INTRODUCCION A LOS METODOS CROMATOGRAFICOS

Introducción a los Métodos Cromatográficos

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Tema 10

INTRODUCCION A LOS METODOS CROMATOGRAFICOS Los métodos que se utilizan en análisis químico presentan una selectividad más o menos alta, si bien, existen muy pocos que sean verdaderamente específicos. Por ello, en muchas ocasiones, la separación del analito de las posibles sustancias interferentes suele ser una etapa fundamental en los procedimientos analíticos. Sin duda, la Cromatografía es uno de los métodos de separación más poderosos que se hayan descubierto. Fue desarrollada originalmente por el botánico ruso M. S. Tswett como técnica para la separación de pigmentos vegetales coloreados, y la I.U.P.A.C.* la define como: "Un método utilizado inicialmente para la separación de los componentes de una muestra en la cual los componentes se distribuyen en dos fases, una de las cuales es estacionaria, mientras que la otra se mueve. La fase estacionaria puede ser un sólido, un líquido sobre un soporte sólido, o un gel. La fase estacionaria puede estar contenida en una columna, extendida en forma de capa o dispuesta en forma de película …. La fase móvil puede ser gaseosa o líquida".

El término "cromatografía" posiblemente derive de las palabras griegas "chroma" (color) y "graphein" (escribir), aludiendo a que los pigmentos vegetales separados se ponen claramente de manifiesto como bandas coloreadas. Sin embargo, el mismo Tswett indica que también pueden separarse sustancias incoloras por el mismo procedimiento. Cuando se utiliza una columna rellena de CaCO3 (figura 10.1.a.), en la que se introduce un extracto de hojas verdes en éter de petróleo, y seguidamente se añade disolvente puro (eluyente) es posible la separación de clorofila, carotenos y xantofilas. En estas separaciones, la fase estacionaria es el relleno (CaCO3), la fase móvil es el éter de petróleo y los componentes a separar, los distintos pigmentos vegetales, los cuales se encuentran sometidos a dos fuerzas contrarias: el disolvente tiende a arrastrarlos hacia la salida y el CaCO3 a retenerlos. Como este último efecto es

* I.U.P.A.C. "Compendium of Analytical Nomenclature". Pergamon Press. Oxford (1977).

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Claudio González Pérez

diferente para los distintos pigmentos, éstos se mueven a diferente velocidad y emergen de la columna a distintos tiempos (figura 10.1.b.c.d.) disolvente puro (eluyente) extracto de hojas verdes en éter de petróleo

CaCO 3

.

eluato

a

b

c

d

Figura 10.1. Separación hipotética de tres componentes de una mezcla por cromatografía en columna.

Cuando se mide la concentración de cada componente a la salida de la columna y se representa en función del volumen de fase móvil, o del tiempo transcurrido desde la introducción de la muestra, se obtiene una gráfica como la representada en la figura 10.2., denominada "cromatograma"*.

R

volumen o tiempo

Figura 10.2. Cromatograma de la mezcla de tres componentes de la figura 10.1. * Aunque es posible recoger distintas fracciones de fase móvil que sale de la columna y determinar en cada

una de ellas la concentración de soluto, normalmente el efluente se monitoriza continuamente con un detector que mide alguna propiedad física o química del soluto o de la fase móvil.


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La cromatografía es una técnica cuyo campo de aplicación se extiende a todas las áreas de la Química y de la Bioquímica. Asimismo, es importante en Biología, Control de Calidad, Investigación, Análisis, separaciones a escala preparativa y medidas fisicoquímicas. Asimismo, puede aplicarse con el mismo éxito tanto a escala micro como macro, siendo posible su utilización industrial para la separación de los componentes en los más diversos materiales: azúcares, tierras raras, productos farmacéuticos, etc.

CLASIFICACION DE LOS METODOS CROMATOGRAFICOS Los métodos cromatográficos pueden clasificarse atendiendo a distintos factores: estado físico de las fases móvil y estacionaria (gas-líquido, líquido-líquido, etc), soporte utilizado (columna, papel, etc), mecanismo de la separación (adsorción, reparto), e incluso el tipo de soluto (cromatografía iónica, cromatografía de proteínas, etc). En el cuadro de la figura 10.3. se muestra una clasificación en función de algunos parámetros mencionados anteriormente.

1. 2. 3. 4.

Cuando se utiliza como fase móvil un fluido a presión y temperatura superiores a la crítica se tiene un tipo de cromatografía denominada de fluido supercrítico. Además de los mecanismos mencionados existen otros tales como: fase enlazada, interacción iónica, afinidad, quelación. El mecanismo es de adsorción cuando la fase móvil en un líquido polar. El mecanismo puede ser de reparto cuando la fase móvil es un líquido no polar

