ISOLASI DAN KARAKTERISASI BAKTERI PROBIOTIK YANG BERASAL DARI USUS ITIK PEDAGING Anas domesticus
ANASTIAWAN H411 10 259
JURUSAN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS HASANUDDIN MAKASSAR 2014
i
ISOLASI DAN KARAKTERISASI BAKTERI PROBIOTIK YANG BERASAL DARI USUS ITIK PEDAGING Anas domesticus
Skripsi ini diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Biologi pada Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Hasanuddin
ANASTIAWAN H411 10 259
JURUSAN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS HASANUDDIN MAKASSAR 2014 ii
HALAMAN PENGESAHAN
ISOLASI DAN KARAKTERISASI BAKTERI PROBIOTIK YANG BERASAL DARI USUS ITIK PEDAGING Anas domesticus
Disususn dan diajukan oleh ANASTIAWAN H411 10 259
Disetujui oleh : Pembimbing Utama
Dra. Hj. Risco G. Budji, M.S. NIP. 195002161979032001
Pembimbing Pertama
Dr. Sartini, M. Si., Apt. NIP. 19611111 1987032001
Pembimbing Kedua
Dr. Zaraswati Dwyana, M. Si. NIP. 196512091990082001 Makassar,
Januari 2014
iii
KATA PENGANTAR
Assalamu’alaikum Wr. Wb. Alhamdulillahi rabbil’alamin segala puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT. Karena hanya dengan hidayah dan berkah-Nya yang selalu diberikan kepada hambanya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul “Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Probiotik yang Berasal dari Saluran Pencernaan Itik Pedaging Anas domesticus” dapat selesai dengan baik. Skripsi ini merupakan salah satu syarat dalam menyelesaikan pendidikan di Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Hasanuddin Makassar. Tak lupa pula kami kirimkan shalawat dan salam kepada junjungan kita Nabi Muhammad SAW., keluarga, dan para sahabatnya yang telah membimbing kita ke jalan kebenaran sehingga kita bisa tetap berada di jalan-Nya. Atas bantuan, doa dan semangat dari berbagai pihak sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini. Secara khusus dan istimewa skripsi ini didedikasikan sebagai wujud rasa terima kasih penulis yang tak terhingga kepada kedua orang tua penulis yakni, H. M. Alwi dan Hj. Nursiah yang telah merawat, membesarkan, mendukung dan memotivasi diri penulis untuk menuntut ilmu dan doa dari mereka yang tak henti-hentinya diberikan untuk penulis. Kepada Dra. Hj. Risco G. Budji, MS. selaku Pembimbing Utama, Dr. Sartini, M. Si., Apt. selaku Pembimbing Pertama, dan Dr. Zaraswati Dwyana, M. Si. selaku Pembimbing Kedua, penulis menghaturkan banyak ucapan terima kasih yang sedalam-dalamnya atas segala bantuan yang beliau-beliau berikan baik berupa kritik, saran, maupun motivasi yang membantu penulis selama proses
iv
penulisan skripsi ini sampai selesai. Tanpa beliau-beliau penulis tidak akan dapat menyelesaikan skripsi ini. Terima kasih sekali lagi. Penulis juga mengucapkan terima kasih serta penghargaan yang tulus, kepada : Bapak Prof. Dr. H. Hanapi Usman, MS. selaku Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Hasanuddin, bererta staf pegawainya. Bapak Dr. Eddy Soekendarsi, M.Sc. selaku Ketua Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Hasanuddin. Bapak/Ibu Dosen dan pegawai Jurusan Biologi yang senantiasa membantu penulis sehingga dapat mencapai gelar sarjana. Bapak Drs. Asadi Abdullah, M. Si. Selaku Penasehat Akademik (PA), yang senantiasa memberikan arahan kepada penulis sedari penulis memulai studinya sampai selesai. Kepada seluruh Tim Penguji, yang senantiasa meluangkan waktunya untuk memberikan waktunya untuk memberikan kritik dan saran yang tentunya sangat bermanfaat bagi penulis. Kepada saudara dan saudariku tercinta Biologi Unhas Angkatan 2010, terima kasih banyak telah menemani penulis dari Maba sampai Sarjana. Terima kasih pula kepada rekan penelitianku Aulia Insani yang telah rela berbagi suka dan duka serta pertolongan yang diberikan selama ini. Penulis menyadari sepenuhnya bahwa skripsi ini masih jauh dari kesempurnaan. Oleh karena itu kritik dan saran yang membangun sangat diharapkan demi kesempurnaan penulisan mendatang. Penulis berharap semoga
v
sksripsi ini dapat berguna bagi kita semua, bagi perkembangan dunia sains dan teknologi. Sekali lagi terima kasih.
Makassar,
Desember 2013
Penulis
vi
ABSTRAK Telah dilakukan penelitian “Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Probiotik yang Berasal dari Usus Itik Pedaging Anas domesticus”. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui karakter bakteri probiotik yang diisolasi dari usus itik pedaging Anas domesticus. Isolasi bakteri probiotik dilakukan dengan menggunakan medium MRSA (Man Rogosa Sharpe Agar) yang ditambahkan CaCO3 1%. Kemampuan sebagai bakteri probiotik diperoleh dengan melakukan uji ketahanan terhadap pH rendah dan garam empedu. Karakteristik bakteri dilakukan melalui uji makroskopik dengan mengamati bentuk koloni, uji mikroskopik dilakukan dengan pewarnaan Gram, uji fisiologis meliputi uji ketahanan terhadap temperatur dan uji-uji biokimia seperti uji motilitas, uji MR-VP, uji katalase dan uji TSIA, serta uji daya hambat terhadap bakteri patogen dengan menggunakan bakteri Escherichia coli dan Staphylococcus aureus. Hasil yang diperoleh terdapat delapan isolat bakteri probiotik, 6 isolat bersifat gram positif dan 2 isolat bersifat gram negatif, berbentuk batang dan bulat, mampu tumbuh pada medium yang memiliki pH2,5-3 dan medium yang mengandung garam empedu sintetik 1% dan 5%, temperatur pertumbuhan 15OC dan 45 OC, serta optimum pada temperatur 37OC. kedelapan isolat bersifat non motil, positif terhadap uji MR, positif dan negatif terhadap uji VP, bersifat katalase negatif, dan mampu memfermentasi karbohidrat pada medium TSIA. Dari hasil uji daya hambat didapatkan bahwa semua isolat memiliki kemampuan menghasilkan antimikroba yang bersifat bakteriosida terhadap pertumbuhan bakteri E.coli dan S. aureus. Kata Kunci : Probiotik, itik pedaging Anas domesticus, usus itik pedaging
vii
ABSTRACT The research about “The Isolation and Characterization of Probiotic Bacteria which Is Taken From Intestines of the broiler duck Anas domesticus” has been done. This research aimed to is get the characters of those bacteria. Probiotic bacteria was isolated by using a medium MRSA (Man Rogosa Sharpe Agar) which is added with CaCO3 1%. To get the ability as probiotic bacteria by using a few test such as the ability in low pH and mineral compound of bile. The characteristic of bacteria can be observe by macroscopic test for the colony form, the microscopoc test by using the Gram staining, the physiological test was using temperature ability, biochemichal tests for motility test, MR-VP test, catalase test, and TSIA test. The test of inhibitory growth of pathogen bacterial was used Escherchia coli and Staphylococcus aureus. The result shows that eight isolates of probiotic bacteria are 6 isolates Gram positive and 2 isolates Gram negative, rod and round shape. They were able to grow on a medium which has a pH between 2,5 and 3 and a medium of 1% and 5% synthetic mineral compound of bile, growth temperature 15OC and 45 OC (optimum at 37OC). The eight isolates are non motil, positive at MR test, positive and negative at VP test, catalase negative and be able to fermented carbohydrates in the TSIA medium. From the result of the inhibitory power test show that all isolates have the ability to produce antimicrobial that are bacteriosida against bacterial growth of E.coli and S. aureus. Keywords : Probiotic, broiler duck Anas domesticus, intestines of broiler duck.
viii
DAFTAR ISI
Halaman Halaman Judul.................................................................................................. Lembar pengesahan........................................................................................
i iii
Kata Pengantar.................................................................................................
iv
Abstrak..............................................................................................................
vii
Abstract.............................................................................................................
viii
Daftar Isi...........................................................................................................
ix
Daftar Tabel.....................................................................................................
xi
Daftar Gambar..................................................................................................
xii
Daftar Lampiran...............................................................................................
xiii
BAB I PENDAHULUAN...............................................................................
1
I.1 Latar Belakang.................................................................................
1
I.2 Tujuan Penelitian..............................................................................
3
I.3 Manfaat Penelitian.............................................................................
3
I.4 Waktu dan Tempat Penelitian............................................................
3
BAB II TINJAUAN PUSTAKA....................................................................
4
II.1 Bakteri Probiotik...............................................................................
4
II.2 Manfaat Bakteri Probiotik..............................................................
6
II.3 Jenis-jenis Bakteri Probiotik.............................................................
8
II.4 Kriteria Bakteri Probiotik.................................................................
9
II.5 Mekanisme Kerja Probiotik.............................................................
11
II.6 Studi Keamanan Probiotik...............................................................
11
ix
II.7 Sumber Isolat..................................................................................
14
II.8 Manfaat Probiotik pada Ternak........................................................
15
BAB III METODE PENELITIAN ...............................................................
17
III.1 Alat...............................................................................................
17
III.2 Bahan...............................................................................................
17
III.3 Prosedur Kerja.................................................................................
17
III.3.1 Sterilisasi Alat dan Medium.........................................................
17
III.3.2 Pengambilan Sampel....................................................................
