g,m:-), Salmonella Typhi (9,12 [VI]:d:-); pero la gran mayoría de las serovariedades tienen dos fases flagelares o sea son cepas difásicas; por ej., Salmonella

Typhimurium (1,4,5,12:i:1,2) y

Salmonella Hadar

(6,8:z10:e,n,x), que expresan la fase 1 (constituida en los ejemplos por los antígenos: i ó z10 ) y la fase 2 ( por los antigenos: 1,2 y e,n,x respectivamente).

44

C) Antígeno Capsular (Ag Vi) El antígeno capsular es un polisacárido, constituido por ácido N-acetilglucosaminourónico. Entre los antígenos capsulares de las Enterobacterias, el Vi es el más importante en el género Salmonella. Se encuentra en sólo tres serovariedades: S. Typhi, S. Paratyphi C y en algunas cepas de S. Dublin. Descripción del Esquema de Kauffmann - White Sobre la base de los componentes antigénicos somáticos O y flagelares H se ha establecido lo que se denomina el Esquema de Kauffmann-White, que agrupa a todas las serovariedades conocidas. El esquema está conformado por cuatro columnas: Primera columna: indica el nombre de la serovariedad, si la misma pertenece a S. enterica subesp. enterica (I) ó las siglas S. II, S. IIIa, S. IIIb, S. IV, S. V, S. VI; indicando que la serovariedad considerada pertenece a la subespecie II ó III a, etc. Segunda columna: Antígenos somáticos (O). Los números indican el ó los factores del antígeno O y se escriben, separados por una coma. Las serovariedades son agrupadas en grupos somáticos, cada uno de ellos caracterizado por un factor O mayor. Así se determinan los grupos A, B, C, etc. Por ej. el grupo O:2 (A) está integrado por S. Paratyphi A (1,2,12:a:-) entre otras, el grupo O:4 (B) por S. Typhimurium (1,4,5,12:i:1,2); S. Agona (1,4,12:f,g,s:- ); S. Saintpaul (1,4,5,12:e,h:1,2), entre otras, etc. El Esquema de Kauffmann-White presenta 67 grupos O, desde el grupo A hasta el Z y luego continúa con números, desde el O:51 hasta el O:67 Tercera y cuarta columna: Antígenos flagelares (H). Se indican los factores de las fases 1 y 2, del antígeno H, respectivamente. Para la fase 1 los factores se denominan con letras minúsculas, seguidas algunas veces por un número que figura como subíndice y para la fase 2 se emplean en general números arábigos, aunque también se utilizan letras minúsculas. Un signo "negativo" indica que la fase considerada está ausente y por lo tanto la serovariedad es monofásica.

45


Los símbolos para los factores somáticos determinados por conversión fágica están subrayados (por ej. 1,2,12)
[ ] = los factores O o H entre corchetes, no subrayados, pueden estar presentes o ausentes sin relación con la conversión fágica. Por ej. factor [5] del grupo O:4 (B). Cuando los factores H

están entre corchetes significa que ellos se encuentran

excepcionalmente en cepas salvajes. Ejemplos: Salmonella Enteritidis

1, 9,12:g,m:El Ag O es 1, 9,12; el Ag H (fase 1) es g,m; El Ag H (fase 2)es -; la fase 2 está ausente, por lo tanto la serovariedad es monofásica.

Salmonella Typhimurium

1, 4,5,12:i:1,2 El Ag O es 1,4,5,12 ; el Ag H (fase 1) es i ; el Ag H (fase 2) es 1,2; las dos fases flagelares están presentes, por lo tanto la serovariedad es difásica.

Salmonella Hadar

6,8:z10:e,n,x

Salmonella Typhi

1, 9,12[Vi]:d:-

46

ESQUEMA DE KAUFFMANN-WHITE (*)

47

Materiales y equipamiento •

Estufa de cultivo a 37ºC

•

Heladera a 4ºC

•

Baño de agua a 50ºC

•

Ansas

•

Tubos de ensayo

•

Tubos de 13x100 mm con tapa a rosca

•

Tubos de Craigie

•

Cajas de Petri

•

Láminas de vidrio de 20x20 cm

•

Pipetas de 5 ml

•

Gradillas

•

Mecheros

•

Lámparas para leer aglutinaciones

•

Palillos de madera

•

Estrías de agar tripticasa de soja (TSA)

•

Agar movilidad al 0,7% (para inversión de fase)

•

Agar movilidad al 0,5% (para Craigie)

•

Caldo flagelar

Medios

Reactivos y Soluciones •

Antisueros diagnósticos O y H

•

Solución salina al 2%

•

Solución fisiológica formolada al 1%

Cepas bacterianas Cepas de Salmonella spp. en agar TSA, cultivos de 18 horas a 37ºC Esquema de Kauffmann-White (Poppof, M.Y., 8ª Ed, WHO Centre for Referente and Research on Salmonella, Instituto Pasteur, París, Francia, 2001).