Figura 10.3. Clasificación de los métodos cromatográficos


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Según la naturaleza de la fase móvil, los métodos cromatográficos se clasifican en dos grupos: cromatografía líquida y cromatografía de gases (además de la mencionada en el pie de la figura 10.3. de fluidos supercríticos), según que la fase móvil sea un líquido o un gas respectivamente. En cromatografía líquida, cuando la fase estacionaria es polar y la fase móvil nopolar, se denominan sistemas normales, o de fase normal. En estos sistemas, la retención del soluto se incrementa generalmente con su polaridad. Por otra parte, si la fase estacionaria es menos polar que la fase móvil, el sistema se designa como de fase inversa, y en éstos, las especies polares tienen poca afinidad por la fase estacionaria, siendo eluidos más fácilmente. En cuanto al soporte, o la técnica utilizada para desarrollar el cromatograma, pueden distinguirse dos categorías: plana y en columna. En cromatografía plana, la fase estacionaria puede estar constituida por una hoja de papel (cromatografía en papel) o por una capa de un sólido distribuido uniformemente sobre una lámina de vidrio, plástico o aluminio (cromatografía de capa fina). Por otra parte, la fase estacionaria puede estar contenida en una columna, en cuyo caso la técnica se denomina cromatografía en columna. Cuando la fase estacionaria es un líquido, éste debe inmovilizarse sobre un soporte sólido inerte, o sobre la propia columna. Evidentemente, la cromatografía plana está limitada al uso de fase móvil líquida, debido a las dificultades inherentes para confinar un gas o un fluido supercrítico en una superficie plana. Sin embargo, la cromatografía en columna puede utilizarse en las modalidades de líquidos, gases y fluidos supercríticos. En el caso de la cromatografía líquida en columna existen dos modalidades, que pueden denominarse en función de su desarrollo cronológico como cromatografía clásica en columna y cromatografía de alta resolución (CLAR o HPLC)*

Columnas cromatográficas Las columnas convencionales usadas en cromatografía líquida y de gases tienen diámetros relativamente grandes: 2-4 mm en CG y 4-6 mm en HPLC. Estas columnas contienen la fase estacionaria empacada, consistente en un sólido o un líquido volátil recubriendo a un soporte sólido inerte. Desde 1957 se han venido desarrollando distintos tipos de columnas capilares (también denominadas columnas tubulares abiertas) utilizadas inicialmente en CG y * Las siglas HPLC corresponden a las iniciales de la denominación en inglés High Performance Liquid

Chromatography.

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extendiéndose posteriormente a CL e incluso a cromatografía de fluidos supercríticos. Estas columnas son mucho más estrechas y mucho más largas que las columnas empacadas. En ellas, la fase estacionaria sólida está constituida por una capa porosa (figura 10.4.a) y la fase estacionaria líquida puede estar recubriendo directamente la pared interna de la columna (figura 10.4.b.), o sobre un soporte sólido (figura 10.4.c.). fase estacionaria sólida fase estacionaria líquida

soporte sólido recubierto con fase estacionaria líquida

pared de la columna

a

b

c

Figura 10.4. Columnas tubulares abiertas. a) de capa porosa. b) con pared recubierta. c) con soporte recubierto.

Las columnas tubulares abiertas proporcionan mayor resolución, requieren menor tiempo para el análisis y presentan mayor sensibilidad que las columnas empacadas, si bien, se maneja una cantidad de muestra considerablemente menor y no son útiles para separaciones preparativas en las que se trate de aislar cantidades relativamente grandes de compuesto.

Mecanismo de las separaciones cromatográficas La naturaleza de las interacciones entre los distintos componentes de la muestra y las dos fases, móvil y estacionaria, permite clasificar los sistemas cromatográficos desde este punto de vista, si bien, puede considerarse que la fase estacionaria es la que gobierna el modo de separación. Las fuerzas implicadas en estas interacciones suelen ser débiles, tales como fuerzas de Van der Waals o enlaces de hidrógeno. La cromatografía de adsorción se tiene cuando la fase estacionaria es un sólido adsorbente de gran área superficial (gel de sílice, alúmina, etc.). Los centros activos situados sobre la superficie del sólido (por ejemplo, los grupos silanol de la gel de sílice) interaccionan con los grupos funcionales polares de los compuestos a separar (figura 10.5.a.). La separación se produce como consecuencia de la distinta intensidad de las mencionadas interacciones para unos y otros compuestos.


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Las primitivas separaciones de Tswett corresponden a un mecanismo de adsorción. Actualmente aún se utiliza la adsorción en algunas separaciones por cromatografía líquida en columna, si bien, su principal campo de aplicación corresponde a la cromatografía de capa fina. Por otra parte, las aplicaciones de la adsorción en cromatografía de gases se limitan fundamentalmente a separaciones donde los analitos son gases permanentes. Una característica importante del adsorbente es el tamaño de partícula. En principio, la retención es proporcional al área superficial, la cual, a su vez, depende del tamaño de partícula y de la estructura interna de las partículas de adsorbente. Cuanto menor sea el tamaño de partícula, mayor será el área superficial del adsorbente y, en consecuencia, mayor el número de centros activos disponibles para la adsorción. La cromatografía de reparto tiene lugar cuando se utiliza un líquido como fase estacionaria. Para inmovilizar este líquido se utiliza un soporte sólido (gel de sílice, celulosa, tierra de diatomeas, poli-estireno, etc.) de gran área superficial. En cromatografía líquido-líquido, para evitar que se mezclen las fases se utiliza como fases móvil y estacionaria dos líquidos de polaridades muy diferentes. Si el líquido estacionario es polar (por ejemplo, etilen-glicol), la fase móvil será no polar (por ejemplo, hexano). En este caso, los solutos polares son retenidos más fuertemente que los no polares. La forma citada es la de operación normal, si bien también puede operarse con una fase estacionaria no polar (por ejemplo, decano) y con una fase móvil polar (por ejemplo, agua). Esta forma de proceder se denomina de fase inversa. En cualquier caso, la separación se produce porque las moléculas de soluto se distribuyen entre las dos fases según su solubilidad relativa en cada una de ellas* (figura 10.5.b.). En la cromatografía de intercambio iónico, la fase estacionaria es una matriz rígida, en cuya superficie existen grupos funcionales cargados positiva o negativamente (A) y contra-iones de carga opuesta (M), susceptibles de intercambiarse con iones de la misma carga contenidos en la fase móvil (figura 10.5.c.) Intercambio catiónico: Matriz-A– M+ + X+ —> Matriz-A–X+ + M+ * Frecuentemente, en cromatografía líquido-líquido, la fase estacionaria está unida quimicamente al soporte

sólido, en lugar de estar simplemente depositado sobre el. En este caso, se tiene la denominada cromatografía de fase enlazada (bonded-phase chromatography, BPC). El mecanismo de las separaciones por esta técnica es complejo, si bien, parece que implica una combinación de adsorción y reparto, dependiendo de las condiciones experimentales. En HPLC, la utilización de la BPC está muy generalizada.