18
III.3.3 Pembuatan Medium...................................................................
18
III.3.4 Isolasi Bakteri Probiotik...............................................................
20
III.3.5 Tahap Pemurnian Kultur Bakteri.................................................
20
III.3.6 Pengamatan Morfologi.................................................................
21
III.3.7 Pembuatan Stok Bakteri...............................................................
21
III.3.8 Uji Probiotik.................................................................................
22
III.3.9 Uji Fisiologis Probiotik................................................................
22
III.3.10 Uji Biokimia...............................................................................
23
III.3.11 Uji Daya Hambat Terhadap Bakteri Patogen.............................
24
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN........................................................
26
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN..........................................................
47
V.1 Kesimpulan.....................................................................................
47
V.2 Saran.................................................................................................
47
DAFTAR PUSTAKA..................................................................................
48
x
DAFTAR TABEL Tabel
Halaman
1. Morfologi Koloni Isolat Bakteri Probiotik yang Diperoleh ..................
27
2. Hasil Pengecatan Gram dan Karakteristik Isolat Berdasarkan Pertumbuhan Isolat pada Kondisi pH, Garam Empedu, dan Suhu yang Berbeda .........................................................................................
29
3. Hasil Uji TSIA, MR-VP, Motilitas, dan Katalase .................................
39
4. Identifikasi Hasil Fermentasi Bakteri pada Medium TSIA ..................
42
5. Hasil Pengukuran Zona Bening pada Uji Daya Hambat .......................
44
6. Hasil Karakterisasi Bakteri Probiotik BAL...........................................
70
xi
DAFTAR GAMBAR Gambar
Halaman
1. Isolat Bakteri A-H Hasil Isolasi Bakteri Probiotik dari Saluran Pencernaan Itik Pedaging ...............................................................
26
2. Hasil Pengamatan Pengecatan Gram dengan Perbesaran 100x10..
28
3. Hasil Pengamatan Uji Terhadap Keasaman (pH)...........................
31
(1) MRSB degan pH 2,5..................................................................
31
(2) MRSB dengan pH 3...................................................................
31
4. Hasil Pengamatan Uji Terhadap Garam Empedu...........................
33
(1) MRSB + Garam Empedu Sintetik 1%.......................................
33
(2) MRSB + Garam Empedu Sintetik 5%.......................................
33
5. Hasil Uji Temperatur/Suhu ............................................................
35
(a) Inkubasi Pada Suhu 37OC .........................................................
35
(b) Inkubasi Pada Suhu 45OC..........................................................
35
(c) Inkubasi Pada Suhu 15OC..........................................................
35
6. Hasil Uji MR (Methyl Red) ............................................................
37
7. Hasil Uji VP (Voges Preskauer) ....................................................
38
8. Hasil Uji Motilitas ..........................................................................
40
9. Hasil Uji Katalase ..........................................................................
41
10. Hasil Uji TSIA (Triple Sugar Iron Agar) ......................................
43
xii
DAFTAR LAMPIRAN Lampiran
Halaman
1. Skema Kerja Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Probiotik yang Berasal dari Saluran Pencernaan Itik Pedaging Anas domesticus .....................
54
2. Skema Kerja Isolasi Bakteri Probiotik .................................................
55
3. Skema Kerja Pengecatan Gram ............................................................
56
4. Skema Kerja Uji Motilitas ....................................................................
57
5. Skema Kerja Uji Ketahanan terhadap Keasaman (pH) ........................
58
6. Skema Kerja Uji Ketahanan terhadap Garam Empedu ........................
59
7. Skema Kerja Uji Ketahanan Temperatur .............................................
60
8. Skema Kerja Uji MR (Methyl Red) ......................................................
61
9. Skema Kerja Uji VP (Voges Preskauer) ..............................................
62
10. Skema Kerja Uji Katalase ....................................................................
63
11. Skema kerja uji TSIA (Triple Sugar Iron Agar) ..................................
64
12. Skema Kerja Uji Daya Hambat ............................................................
65
13. Uji Daya Hambat ..................................................................................
66
14. Pemurnian Isolat BAL dengan Metode Kuadran .................................
67
15. Foto Prosedur Kerja ..............................................................................
68
16. Hasil Karakterisasi Bakteri Probiotik....................................................
70
xiii
BAB I PENDAHULUAN
I.1 Latar Belakang Seiring dengan meningkatnya jumlah penduduk, maka kebutuhan daging di Indonesia tiap tahun mengalami peningkatan. Kebutuhan konsumsi daging di Indonesia pada tahun 2000 berkisar 1,6 juta ton. Peningkatan kebutuhan daging ini merangsang para ahli di bidang peternakan untuk berusaha meningkatkan produktivitas ternak. Salah satu cara untuk meningkatkan produktivitas ternak yang sekarang sedang berkembang yaitu dengan memperbaiki pakan ternak menggunakan mikroorganisme seperti probiotik (Gunawan dan Sundari, 2003). Probiotik adalah mikroorganisme hidup yang bila dikonsumsi dapat meningkatkan kesehatan manusia ataupun ternak dengan cara menyeimbangkan mikroflora dalam saluran pencernaan jika dikonsumsi dalam jumlah yang cukup. Probiotik mempunyai kemampuan untuk menurunkan kadar kolesterol serum darah (Kusumawati et al., 2003). Salah satu kelompok bakteri yang berperan sebagai probiotik adalah bakteri asam laktat. Bakteri asam laktat (BAL) sering digunakan sebagai kultur probiotik dalam produk-produk fermentasi susu atau produk olahannya, fermentasi daging dan fermentasi buah atau sayuran
Salah satu jenis ternak yang diduga memiliki BAL pada ususnya adalah itik Anas domesticus sehingga tingkat kesehatan itik tergolong baik. Itik Anas domesticus mampu mempertahankan produksi telur lebih lama dibandingkan ayam, tingkat kematiannya kecil, tahan terhadap penyakit, dan pada penggunaan kualitas pakan yang rendah itik masih dapat berproduksi. Komoditas unggulan dari itik adalah daging dan telur. Konsumsi per kapita telur itik pada tahun 2005
1
sebesar 0,73 kg/tahun, sedangkan konsumsi per kapita daging itik hanya 0,05 kg/tahun (Ditjennak, 2006). Namun bagi beberapa orang, itik relatif mahal dan berukuran kecil bila dibandingkan dengan ayam. Kandungan kolesterol itik juga tinggi, maka dari itu orang cenderung lebih memilih daging ayam. Sebenarnya itik memiliki keunggulan tersendiri yaitu kandungan vitamin lebih banyak dibandingkan daging ayam. Untuk memperbaiki gizi dan kualitas itik, maka salah satu cara yang dapat ditempuh adalah dengan menggunakan probiotik seperi BAL (Sari, 2012), karena BAL dapat meningkatkan pertumbuhan dan efesiensi pakan ternak dengan menyerap lebih banyak nutrisi pakan tanpa terbuang percuma melalui tinja. BAL juga menyeimbangkan populasi mikrobia pada saluran pencernaan ternak, mengendalikan mikroorganisme patogen pada tubuh inang dan lingkungan dan menstimulasi imunitas inang (Surono, 2004). Probiotik seperti BAL juga mempunyai kemampuan untuk menurunkan kadar kolesterol serum darah ternak disebabkan karena
kemampuannya menghasilkan enzim bile salt hydrolase
(BSH) (Kusumawati et al., 2003). Bakteri asam laktat (BAL) merupakan kelompok bakteri gram-positif yang mampu mengubah karbohidrat menjadi asam laktat (Nettles dan Barefoot, 1993). Bakteri asam laktat (BAL) hidup di saluran pencernaan ternak. Keberadaan bakteri probiotik tersebut masih sangat kurang khususnya di usus halus, sehingga penyerapan sari makanan menjadi kurang maksimal. Jadi untuk menambahkan jumlah bakteri probiotik seperti BAL pada usus biasanya bakteri probiotik tersebut diisolasi dari usus ternak itu sendiri agar didapatkan bakteri probiotik yang benar-benar cocok dan sesuai dengan sistem pencernaan ternak tersebut
2
namun tidak semua jenis bakteri usus merupakan bakteri probiotik BAL (Sari, 2012). Berdasarkan uraian tersebut di atas maka telah dilakukan penelitian tentang isolasi dan karakterisasi bakteri probiotik yang berasal dari saluran pencernaan itik pedaging Anas domesticus yang bisa membantu meningkatkan produktivitas itik pedaging. I.2 Tujuan penelitian Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui karakter bakteri probiotik yang diisolasi dari usus itik pedaging Anas domesticus. I.3 Manfaat Penelitian Dari hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi terhadap penelitian-penelitian selanjutnya tentang pemanfaatan bakteri probiotik dari usus itik pedaging Anas domesticus pada industri peternakan itik. I.4 Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilakukan pada bulan Agustus - Oktober 2013 di Laboratorium Mikrobiologi, Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam,
Universitas Hasanuddin. Pengambilan sampel pada
peternakan itik lokal di Lembang Loe Kecamatan Binamu Kabupaten Jeneponto.
3
BAB II TINJAUAN PUSTAKA
II.1 Bakteri Probiotik Konsep tentang probiotik berawal dari penemuan Parker (1974) yang selanjutnya mendifinisikan probiotik sebagai organisme dan senyawa yang dapat menyeimbangkan mikroflora saluran pencernaan. Akan tetapi definisi ini dipandang terlalu luas oleh Fuller (1986) karena meliputi biakan, sel serta metabolit mikroba sehingga di dalamnya akan termasuk juga preparat antibiotika. Ducluzeau
et
al.