48

2.3.1- SEROTIPIFICACIÓN SOMÁTICA O Procedimiento

Comentario

Dia 1 Serotipificación somática O •La determinación del antígno O de

• La detección de los antígenos somáticos se

Salmonella spp. se hace en lámina a partir

realiza por aglutinación en lámina. Los

de un cultivo en agar TSA, incubado a 37ºC

anticuerpos en el suero específico aglutinan

por 18-24 horas

con

la

bacteria

correspondiente

cuando está

el

antígeno

presente.

Es

importante que el aislamiento esté en forma lisa.

• Verificar que el cultivo se encuentre en

• La aglutinación con solución salina al

forma lisa:

2% debe dar negativa

- Mezclar una ansada de cultivo puro se mezcla con una gota de solución salina al 2%, cuiadosammente con un palillo. Rotar suavemente la lámina, durante 2 minutos. Observar la presencia o ausencia de grumos: a) Si hay grumos la cepa está rugosa.

• Para revertir la rugosidad se deben realizar subcultivos de la cepa en agar sangre o en agar Mueller Hinton, de manera de recuperar la forma lisa y poder continuar con la serotipificación somática O. • Si no es posible la reversión de la forma rugosa a la lisa, se debe confirmar su identificación bioquímica y realizar la seropitificación flagelar H.

b) Si no presenta grumos se realiza la serotipificación somática O

49

• Enfrentar sobre una lámina de vidrio una

• Estos polivalentes comprenden el 98%

ansada del cultivo en agar TSA, con una

de las serovariedades aisladas del hombre y

gota de los antisueros polivantes OS-A y

de los animales. Estos antisueros cumplen

OS-B. Mezclar cuidadosamente con un

la función de una primera selección en

palillo.

lámina,

grandes grupos. Si la aglutinación no ocurre

durante 2 minutos, para favorecer la

con los polivalentes OS-A y OS-B puede

reacción antígeno-anticuerpo y

ser:

Mover

suavemente

la

observar

presencia o ausencia de aglutinación, con luz

a) Una serovariedad no comprendida

indirecta.

en dichos antisueros, en tal caso remitir la cepa al Laboratorio de Referencia b) Una serovariedad que presente antígeno de envoltura Vi (S. Typhi, S. Paratyphi C y algunas cepas de S. Dublin). En este caso se debe enfrentar el cultivo con el antisuero Vi

• Si hay aglutinación con alguno de los dos antisueros polivalentes, probar los antisueros de grupo O correspondientes. • Si hay aglutinación con un antisuero de grupo O, probar los antisueros de factores O

• Lectura e interpretación de resultados Registrar el grado de aglutinación de la siguiente manera: • 4+: 75 a 100% de microorganismos aglutinados • 3+:

75%

aproximadamente

de

50

microorganismos aglutinados • 2+:

50%

aproximadamente

de

microorganismos aglutinados • 1+: menos de 2% de microorganismos aglutinados • Negativo: ausencia de aglutinación. Se observa una suspensión homogénea. • Registrar los resultados tanto negativos como positivos para los antígenos O estudiados, en la Planilla 3 - Registro de Resultados: Serotipificación Somática de Cepas de Salmonella. 2.3.2- SEROTIPIFICACIÓN FLAGELAR H Procedimiento

Comentario

Día 1 Serotipificación flagelar H • Sembrar la cepa de Salmonella spp. en 5

• La detección de los antígenos flagelares

ml de caldo flagelar e incubar a 37ºC,

H se realiza por aglutinación en tubo o en

durante 18-24 horas.

placa dependiendo de las características de los antisueros. En este protocolo se describe la aglutinación en tubo, ya que los antisueros están preparados por el productor para realizar la aglutinación en tubo.

Día 2 • Separar del caldo flagelar una alícuota de 0.5 ml en un tubo estéril de 13x100 con tapa a rosca. • Agregar al caldo flagelar restante 5 ml de solución fisiológica formolada al 1% (caldo

51

formolado) y dejar reposar durante 1 hora a temperatura ambiente • Colocar en 4 tubos de ensayo una gota de cada uno de los antisueros flagelares polivalentes (HS-1, HS-A, HS-B y HS-C) y agregar a cada tubo 0.5 ml del caldo formolado. • Incubar 1 hora a 50ºC en baño de agua y

• La

aglutinación

flagelar

registrar la presencia o ausencia de flóculos

apariencia flocular, menos compacta que la

con luz indirecta.

aglutinación

somática.

Su

tiene

una

estructura

tridimensional no es estable, por lo tanto no se deben agitar los tubos luego de la incubación a fin de no disgregar los flóculos.