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Introducción a los Métodos Cromatográficos Intercambio aniónico: Matriz-A+M– + Y– —> Matriz-A+Y– +M–

La fase móvil suele ser una solución acuosa tamponada y la separación se produce por la competencia que se establece entre los iones de la fase móvil y los iones del analito por los centros activos de la resina. Este tipo de cromatografía se utiliza ampliamente en química inorgánica para la separación de iones metálicos, así como en sistemas biológicos para la separación de compuestos iónicos solubles en agua. interfase fase móvil

fase estacionaria sólida

fase móvil

fase estacionaria líquida

soluto

. centros activos

a) adsorción

fase móvil

.

+

grupo funcional


b) reparto

fase móvil


+ contraión

c) intercambio iónico

d) exclusión

Figura 10.5. Representación esquemática de algunos mecanismos de separaciones cromatográficas.

La cromatografía de exclusión también se denomina cromatografía de filtración en gel o cromatografía de permeación en gel. En ella, la fase estacionaria consiste en un sólido inerte que contiene pequeños poros en los que pueden penetrar las moléculas


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de tamaño reducido, pero no las grandes (figura 10.5.d.). El grado de retención depende del tamaño de las moléculas (solvatadas) y del tamaño de los poros. Las moléculas pequeñas pueden penetrar en los poros pequeños, mientras que las de tamaño intermedio pueden penetrar solo en algunos poros, siendo excluidas de los otros, y las moléculas grandes son excluidas completamente, Estas últimas se desplazan con la fase estacionaria y son eluidas en primer lugar. Este tipo de cromatografía resulta especialmente adecuada para la separación de especies orgánicas de peso molecular elevado de otras moléculas pequeñas*.

FUNDAMENTOS TEORICOS Se presentan seguidamente los conceptos en los que se basan las separaciones cromatográficas y aquellos parámetros que son de utilidad para comprender y mejorar la calidad de los cromatogramas.

CONSTANTE DE DISTRIBUCION Y SEPARACIONES Los componentes a separar, en su desplazamiento a lo largo del sistema cromatográfico se mueven a diferentes velocidades, dependiendo de la afinidad de cada uno por la fase estacionaria, respecto a la fase móvil. Cada uno de ellos se distribuye entre las dos fases según un equilibrio caracterizado por una constante denominada constante de distribución o coeficiente de distribución. Para el componente A, Amóvil <—> Aestacionaria KA=

AS AM

donde [AS] es la concentración de A en la fase estacionaria, y [AM] la concentración de A en la fase móvil. Este modelo es análogo al utilizado en sistemas de extracción simple, si bien, la cromatografía es un sistema dinámico en el que los procesos de * En el extremo opuesto a la cromatografía de exclusión puede situarse la denominada cromatografía de

afinidad. En ésta, la fase estacionaria consiste en una especie bioactiva unida a un soporte sólido. La separación se produce en función de la afinidad química entre los diferentes solutos y el líquido bioactivo. Se utilizan interacciones altamente específicas, tales como las existentes entre un antígeno y un anticuerpo. El compuesto activo es retenido por la fase estacionaria, siendo eluidos los demás. Posteriormente, un cambio en el pH o en la composición de la fase móvil origina la liberación de la especie retenida, haciendo posible su elución.

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separación tienen lugar continuamente, con solutos moviéndose sobre la fase estacionaria y tratando de alcanzar el equilibrio definido por K. En cualquier caso, cuanto mayor sea el valor de K, mayor será la afinidad del componente en cuestión para la fase estacionaria y menor será la velocidad a la que se mueve a través del sistema. Para una muestra que contenga los componentes A, B y C, y que se introduzca como una banda estrecha sobre una fase estacionaria, si KA > KB > KC el componente A se desplazará a lo largo del sistema más lentamente que el B, y éste más despacio que el C. En cromatografía plana, los componentes A, B y C se ponen de manifiesto por la presencia de manchas, mientras que en cromatografía de gases o en HPLC, donde normalmente se utilizan métodos instrumentales como detectores a la salida de la columna en los que se monitoriza continuamente la composición de la fase móvil, la señal obtenida es proporcional a la cantidad de soluto presente en el eluyente, con lo que se obtienen picos más o menos Gaussianos, como los representados en la figura 10.7.(Los picos se ensanchan por una serie de causas que se considerarán posteriormente).

A BC

. A+B+C

.

A B C

COLUMNA

A

B

C

DETECTOR

Figura 10.7. Separación cromatográfica de una mezcla de tres compuestos.

RETENCION Y DISTRIBUCION El cromatograma simplificado representado en la figura 10.8 corresponde a una muestra que contiene un solo analito (A). El pico pequeño (B), corresponde a una especie no retenida por la columna y que a menudo está contenida en la muestra, pero que puede añadirse para facilitar la identificación de los picos*. En la misma figura se muestran algunos datos y símbolos característicos.

* En cromatografía de gases con detector de conductividad térmica suele inyectarse, junto con la muestra,

unos micro-litros de aire,.


