ISBN No. 978-602-98559-1-3
Prosiding SNSMAIP III-2012
ISOLASI DAN KARAKTERISASI Bacillus sp. PENGHASIL ANTIMIKROBA DARI SALURAN PENCERNAAN AYAM KAMPUNG (Gallus domesticus) 1*
1
1
Sumardi , Christina Nugroho Ekowati , Kusuma Handayani , dan Nurhayati
2
1
Jurusan Biologi FMIPA Unila, Jl. S. Brojonegoro No.1, B. Lampung 35145 2 Alumni Jurusan Biologi FMIPA Universitas Lampung Penulis untuk korespondensi, HP 085216391087 email:
[email protected] ABSTRAK Bacillus sp. memiliki kemampuan untuk hidup dan berkembang dalam usus ternak. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mencari isolat dan karakter Bacillus sp yang memiliki kemampuan menghasilkan antimikroba. Dari hasil penelitian diperoleh dua isolat Bacillus sp. yaitu Bacillus sp.A1 dan Bacillus sp.A2. Kedua isolat bakteri tersebut memiliki kemampuan menghambat pertumbuhan bakteri patogen Streptococcus, Klebsiella pneumonia, Vibrio cholera dan Escherichia coli. Kedua isolat bakteri bersifat Gram positif, mesofil, neutrofil, menghasilkan spora oval yang letaknya di tengah, mampu menfermentasi gula seperti glokosa, galaktosa, fruktosa dan sukrosa, serta mampu menghasilkan enzim katalase. Dari hasil karakterisasi berat molekul protein menggunakan SDS-PAGE terbentuk 6 pita protein yang berat molekulnya 30 KDa, 45 KDa, 60 KDa, 105 KDa, 143 KDa dan 165 KDa. Kata Kunci: isolasi, Bacillus, karakterisasi, ayam kampung, SDS-PAGE
1. PENDAHULUAN
2. METODE PENELITIAN
Ayam kampung lebih tahan terhadap penyakit dibandingkan dengan ayam ras. Dari hal tersebut dapat dipastikan bahwa di dalam tubuh ayam kampung ada bakteri yang berperan dalam memusuhi mikroba patogen.
2.1 Isolasi Bakteri Penghasil Antimikroba Untuk mendapatkan isolat bakteri penghasil antimikroba, maka di lakukan langkahlangkah sebagai berikut : a) Bakteri yang akan diisolasi berasal dari sampel pakan yang telah mengalami pelunakan (karena proses pencernaan) di dalam ventrikulus, sampel pakan yang telah digiling menjadi molekul yang lebih kecil di dalam ampela, ayam kampung. b) Masing-masing dari sampel tersebut diambil kurang lebih 1 sendok teh kemudian di masukkan ke dalam media pengkayaan/enrichment yaitu media NB. cair sebanyak 50 ml.. Kemudian di o inkubasi selama 5 hari pada suhu 40 C. c) Setelah diinkubasi selama 5 hari, 1 ml sampel di inokulasikan ke dalam 20 ml media NA yang sudah mencair kemudian ditunggu hingga memadat. Setelah padat, diinkubasi selama 24 o jam dalam suhu 40 C. Adanya bakteri penghasil antimikroba ditandai dengan adanya zona jernih di sekitar bakteri yang merupakan bukti bahwa bakteri tersebut memiliki kemampuan untuk menghambat pertumbuhan koloni bakteri yang lain. Koloni ini merupakan koloni kandidat penghasil antimikroba. d) Setelah 24 jam, koloni yang tumbuh diamati dengan melihat pertumbuhan
Bakteri Bacillus sp. merupakan salah satu mikroba flora normal pada saluran pencernaan ayam kampung (Green et al., 2006). Bacillus sp. memiliki sifat mampu hidup dan berkembang dalam usus ternak dengan baik dan dapat menghasilkan enzim pencernaan seperti protease dan amilase yang dapat membantu pencernaan, serta memproduksi asam-asam organik rantai pendek yang mempunyai sifat antimikroba. Hasil penelitian Sjofjan (2003) membuktikan bahwa Bacillus sp. mampu menghasilkan antimikroba yang dapat menghambat bakteri patogen seperti Salmonella sp. dan E.coli. Pada percobaan in vitro menunjukkan bahwa kultur Bacillus dapat menekan perkembangan Salmonella sp. dan E.coli. Berdasarkan uraian di atas, maka penelitian ini dilakukan untuk mendapatkan isolat bakteri Bacillus sp. dan karakterisasinya yang memiliki kemampuan antimikroba dari saluran pencernaan ayam kampung untuk mengurangi terjadinya infeksi pada ayam.