• Si hay aglutinación, con uno o dos de los

• Si la cepa de Salmonella spp., de la cual

antisueros flagelares polivalentes, enfrentar

se ha identificado el antígeno O, no

el caldo formolado, con los antisueros de

reacciona con ninguno de los antisueros

fase H correspondientes (una gota del

flagelares polivalentes, hay que tener en

antisuero más 0,5 ml del caldo formolado)

cuenta: a)

La cepa puede presentar un

• Si el antisuero de fase flagelar está

antígeno

compuesto por más de un factor (por ej. 1,2),

antisueros polivalentes, en este caso

determinar los factores H correspondientes,

debe ser remitida al Laboratorio de

utilizando

Referencia,

los

antisueros

de

factores

no

incluido

para

en

completar

los

su

serotipificación

específicos

b) Se puede tratar de una cepa inmóvil, por la ausencia de flagelos c) Se puede tratar de una cepa con movilidad reducida. En este caso se debe

52

exaltar

la

movilidad

por

pasajes sucesivos en tubos Craigie o en tubo en U con agar movilidad al 0.5% • Si el cultivo aglutina con un solo antisuero polivalente flagelar, puede ser: a)

Que

se

trate

de

una

serovariedad monofásica b)

Que sea una serovariedad

difásica, de acuerdo al Esquema de Kauffmann-White,

por

los

resultados de la aglutinación O y únicamente se expresa una sola fase H, por lo tanto hay que poner en evidencia la fase no detectada, usando el “Método de inversión de fase”.

Método de Inversión de Fase • Fundir 10 ml de agar movilidad al 0.7%,

• Es un método que permite poner en

dejar enfriar a 50ºC.

evidencia,

en

caso

de

serovariedades

difásicas, la fase que no se expresó. Para • Mezclar en una caja de Petri dos gotas

ello

del

flagelar

establecida previamente con el antisuero

predeterminada con el agar movilidad al

correspondiente a esa fase flagelar. Se trata

0.7%, homogenizar con movimientos de

de

rotación y dejar solidificar.

microorganismos que presentan la fase

antisuero

de

la

fase

se

un

inmoviliza

método

de

la

fase

selección

flagelar

de

flagelar no expresada hasta ese momento.

53

los

• Sembrar una ansada del cultivo sin formolar en el centro de la superficie del agar • Incubar a 37ºC, durante 18-24 horas. Día 3 • Tomar el desarrollo bacteriano de la periferia de la placa y enfrentar con el antisuero de la fase sospechada. • Lectura e interpretación de resultados Registrar el grado de aglutinación de la siguiente manera: • 4+: 75 a 100% de microorganismos aglutinados y el sobrenadante es un líquido claro • 3+:

75%

aproximadamente

microorganismos

aglutinados

y

de el

sobrenadante es un líquido ligeramente turbio • 2+:

50%

aproximadamente

microorganismos

aglutinados

y

de el

sobrenadante es un líquido moderamente turbio • 1+: menos de 2% de microorganismos aglutinados y el sobrenadante es turbio • Negativo:

ausencia

de

aglutinación,

caracterizada

por

una

suspensión

homogénea.

54

• Registrar los resultados tanto negativos como positivos para los antígenos H estudiados, en la Planilla 4 - Registro de Resultados: Serotipificación Flagelar de Cepas de Salmonella spp. • Identificación de la serovariedad Combinando

los

antígenos

O

y

H

identificados se determina la serovaridad de acuerdo con el Esquema de KauffmannWhite.

Ver Tubos de Craigie y en U (Figura 2) Ver Flujograma de Serotipificación (Figura 3) FIGURA 2.- TUBOS DE CRAIGIE Y EN U

Tubo de Craigie

Siembra del inóculo Recolección del desarrollo

Recolección del desarrollo

Siembra del Inóculo

Tubo en U

55

FIGURA 3.- FLUJOGRAMA DE SETROTIPIFICACIÓN DE SALMONELLA

Cepa con características bioquímicas de Salmonella

Serotipificación somática (aglutinación en lámina)

Estría en TSA

Serotipificación flagelar (aglutinación en tubo)

Aglutinación con solución salina al 2%

Negativa

Positiva

Aglutinación c/ antisueros poliv. somáticos (1) Negativa (3)

Caldo flagelar

Aglutinación c/ antisueros poliv. flagelares H (4)

Cepa Rugosa (2) Negativa (5)

Positiva

Aglutinación c/ antisueros de fases H / factores H (6)

Positiva

Aglutinación c/ antisueros de grupo O

Positiva

Positiva Aglutinación c/ antisueros de factores O RESULTADO FINAL

Positiva

(1) Antisueros polivalentes somáticos: OS-A y OS-B (2) Para revertir una cepa de la forma rugosa a lisa, se realizan subcultivos en agar sangre o Mueller Hinton. Si no es posible revertir la rugosidad, se debe confirmar la identificación por pruebas bioquímicas y realizar la serotipificación flagelar H. (3) Ver Consideraciones a tener en cuenta en "Serotipificación somática" (4) Antisueros polivalentes flagelares: HS-1; HS-A; HS-B; HS-C (5) Ver Consideraciones a tener en cuenta en "Serotipificación flagelar”. (6) Si la serovariedad de Salmonella es difásica y sólo expresa una fase, realizar "Método de inversión de fases"