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tM: tiempo muerto (tiempo requerido para que una especie no retenida alcance el detector) VM: volumen muerto (volumen de fase móvil que se requiere para eluir una especie no

retenida)

tR: tiempo de retención (tiempo transcurrido desde la introducción de la muestra hasta que el componente alcanza el detector) VR: volumen de retención (volumen de fase móvil que se requiere para eluir un soluto de la columna cromatográfica) h: altura de pico; w: anchura de pico; w1/2: anchura de pico a la semialtura w0,1: anchura de pico a un décimo de la altura.

Figura 10.8. Cromatograma: parámetros característicos.

Anteriormente se ha indicado que la mayor o menor retención de los componentes de una muestra por la fase estacionaria depende de las correspondientes afinidades. Estas, a su vez, dependen de diversos factores, entre los que cabe mencionar: * Interacciones electrostáticas entre especies de carga opuesta, como las que tienen lugar en separaciones por cromatografía iónica. * Interacciones por fuerzas de van der Waals del tipo dipolo-dipolo (orientación) o del tipo dipolo-dipolo inducido (inducción) * Interacciones por fuerzas de dispersión entre moléculas neutras o grupos funcionales. * Formación de enlaces de hidrógeno.


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El tiempo de retención puede considerarse que está constituido por dos componentes. Uno de ellos es el ya mencionado tiempo muerto, que es el mismo para todos los analitos en un sistema cromatográfico determinado, y el otro es el denominado tiempo de retención ajustado, t'R, que es el tiempo que realmente se invierte en la retención de un soluto por la fase estacionaria, y que se define como t'R = tR — tM Las características de retención de los componentes suelen describirse en la práctica por el factor de retención o factor de capacidad, k', definido como, '

k =

masa de soluto S masa de soluto M

=

mS mM

y relacionado con el coeficiente de distribución y los volúmenes de fase móvil y fase estacionaria por: mS VM m S VM AS ' VM =k . = = K= VS m M VS AM m M VM

donde VM y VS son los volúmenes de fase móvil y estacionaria respectivamente. La relación VM/VS se denomina relación de fases, β, y es uno de los parámetros que se utilizan para caracterizar una columna cromatográfica, particularmente en cromatografía de gases. La medida directa de mS y mM suele ser difícil, por lo que la determinación del factor de retención generalmente se lleva a cabo a partir de los tiempos de retención, parámetros fácilmente medibles en el cromatograma. Para ello, el factor de retención puede considerarse que es, '

k =

tiempo de permanencia del soluto en la fase estacionaria tiempo de permanencia del soluto en la fase móvil

o lo que es lo mismo*, '

k =

tR — tM tM

Como el volumen es proporcional al tiempo (VR = tR F, siendo F la velocidad de flujo de fase móvil a través de la columna y VM = tM F), cualquier relación que se * La ecuación k' = m /m representa la relación entre la probabilidad de que una molécula de soluto s M

permanezca en la fase estacionaria y en la fase móvil y esta relación de probabilidad es tambien igual a la relación entre el tiempo que en promedio una molécula de soluto permanece en la fase estacionaria y en la fase móvil.


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exprese como un cociente de tiempos puede escribirse como el cociente de los volúmenes correspondientes. Por ello, '

k =

t R — t M VR — VM = tM VM

El factor de capacidad es un parámetro importante porque es independiente de la velocidad de flujo de la fase móvil y de las dimensiones de la columna, y puede usarse para comparar retenciones en instrumentos diferentes. Los factores de retención grandes favorecen una buena separación, pero también incrementan el tiempo de elución y el ancho de banda. Idealmente, las separaciones se realizan en unas condiciones en las que los factores de capacidad para las especies de una mezcla oscilan entre 1 y 5. El volumen de retención es un parámetro de utilidad en muchas ocasiones. De la expresión anterior se deduce que, VR = VM (1 + k') y sustituyendo k' por K VS/VM, se tiene, VR = VM (1 + K VS/VM) ó

VR = VM + K VS

que es una ecuación importante en cromatografía, si bien, en cromatografía de adsorción debe modificarse de la forma siguiente: VR = VM + kA As donde kA es el coeficiente de adsorción y As el área superficial del adsorbente. La capacidad de una determinada fase estacionaria para separar dos componentes A y B se expresa mediante el factor de separación o factor de selectividad, α, definido por: '

α=

kB '

kA


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y, por otra parte, puede determinarse fácilmente de forma directa midiendo los tiempos de retención de las especies A y B sobre un cromatograma experimental, ya que,

α=

tR B — tM tR A — tM

EFICACIA DE LAS COLUMNAS CROMATOGRAFICAS La observación de los picos cromatográficos muestra una gran semejanza con las curvas de error normal o Gaussianas, lo cual puede explicarse de la forma siguiente: durante el desplazamiento por el interior de una columna cromatográfica, una partícula individual de analito experimenta miles de transferencias entre las fases móvil y estacionaria. El tiempo de residencia en una fase dada es muy irregular, pudiendo ser muy pequeño en algunas etapas, y relativamente grande en otras. Por ello, el tiempo de permanencia de la partícula en el interior de la columna también será irregular, ya que solamente se eluye cuando reside en la fase móvil; algunas partículas se desplazarán rápidamente, debido a que permanecen más tiempo en la fase móvil, mientras que otras lo harán con mayor lentitud, como consecuencia de su mayor permanencia accidental en la fase estacionaria.

Respuesta del detector

Debido a que los procesos individuales mencionados transcurren de forma aleatoria, se obtiene una dispersión de los tiempos de residencia en la columna (o de las velocidades) alrededor de un valor medio, originándose un pico Gaussiano como el representado en la figura 10.9., y en el que casi un 96 % del área se encuentra dentro del intervalo comprendido entre más y menos dos veces la desviación estándar alrededor del máximo.

w 1/2 =2.35 1/2

σ

h w=4 σ Volumen

Figura 10.9. Pico cromatográfico ideal.