(1991)
menyatakan
bahwa
definisi
probiotik
ialah
mikroorganisme hidup dalam bentuk kering yang mengandung media biakan serta produk hasil metabolisme mikroorganisme tersebut. Probiotik mengandung bakteria gram positif dan gram negatif, yeast serta jamur. Mencermati adanya perbedaan dalam definisi probiotik yang cukup luas maka definisi yang sesuai untuk probiotik sebaiknya diarahkan pada tujuan serta manfaatnya yaitu untuk upaya manipulasi mikroflora saluran pencernaan untuk tujuan peningkatan kondisi kesehatan serta produktivitas penerima probiotik. Lilly dan Stillwell memperkenalkan istilah "probiotik" pada tahun 1965 untuk nama bahan yang dihasilkan oleh mikroba yang mendorong pertumbuhan mikroba lain (FAO/WHO, 2001). Probiotik merupakan organisme hidup yang mampu memberikan efek yang menguntungkan kesehatan hostnya apabila dikonsumsi dalam jumlah yang cukup (FAO/WHO, 2001; FAO/WHO, 2002; ISAPP, 2009) dengan memperbaiki keseimbangan mikroflora intestinal pada saat masuk dalam saluran pencernaan (Shitandi et al., 2007; Dommels et al., 2009; Weichselbaum, 2009).
4
Probiotik didefinisikan sebagai kultur hidup satu macam mikroba atau lebih yang diberikan pada manusia atau hewan untuk mikroflora pencernaan (Havenaaret al., 1992 dalam Sari, 2012). Jenis mikroba tersebut harus sudah dinyatakan sebagai yang aman digunakan sebagai bahan pakan atau pangan. Penggunaan probiotik pada ternak telah dilaporkan berfungsi sebagai: (i) zat pemacu tumbuh, (ii) meningkatkan konversi pakan, (iii) kontrol kesehatan atau pencegahan mikroba patogen terutama untuk ternak usia muda, dan (iv) pengurai faktor antinutrisi seperti antitripsin (Havenaaret al., 1992 dalam Sari, 2012). Bakteri probiotik atau bakteri baik adalah bakteri asam laktat yang hidup di dalam usus, bersimbiosis dengan mikroflora usus yang mampu melawan bakteri patogen di dalam usus, oleh karena itu pemberian probiotik dapat berpengaruh menguntungkan bagi kesehatan. Sebagian besar jenis bakteri pada probiotik berasal dari Lactobacillus atau Bifidobacterium. Dua golongan bakteri ini mampu memperpanjang massa simpan produk dan secara alami melindungi usus manusia (Saxelin, 1997). Bakteri ini sering dimanfaatkan untuk industri makanan seperti yoghurt, keju, sauerkraut, acar, bir, anggur (minuman), cuka, kimchi, cokelat dan makanan fermentasi lainnya (Khedid et al., 2006). Probiotik didefinisikan sebagai mikroorganisme hidup non-patogenik, yang
jika
dikonsumsi
dalam
jumlah
tertentu
akan
memberikan
efek
menguntungkan bagi inang (host) (FAO/WHO, 2001). Probiotik merupakan bakteri-bakteri yang secara tradisional telah lama digunakan dalam bentuk makanan, mengandung baik bakteri hidup, bakteri mati maupun metabolitnya yang dalam kurun waktu lama terbukti aman.
5
Karakterisasi bakteri asam laktat yang dapat digolongkan ke dalam bakteri probiotik adalah diketahui sebagai materi yang tidak berbahaya, dapat hidup selama dilakukan proses dan penyimpanan, memiliki efek antagonis terhadap bakteri patogen, toleran terhadap asam lambung, getah pankreas dan cairan empedu serta mampu melindungi epitelium inangnya (Mac Farland dan Cummings 2002; Begley et al., 2005, dalam Vélez, 2007). Menurut Food and Agriculture Organization/World Health Organization (FAO/WHO) (2001), idealnya strain probiotik seharusnya tidak hanya mampu bertahan melewati saluran pencernaan tetapi juga memiliki kemampuan untuk berkembang biak dalam saluran pencernaan, tahan terhadap cairan lambung dan cairan empedu dalam jalur makanan yang memungkinkan untuk bertahan hidup melintasi saluran pencernaan dan terkena paparan empedu. Selain itu probiotik juga harus mampu menempel pada sel epitel usus, mampu membentuk kolonisasi pada saluran pencernaan, mampu menghasilkan zat anti mikroba (bakteriosin), dan memberikan pengaruh yang menguntungkan inangnya. Syarat lainnya adalah tidak bersifat patogen dan aman jika dikonsumsi. Strain probiotik juga harus tahan dan tetap hidup selama proses pengolahan makanan dan penyimpanan, mudah diaplikasikan pada produk makanan, dan tahan terhadap proses psikokimia pada makanan (Prado et al., 2008). II.2 Manfaat Bakteri Probiotik Probiotik merupakan organisme hidup yang mampu memberikan efek yang menguntungkan kesehatan hostnya apabila dikonsumsi dalam jumlah yang cukup (FAO/WHO, 2001; FAO/WHO, 2002; ISAPP, 2009) dengan memperbaiki keseimbangan mikroflora intestinal pada saat masuk dalam saluran pencernaan (Shitandi et al., 2007; Dommels et al., 2009; Weichselbaum, 2009). 6
Probiotik umumnya dari golongan bakteri asam laktat (BAL), khususnya genus Lactobacillus dan Bifidobacterium yang merupakan bagian dari flora normal pada saluran pencernaan (Sujaya et al. 2008). Lactobacillus merupakan probiotik yang dapat memberikan efek yang menguntungkan seperti menstimulasi sistem kekebalan (immune) tubuh (Isolauri et al., 2001) dan menurunkan kadar kolesterol (Pereira et al., 2003; Yulinery et al., 2006; Belviso et al., 2009; Lee et al., 2010). Probiotik dapat memproduksi bakteriosin untuk melawan patogen yang bersifat selektif hanya terhadap beberapa strain patogen. Probiotik juga memproduksi asam laktat, asam asetat, hidrogen peroksida, laktoperoksidase, lipopolisakarida,
dan
beberapa
antimikrobial
lainnya.
Probiotik
juga
menghasilkan sejumlah nutrisi penting dalam sistem imun dan metabolisme host, seperti vitamin B (Asam Pantotenat), pyridoksin, niasin, asam folat, kobalamin, dan biotin serta antioksidan penting seperti vitamin K (Adams, 2009). Manfaat probiotik bagi inangnya dapat melalui mekanisme fungsi yaitu fungsi protektif, yaitu kemampuannya untuk menghambat patogen dalam saluran pencernaan. Terbentuknya kolonisasi probiotik dalam saluran pencernaan, mengakibatkan kompetisi nutrisi dan lokasi adhesi (penempelan) antara probiotik dan bakteri lain, khususnya patogen. Pertumbuhan probiotik juga akan menghasilkan berbagai komponen anti bakteri (asam organik, hidrogen peroksida, dan bakteriosin yang mampu menekan pertumbuhan patogen) (Collado et al., 2009). Probiotik memberikan efek fisiologis seperti antikolesterol, antihipertensi, intoleran laktosa, anti karsinogenik, gangguan saluran pencernaan serta alergi. Dengan memperhatikan kesehatan inangnya penambahan probiotik harus
7
memperhatikan konsentrasi antara 107 – 1011 CFU/g per hari untuk manusia dan 107-109/g per hari untuk binatang, sehingga dapat berperan untuk menurunkan kadar kolesterol (Ooi dan Min-Tze, 2010). Sejumlah peneliti juga mengungkapkan beberapa pengaruh positif probiotik yaitu sebagai berikut (Tensiska, 2008) : 1) Meningkatkan ketahanan terhadap penyakit infeksi terutama infeksi usus dan diare; 2) Menurunkan tekanan darah/ antihipertensi; 3) Menurunkan konsentrasi kolesterol serum darah; 4) Mengurangi reaksi lactose intolerance; 5) Mempengaruhi respon imun; 6) Menurunkan resiko terjadinya tumor dan kanker kolon, dan 7) Bersifat antimutagenik serta bersifat antikarsinogenik II.3 Jenis-jenis Bakteri Probiotik Menurut Leeson dan Summers (1996) probiotik diklasifikasikan dalam dua tipe, yaitu kultur mikrobial hidup, sebagai contoh adalah probiotik “starbio” yang berasal dari lambung sapi dan produk mikrobial fermentasi, contohnya adalah kultur yeast (Saccharomyces cerevisiae), Aspergilllus niger, A. oryzae dan Lactobacillus acidophilus. Salah satu bakteri yang berperan sebagai probiotik adalah bakteri asam laktat. Bakteri asam laktat (BAL) sering digunakan sebagai kultur probiotik dalam produk-produk fermentasi susu atau produk olahannya, fermentasi daging dan fermentasi buah atau sayuran. Bakteri asam laktat (BAL) merupakan kelompok bakteri gram-positif yang mampu mengubah karbohidrat menjadi asam laktat. Genus bakteri yang tergolong
8