56

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58

CAPÍTULO III – PRECAUCIONES DE BIOSEGURIDAD Los laboratorios de microbiología son ambientes de trabajo que pueden presentar riesgos de adquirir enfermedades infecciosas para las personas que trabajan en ellos. Los accidentes en el laboratorio ocurren por ausencia de entrenamiento, desconocimiento, experiencia escasa, cansancio, trabajar muy rápido, no seguir prácticas seguras y subestimar la peligrosidad del trabajo. Frente a estas situaciones se introdujo el concepto de bioseguridad que es el “conjunto de métodos tendientes a minimizar el riesgo asociado al manejo de microorganismos, mediante la protección de los operadores, personas del entorno, productos y medio ambiente”. Define las condiciones de contención provistas por el uso de equipos de seguridad. Los microorganismos se han clasificado en grupos de riesgo en función de su patogenicidad, forma y facilidad de transmisión, la dosis infecciosa, y la existencia de tratamiento. Los microorganismos con los cuales se trabajará Salmonella, Shigella y otros miembros de la Familia Enterobacteriaceae, pertenecen al Grupo de Riesgo II, donde el riesgo individual es moderado y el riesgo comunitario limitado. Estos microorganismos pueden provocar enfermedades en humanos y animales, pero con pocas probabilidades de riesgo grave para el personal de laboratorio, animales o medio ambiente. La exposición en el laboratorio puede provocar una infección pero se dispone de medidas de tratamiento y de prevención y el riesgo de propagación es limitado. 1.- NIVEL DE LABORATORIO El laboratorio donde se trabaja con estos microorganismos es de Nivel de Bioseguridad 2. En este nivel el personal debe contar con una capacitación específica para el manejo de los agentes patógenos y el director es un profesional competente. El acceso al laboratorio está restringido cuando se están desarrollando actividades y la puerta de entrada debe tener el símbolo indicador. Se toman precauciones especiales cuando se manejan elementos cortopunzantes y se utilizan elementos de protección (ambos, delantales, guantes, máscaras faciales) con los procedimientos que pueden representar un riesgo para el operador. Las mesadas de trabajo tienen que ser impermeables al agua, resistentes al calor moderado y a los productos químicos empleados en la desinfección.

59

El laboratorio debe disponer de un lavatorio para el lavado de manos y de adecuados sistemas de decontaminación del material. En los laboratorios está prohibido comer, beber, fumar, manipular lentes de contacto, maquillarse. 2.- ELEMENTOS DE PROTECCION a) Ambos, delantales o uniformes de laboratorio durante la permanencia en el mismo; esta vestimenta no debe salir del laboratorio y el personal no puede llevarla a su casa para el lavado. b) Guantes cuando es posible que las manos entren en contacto con materiales infecciosos o superficies contaminadas. Los guantes se descartan luego de su uso, no se lavan ni se reusan y no se deben usar fuera del laboratorio. c) Protección facial se requiere su uso cuando existe la posibilidad que algún procedimiento genere gotas o aerosoles La protección facial esta dada por anteojos, máscaras faciales, barbijos. d) Gabinete de seguridad biológica, cuando existe la posibilidad de generación de gotas o aerosoles. El gabinete que se utiliza es Clase II que protege al operador, los productos y el medio ambiente.

El aire externo no entra directamente a la mesa de trabajo sino que

previamente pasa por un filtro HEPA para luego ingresar al área de trabajo, y también sale al ambiente a través de otro filtro, (Fig. 1). Es obligatorio que los gabinetes se evalúen y certifiquen en el momento de la instalación en el laboratorio, cuando se trasladan y por lo menos una vez por año a partir de ese momento.

FIGURA 1

60

Dentro del gabinete debe ingresar solamente el material indispensable para trabajar para perturbar lo menos posible la circulación del aire dentro del gabinete. 3.- INSTRUCCIONES PARA EL TRABAJO 1. Leer cuidadosamente todas las instrucciones antes de comenzar con los protocolos de trabajo. 2. Considerar POTENCIALMENTE CONTAMINADO a todo material de vidrio, plástico, pipetas, espátulas, que esté en contacto con las suspensiones bacterianas. 3. Todo material contaminado potencialmente infeccioso se tratará en autoclave. No efectuar ninguna limpieza del mismo en el laboratorio. 4. Descartar los residuos plásticos potencialmente infecciosos en recipientes resistentes a la perforación, que contienen hipoclorito de sodio al 1%. Estos NO SE DEBEN LLENAR COMPLETAMENTE. 5. Descartar los materiales con cultivos microbianos en recipientes con bolsas plásticas de color rojo, para su posterior eliminación. 6. Descartar material de vidrio en recipientes de acero inoxidable con tapa de seguridad para su posterior descontaminación en autoclave. 7. Cada mesada debe tener propipetas, guantes, alcohol 70% y una solución de hipoclorito de sodio al 10%. 8. Notificar a las personas responsables del área o instructores de trabajos prácticos cuando se produzcan derrames, quienes tomarán las medidas adecuadas según el caso. 9. Descartar el material de vidrio roto envolviendo los trozos en papel, colocarlo en bolsa plástica y finalmente en un recipiente resistente y rotulado con claridad “vidrios rotos”. 4.- ACCIONES A REALIZAR EN CASO DE INCENDIO 1. Mantener la calma y avisar al resto de las personas. 2. Dar aviso al Departamento de Seguridad e Higiene. 3. Si el fuego es pequeño y sabe utilizar un extintor, úselo. Si el fuego es de consideración no se arriesgue y evacue el laboratorio. 4. No corra, camine rápido, cerrando a su paso la mayor cantidad de puertas. 5. No lleve objetos ya que pueden entorpecer su salida.