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Por otra parte, la anchura de los picos está directamente relacionada con el tiempo de residencia en la columna (inversamente proporcional a la velocidad de flujo de la fase móvil), ya que a mayor tiempo, mayor dispersión, de forma que las especies eluidas al final presentan picos más anchos que las eluidas al comienzo, como se muestra en la figura 10.2. El ensanchamiento de los picos de los distintos componentes del analito actúa en detrimento de la separación, de forma que el objetivo en cromatografía es la obtención de picos estrechos y simétricos. El término "eficacia" de una columna, o mejor, de un sistema cromatográfico, se utiliza para describir el ensanchamiento de las bandas de los solutos en su movimiento a través de la columna, papel o placa. Los tratamientos que normalmente se utilizan están relacionados con cromatografía en columna, si bien, pueden extenderse fácilmente a la cromatografía plana. El tema de la eficacia de un sistema cromatográfico se aborda desde dos puntos de vista: la teoría de platos y la teoría cinética, que se consideran brevemente a continuación.

Teoría de los platos en Cromatografía Se basa en considerar que la columna cromatográfica es como si estuviera constituida por numerosas, pero discretas capas estrechas, denominadas platos teóricos, en términos análogos a lo que ocurre en la teoría de la destilación fraccionada o de la extracción en contracorriente. Se considera que en cada plato se establece un equilibrio del componente entre la fase móvil y la fase estacionaria, y el desplazamiento del analito a través de la columna se trata como una transferencia de la fase móvil desde un plato al siguiente. La eficacia de la columna aumenta al hacerlo el número de estas transferencias, esto es, al aumentar el número de platos teóricos. El número de platos teóricos, N, se define como

N=

tR

2

σ

donde tR es el tiempo de retención del analito y σ la desviación estándar del pico Gaussiano. Como, w = 4 σ (figura 10.9.), t N = 16 R w

2

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Introducción a los Métodos Cromatográficos expresión que permite obtener N midiendo directamente en el cromatograma.

En la práctica, es más frecuente medir la anchura de pico a la semi-altura, w1/2, en cuyo caso, 2

tR

N =

w

1 /2

tR

= 5.54

w

2.35

2

1 /2

(En esta ecuación, como en la anterior, pueden utilizarse volúmenes de retención, en lugar de tiempos, en cuyo caso, el ancho se medirá también en unidades de volumen). Es evidente que el número de platos teóricos será directamente proporcional a la longitud de la columna, de forma que si esta se representa por L, la denominada altura equivalente a un plato teórico, (AEPT* ó H) será:

H=

L N

Es necesario indicar que las columnas se comportan a menudo como si tuvieran distintos números de platos para distintos solutos en una mezcla. Los picos simétricos (Gaussianos) se originan cuando el coeficiente de distribución, K, (K=CS/CM), es constante e independiente de la cantidad de soluto. En realidad, casi siempre se obtienen picos asimétricos, ya que la relación CS/CM suele variar con la cantidad de soluto, obteniéndose isotermas (representación gráfica de CS frente a CM) no lineales. En la figura 10.10. se muestran tres isotermas y las formas de los picos correspondientes. CS

CS

.

CS

CM

CM

Respuesta

Respuesta

Respuesta

CM

a

b

b

a

t

t

a

10 % h

b

Figura 10.10. Isotermas y forma de los picos cromatográficos. * En literatura inglesa, HETP (Height Equivalent to a Theoretical Plate).

c

t

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La isoterma representada en la figura 10.10.b. suele presentarse en sistemas de adsorción con centros activos donde la fase estacionaria retiene fuertemente al soluto. Cuando estos centros se saturan, K disminuye, al no existir sitios de retención fuerte disponibles, lo que se traduce en la presencia de una cola más o menos pronunciada. El comportamiento representado en la figura 10.10.c. suele observarse en sistemas de reparto en los que las interacciones soluto-fase estacionaria son relativamente débiles comparadas con las interacciones soluto-soluto, o cuando se añade una cantidad de analito excesivamente grande (sobrecarga). En este caso, la fase estacionaria sobrecargada tiende a comportarse como una fase líquida constituida por el mismo soluto y, como "lo semejante disuelve a lo semejante", el valor de K aumenta con la concentración y el pico presenta un frente difuso y una cola muy poco pronunciada. El cálculo del número de platos cuando los picos son asimétricos es más complicado que cuando son simétricos. Para ello se han propuesto diversos métodos, siendo uno de los más empleados el que hace uso de la relación

41.7 t R w 0,1 N= a + 1.25 b

2

donde w0,1 es la anchura de pico a un décimo de la altura, y a/b (ver figura 10.10.) el denominado factor de asimetría. La teoría de platos explica satisfactoriamente la forma de los picos cromatográficos, si bien, falla al intentar justificar el ensanchamiento de los mismos. Por otra parte, se basa en unas supuestas condiciones de equilibrio que, en realidad no se alcanzan, debido al movimiento continuo de la fase móvil.

Teoría cinética La teoría cinética considera que el ensanchamiento de las bandas (o picos) cromatográficos se produce como consecuencia de que los distintos procesos de transferencia de masa durante el desplazamiento de una especie a lo largo de la columna ocurren a velocidad finita. Según esta teoría, la forma de los picos depende de los siguientes factores: * Difusión por turbulencia y trayectorias seguidas por la fase móvil. * Difusión longitudinal del soluto a lo largo de la columna.