306
ISBN No. 978-602-98559-1-3
e)
dan morfologi koloni meliputi tepi, ukuran, bentuk dan warna. Koloni kandidat yang sudah didapatkan kemudian ditumbuhkan ke dalam media NA (Nutrien Agar) dalam agar miring. Koloni ini disebut koloni murni. Koloni murni ini kemudian diperbanyak dengan metode streak plate secara penuh pada cawan petri dengan menggunakan media NA (Nutrien Agar).
2.2 Uji Isolat Bakteri Penghasil Antimikroba terhadap beberapa Bakteri Patogen Satu ose bakteri kandidat diinokulasikan ke dalam 5 ml aquades, divorteks kemudian 1 ml bakteri dimasukkan pada cawan Petri setelah itu ditambahkan media steril (MC untuk Streptococcus, NA untuk Klebsiella pneumonia dan Vibrio cholera, EMBA untuk Escherichia coli) yang sudah mencair sebanyak 20 ml kemudian ditunggu hingga memadat. Setelah padat, kandidat bakteri penghasil antimikroba yang telah dimurnikan pada media NA dipotong menggunakan spatula besi dengan ukuran kira-kira 0,8 cm kemudian dipindahkan ke masing-masing media yang telah mengandung bakteri uji. Untuk setiap cawan petri dapat digunakan 2 isolat bakteri kandidat penghasil antimikroba. Kultur diinkubasi selama 24 jam o dalam suhu 40 C. Setelah masa inkubasi selesai, dilakukan pengamatan terhadap diameter zona jernih yang terbentuk di sekitar bakteri kandidat penghasil antimikroba. Pengukuran dilakukan dengan menggunakan penggaris. Untuk menghitung besarnya zona jernih yang dihasilkan, didapat dengan cara menghitung luas zona jernih di sekitar koloni bakteri berbanding luas koloni isolat bakteri atau ditulis dengan rumus: I = luas zona total / luas koloni isolat. 2.3 Karakteristik Bakteri penghasil antimikroba Karakterisasi yang dilakukan pada bakteri hasil isolasi adalah : 1. Morfologi koloni : melihat bentuk dan warna koloni. 2. Pengecatan gram. Bacillus adalah bakteri yang bersifat gram positif (berwarna ungu) dan yang bersifat gram negatif berwarna merah. Uji Enzim Amilase Sampel yang sudah diperoleh diinokulasi dengan streak plate methode secara titik pada media NA padat yang diperkaya amilum dengan menggunakan ose
Prosiding SNSMAIP III-2012
runcing/lurus. Kemudian diinkubasi selama o 24 jam dalam suhu 40 C. Setelah di inkubasi 24 jam, dilakukan pengamatan dengan mengukur zona jernih yang terbentuk. Zona jernih itu dapat terlihat jika di sekitar bakteri yang kita inokulasikan diberi larutan lugol iodine. Uji Enzim Protease Sampel yang sudah diperoleh diinokulasi secara titik pada media yang diperkaya amilum dengan menggunakan ose tumpul/lurus. Kemudian diinkubasi selama o 24 jam dalam suhu 40 C. Setelah diinkubasi dilakukan pengamatan dengan mengukur zona jernih yang terbentuk. Uji Enzim Selulase Sampel yang sudah diperoleh diinokulasi secara titik pada media yang diperkaya CMC (selulosa) dengan menggunakan ose tumpul/lurus. Kemudian diinkubasi selama o 24 jam dalam suhu 40 C. Setelah diinkubasi ditambahkan 1% Congo red didiamkan selama 20 menit pada suhu ruangan setelah itu cawan petri dicuci dengan 1M Natrium klorida, maka akan terbentuk zona jernih. Uji Biokimia 1 ose sampel bakteri kandidat penghasil antimikroba diinokulasikan pada media uji biokimia (glukosa, fruktosa, sukrosa, laktosa dan galaktosa) kemudian diinkubasi selama o 24 jam dalam suhu 40 C. Setelah waktu inkubasi selesai, kemudian melakukan pengamatan terhadap perubahan warna pada media dan terbentuknya gelembung udara pada tabung durham. Warna media awalnya adalah berwarna merah. Jika terjadi fermentasi asam maka media akan mengalami perubahan warna media menjadi kuning. Adanya gelembung udara menunjukkan bahwa bakteri kandidat yang didapat dari isolasi saluran pencernaan ayam kampung merupakan bakteri aerob. Pengaruh pH terhadap Pertumbuhan Bakteri (kualitatif) Sampel bakteri kandidat penghasil antimikroba yang sudah diperoleh digoreskan (streak) pada media NA (Nutrien Agar) dengan pH 4, 7 dan 9, kemudian o diinkubasi selama 24 jam dalam suhu 40 C. Setelah diinkubasi, melakukan pengamatan terhadap ukuran koloni yang tumbuh pada media.