61

6. Si pudo salir del laboratorio, por ninguna causa vuelva a entrar. Deje que los equipos especializados se encarguen. 5.- CENTROS PARA REQUERIR AYUDA Se deben tener disponibles los números telefónicos correspondientes. 6.- TRANSPORTE DE MUESTRAS El acondicionamiento seguro de muestras para diagnóstico bacteriológico es responsabilidad de todos los involucrados en el proceso: el profesional, el responsable del laboratorio y el personal de la empresa de transporte. El embalaje de los materiales infecciosos debe evitar la fuga de los mismos por rotura o mal empaque del envío. Los materiales para diagnóstico se deben enviar en el “sistema de triple envase” de acuerdo a las recomendaciones de la Organización Mundial de la Salud WHO/EMC/97.3. (Fig. 2) El sistema consiste de: a) Recipiente primario, a prueba de pérdidas, con cierre hermético (tubo pequeño o vial), en el cual se coloca la muestra. b) Recipiente secundario, resistente, a prueba de fugas, impermeable, donde se incluye el recipiente primario. c) Envoltorio externo, para proteger el envase secundario de influencias externas, como daño físico o agua. El espacio entre los recipientes primario y secundario se debe llenar con material absorbente, para retener el contenido del recipiente primario en caso que ocurra una pérdida durante el transporte. Los formularios con datos de la muestra, notas y todo otro tipo de información que identifiquen o describan a la muestra, al remitente y al destinatario, se deben colocar alrededor del recipiente secundario.

62

FIGURA 2 REFERENCIAS Laboratory Biosafety Manual, 3rd ed., World Health Organization Geneva, 2004 www.who.int

Biological Safety. Principles and Practices, 3rd ed. Fleming, D.O., Hunt, D.L. Ed. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, 4th ed., Richmond J., McKinney Ed. CDC/NIH, 2001. www.cdc.gov. Safety in Health-Care Laboratories. World Health Organization Geneva, 1997. www.who.int/.

63

CAPÍTULO IV - MEDIOS DE CULTIVOY SOLUCIONES Descripción y Preparación La mayoría de los medios de cultivo se encuentran disponibles comercialmente Caldo Selenito Para el enriquecimiento selectivo de Salmonella en materia fecal, orina y tejidos infectados, incluída Salmonella Typhi, pero no sirve para Shigella. El selenito inhibe el crecimiento de coliformes intestinales y enterococos, principalmente en las primeras 6 a 12 horas de incubación. No son inhibidos Salmonella, Proteus, Pseudomonas. Los componentes del medio son: peptona o triptona 5.0 g, lactosa 4.0 g, selenito de sodio 4.0 g, fosfato dipotásico (K2HPO4) 3.5 g, fosfato monopotásico (KH2PO4) 6.5 g. Disolver los componentes en 1000 ml de agua destilada calentando hasta 60ºC si es necesario y esterilizar por filtración. NO AUTOCLAVAR Si se observa un color rojo ladrillo de selenito precipitado, el medio no se debe utilizar. El material sólido se inocula directamente en el caldo, el material líquido se debe mezclar en una relación 1:1 con caldo a doble concentración. Se incuba 24 horas a 37ºC. El pasaje a medios selectivos se puede hacer al cabo de 6 a 12 horas. Caldo Tetrationato Es un caldo que se usa para el enriquecimiento selectivo de Salmonella, excepto para S. Typhi, S. Pullorum y S. Gallinarum. El tetrationato junto con el tiosulfato inhibe los coliformes, mientras que las bacterias reductoras de tetrationato como Salmonella y Proteus pueden crecer sin dificultad. Las sales biliares inhiben a todos los micoorganismos intestinales acompañantes y el verde brillante inhibe la flora gram positiva. Solución de verde brillante: se disuelve 0.1 g del colorante en 100 ml de agua destilada estéril. Solución de iodo-ioduro de potasio: se disuelven en 16 g de yodo y 20 g de yoduro de potasio en 80 ml de agua destilada estéril.

64

Los componentes del medio son: extracto de carne 0.9g, peptona 4.5 g, extracto de levadura 1.8 g, cloruro de sodio 4.5 g, carbonato de calcio 25.0 g, tiosulfato de sodio 40.7 g, sales biliares 4.75 g, solución de verde brillante 1:1000 10 ml, solución de iodo-ioduro de potasio 20 ml. Se disuelven los componentes 1000 ml de agua destilada estéril con agitación. Se agrega en forma aséptica la solución de verde brillante y luego la solución de iodo-ioduro de potasio. Se ajusta el pH a 7.4-7.8 a 25ºC. El caldo se guarda en heladera. NO AUTOCLAVAR. El caldo preparado y listo para usar debe ser utilizado el mismo día de su preparación. Caldo Flagelar Es un caldo que se usa para la determinación de antígenos flagelares. Los componentes del medio son: caldo tripticasa de soja 15.0 g, caldo triptosa 13.0 g. Disolver los componentes en 1000 ml de agua destilada con ebullición hasta disolución completa. Se fracciona en volúmenes de 5 ml en tubos de 16x150 con tapa a rosca y se autoclava a 121ºC por 15 minutos. Solución Salina Se disuelve 8.5 g de cloruro de sodio en 1000 ml de agua destilada, ajustar a pH 7.0 y autoclavar a 121ºC por 20 minutos. Agar Movilidad (Swarm Agar) Los componentes del medio son: extracto de levadura 1,0g, extracto de carne 5,0g, caldo tripticasa de soja 30g, agar-agar de 5 a 10g dependiendo de la dureza deseada. Los componentes se disuelven en 1000 ml de agua destilada calentando si es necesario. Se ajusta el pH a 7.4 y se autoclava a 121ºC por 15 minutos. Agar Nutritivo Los componentes del medio son: extracto de carne 3.0 g, peptona 5.0 g, agar 12.0 a 18.0 g. Disolver los componentes en 1000 ml de agua destilada con ebullición si es necesario, autoclavar a 121ºC por 20 minutos, ajustar el pH a 7.0 luego de esterilizar.