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* Equilibrio del soluto entre las fases móvil y estacionaria no suficientemente rápido. Los tres factores mencionados normalmente se identifican con los parámetros A, B y C y su contribución al ensanchamiento de las bandas cromatográficas conducen a la ecuación de van Deemter:

H=A+

B +Cu u

donde u es la velocidad lineal media de la fase móvil (u=L/tM; L=longitud de la columna; tM=tiempo muerto). Este modelo es el clásico, y puede considerarse anticuado, si bien, se expondrá aquí por su sencillez y valor didáctico. Por otra parte, la teoría se desarrolló inicialmente para cromatografía de gases con columnas empacadas, pero puede extenderse sin demasiadas dificultades a otros tipos de cromatografía, incluyendo columnas tubulares abiertas e incluso a cromatografía plana.

Término A (difusión por turbulencia) Este primer factor surge de la multitud de trayectorias de distintas longitudes que toma la fase móvil que fluye a través de la columna, que está empacada con partículas de diferentes tamaños y formas acomodadas de manera irregular. Según se observa en la figura 10.11., donde se representan las trayectorias seguidas por dos moléculas durante la elución, la distancia recorrida entre las líneas a y b por la molécula 1 es mayor que la recorrida por la molécula 2, por lo que ésta llegará antes a la línea b. 1

fase móvil

2

a Figura 10.11. Trayectorias de la fase móvil.

b

El término A es independiente de la velocidad de la fase móvil, pero es función del tamaño de las partículas de la fase estacionaria, de forma que

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Claudio González Pérez A = λ dp

donde λ es una constante que depende de las dimensiones, geometría y uniformidad del empaquetamiento de la columna, y dp es el diámetro medio de las partículas de la fase estacionaria. Según la expresión anterior, partículas pequeñas y uniformemente empaquetadas conducirán a columnas más eficaces, si bien, ello implicará el empleo de presiones altas. Por otra parte, el término A es cero para columnas tubulares abiertas, debido a que la fase estacionaria en tales columnas se deposita directamente sobre la pared de la columna.

Término B (difusión longitudinal) El segundo factor que contribuye al ensanchamiento de las bandas es la difusión longitudinal del soluto en la fase móvil. Se produce debido a que la concentración de soluto es menor en los bordes de la banda que en el centro, por lo que una banda de soluto que se mueva a lo largo de la columna (de a hasta b en la figura 10.12.) se ensanchará cuando las moléculas se difundan hacia las zonas de menos concentración, hacia adelante y hacia atrás de la banda.

perfil de concentraciones

fase móvil

a

b

Figura 10.12. Ensanchamiento de banda debido a la difusión longitudinal.

La difusión longitudinal se dificulta por las partículas contenidas en la columna y el coeficiente de difusión en la fase móvil, DM, de forma que, B = 2 γ DM donde γ es un factor de impedimento que depende de las características del relleno de la columna (γ suele ser 0.7 para columnas con relleno y 1.0 para columnas tubulares abiertas) La contribución cromatografía líquida, líquidos. Sin embargo, mayores que en fase

del término B al valor de H suele ser despreciable en por los bajos valores de los coeficientes de difusión de los los coeficientes de difusión de los gases suelen ser 105 veces líquida. Por otra parte, como la difusión consume un cierto


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tiempo, el término de difusión en la ecuación de van Deemter depende de la velocidad de la fase móvil, disminuyendo a medida que aumenta ésta.

Término C (resistencia a la transferencia de masa) El término C está relacionado con el hecho de que el equilibrio para la distribución del soluto entre las fases móvil y estacionaria se establece tan lentamente que una columna cromatográfica siempre opera en condiciones lejos del equilibrio. En realidad, el término C puede descomponerse en dos, CS y CM, según se considere la transferencia de masa en la fase estacionaria y en la fase móvil. La resistencia a la transferencia de masa en la fase estacionaria es despreciable para fases sólidas, ya que la transferencia del analito sobre la superficie de un adsorbente es muy rápida. Sin embargo, para fases estacionarias líquidas, el término depende del espesor de la película (df) y del coeficiente de difusión del analito (DS) 2

df CS = DS

En la práctica, las fases estacionarias líquidas poco viscosas presentan un espesor de película favorable. El término CM describe la resistencia a la transferencia de masa en la fase móvil. En la figura 10.13. se representa el ensanchamiento de banda originado por el hecho de que el equilibrio no se produce instantáneamente. Fase móvil

Equilibrio Fase estacionaria

Fase móvil

No equilibrio Fase estacionaria

Figura 10.13. Ensanchamiento de banda originado por el no equilibrio en la transferencia de masa. Perfiles de concentración en las fases móvil y estacionaria.

Si la fase móvil se mueve rápidamente, y el soluto no puede "salir" con rapidez de la fase estacionaria, entonces la zona del soluto en la fase móvil se adelanta respecto a la fase estacionaria.

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En cromatografía de gases, los efectos de la fase móvil, CM, son mucho menores que los correspondientes de la fase estacionaria, CS, mientras que en HPLC, CM y CS tienen valores comparables. En la figura 10.14. se representa la variación de los tres términos de la ecuación de van Deemter en función de la velocidad de la fase móvil. Nótese que la contribución del término A es independiente de la velocidad, mientras que B/u aumenta cuando la velocidad disminuye y que Cu predomina a velocidades elevadas.

H

A+

B +Cu u Cu A

B/u u Figura 10.14. Representación esquemática de la ecuación de van Deemter.

Las curvas de la ecuación de van Deemter son similares para CG y para CL, presentando, en todos los casos un valor mínimo de H para una determinada velocidad de la fase móvil (condición óptima). A velocidades inferiores a la óptima la difusión longitudinal (B) origina un incremento en la altura de plato y un ensanchamiento de la banda, mientras que a velocidades superiores, la resistencia a la transferencia de masa (equilibrio lento) entre fases provoca que el soluto se extienda. A partir de la ecuación de van Deemter pueden deducirse las condiciones experimentales que minimicen el valor de H. Así, el valor de H disminuye con el tamaño de partícula (dp) y con un empaquetamiento uniforme (λ), así como operando con capas finas de fase estacionaria líquida (df2) de baja viscosidad y a temperatura elevada (para incrementar DS).