kepada BAL adalah Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Streptococcus, Propionibakterium (Nettles dan Barefoot, 1993). Dari sekian banyak mikroorganisme, Lactobacillus dan Bifidobacterium merupakan mikroflora normal usus yang paling utama, merupakan mikroba yang paling banyak berperan menjaga kesehatan fungsi saluran cerna, sehingga kedua genus ini paling banyak digunakan dalam pengembangan produk probiotik. Lactobacillus dan Bifidobacterium merupakan probiotik yang tahan terhadap asam lambung, cairan empedu, mampu menempel pada dinding saluran cerna sehingga melindungi mukosa saluran cerna, dan mampu menghasilkan zat yang berpotensi sebagai antimikroba. Kedua mikroba ini sering juga disebut bakteri asam laktat (LAB – lactic acid bacteria) karena mampu melakukan proses fermentasi membentuk asam laktat pada usus besar (Simadibrata, 2010). II.4 Kriteria Bakteri Probiotik Karakterisasi bakteri asam laktat yang dapat digolongkan ke dalam bakteri probiotik adalah diketahui sebagai materi yang tidak berbahaya, dapat hidup selama dilakukan proses dan penyimpanan, memiliki efek antagonis terhadap bakteri patogen, toleran terhadap asam lambung, getah pankreas dan cairan empedu serta mampu melindungi epitelium inangnya (Mac Farland dan Cummings 2002; Begley et al., 2005; Vesterlund et al., 2005, dalam Vélez, 2007). Ketika bakteri probiotik termakan, maka bakteri pertama kali akan menghadapi keasaman lambung. Bakteri asam laktat tidak hanya tumbuh dengan lambat pada pH rendah, tetapi kerusakan akibat asam dan hilangnya viabilitas juga dapat terjadi pada sel bakteri yang terpapar pada pH rendah. Tiap galur
9
memiliki ketahanan yang berbeda terhadap asam atau pH rendah. Contohnya pada penelitian yang dilakukan adalah, sebanyak 20 isolat yang berasal dari galur yang berbeda-beda memiliki ketahanan yang berbeda-beda pada pH 2,5 selama 90 menit. Keseluruhan isolat yang diteliti ternyata mampu hidup di pH 2,5 namun isolat yang berasal dari galur feses bayi dan air kelapa penurunan populasinya lebih rendah daripada isolat yang berasal dari keju, tape dan moromi kecap (Surono, 2004). Bakteri yang mampu bertahan pada kondisi keasaman lambung akan dialirkan menuju ke usus bagian atas dimana pada usus, bakteri akan menghadapi tekanan yang berhubungan dengan ketersediaan O2 yang rendah, garam empedu dan persaingan dengan mikrobiota (mikroorganisme lainnya yang terdapat di dalam usus). Garam empedu yang terdapat di dalam usus disintesis di dalam hati dengan cara mengkonjugasi steroid heterosiklik yang berasal dari kolesterol dan disalurkan ke usus melalui usus dua belas jari. Garam empedu kemudian akan diserap kembali dari ileum bagian bawah dan kembali ke hati untuk disekresikan lagi ke empedu. Lamanya bakteri di dalam usus sekitar 4-6 jam. Bakteri yang telah melewati garam empedu harus mampu mengkolonisasi pada saluran usus bagian bawah agar dapat dikatakan bakteri probiotik (Surono, 2004). Seperti halnya ketahanan terhadap asam, semua mikroba yang berhasil hidup setelah ditumbuhkan dalam MRSA yang ditambah 0,3% ox gall, dinyatakan bersifat tahan terhadap garam empedu. Konsentrasi garam empedu sebesar 0,3% merupakan konsentrasi yang kritikal, nilai yang cukup tinggi untuk melakukan seleksi terhadap isolat yang resisten terhadap garam empedu.
10
II.5 Mekanisme Kerja Probiotik Mekanisme probiotik melindungi atau memperbaiki kondisi inangnya antara lain dengan menghambat pertumbuhan bakteri patogen melalui beberapa cara antara lain dengan (Simadibrata, 2010): 1. Memproduksi substansi-substansi penghambat. Probiotik mampu memproduksi zat-zat penghambat pertumbuhan bakteri gram positif maupun negatif. Zat-zat ini termasuk asam organik, hidrogen peroksida (H2O2), bakteriosin, reuterin yang mampu menghambat tidak hanya bakteri hidup namun juga produksi toksin. 2. Menghambat perlekatan bakteri patogen dengan berkompetisi di tempat perlekatan permukaan mukosa saluran cerna diduga juga merupakan salah satu cara probiotik menghambat invasi dari bakteri patogen. 3. Kompetisi nutrisi. Bakteri-bakteri yang menguntungkan (probiotik) akan berkompetisi dengan bakteri patogen dalam hal memperebutkan nutrisi dalam saluran cerna. II.6 Studi Keamanan Probiotik Aspek keamanan dan fungsional menjadi pertimbangan utama dalam proses seleksi mikroba probiotik. Aspek keamanan seperti : menyehatkan saluran pencernaan), bersifat non patogen, dan tahan terhadap antibiotik. Aspek fungsional seperti kemampuan hidup dan tahan dalam saluran pencernaan, dapat diaplikasikan pada dunia industri, dan tidak menimbulkan aroma yang menyimpang pada makanan (Saarela et al., 2000; Prado et al., 2008). Bakteri asam
laktat
termasuk mikroorganisme
yang aman jika
ditambahkan dalam pangan karena sifatnya tidak toksik dan tidak menghasilkan
11
toksik, maka disebut food grade microorganism atau dikenal sebagai mikroorganisme
yang
Generally
Recognized
As
Safe
(GRAS)
yaitu
mikroorganisme yang tidak beresiko terhadap kesehatan, bahkan beberapa jenis bakteri tersebut berguna bagi kesehatan. BAL bermanfaat untuk peningkatan kualitas higiene dan keamanan pangan melalui penghambatan secara alami terhadap flora berbahaya yang bersifat patogen (Kusmiati dan Malik, 2002). Senyawa yang dihasilkan oleh BAL diantaranya adalah asam organik, suatu peptida yang bersifat antimikroba, berbagai jenis vitamin, asam folat serta senyawa flavor. BAL juga menurunkan pH lingkungannya dan mengeksresikan senyawa yang mampu menghambat mikroorganisme patogen seperti H2O2, diasetil, CO2, asetaldehid, d-isomer, asam asam amino dan bakteriosin (Surono, 2004). Konsumsi probiotik biasanya diaplikasikan pada pembuatan produk pangan olahan seperti; yogurt, keju, minuman penyegar, es krim, yakult, permen dan yogurt beku (Senok, 2009; Granato et al., 2010). Jumlah minimal strain probiotik yang ada dalam produk makanan adalah sebesar 106 CFU/g atau jumlah strain probiotik yang harus dikonsumsi setiap hari sekitar 108 CFU/g, dengan tujuan untuk mengimbangi kemungkinan penurunan jumlah bakteri probiotik pada saat berada dalam jalur pencernaan (Shah, 2007). Keamanan dan kemanjuran probiotik sangat ditentukan oleh karakter dan jumlah bakteri yang digunakan. Oleh karena itu, dalam menilai keamanan dan kemanjuran suatu produk probiotik beberapa faktor harus diperhatikan diantaranya sifat-sifat bakteri yang akan digunakan seperti kemampuan bakteri terus hidup (viability) selama proses produksi, ketika bakteri berada dalam produk
12
(carrier), ketika berada dalam saluran pencernaan dan ketika dalam penyimpanan (bakteri mudah mengalami degradasi oleh panas, cahaya, kelembapan, dan oksigen. Oleh karena itu, produk probiotik biasanya harus disimpan di pendingin untuk dijaga agar bakteri tetap hidup dan aktif). Sifat bakteri lainnya yang harus diperhatikan adalah sifat ketahanannya terhadap antibiotik dan tidak memiliki sifat virulen (dapat menyebabkan penyakit) (Tensiska, 2008). Jumlah bakteri juga sangat penting diperhatikan karena berhubungan dengan kemanjuran produk probiotik bersangkutan dan juga untuk mencegah agar tidak terjadi “over dosis” meskipun belum ada laporan mengenai efek samping negatif probiotik dalam konsentrasi tinggi. Kelebihan probiotik di dalam tubuh biasanya dapat dikeluarkan melalui tinja. Efek samping probiotik, jika terjadi, cenderung ringan dan bersifat digestif (seperti buang angin dan kembung). Efek yang lebih serius bisa saja terjadi. Secara teoritis probiotik dapat menyebabkan infeksi yang membutuhkan perawatan antibiotik, aktivitas metabolik yang tidak sehat, stimulasi sistem kekebalan tubuh berlebihan, dan transfer gen (penyisipan material genetik ke dalam sel) (Tensiska, 2008). Tak sembarang bakteri bisa digunakan sebagai probiotik. Ada beberapa persyaratan yang harus dipenuhi, diantaranya punya aktivitas antimikroba dan antikarsinogenik, mampu berkoloni dalam saluran pencernaan serta mampu meningkatkan penyerapan usus. Beberapa jenis probiotik yang sering digunakan adalah Bifidobacterium brevis, B. infantis, B. longu, Lactobacillus acidopholus,L. bulgaricus, L. plantarum, L. rhamnosus, L. casei, dan Streptococcusthermophilus. Di pasaran probiotik ini dijual dalam bentuk susu dan foodsupplement (Tensiska, 2008).
13
Kesimpulannya, harus dipastikan bahwa mikroorganisme probiotik tidak meningkatkan daya serap usus yang dapat merangsang alergi pada makanan dan menyebabkan kondisi radang lokal maupun sistemik pada sistem pencernaan. Ini merupakan keterangan penting untuk strain-strain yang diberikan untuk terapi (Tensiska, 2008). II.7 Sumber Isolat Usus besar mengandung mikroorganisme, suatu komponen yang kompleks dan mempunyai kegiatan metabolisme yang bermacam-macam. Fungsi utamanya adalah menampung energi dari karbohidrat yang tidak tercerna di bagian usus, hal ini dapat dimungkinkan oleh karena kemampuan fermentasi dan absorpsi mikroorganisme terhadap karbohidrat yang tidak terserap oleh dinding usus, sehingga
mikroorganisme
berperan
dalam
fermentasi
karbohidrat.