65

Agar Mueller-Hinton El medio contiene: extracto de carne 2.0 g, hidrolizado ácido de caseína 17.5 g, almidón 1.5 g, agar 17.0. Disolver los componentes en 1000 ml de agua destilada calentando si fuera necesario, ajustar el pH a 7.2-7.4 y autoclavar a 110ºC por 20 minutos. Agar EMB Es un medio selectivo y diferencial para el aislamiento de bacterias patógenas intestinales Gram (-). El contenido de lactosa y sacarosa hace posible la diferenciación de Salmonella y Shigella lac/sac (-), de la flora acompañante lac (-)/lac (+) (Proteus vulgaris, Citrobacter, Aeromonas hydrophila). La combinación de colorantes es la que permite diferenciar entre los fermentadores y no fermentadores de lactosa. La sacarosa se incluye porque algunos coliformes la fermentan más rápido que a la lactosa. El desarrollo de las bacterias Gram (+) está inhibido por los colorantes del medio (eosina amarilla y azul de metileno). Agar EMB Levine contiene solamente lactosa. Los componentes del medio son: peptona 10.0 g, fosfato dipotásico (K2HPO4) 2.0 g, lactosa 5.0 g, sacarosa 5.0 g, eosina amarilla 0.4 g, azul de metileno 0.07 g. Disolver los componentes en 1000 ml de agua destilada y autoclavar a 121ºC por 15 minutos. Aspecto de las colonias Salmonella, Shigella

transparentes, ámbar rosado

Escherichia

violáceas con brillo metálico y centro negro azulado

Enterobacter, Klebsiella

más grandes que las anteriores, mucosas sin brillo metálico y centro oscuro.

Bacterias lac (+)

negras o centro oscuro, halo transparente

Bacterias lac (+) o sac (-)

incoloras

Agar MacConkey Es un medio selectivo y diferencial para aislar microorganismos fermentadores y no fermentadores de lactosa.

66

Sirve para aislar Salmonella, Shigella, y coliformes de materia fecal, orina, alimentos y aguas residuales. Es un medio de baja selectividad para usar con inóculos pequeños. Las sales biliares y el cristal violeta inhiben microorganismos Gram (+). La presencia de lactosa permite el desarrollo de las cepas lac (+) que se manifiesta por el viraje del indicador debido a la producción de ácido; luego se absorbe el rojo neutro dando color rojo a la colonia y un halo turbio por la precipitación de las sales biliares por la acidez del medio. Las bacterias no fermentadoras de lactosa (S. Typhi, S. Paratyphi, Shigella dysentariae) no alteran el medio, dando colonias incoloras y transparentes. Para detectar S. Typhi hay que usar medio MacConkey con agar SS y agar bismuto sulfito. Los componentes del medio son: peptona 1.7 g, proteosa-peptona 3.0 g, lactosa 10.0 g sales biliares 1.5 g, rojo neutro 0.03 g, cristal violeta 0.001g, cloruro de sodio 5.0 g. Disolver los componentes en 1000 ml de agua destilada, calentando si es necesario, ajustar a pH 7.1 y esterilizar a 121ºC, durante 15 minutos. Aspecto de las colonias Salmonella, Shigella

incoloras, medio amarillo

Escherichia

rojas, halo turbio

Enterobacter, Klebsiella

grandes, rosadas a rojo, mucosas

Proteus

Incoloras

Agar SS Es un medio selectivo para Salmonella y Shigella a partir de materia fecal, alimentos y animales; pero no es el ideal para Sh. dysenteriae y Sh. boydii. Sirve también para Y. enterocolitica y para diferenciar fermentadores de lactosa de los no fermentadores. La presencia de verde brillante, bilis de buey, alta concentración de tiosulfato y el citrato inhiben la flora acompañante. El tiosulfato y la sal de hierro ponen en evidencia la formación de sulfuro de hierro. La degradación de la lactosa a ácido provoca el viraje del indicador rojo neutro a rojo.