307
ISBN No. 978-602-98559-1-3
Prosiding SNSMAIP III-2012
Pengaruh Suhu terhadap Pertumbuhan Bakteri (kualitatif) Sampel bakteri kandidat penghasil antimikroba yang sudah diperoleh digoreskan (streak) pada media NA (Nutrien Agar) padat kemudian diinkubasi pada suhu o o o o 30 C, 40 C, 50 C dan 60 C. Setelah diinkubasi, melakukan pengamatan terhadap ukuran koloni yang tumbuh pada media.
30 menit. Untuk mendapatkan pita protein, gel direndam Natrium karbonat selama 3-5 menit sampai muncul pita protein. Untuk menghentikan munculnya pita, gel tersebut dimasukkan dalam larutan fiksasi yang telah digunakan diatas. Sebelum memasukkan AgNO3, limbah tempat pembuangan ditetesi dengan HCl agar tidak bereaksi dengan Natrium karbonat.
Elektroforesis Sampel yang akan dielektroforesis adalah zat antimikroba yang diproduksi oleh Bacillus sp. hasil isolasi. Elektroforesis di lakukan dengan menggunakan piranti Mini Protean II. Berat molekul protein yang muncul diukur dengan menggunakan standar berat molekul rendah yang terdiri atas fosforilase b (otot kelinci) 94 kDa, albumin (serum bovin) 67 kDa, ovalbumin (putih telur) 43 kDa, karbonat anhidrase (eritmoritbovin) 30 kDa, tripsin inhibitor (kedelai) 20,1 kDa dan α-laktat-bumin (susu bovin) 14,4 kDa.
3.
Elektroforesis menggunakan gel pemisah (8% poliakrilamid) dan gel penahan (4% poliakrilamid). Gel pemisah digunakan untuk mengetahui lokasi keberadaan protein pada sampel. Sebelum dimasukkan ke dalam sumur, 20 µl sampel masing-masing di campur dengan 5 µl buffer sampel di dalam tabung mikro kemudian divorteks dan disentrifuge selama 10 detik. 1 µl standard dan 25 µl campuran tersebut dimasukkan ke sumur (lubang) pada gel penahan. Setelah gel dipasang pada piranti elektroforesis, 400 ml buffer elektroforesis pH 8,3 di tuangkan pada tempatnya (piranti Mini Protean II). Elektroforesis dijalankan pada tegangan konstan 110 volt 50 mA selama 2 jam dalam keadaan dingin (air es). Proses ini disebut running. Setelah running selesai, gel elektroforesis dilepas dari cetakan dan jarak migrasi bromofenol biru diukur dari batas atas gel pemisah dengan menggunakan penggaris. Setelah itu dilakukan pewarnaan terhadap gel dengan cara gel direndam dalam larutan fiksasi selama 1 jam hingga semalamdan diinkubasi dalam shaker bergoyang dengan kecepatan 30 rpm, lalu direndam dengan larutan etanol 50% selama 30 menit, direndam 2 kali dalam larutan etanol 30 % masing-masing 20 menit, gel direndam dalam larutan enhancer selama 1 menit, gel dicuci 3 kali dalam aquabides masing-masing 20 detik, gel direndam dalam larutan perak nitrat selama
HASIL DAN PEMBAHASAN
3.1 Isolasi dan Seleksi Bakteri Penghasil Antimikroba Isolasi bakteri penghasil antimikroba dari saluran pencernaan ayam kampung (tembolok, usus halus, usus besar dan ampela) telah dilakukan. Bakteri tersebut dibiakkan dalam media nutrient broth. Setelah 4 hari, ditemukan 7 isolat bakteri yang memproduksi antimikroba. Isolat tersebut ditandai dengan adanya zona jernih yang terbentuk di sekitar koloni bakteri. Isolat yang didapat diberi kode berdasarkan asal isolat. Isolat bakteri yang dihasilkan dapat dilihat secara lengkap pada Tabel 1. Tabel1.