Mikroorganisme juga mempunyai peranan dalam sintesis vitamin B dan vitamin K, dan metabolisme asam-asam empedu, sterol dan xenobiotic. Mikroorganisme dalam usus sangat responsif terhadap diet karbohidrat yang dapat difermentasi, misalnya polisakarida nonstarch, resistant starch dan oligosakarida. Adanya bahan tersebut bakteri akan tumbuh subur dan dapat mensintesis 15 gram biomassa yang disekresikan lewat tinja yang mengandung 1 gram Nitrogen bakterial. Begitupun dengan usus pada ternak, dimana terdapat mikroorganisme yang dapat mempermudah proses penyerapan nutrisi makanan ternak (Tensiska, 2008). Pada usus besar koloni bakteri sangat tinggi tetapi pada usus halus/kecil jumlah mikroflora hanya sedikit sehingga efek pertahanan terhadap patogenpun
14
sangat terbatas. Hal tersebut menjadi alasan kenapa sebagian target infeksi virus dan bakteri adalah usus halus (Tensiska, 2008). II.8 Manfaat Probiotik pada Ternak Daging itik Anas domesticus mengandung lemak yang cukup tinggi yaitu 17% (Samudra dan Arif, 2008) dan kolesterol itik mencapai 50 mg/dl (Setiabudi, 2011). Selain itu, permasalahan yang dihadapi pada usaha produksi daging itik adalah tidak efisiennya dalam memanfaatkan pakan (Sinurat et al., 1993), sehingga biaya produksi menjadi tinggi. Biaya produksi kira-kira 50% lebih tinggi dibanding dengan ayam potong, yang disebabkan rasio konversi pakan yang tidak sebaik seperti pada ayam potong (Yeong, 1994). Untuk mencapai bobot badan antara 1100 – 1200 g diperlukan waktu 10 minggu dengan konversi pakan 4,19 – 6,02 (Sinurat et al., 1993; Iskandar et al., 1995). Efisiensi penggunaan pakan dapat dilakukan dengan pemberian bahan imbuhan (feed additive) atau zat pemacu tumbuh (growth promotant). Pencampuran feed additive ini dimaksudkan untuk meningkatkan daya simpan ransum dan memacu pertumbuhan
ternak. Namun penggunaan feed additive
secara terus menerus akan mengakibatkan terdapatnya produk metabolit berupa residu antibiotic. Oleh karena itu penggunaan feed additive alami merupakan alternative untuk mengurangi akumulasi residu feed additive dalam daging. Salah satu feed additive alami yang mulai digunakan yakni bakteri probiotik (Tensiska, 2008). Pemberian probiotik pada ternak unggas biasanya diberikan dalam bentuk campuran ransum atau diberikan melalui air minum, atau dalam bentuk probiotik yang hanya mengandung satu macam strain mikroba saja atau dalam bentuk
15
campuran terdiri dari beberapa strain mikroba seperti “probiolac” atau “protexin”. Beberapa keuntungan dari penggunaan probiotik pada hewan atau ternak antara lain adalah dapat memacu pertumbuhan, memperbaiki konversi ransum, mengontrol kesehatan antara lain dengan mencegah terjadinya gangguan pencernaan terutama pada hewan-hewan muda (Budiansyah, 2004). Daging itik juga merupakan salah satu sumber kolesterol yang apabila terus dikonsumsi akan menyebabkan penyumbatan pada pembuluh darah sehingga dapat mengakibatkan strok dan serangan jantung. Hal ini menyebabkan kurangnya konsumsi itik oleh masyarakat, sehingga penurunan kadar kolesterol pada itik perlu diupayakan (Budiansyah, 2004). Penelitian yang telah dilakukan dengan menggunakan probiotik untuk penurunan kadar kolesterol adalah pada telur ayam dengan persentase penurunan 5% pemberian 3,2 x 106 CFU/g Bacillus subtilis (Mahdavi et al., 2005). Yousefi dan Karkoodi (2007) juga sudah telah melakukan penelitian pada ayam broiler, dimana penurunan kadar kolesterol pada kuning telur ayam dengan pemberian probiotik Thepax® yaitu 9% (dengan pemberian 0,05% probiotik) dan pemberian Saccaromyces (ragi) yaitu 7,3% (dengan pemberian 0,15% ragi). Penurunan kolesterol pada kuning telur ayam dengan pemberian Lactococcus plantarum asal blondo dalam ransum ayam petelur menurunkan kadar kolesterol kuning telur pada pemberian 3 ml (3,9 x 108 CFU/g) probiotik dengan persentase penurunan 53,6% (Purwati, 2011).
16
BAB III METODE PENELITIAN
III.1 Alat Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah Erlenmeyer, inkubator, oven, neraca analitik, pipet tetes, tabung reaksi, cawan petri, jarum ose, mikroskop, gelas objek, hot plate, corong, batang pengaduk, tabung durham, lemari pendingin, penjepit tabung, rak tabung reaksi, spoit, termos, autoklaf, scalpel, mortal, pastel, dan jangka sorong. III.2 Bahan Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah usus segar itik, air suling, alkohol 70%, medium selektif MRSA (Man Ragosa Sharpe Agar) (ACUMEDIA), medium TSIA (Triple Sugar Iron Agar) (MERCK), reagen H2O2, medium SIM (Sulfid Indol Motility) (MERCK), medium MR-VP (Methyl RedVoges Proskauer) (MERCK), medium NA (Nutrien Agar) (MERCK), KOH 40%, alfanaftol, metil-red, pewarnaan gram (Kristal Violet, lugol, alkohol-aseton, dan safranin), NaCl fisiologis, HCl 0,1 N, garam empedu sintetik (ox bite) dengan konsentrasi 1% dan 5%, minyak emersi, kapas, paper disk, kertas lakmus, dan aluminium foil. III.3 Prosedur Kerja III.3.1 Sterilisasi Alat dan Medium a. Alat-alat gelas berupa tabung reaksi, cawan petri, gelas objek dan pipet tetes disterilkan dengan sterilisasi panas kering (udara panas) pada oven. Sterilisasi dilakukan pada temperatur 170⁰- 180O C selama 1-2 jam (Lay dan Hastowo, 1992).
17
b. Jarum ose disterilkan dengan sterilisasi panas kering dalam nyala api bunsen sampai merah membara (Dwyana dan Gobel, 2011). c. Medium dan alat non-gelas yang digunakan terlebih dahulu disterilkan dengan sterilisasi panas basah yaitu dengan menggunakan autoklaf. Sterilisasi ini dilakukan selama 15 menit dalam temperatur 121OC dan tekanan 2 atm (Lay dan Hastowo, 1992). III.3.2 Pengambilan Sampel Sampel diperoleh dari peternakan itik pedaging. Itik lalu dipotong dan bagian anterior jejunum dan kloaka diikat terlebih dahulu kemudian usus tersebut dimasukkan ke dalam plastik sampel dan dibawa ke laboratorium lalu disimpan pada freezer sampai penelitian dilakukan. III.3.3 Pembuatan Medium Pembuatan medium (Dwyana dan Gobel, 2011) : a. Medium MRSA (Man Ragosa Sharpe Agar) Sebanyak 6,2 g medium MRSA dan CaCO3 1% dilarutkan ke dalam 100 mL air suling dan dibuat dalam pH 6,2. Kemudian dipanaskan sambil diaduk sampai homogen. Selanjutnya larutan dibagi ke dalam 4 buah erlenmeyer masingmasing sebanyak 25 mL. Kemudian mulut masing-masing erlenmeyer ditutup dengan menggunakan aluminium foil lalu disterilkan dalam autoklaf dengan suhu 121 O C dan tekanan 2 atm selama 15 menit. b. Medium MRSB(Man Ragosa Sharpe Broth) Sebanyak 5,2 g medium MRSB dilarutkan ke dalam 100 mL air suling dan dibuat dalam pH 6,2. Kemudian dipanaskan sambil diaduk sampai homogen. Selanjutnya larutan dibagi ke dalam 4 buah erlenmeyer masing-masing sebanyak
18
25 mL. Lalu mulut masing-masing erlenmeyer ditutup dengan menggunakan aluminium foil lalu disterilkan dalam autoklaf dengan suhu 121 O C dan tekanan 2 atm selama 15 menit. c. Medium TSIA (Triple Sugar Iron Agar) Sebanyak 6,5 g medium TSIA dilarutkan ke dalam 100 mL air suling, dibuat dengan pH 7,4. Kemudian dipanaskan sambil diaduk sampai homogen. Selanjutnya larutan dibagi ke dalam 4 buah erlenmeyer masing-masing sebanyak 25
mL.
Kemudian
mulut
masing-masing
erlenmeyer
ditutup
dengan
menggunakan aluminium foil lalu disterilkan dalam autoklaf dengan suhu 121 O C dan tekanan 2 atm selama 15 menit. d. Medium MR-VP (Methyl Red-Voges Proskauer) Sebanyak 1,7 g medium MR-VP dilarutkan ke dalam 100 mL air suling, dibuat dengan pH 6,9. Kemudian dipanaskan sambil diaduk sampai homogen. Selanjutnya larutan dibagi ke dalam 4 buah erlenmeyer masing-masing sebanyak 25
mL.
Selanjutnya
mulut
masing-masing
erlenmeyer
ditutup
dengan
menggunakan aluminium foil lalu disterilkan dalam autoklaf dengan suhu 121 O C dan tekanan 2 atm selama 15 menit. e. Medium SIM (Sulfid Indol Motility) Sebanyak 3 g medium SIM dilarutkan ke dalam 100 mL air suling dibuat dengan pH 7,3. Kemudian dipanaskan sambil diaduk sampai homogen. Selanjutnya larutan dibagi ke dalam 4 buah erlenmeyer masing-masing sebanyak 25
mL.