67

Los componentes del medio son: extracto de carne 5.0 g, proteosa-peptona 5.0 g, lactosa 10.0 g, citrato de hierro amoniacal 1.0 g, tiosulfato de sodio 8.5 g, sales biliares 8.5 g, verde brillante 0.003 g, rojo neutro 0.025 g, agar 13.5 g. Disolver los componentes en 1000 ml de agua destilada calentando hasta disolución de los mismos. NO AUTOCLAVAR Aspecto de las colonias Salmonella

incoloras, transparentes, centro negro

Shigella

incoloras, transparentes, medio amarillo

Proteus

transparentes, centro rojo, medio amarillo

Escherichia coli

rosadas a rojo, medio rojo

Enterobacter aerogenes

rosadas a crema, opacas, mucosas

Bacterias lactosa+

rojizas, mucoides, centro negro

Agar Hektoen Es un medio selectivo para bacterias intestinales, incluídas algunas shigellas. No tiene efecto inhibidor sobre Salmonella y Shigella pero si sobre flora acompañante. Debido a los dos indicadores (azul de bromotimol y fucsina), las colonias lac+ tienen una diferencia cromática con las colonias lac-; lo mismo ocurre con bacterias fermentadoras de sacarosa y salicina. El tiosulfato con el hierro dan coloración negra a las colonias sulfídrico+. Las sales biliares inhiben a la flora acompañante. Puede agregarse novobiocina para inhibir Citrobacter y Proteus. Los componentes del medio son: peptona 15.0 g, extracto de levadura 3.0 g, sacarosa 14.0 g, lactosa 14.0 g, salicina 2.0 g, tiosulfato de sodio 5.0 g, citrato de hierro amoniacal 1.5 g, sales biliares 2.0 g, azul de bromotimol 0.05 g, fucsina ácida 0.08 g, agar 13.5 g. Disolver los componentes en 1000 ml de agua destilada estéril. NO AUTOCLAVAR. Aspecto de las colonias Shigella, Providencia verdes, planas, transparentes Salmonella, Proteus

verde-azuladas, c/s centro negro

Pseudomonas

verde-azuladas, planas, borde irregular

Coliformes

salmón, halo de precipitación

68

Agar Verde Brillante Excelente medio de gran selectividad para el aislamiento de Salmonella a partir de materia fecal; pero no puede usarse para aislar S. Typhi. Los fermentadores de lactosa o sacarosa que pueden crecer en este medio se diferencian rápidamente debido a la formación de colonias verde-amarillentas, rodeadas de una zona de igual color. Esto se debe a la fermentación de los azúcares que produce acidez, haciendo virar el indicador (rojo fenol) a amarillo. En medio alcalino se observa un color rojo intenso. El verde brillante inhibe microorganismos Gram (+), S. Typhi y Shigella. Para inhibir Proteus se recomienda agregar 0,2% de desoxicolato de sodio. La selectividad del medio permite usar inóculos densos. Si se exceden los 15 minutos de esterilización a 121ºC, disminuye la selectividad del medio. Los componentes del medio son: proteosa-peptona 10.0 g, lactosa 10.0 g, sacarosa 10.0 g extracto de levadura 3.0 g, rojo fenol 0.09 g, verde brillante 0.0047 g, agar 12.0 g. Disolver los componentes en 1000 ml de agua destilada hasta ebullición y mantener por 1 minuto; ajustar a pH 6.7-7.1. NO AUTOCLAVAR Aspecto de las colonias Salmonella a veces Proteus y Citrobacer rosa pálido, transparentes E. coli, Enterobacter

verde-amarillo

Klebsiella, Bacterias lactosa +

opacas, halo verde-amarillo

Agar XLD Es un medio de selectividad moderada a alta que permite ser usado con Salmonella y Shigella. La degradación de xilosa, lactosa y sacarosa produce acidez que hace virar el indicador al amarillo. El tiosulfato y la sal de hierro ponen en evidencia la producción de sulfídrico. La decarboxilación de la lisina a cadaverina se visualiza por la presencia de un color rojo púrpura por aumento del pH. El desoxicolato inhibe Gram (+). La diferenciación de Salmonella/Shigella de otras enterobacterias se basa en tres reacciones: fermentación de xilosa, decarboxilación de lisina y producción de sulfídrico. La xilosa diferencia Shigella de Providencia que no fermenta xilosa o lo hace muy lentamente; la lisina diferencia Salmonella

69

de los fermentadores de xilosa no patógenos. La lactosa y la sacarosa en exceso evitan que los coliformes lis+ reviertan la condición alcalina de los microorganismos consumidores rápidos de xilosa/lisina. La producción de sulfídrico ocurre en condiciones alcalinas dando colonias con centro negro; en condiciones ácidas la precipitación negra se inhibe. Los componentes del medio son: extracto de levadura 3.0 g, xilosa 3.75 g, lactosa 7.5 g, sacarosa 7.5 g, l-lisina hidrocloruro 5.0 g, desoxicolato de sodio 1.0 g, tiosulfato de sodio 6.8 g, citrato de hierro amoniacal 0.8 g, rojo fenol 0.08 g,cloruro de sodio 5.0 g, agar 15.0 g. Disolver los componentes en 1000 ml de agua destilada. Calentar hasta que comience a hervir (no sobrecalentar); llevar a un baño de 50ºC siempre con agitación. Ajustar el pH a 7.4±0.2 a 25ºC. Guardar a 4ºC por 14 días, en la oscuridad. El precipitado que ocasionalmente presenta el medio no perjudica su rendimiento, puede eliminarse por filtración. Aspecto de las colonias E. coli, Enterobacter