Data isolat antimikroba
No
Kode
bakteri
kandidat
Asal Organ
penghasil Zona hambat
1
AUB 1
Usus Besar
± 0,2 cm
2
AUB 2
Usus Besar
± 0,1 cm
3
AUB 3
Usus Besar
± 0,1 cm
4
AUH 1
Usus Halus
± 0,1 cm
5
AUH 2
Usus Halus
± 0,2 cm
6
AA 1
Ampela
± 0,1 cm
7
AA 2
Ampela
± 0,2 cm
Ket:
AUB: Ayam Kampung Usus Besar AUH: Ayam Kampung Usus Halus AA : Ayam Kampung Ampela
Dari ketujuh isolat yang ditemukan tersebut akan diuji kemampuan antimikrobanya terhadap beberapa bakteri patogen. Hasil dari uji inilah yang akan dikarakterisasi. 3.2 Uji Isolat Bakteri Penghasil Antimikroba terhadap beberapa Bakteri Patogen Uji Isolat Bacillus sp. kandidat penghasil antimikroba dilakukan untuk mengetahui kemampuan masing-masing isolat dalam menghambat bakteri patogen. Hasil dari uji bakteri penghasil antimikroba terhadap beberapa bakteri patogen adalah seperti pada Tabel 2 dan Gambar 1
308
ISBN No. 978-602-98559-1-3
Prosiding SNSMAIP III-2012
.Tabel 2. Hasil uji isolat bakteri penghasil antimikroba terhadap beberapa bakteri uji No
1
2
Bakteri
Bakteri Uji
Bacillus sp.
Streptococcus
Diameter Zona Hambat (cm) 1,2
A1
K. pneumonia
1,7
V. cholera
1,2
E. coli
1,2
Bacillus sp.
Streptococcus
0
A2
K. pneumonia
0
V. cholera
0
E. coli
1,5
Data pada tabel di atas jika ditampilkan dalam diagram akan tampak seperti Gambar 1.
kesempatan E. coli untuk menempel pada usus jauh berkurang. Dengan demikian, E. coli hanya berada dalam lumen dan akan dikeluarkan bersama feses. Antimikroba Bacillus dihasilkan pada fase stationer yaitu pada saat menghasilkan metabolit sekunder (Todar, 2009). Pada fase ini terjadi perubahan fisiologis (Purwoko, 2007), jumlah sel yang mati semakin meningkat, dan jumlah sel hidup konstan (Sumarsih, 2003). Pada fase ini bakteri tidak melakukan perbanyakan sel karena penurunan kadar oksigen, nutrien habis, dan memproduksi antimikroba yang banyak (Purwoko, 2007). Produksi antimikroba diatur oleh kontrol regulasi keseluruhan yang berperan dalam laju pertumbuhan dan efek regulasi khusus pada setiap jalur metabolisme, faktor genetik dan komposisi media. Kemampuan bakteri Bacillus dalam menghambat pertumbuhan bakteri patogen juga dipengaruhi oleh struktur dinding sel suatu bakteri. Bakteri gram negatif lebih rentan terhadap streptomisin. Bakteri gram positif umumnya lebih rentan terhadap penisilin dan kurang rentan terhadap disintegrasi oleh perlakuan mekanik dan pemberian enzim-enzim tertentu.