Selanjutnya
mulut
masing-masing
erlenmeyer
ditutup
dengan
menggunakan aluminium foil lalu disterilkan dalam autoklaf dengan suhu 121 O C dan tekanan 2 atm selama 15 menit.
19
f. Medium NA (Nutrien Agar) Sebanyak 2,3 g medium NA dilarutkan ke dalam 100 mL air suling dibuat dengan pH 7,3. Kemudian dipanaskan sambil diaduk sampai homogen. Selanjutnya larutan dibagi ke dalam 4 buah Erlenmeyer masing-masing sebanyak 25 mL. Selanjutnya mulut masing-masing Erlenmeyer ditutup dengan menggunakan aluminium foil lalu disterilkan dengan autoklaf dengan suhu 121⁰ C dan tekanan 2 atm selama 15 menit III.3.4 Isolasi Bakteri Probiotik Usus itik dikeluarkan dari freezer dan dibiarkan sampai lunak, kemudian secara aseptis, bagian dalam (isi) usus itik dikerok dengan menggunakan scalpel. Hasil kerokan tersebut kemudian dihaluskan dengan menggunakan mortal dan pastel lalu dimasukkan ke dalam erlenmeyer steril dan diencerkan dengan larutan NaCl fisiolgis steril dengan pengenceran 10-1, 10-2, dan 10-3. Sebanyak 1 mL hasil pengenceran tadi kemudian diinokulasikan pada medium MRSA (Man Ragosa Sharpe Agar) yang mengandung CaCO3 1 % kemudian diinkubasikan pada suhu 37OC selama 2-3x24 jam. Koloni yang menunjukkan zona bening disekitar koloni menunjukkan bahwa koloni tersebut adalah bakteri asam laktat. III.3.5 Tahap Pemurnian Kultur Bakteri Pemurnian dimulai dengan memilih koloni-koloni yang disekitarnya terdapat zona bening. Mensterilkan jarum ose, lalu disentuhkan pada permukaan koloni bakteri kemudian diinokulasikan pada permukaan medium MRSA yang mengandung
20
CaCO3 1%
dengan metode gores untuk mendapatkan koloni yang terpisah.
Diinkubasikan pada suhu 37OC selama 2x24 jam. Tahap pemurnian dapat dilakukan 2-3 kali, untuk lebih menyakinkan bahwa koloni yang terbentuk benarbenar murni atau tidak. III.3.6 Pengamatan Morfologi Morfologi setiap koloni tunggal yang terbentuk setelah pemurnian kemudian diamati. Pengamatan yang dilakukan meliputi bentuk koloni (shape), bentuk tepi (edge), warna (colour), permukaan koloni (elevation), dan bau (odor). a. Pengecatan Gram Pengamatan morfologi koloni dilakukan dengan teknik pewarnaan gram. Pertama-tama ulasan bakteri dibuat pada gelas objek dan dilakukan fiksasi. Sebanyak 2-3 tetes gram A (kristal violet) diteteskan pada koloni bakteri, diamkan selama 60 detik. Kemudian preparat dicuci dengan menggunakan air mengalir lalu dikeringanginkan. Sebanyak 2-3 tetes gram B (larutan lugol) diteteskan di atas preparat dan dibiarkan selama 60 detik. Preparat dicuci dengan air mengalir lalu dikeringanginkan. Preparat kemudian ditetesi 2-3 tetes larutan alkohol-aseton dan dibiarkan selama 60 detik lalu dicuci kembali dan dikeringanginkan. Selanjutnya preparat ditetesi dengan larutan safranin sebanyak 2-3 tetes dan didiamkan selama 60 detik, lalu dicuci dan dikeringanginkan. Setelah itu diamati di bawah mikroskop. III.3.7 Pembuatan Stok Bakteri Setiap koloni tunggal yang berbeda dan terbentuk setelah pemurnian kemudian masing-masing diinokulasikan pada medium MRSA miring untuk persiapan pengujian selanjutnya.
21
III.3.8 Uji Probiotik a. Uji Ketahannan Terhadap Keasaman Lambung (pH) Menurut Djide dan Wahyuddin (2008), uji ketahanan terhadap asam dilakukan dengan menggunakan medium MRSB yang ditambahkan dengan HCl 0,1 N untuk mendapatkan pH 2,5-3 (sesuai dengan pH lambung). Sebanyak 1 ose (ose bulat) masing-masing isolat bakteri yang diambil dari stok kultur kemudian diinokulasikan pada medium MRSB-HCl. Diinkubasi selama 2x24 jam pada suhu 37OC. Hasil positif apabila terjadi pertumbuhan bakteri pada medium MRSB-HCl, dan hasil negatif apabila tidak terjadi pertumbuhan bakteri pada medium MRSBHCl. b. Uji Ketahanan Terhadap Garam Empedu Medium MRSB ditambahkan dengan garam empedu sintetik (ox bite), dengan konsentrasi 1% dan 5%. Sebanyak 1 ose (ose bulat), masing-masing isolat bakteri yang diambil dari stok kultur diinokulasikan pada medium MRSB-garam empedu, lalu inkubasi selama 2-3 x24 jam pada suhu 37OC (Djide dan Wahyuddin, 2008). Hasil diperoleh dari perbandingan jumlah koloni bakteri yang tumbuh sebelum dan sesudah inkubasi. III.3.9 Uji Fisiologis Probiotik a. Uji Ketahanan Temperatur (Suhu) Sebanyak 1 ose (ose bulat), masing-masing isolat bakteri yang diambil dari stok kultur diinokulasikan pada medium MRSB dalam tabung reaksi. Selanjutnya diinkubasi pada suhu 15OC, 37OC, dan 45OC selama 2 x 24 jam. Hasil positif apabila terjadi pertumbuhan bakteri pada medium dan hasil negatif apabila tidak terjadi pertumbuhan bakteri pada medium.
22
III.3.10 Uji Biokimia a. Uji MR (Methyl Red) Sebanyak 1 ose (ose bulat) isolat bakteri diambil dari stok kultur dan diinokulasikan pada medium MR-VP cair dalam tabung reaksi. Selanjutnya diinkubasi selama 5x24 jam pada suhu 37OC. Sebanyak 5 tetes methyl-red ditambahkan di atas preparat isolat bakteri. Hasil positif apabila terbentuk kompleks berwarna merah muda sampai merah yang menandakan bahwa mikroba tersebut menghasilkan asam. b. Uji VP (Voges Proskauer) Sebanyak 1 ose (ose bulat) isolat bakteri diambil dari stok kultur dan diinokulasikan pada medium MR-VP cair dalam tabung reaksi. Selanjutnya diinkubasi selama 3x24 jam pada suhu 37OC. Medium kemudian ditambahkan 0,2 mL KOH 40% dan 0,6 mL alfanaftol lalu dikocok selama 30 detik. Hasil positif jika medium berubah warna lembayung. c. Uji Motilitas Sebanyak 1 ose (ose lurus) isolat dari stok kultur lalu diinokulasikan dengan cara ditusuk pada medium SIM tegak, lalu diinkubasi pada suhu 37OC selama 2x 24 jam. Hasil positif (motil) apabila terdapat rambatan-rambatan di sekitar bekas tusukan jarum pada medium dan hasil negatif (non motil) bila tidak terdapat rambatan-rambatan disekitar bekas tusukan jarum ose pada medium. d. Uji Katalase Isolat bakteri diambil sebanyak 1 ose (ose bulat) dari masing-masing stok kultur kemudian dicelupkan ke dalam reagen H2O2 yang telah diisi ke dalam
23
tabung reaksi. Hasil positif apabila terbentuk gelembung gas pada ose, dan hasil negatif apabila tidak terbentuk gelembung gas. e. Uji TSIA (Triple Sugar Iron Agar) Isolat bakteri diambil sebanyak 1 ose (ose lurus) dari masing-masing stok kultur kemudian diinokulasikan dengan cara ditusukkan pada medium TSIA. Kemudian diambil lagi 1 ose (ose bulat) isolat bakteri dari masing-masing stok kultur dan digores pada permukaan medium. Selanjutnya diinkubasi selama 23x24 jam pada suhu 37OC. Perubahan yang diamati setelah inkubasi adalah warna medium menjadi kuning menandakan asam, warna medium menjadi lebih merah menandakan medium menjadi basa, warna menjadi hitam menandakan terbentuknya H2S dan bila medium terangkat menandakan bahwa mikroba tersebut mampu untuk memproduksi gas. III. 3. 11. Uji Daya Hambat Terhadap Bakteri Patogen Untuk mengetahui bahwa isolat bakteri mempunyai potensi yang bagus sebagai bakteri probiotik maka perlu dilakukan uji daya hambat terhadap bakteri patogen. Bakteri patogen yang digunakan adalah Staphylococcus aureus (bakteri gram positif) dan Escherichia coli (bakteri gram negatif). Langkah awal yang perlu dilakukan adalah menginokulasi 1 ose (ose bulat) isolat dari stok kultur pada medium MRSA (Man Ragosa Sharpe Agar) miring dan diinkubasi selama 1x24 jam pada suhu 37°C. Hal yang sama dilakukan terhadap bakteri uji (Staphylococcus aureus dan Escherichia coli) yang diinokulasikan pada medium NA (Nutrien Agar) miring dan diinkubasikan selama 1x24 jam pada suhu 37°C. Setelah diinkubasi, 5 ml aquades steril ditambahkan ke dalam inokulum kemudian divortex agar koloni bakteri yang menempel pada
24
permukaan medium dapat larut. Suspensi bakteri kemudian dipindahkan ke cuvet lalu dilakukan spektrofotometri untuk mendapatkan keadaan 25%T dalam sampel dimana aquades digunakan sebagai blanko. Sebanyak 1 ml masing-masing isolat Staphylococcus aureus dan Escherichia coli diinokulasikan pada medium pada medium NA dengan metode tuang dan dibiarkan memadat. Sementara itu siapkan paper disk steril lalu direndam dalam masing-masing suspensi isolat probiotik selama 10 menit. Kemudian paper disk diletakkan di permukaan medium NA yang telah memadat, lalu diinkubasi selama 2x24 jam pada suhu 37°C. Diameter zona bening yang terbentuk diukur dengan menggunakan jangka sorong.