amarilla, opacas, con precipitado

Aeromonas

amarilla, opacas, con precipitado

Klebsiella

amarilla, opacas, mucosas, c/precipitado

Citrobacter

amarilla, opacas, centro negro

Serrati, Hafnia

amarilla, opacas

P. vulgaris, P. mirabilis

amarilla, translúcidas, centro negro

Salmonella

igual color del medio, centro negro

Shigella, Providencia

igual color del medio, translúcidas

S. Typhi

amarilla, ligeramente opacas

70

CAPITULO V - PLANILLA DE RESULTADOS

PLANILLA 1 – REGISTRO DE RESULTADOS: AISLAMIENTO DE SALMONELLA spp. MORFOLOGIA EN PLACAS DE AGAR SELECTIVO

Fecha: Nombre: Muestra: ____________ Color

Resultados

Morfología en MC Morfología en SS Morfología en XLD De Selenito: Morfología en MC Morfología en SS

71

Comentarios

PLANILLA 2 – REGISTRO DE REDULTADOS: AISLAMIENTO DE SALMONELLA spp. PRUEBAS BIOQUIMICAS Fecha: Nombre: Muestra: Color

Resultados

TSI Botón TSI Estría TSI Gas TSI H2S LIA Botón LIA Estría LIA H2S Hidrólisis de urea Lisina decarboxilasa Ornitina decarboxilasa Arnina dehidrolasa Reacción deβ-galactosidasa Reacción de Voges-Proskauer Reacción de indol Agar SIM (H2S) Agar SIM (Indol) Agar SIM (Movilidad) Fermentación de Dulcita Utilización del Molonato Resultado general: _______________________________________

72

Comentarios

PLANILLA 3 – REGISTRO DE RESULTADOS: SEROTIPIFICACION SOMATICA DE CEPAS DE SALMONELLA spp.

Fecha: Nombre: Muestra: ________________

OSA

OMB

OMC

OMD

OME

OMF

OSA

1,2,12

4,5,12

9,12

9,46

3,10

3,15

1,3,19

21

OSB

6,7,8

6,7

6,8

13,22

13,23

6,14,24

6,14

8,20

11

OSC

16

17

18

28

30

OSD

35

38

39

40

41

43

44

45

OSE

47

48

50

51

52

OSF

73

Control

42

PLANILLA 4 – REGISTRO DE RESULTADOS: SEROTIPIFICACION FLAGELAR DE CEPAS DE SALMONELLA spp.

Fecha: Nombre: Muestra: ______________ HSA

HSB

HSC

HS1

Control

HSA

a

B

c

d

i

z10

Z29

HSB

e,h

e,n,x

e,n,z15

f.g

g,m

g,p

m,t

HSC

k

l,v

l,w

r

y

Z

z4,z23

HS1

1,2

1,5

1,6

1,7

z6

HSA

HSB

HSC

HSD

HS1

HSA

a

b

c

d

i

z10

z29

HSB

e,h

E,n,x

e,n,z15

f.g

g,m

g,p

m,t

HSC

k

l,v

l,w

r

y

Z

z4,z23

HS1

1,2

1,5

1,6

1,7

z6

Control

74

PLANILLA 5 – REGISTRO DE RESULTADOS: SEROTIPIFICACION DE CEPAS DE SALMONELLA spp. Fecha: Nombre: Muestra: ________________ Antígeno O

Antígeno H

A-67

A-I

Gr. A

Gr. B

Gr. C

Gr. D

Gr. A

O:1

O:2

O:12

Gr. B

O:1

O:4

Gr. C

O:6

Gr. D

Gr. E

O:5

O:12

O:27

O:7

O:8

O:14

O:20

O:1

O:9

O:12

O:46

Gr. E

O:1

O:10

O:15

O:19

H:H(a-z)

H:L

H:G

H: no específico

H:L

H:lv

H:v

H:w

H:z13

H:z28

H:G

H:f

H:g

H:s

H:t

H:m

H:p

H: no específico

H:2

H:5

H:6

H:7

H:z6

Gr. B

H:a

H:b

H:c

H:d

H:eh

H:i

Gr. C

H:a

H:b

H:c

H:eh

H:r

H:h

H:x

H:z15

H:z23

H:z24

H:z32

O:34

Fórmula Antigéncia: ___________________________ Serovariedad: _____________________

75

H:q

PLANILLA 6 – REGISTRO DE RESULTADOS: SEROTIPIFICACION DE CEPAS DE SALMONELLA spp.

Fecha: Nombre:

Muestra: ________________

O:5

O:9

O:10

O:15

O:19

O:27

O:34

O:46

O:7

O:8

O:20

O:22

O:23

H:h

H:x

H:z15

H:m

H:p

H:s

H:t

H:f

H:v

H:w

H:z23

H:z24

H:z32

H:z13

H:z28

H:2

H:5

H:6

H:7

H:q

Fórmula Antigéncia: ___________________________ Serovariedad: _____________________

76

H:u