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En la práctica, los datos para el gráfico de la ecuación de van Deemter suelen determinarse experimentalmente usando valores de tiempos de retención, tiempo muerto y anchuras de pico, con objeto de objeto de obtener N y por tanto, H a distintas velocidades de fases móviles. En cualquier caso, normalmente suele operarse a velocidades superiores a la óptima, con objeto de reducir el tiempo necesario para la separación.

Factores extra-columna sobre el ensanchamiento de las bandas cromatográficas Además de los factores ya considerados que contribuyen al ensanchamiento de los picos y que se producen en la propia columna cromatográfica, es necesario mencionar algunos que ocurren en otras zonas del sistema distintas de las fase estacionaria. Entre ellos, pueden considerarse los siguientes: * Introducción de la muestra. Teóricamente suele considerarse que la muestra se introduce en el sistema cromatográfico de forma que ocupa una capa de espesor infinitamente pequeño. Sin embargo, en la realidad, la muestra ocupa un volumen finito, y a veces relativamente grande, tal como sucede en CG, donde un micro-litro de una sustancia líquida inyectada puede ocupar un volumen del orden de 0.5 mL cuando se vaporiza a 250 º, y ello representa varios centímetros de longitud de columna. Además, la lenta velocidad de vaporización contribuye también al ensanchamiento de la banda. En cromatografía líquida suelen emplearse bucles conteniendo un determinado volumen de muestra a temperatura ambiente. En estas ocasiones, la relativamente lenta eliminación de trazas de la muestra de las paredes de la válvula es el factor que puede contribuir al ensanchamiento de la zona. En cromatografía en papel y de capa fina la muestra deberá aplicarse en forma de una gota tan pequeña como sea posible.

* Volúmenes muertos en el sistema de inyección, detector y tubos de conexión. Por volumen muerto se considera el existente entre el punto de inyección de la muestra y el punto de detección, excepto el volumen ocupado por la fase

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estacionaria, de forma que cualquier zona del sistema en la que estén presentes el soluto y la fase móvil, pero no expuesta a la fase estacionaria contribuye a la difusión del soluto y, en consecuencia, al ensanchamiento de las bandas cromatográficas. Es evidente, que deberán usarse tubos estrechos para las conexiones entre el sistema de inyección y la columna, y entre ésta y el detector. En CG el volumen muerto constituye un verdadero problema cuando se opera con columnas tubulares abiertas, mientras que en HPLC, la menor velocidad de difusión en la fase líquida disminuye la posibilidad de mezclas. Por otra parte, el empacado de la columna es susceptible de compresión, sobre todo cuando se trabaja con presiones altas y cuando la columna ha sido objeto de súbitos y rápidos cambios de presión. En cuanto a los detectores, su propio volumen podrá actuar como una verdadera cámara de mezcla. Deberán diseñarse de forma que su volumen sea pequeño y de que se mantenga un flujo laminar en su interior.

En resumen, para minimizar el ensanchamiento de las bandas cromatográficas por factores extra-columna, deben minimizarse todos los espacios muertos y las dimensiones de los tubos; la muestra deberá aplicarse en una zona muy estrecha y deberá procurarse que penetre en la columna antes de mezclarse con el eluyente.

RESOLUCION Y SU OPTIMIZACION La separación de solutos por un sistema cromatográfico puede expresarse por el factor de selectividad, α, ya mencionado, α=

tR B — tM tR A — tM

'

=

kB '

kA

=

KB KA

Sin embargo, α describe la separación entre los centros de las bandas cromatográficas, pero no tiene en cuenta las anchuras de pico, ya que puede ocurrir que el factor de selectividad entre dos picos de dos cromatogramas diferentes sean iguales, y, sin embargo, la resolución sea bastante diferente, como puede apreciarse en la figura 10.15.


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A

B

Figura 10.15. Selectividad y resolución.

Por lo anteriormente mencionado, resulta más adecuado obtener la resolución a partir de la expresión (para picos Gaussianos)

R=

2 t RB — t RA wA— wB

o. alternativamente,

R=

2 t RB — t RA 1.699 w 1/2 A + w 1/2 B

según se midan anchuras de pico, o anchuras a la semi-altura respectivamente (figura 10.16.)

Figura 10.16. Medidas para calcular la resolución.

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Si R=1.5, los dos picos solo se superponen un 0.3 %, mientras que si R=1, la superposición es del orden del 2 %, que puede considerarse adecuada para muchos análisis. La ecuación anterior resulta adecuada para obtener el valor de R, pero no proporciona información acerca de las propiedades cinéticas o termodinámicas de la columna, lo cual es importante en orden a optimizar R. Por ello, una ecuación alternativa para la resolución es la siguiente:

α—1 1 N R= 4 α

k

'