25
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolasi bakteri probiotik asam laktat dilakukan dengan menggunakan medium MSRA + CaCO3 1% dan dilakukan inkubasi selama 2x24 jam. Setelah inkubasi diperoleh koloni-koloni yang memperlihatkan zona bening disekitar koloni. Isolasi koloni bakteri yang memiliki zona bening di sekitarnya diambil dari pengenceran 10-3 karena pada pengenceran ini koloni-koloni sudah terpisah seperti yang terlihat pada gambar di bawah ini.
G
C
H F
D E B
A
Gambar 1 . Isolat Bakteri A-H Hasil Isolasi Bakteri Probiotik dari Saluran Pencernaan Itik Pedaging Berdasarkan hasil isolasi diperoleh 8 koloni yang memperlihatkan zona bening pada medium MRSA + CaCO3 1%. Menurut Rahayu dan Margino (1997), bakteri asam laktat memiliki sifat fisiologis yang sangat bervariasi. Medium yang
26
direkomendasikan untuk menumbuhkan bakteri asam laktat adalah medium MRSA (Man Rogosa Sharpe Agar) yang merupakan medium selektif untuk menumbuhkan bakteri asam laktat. Sedangkan penambahan CaCO3 1% bertujuan untuk menyeleksi bakteri asam laktat yang tumbuh pada medium maka setelah inkubasi 1 x 24 jam akan terlihat zona bening di sekitar koloni bakteri yang tumbuh. Hal ini disebabkan karena dalam masa pertumbuhannya selama inkubasi bakteri asam laktat menghasilkan asam laktat yang bereaksi dengan CaCO3 yang tidak larut di dalam medium sehingga membentuk kalsium laktat yang larut, dengan menunjukkan adanya daerah atau zona bening disekitar koloni bakteri yang tumbuh (Djide dan Sartini, 2008). Selanjutnya dilakukan pemurnian pada kedelapan koloni, kemudian dilakukan pengamatan morfologi koloni. Adapun ciri-ciri morfologi dari kedelapan koloni yang berhasil diperoleh, dapat dilihat dari pada tabel 1 di bawah ini. Tabel 1. Morfologi Koloni Isolat Bakteri Probiotik yang Diperoleh
A B C D E
Bentuk Bulatan kecil Bulatan kecil Bulatan Besar Bulatan kecil Bulatan Besar
Tepi Rata Rata Rata Rata Rata
Bentuk Koloni Bentuk permukaan Cembung Cembung Cembung Cembung Cembung
F
Bulatan kecil
Rata
Cembung
G H
Bulatan Besar Bulatan kecil
Rata Rata
Cembung Cembung
Isolat
Warna Putih Putih Putih Putih Putih Putih Kekuningan Putih Putih
Bau Berbau Berbau Berbau Berbau Berbau Berbau Berbau Berbau
Setelah diperoleh kultur murni dari kedelapan isolat bakteri yang diinginkan, maka selanjutnya dibuat dalam stok bakteri dalam agar miring untuk persiapan uji-uji yang akan dilakukan. 27
Pengamatan morfologi bakteri probiotik asam laktat dilakukan dengan pengecatan Gram. Hasil dari pengecatan Gram dapat dilihat dari gambar 2 dan tabel 2 berikut.
Isolat A
Isolat B
Isolat C
Isolat D
Isolat E
Isolat F
Isolat G
Isolat H
Gambar 2. Hasil Pengamatan Pengecatan Gram dengan Perbesaran 100x10
28
Tabel 2. Hasil Pengecatan Gram dan Karakteristik Isolat Berdasarkan pertumbuhan isolat pada kondisi pH, garam empedu, dan Suhu yang berbeda.
Nama Isolat A B C D E F G H
Pengecatan Gram Bentuk Gram Basil Positif Coccus Negatif Basil Positif Coccus Negatif Coccus Positif Coccus Positif Coccus Positif Coccus Positif
Karakteristik Ketahanan Ketahanan Ketahanan Suhu Asam (pH) Garam Empedu (OC) 2,5 3 1% 5% 15 37 45 +++ +++ +++ +++ + +++ ++ +++ +++ ++ +++ + +++ ++ +++ +++ +++ +++ + +++ ++ + + ++ ++ + ++ + ++ ++ + + + ++ + ++ ++ + + + ++ + + ++ ++ + + ++ + +++ +++ +++ +++ + +++ ++
Keterangan :Coccus = bulat, basil = batang; +++ = sangat keruh dan banyak endapan, ++ = keruh dan cukup banyak endapan, + = tidak keruh dan sedikit endapan.
Berdasarkan pewarnaan Gram, dapat pula diketahui sifat dinding sel bakteri terhadap cat pewarna kristal violet dan safranin. Bakteri yang menyerap Gram A (Kristal violet) akan tetap berwarna ungu setelah pelunturan dengan Gram C (Alkohol aseton) disebut Bakteri Gram positif , sedangkan bakteri yang warna ungunya luntur pada pencucian dengan alkohol, akan menyerap zat warna Gram D (Safranin) sehingga akan berwarna merah muda disebut Bakteri Gram negatif (James, et al., 2008). Menurut Campbell, et al. (2003), struktur dinding sel akan menentukan respon pewarnaan. Bakteri diwarnai dengan suatu zat warna violet dan yodium, dibilas dengan alkohol dan kemudian diwarnai sekali lagi dengan zat warna merah. Bakteri Gram Positif yang sebagian besar dinding selnya mengandung peptidoglikan akan menjerat warna violet. Bakteri Gram Negatif memiliki lebih sedikit peptidoglikan, yang terletak di suatu gel periplasmik antara membran plasma dan suatu membran bagian luar. Zat warna violet yang digunakan dalam
29
pewarnaan gram sangat mudah dibilas dari bakteri gram negatif, akan tetapi selnya tetap menahan zat warna merah. Berdasarkan hasil pewarnaan gram diperoleh 2 macam bentuk yaitu Basil (Batang) yaitu isolat A dan C, serta bentuk Coccus (Bulat) yaitu isolat B, D, E, F, G, dan H. Menurut Surono (2004) bakteri asam laktat ada yang berbentuk Batang (Basil)
dan ada pula yang berbentuk bulat (Coccus). Dari pewarnaan gram
diperoleh pula sifat gram isolat yaitu isolat A, C, E, F, G, dan H bersifat gram positif, sedangkan isolat B dan D memiliki sifat gram negatif. Menurut Cullimore (2000) bakteri asam laktat memiliki sifat gram positif tetapi ada juga yang bersifat bipolar (gram positif dan gram negatif ) yang kemungkinan terjadi akibat granulasi dalam sel dan faktor umur kultur. Bakteri probiotik harus mampu bertahan dalam menghadapi rintanganrintangan dalam saluran pencernaan agar dapat mencapai usus halus dalam keadaan tetap hidup serta dalam jumlah yang cukup memadai untuk berkembang biak dan menyeimbangkan mikrobiota dalam usus (Surono, 2004). Kondisi saluran pencernaan erat kaitannya dengan pH yang berbeda beda. Salah satu faktor yang menonjol dalam menentukan kadar pH dalam saluran pencernaan adalah keasaman asam lambung. Kondisi keasaman lambung berfungsi sebagai pintu gerbang pertama untuk melakukan seleksi mikroba sebelum masuk ke usus (Khan dan Wiyana, 2011). Dari hasil uji terhadap kadar keasaman (pH), terlihat bahwa kedelapan isolat mampu tumbuh pada medium yang memiliki derajat keasaman (pH) 2,5-3. Hal ini terlihat dari koloni bakteri yang tumbuh pada dasar tabung reaksi dan kondisi media yang keruh. Isolat A, B, C, dan H menunjukkan pertumbuhan yang
30
bagus dilihat dari adanya banyak endapan pada tabung. Sedangkan isolat D, E, F, dan G menunjukkan hasil yaitu media menjadi agak keruh pada pH 2,5 dan 3. Semua isolat baik yang bersifat Gram positif ( A, C, E, F, G, dan H) maupun Gram negatif (B dan D), mampu tumbuh pada kadar pH 2,5 dan 3. Hasilnya dapat dilihat pada gambar berikut.