2 Ө Zona 1,5 Hambat (cm)
1
0,5 0 BA1 BA2 Bakteri penghasil Antimikroba Strep Vib
Kleb E.coli
Gambar 1. Daya Antimikroba Bacillus sp. A1 dan A2 terhadap bakteri patogen
Isolat Bacillus sp. A1 mampu menghambat beberapa bakteri patogen. Bukti dari penghambatan tersebut adalah adanya zona bening di sekitar bakteri uji yaitu Streptococcus sebesar 1,2 cm, Klebsiella pneumonia 1,7 cm, Vibrio cholera 1,2 cm dan Escherichia coli sebesar 1,2 cm sedangkan Bacillus sp. A2 hanya mampu menghambat pertumbuhan bakteri Escherichia coli yaitu sebesar 1,5 cm..Dari data penelitian diatas maka dapat diambil kesimpulan bahwa bakteri Bacillus sp. yang memiliki kemampuan dalam menghasilkan antimikroba adalah Bacillus sp.A1 dan A2. Bacillus sp. melakukan adhesi yang kuat dengan dinding usus, mencegah kolonisasi usus oleh mikroba patogen, sehingga
Bakteri Bacillus sp. menghasilkan kekebalan dan antimikroba seperti bakteriosin (Patterson dan Burkholder, 2003). Pada penelitian lain bakteriosin berasal dari Bacillus cereus (Torkar et al.,2003), dan Lactobacillus sp (Sutardi, 2001). Bakteri Bacillus mampu mengontrol bakteri patogen (sebagai competitive exclution) di dalam saluran pencernaan. 3.3 Karakteristik Bakteri hasil Isolasi Bakteri yang menghasilkan antimikroba adalah bakteri Bacillus sp. A1 dan A2. Karakteristik bakteri penghasil antimikroba dilakukan dengan menggunakan pengamatan morfologi, fisiologi dan analisis kandungan protein dengan SDS-PAGE. Hasil dari pengamatan morfologi yaitu koloni berbentuk bulat, warna koloni putih, ukuran koloni tidak begitu besar, memiliki permukaan cembung dan tepi yang rata. Dari pengecatan gram dan bakteri BA 1 dan BA 2 memiliki ciri-ciri morfologi bentuk sel bakteri batang dan bersifat gram positif (berwarna ungu). Pada pengecatan spora bakteri BA 1 dan BA 2 memiliki bentuk spora oval dan letak sporanya di tengah. Sesuai dengan Feliatra, dkk. (2004) yang
309
ISBN No. 978-602-98559-1-3
Prosiding SNSMAIP III-2012
mengatakan bahwa bakteri Bacillus memiliki endospora oval, kadang-kadang bundar atau silinder dan sangat resisten pada kondisi yang tidak menguntungkan. Selain pengamatan secara morfologi, juga dilakukan pengamatan fisiologi yang meliputi tes biokomia, pH, suhu dan uji enzimatik. Pada pengecatan gram Pada uji suhu kedua bakteri ini tumbuh optimum o pada suhu 30-40 C dan pada pH 7-9. Jika bakteri ditumbuhkan pada suhu diatas suhu optimum maka pertumbuhan tidak terjadi secara optimal. Hal ini terjadi karena suhu optimum suatu bakteri bergantung pada suhu sel tempat bakteri itu berasal atau sedikit melebihi suhu sel tersebut (Murray, 2003). Bakteri BA 1 dan BA2 memiliki kemampuan dalam memfermentasi karbohidrat terutama glukosa dan fruktosa serta mendegradasi protein, amilum dan selulosa. 3.4 Hasil identifikasi protein dengan menggunakan SDS-Page Isolat bakteri Bacillus sp.A1 dan A2 yang diperoleh kemudian dianalisis jumlah pita protein dan berat molekulnya dengan SDS PAGE. Kemudian hasilnya akan diwarnai dengan menggunakan pewarna gel yaitu perak nitrat. Hasil yang diperoleh adalah seperti Gambar 2.