1+k

'

donde k' es el valor medio de k'A y k'B. Esta expresión indica que la resolución depende de la eficacia global de la columna (N), de la capacidad de la fase estacionaria para retener a los componentes (α) y de las características de retención de cada componente (k). Según la ecuación anterior, la resolución es una función de la raíz cuadrada de N, por lo que para aumentar significativamente el valor de R es necesario aumentar mucho el de N. Esto puede hacerse incrementando la longitud de la columna, si bien esto puede llevar a un tiempo demasiado grande. Por ello, normalmente suele ser preferible optimizar k y α. Una forma relativamente sencilla de mejorar la resolución es optimizando k', lo cual puede hacerse aumentando la temperatura (sobre todo en CG) o cambiando la composición de la fase móvil (en HPLC). En cuanto al factor de selectividad, éste puede modificarse variando la composición de las fases móvil y estacionaria, así como la temperatura o recurriendo a factores químicos especiales como puede ser incorporar a la fase estacionaria algún agente complejante particular. En cualquier caso, y en la práctica, en muchas ocasiones se utiliza el método SIMPLEX u otros más sofisticados para optimización de los métodos analíticos por cromatografía. Cuando una muestra está constituida por un gran número de componentes, puede ocurrir que se consigan las condiciones óptimas para la separación de algunos , pero ello vaya en detrimento de otros. En estos casos suele recurrirse a cambiar las condiciones mientras se realiza la separación, para lo cual, puede utilizarse la elución con gradiente (variación gradual de la composición de la fase móvil durante la elución) o la programación de temperatura (variación de la temperatura durante la elución).


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LA CROMATOGRAFIA Y EL ANALISIS QUIMICO Aunque la cromatografía es el método más importante para la separación de especies, también es posible su empleo en análisis cualitativo y, sobre todo, en análisis cuantitativo. En análisis cualitativo sus aplicaciones son bastante limitadas, sobre todo cuando se compara la información que proporciona un cromatograma con la que puede obtenerse con otras técnicas como espectroscopia infrarroja, de resonancia magnética o de masas. De todas formas, la cromatografía es una herramienta importante para reconocer la presencia o ausencia de componentes en mezclas que contengan un número limitado de posibles especies de las que se conozca su identidad. Por otra parte, en ocasiones interesa conocer si un determinado componente está ausente en una muestra. En estos casos, muchas veces la cromatografía proporciona una evidencia segura en este sentido, al no aparecer el pico, o la mancha, correspondiente al patrón en las mismas condiciones de operación. Análisis Cuantitativo En cromatografía plana (papel y capa fina) el área ocupada por las especies separadas es el parámetro utilizable en análisis cuantitativo. Las aplicaciones cuantitativas de la cromatografía en columna se basan en la comparación de la altura o del área del pico del analito con los correspondientes a los patrones. El empleo de las alturas de pico tiene la ventaja de su fácil medida*, pero presenta el inconveniente de que debe controlarse rigurosamente la temperatura de la columna, el caudal de eluyente y la velocidad de inyección de la muestra, ya que estas variables alteran las anchuras de pico, y éstas están inversamente relacionadas con las correspondientes alturas. Sin embargo, el área de pico es independiente de los efectos debidos a las variables anteriormente mencionadas, por lo que es el parámetro que normalmente se utiliza. Su medida se lleva a cabo con facilidad, ya que casi todos los cromatógrafos modernos están provistos de integradores electrónicos digitales*. Sin embargo, hay que tener en cuenta que la respuesta del detector varía de un compuesto a otro. Así, por ejemplo, el detector ultravioleta depende de la absortividad de los correspondientes analitos, y el de ionización de llama de la * La altura de un pico cromatográfico se obtiene uniendo las líneas base a cada lado del pico por una línea

recta y midiendo la distancia perpendicular desde esta línea al pico.

* En el caso de no disponer de estos equipos, un método sencillo para picos simétricos consiste en

multiplicar la altura de pico por la anchura a la semi-altura. Otros métodos implican el uso de planímetros o incluso la determinación gravimétrica, consistente en recortar el pico y determinar su peso relativo respecto al peso de un área conocida del papel de registro.

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formación de iones. Por ello, a menudo se utilizan los denominados factores de respuesta, obtenidos de la relación entre el área de un componente y el área de otro componente elegido como referencia. Los métodos de cuantificación que principalmente se utilizan en cromatografía son las rectas de calibrado obtenidas a partir de series de patrones, el método del patrón interno, el de normalización de áreas y el de adición estándar. La obtención de rectas de calibrado se lleva a cabo preparando una serie de disoluciones patrón de composición parecida a la de la muestra, obteniendo los correspondientes cromatogramas y representando las áreas de pico (o las alturas) en función de la concentración. En este método, la fuente más importante de error es la incertidumbre en el volumen de la muestra, sobre todo cuando se utilizan microjeringas. Estos errores pueden reducirse considerablemente con el empleo de válvulas rotatorias, cuyo funcionamiento se ilustra esquemáticamente en la figura 10.17. Muestra (entrada)

Muestra (entrada) Muestra (salida)

Muestra (salida)

Eluyente

Columna

a)

Eluyente

Columna

b)

Figura 10.17. Válvula rotatoria. a) Llenado. b) Inyección (introducción de la muestra en la columna).

En el método del patrón interno se añade a los patrones y a la muestra una cantidad exactamente medida de un componente puro, ausente en la muestra, utilizándose como parámetro analítico la relación de áreas de pico del analito y del patrón interno. Para aplicar este método en cromatografía, es necesario que el pico del patrón interno esté bien aislado de los picos de los demás componentes de la muestra, pero deberá estar cerca del pico del analito.


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El método de normalización de las áreas consiste en eluir todos los componentes de la muestra, determinar las áreas de todos los picos eluidos y obtener las correspondientes áreas de pico corregidas (mediante los factores de respuesta del detector). La concentración del analito se obtiene de la relación entre su área y el área total de los picos de todos los componentes de la muestra. Para el componente x,

% de x =

Acorregida de x

. 100

Acorregidas Finalmente, por lo que se refiere al método de adición estándar, su uso en cromatografía está bastante limitado, debido, sobre todo, a la dificultad de inyectar de forma precisa cantidades exactamente conocidas de la muestra.

INTRODUCCION A LOS METODOS CROMATOGRAFICOS

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