Berdasarkan ciri-ciri morfologi, fisiologi dan hasil analisis dengan menggunakan SDSPAGE maka dapat diketahui bahwa kedua isolat bakteri penghasil antimikroba yang dihasilkan dari saluran pencernaan ayam kampung merupakan bakteri yang sama. Perbedaan kedua bakteri ini adalah pada kemampuan isolat bakteri dalam menghambat pertumbuhan bakteri patogen. 4.
SIMPULAN
1.
Ada dua isolat bakteri Bacillus sp. penghasil antimikroba di dalam saluran pencernaan ayam kampung. Kedua bakteri tersebut adalah jenis yang sama. Bakteri Bacillus A1 memiliki kemampuan menghambat pertumbuhan beberapa bakteri patogen yaitu Streptococcus, Klebsiella pneumonia, Vibrio cholera dan Escherichia coli sedangkan Bacillus A2 hanya memiliki kemampuan dalam menghambat bakteri Escherichia coli Isolat bakteri Bacillus sp. yang diisolasi dari saluran pencernaan ayam kampung memiliki sel berbentuk batang, bersifat gram positif, menghasilkan spora, mampu memfermentasi karbohidrat, mampu mendegradasi amilum, protein dan o selulosa dan tumbuh pada suhu 40 C dan pH 7-9.
2.
3.
UCAPAN TERIMAKASIH Terima kasih kami ucapkan kepada Hibah Bersaing 2010 Dikti, yang telah mendanai proyek penelitian ini. PUSTAKA
NB
BA1 BA2
M
Keterangan : M : Marker BA1 : Bakteri penghasil antimikroba spesies 1 BA2 : Bakteri penghasil antimikroba spesies 2 NB : Nutrien Broth
Pada hasil analisis SDS-PAGE, pita-pita protein yang terbentuk hampir sama antara NB, BA1 DAN BA2.
Feliatra, et al. 2004. Isolasi dan Identifikasi Bakteri Probiotik dari Ikan Kerapu Macan (Ephinephelus fuscogatus) dalam Upaya Efisiensi Pakan Ikan. Universitas Riau. Pekanbaru Murray, Robert K, dkk. 2003. Biokimia Harper edisi 25. Buku Kedokteran EGC. Jakarta. Patterson, J. A dan Burkholder K.M. 2003. Application Of Prebiotics and Probiotics In Poultry. Poult. Sci 82: 627-631. Purwoko, T. 2007. Fisiologi Mikroba. PT Bumi Aksara. Jakarta.
310
ISBN No. 978-602-98559-1-3
Sjofjan, O. 2007. Isolasi dan Identifikasi Bacillus spp. dari Usus Ayam Petelur sebagai Sumber Probiotik. Tanggal kunjungan 26 Agustus 2010. http://library.trunojoyo.ac.id/elib/detil.ph p?id=2148&PHPSESSID=6098f327dle5 448de20dd2d95b4c2ad7 Sumarsih, S. 2003. Mikrobiologi Dasar.tanggal kunjungan 12 Agustus 2010. Pukul 11:00 WIB. http://images.birdfun.multiply.multiplycon ten.com/attachment/0/SWCaMAoKCDE AACGId@11/buku-ajarmikrobiologi.pdf?nmid=160206209 Sutardi, T. 2001. Produksi Biopreservatif Atau “Feed Supplements” (Bakteriosin) Dari Bakteri Asam Laktat. Abstrak Ilmu Nutrisi dan Makanan Ternak – FAPET.Tanggal kunjungan 28 Juli 2010.Pukul 10.00 WIB.
Prosiding SNSMAIP III-2012
http://web.ipb.ac.id/~lppm/ID/index.php? view=penelitian/hasilcari&status=buka&i d_haslit=X019 Todar, K. 2009. Antimocrobial Agents Used in the Treatment of Infectious Disease. Tanggal kunjungan23 Juli 2010 Pukul 09.00WIB. www.textbookofbacteriology.net Torkar, K G, dan Matijasi, B B. 2003. Partial Characterisation of Bacteriocins Produced by Bacillus cereus Isolates from Milk and Milk Products. Food Technol. Biotechnol, 41 (2) 12129(2003)
311