A
B C
D (1)
E
F
G
H
A
B C
D
E
F
G H
(2)
Gambar 3. Hasil Pengamatan Uji Terhadap Keasaman (pH) (1) MRSB dengan pH 2,5 (2) MRSB dengan pH 3 Uji probiotik terhadap ketahanan pH menurut Djide dan Wahyudi (2008) dilakukan dengan menggunakan medium MRSB yang ditambah HCl 0,1 N untuk mendapatkan pH 2,5-3 (sesuai pH lambung). Berdasarkan hasil pengujian isolat bakteri probiotik mampu tumbuh pada pH 2,5-3. Hal ini membuktikan isolat BAL tersebut mampu untuk melewati asam lambung sehingga dapat dimanfaatkan sebagai bakteri probiotik. pH medium biakan mempengaruhi kecepatan pertumbuhan, untuk pertumbuhan bakteri juga terdapat rentang pH dan pH optimal. Meskipun medium pada awalnya dikondisikan dengan pH yang
31
dibutuhkan untuk pertumbuhan, tetapi secara bertahap pertumbuhan akan dibatasi oleh produk metabolit yang dihasilkan oleh mikroorganisme tersebut. Bakteri asam laktat mampu mempertahankan pH intraseluler lebih alkali daripada pH ekstraseluler, tetapi penurunan pH intraseluler tetap berlangsung seiring dengan menurunnya pH ekstraseluler yang mendukung toleransinya terhadap asam (Siegumfeldt et al., 2000). Bakteri dapat menurunkan pH intraseluler sekitar menjadi netral pada saat pH ekstraseluler turun, tetapi akan menggunakan banyak energi karena perbedaan gradien proton yang besar dan mengakibatkan terjadinya akumulasi anion asam organik dalam sitosol yang beracun bagi sel (Russel, 1992). Untuk menguji potensi bakteri asam laktat sebagai bakteri probiotik, bakteri asam laktat tidak hanya harus tahan terhadap pH rendah, akan tetapi juga harus tahan terhadap garam empedu. Menurut Russel (1992), ketahanan terhadap derajat keasaman dan garam empedu merupakan ciri yang penting bagi bakteri asam laktat sebab menentukan aktivitasnya dalam saluran pencernaan, terutama di saluran usus bagian atas tempat empedu disekresikan. Kemampuan kultur probiotik meningkatkan kolonisasi laktobasili pada bagian atas usus dapat mengendalikan pertumbuhan patogen usus yang memasuki sistem pencernaan. Berdasarkan hasil pengujian ketahanan bakteri asam laktat terhadap garam empedu sintetik, setalah 1x24 jam terlihat adanya endapan pada dasar tabung pada isolat A,B,C,dan H, sedangkan pada isolat D, E, F, dan G medium menjadi lebih keruh. Hal ini menadakan bahwa terjadi pertumbuhan bakteri pada medium MRSB yang telah ditambahi garam empedu sintetik 1 % dan 5 %, seperti yang terlihat pada gambar di bawah ini.
32
D
C
B
A
H
G
F
E
(a)
D
C
B
A
H
G
F
E
(b) Gambar 4. Hasil Pengamatan Uji Terhadap Garam Empedu (a) MRSB + Garam Empedu Sintetik 1% (b) MRSB + Garam Empedu Sintetik 5% Dari hasil pengujian diperolah data bahwa isolat A, B, C, dan H menunjukkan pertumbuhan pada kadar garam empedu sintetik 1%, dan adanya endapan pada dasar tabung menunjukkan bahwa isolat tersebut bersifat anaerob. Isolat D, E, F, dan G juga mampu untuk tumbuh pada kadar garam empedu sintetik 1% vdan 5% dan membuat media menjadi keruh tanpa endapan. Hal ini menunjukkan bahwa isolat tersebut tersuspensi pada media sehingga memiliki sifat anaerob fakultatif. Semua isolat baik yang bersifat Gram positif maupun Gram negatif, mampu tumbuh pada kadar garam empedu 1% dan 5%. Menurut Dwyana dan Gobel (2011), pertumbuhan bakteri dalam tabung memperlihatkan perbedaan respon terhadap oksigen atmosferik, bila bakteri berkumpul di permukaan tabung makan bersifat aerob, bila bakteri berkumpul di dasar tabung maka bersifat anaerob, namun apabila bakteri tersuspensi merata pada media dalam tabung maka bersifat anaerob fakultatif. Surono (2004)
33
mengemukakan bahwa baktero probiotik bersifar anaerob sampai anaerob fakultatif. Penelitian
yang
dilakukan
oleh
Djide
dan
Wahyudin
(2008),
membuktikan bahwa isolat bakteri asam laktat mampu tumbuh pada medium yang telah ditambahkan garam empedu sintetik 1 % dan 5%. Hal ini berarti bahwa isolat BAL tersebut mampu melewati saluran pencernaan dimana terdapat garam empedu yang disekresikan oleh hati sehingga dapat digunakan sebagai bakteri probiotik. Garam empedu berpengaruh terhadap permeabilitas sel bakteri (Kusumawati, et al., 2003). Bakteri yang tidak tahan terhadap garam empedu diduga mengalami permeabilitas membran sel sehingga mengalami kebocoran materi intraselular yang besar dan menyebabkan lisisnya sel. Garam empedu memiliki sifat sebagai senyawa aktif permukaan sehingga dapat menembus dan bereaksi dengan sisi membran sitoplasma yang selanjutnya menyebabkan perubahan dan kerusakan struktur membran. Keragaman struktur asam lemak pada membran sel bakteri menyebabkan perbedaan permeabilitas dan diduga akan mempengaruhi ketahan bakteri terhadap garam empedu (Kusumawati, et al., 2003). Salah
satu
faktor
penting
yang
mempengaruhi
pertumbuhan,
perbanyakan dan daya tahan bakteri yaitu suhu. Berdasarkan hasil pengamatan terlihat bahwa kedelapan isolat mampu tumbuh pada suhu 15OC, 37OC, dan 45OC. Akan tetapi pertumbuhan terlihat lebih baik pada suhu 37OC sehingga dapat dikatakan bahwa isolat probiotik BAL baik yang bertipe Gram positif maupun
34
tipe Gram negatif bersifat termofilik. Hasil pengujian terhadap beberapa kondisi suhu yang diberikan dapat dilihat pada gambar berikut.
D
E
G
F
A
B
C
H
(a)
A
B C
H
D
E
F G
(b)
D
E
F
G
A
B
C H
(c) Gambar 5. Hasil Uji Temperatur/Suhu (a) Inkubasi pada Suhu 37 OC, (b) Inkubasi pada Suhu 45 OC (c) Inkubasi pada Suhu 15 OC
35
Bakteri asam laktat dibagi atas dua kelompok berdasarkan suhu, yaitu mesofilik, yang tumbuh optimum pada suhu 25OC dan tumbuh maksimum pada rentang suhu 37- 40 OC, dan termofilik yang tumbuh optimum pada suhu 37- 45 O
C, dan suhu maksimumnya adalah 45- 52 OC (Saruno, 2004). Uji MR (Methyl Red) merupakan uji yang digunakan untuk menentukan
adanya fermentasi asam campuran oleh bakteri. Dari hasil penelitian terlihat bahwa semua isolat positif terhadap uji MR baik itu pada isolat probiotik BAL Gram positif maupun Gram negatif. Hasil positif ditandai dengan berubahnya warna medium dari kuning menjadi kemerah-merahan setelah ditetesi reagen Methyl Red. Pada penelitian yang telah dilakukan oleh Fadlya (2008) diketahui bahwa isolat BAL yang diperoleh dari beberapa sumber menunjukkan hasil yang positif terhadap uji MR yang ditandai dengan adanya perubahan warna medium dari kuning menjadi merah. Hal ini berarti bahwa isolat tersebut dapat memfermentasikan karbohidrat menghasilkan asam campuran seperti yang terlihat pada gambar berikut.
F
G
E
D
A
B
C
H
Gambar 6. Hasil Uji MR (Methyl Red)
36
Bila suatu bakteri memfermentasikan glukosa di dalam medium MR-VP, produk yang dihasilkan biasanya asam laktat, asam asetat, asam suksinat, dan asam format. Akumulasi dari asam-asam ini dapat menurunkan pH sampai 5 atau kurang. Bila idikator merah (Methyl Red) ditambahkan pada biakan tersebut, maka medium yang mengandung asam-asam tersebut akan merubah warna medium menjadi merah. Hal ini menandakan bahwa mikroorganisme ini merupakan penghasil asam campuran. Menurut Raihana (2011), hasil uji dinyatakan negatif apabila tidak terbentuk cincin merah atau medium berubah menjadi warna merah dan mengindikasikan bahwa sangat sedikit atau tidak ada asam organik yang tersisa di medium. Uji VP (Voges Preskauer) digunakan untuk membedakan antara organisme yang menghasilkan asam dalam jumlah yang besar dan yang menghasilkan produk netral seperti asetilmetilkarbonil (asetoin) dari hasil metabolisme glukosa. Produk netral ini membuat bakteri dapat memfermentasi karbohidrat dalam jumlah yang besar. Adanya kandungan asetoin yang diproduksi dalam larutan ditandai dengan perubahan warna larutan dari kuning menjadi merah muda hingga merah tua. Ini juga digunakan untuk mengidentifikasi mikroorganisme yang dapat menfermentasi karbohidrat menjadi 2,3-butadiol sebagai produk utama, dan akan terjadi penumpukan bahan tersebut dalam medium pertumbuhan. Penambahan 40% KOH dan 5% α-naftol dalam etanol dapat menentukan adanya asetoin (asetilmetilkarbonil) yakni suatu senyawa awal dalam sintesis 2,3-butanadiol. Pada penambahan KOH, adanya asetoin ditunjukkan oleh perubahan warna kaldu menjadi merah muda. Perubahan warna ini diperjelas dengan penambahan α-
37
naftol. Perubahan warna kaldu biakan lebih jelas pada bagian yang berhubungan dengan udara, karena sebagian 2,3-butanadiol dioksidasikan kembali menjadi asetoin sehingga memperjelas hasil reaksi. Berikut adalah hasil pengamatan uji VP untuk kedelapan isolat bakteri probiotik BAL dapat dilihat pada gambar di bawah ini.
A
B
C
H
F
G
E
D
Gambar 7. Hasil Uji VP (Voges Preskauer) Uji VP merupakan uji tidak langsung untuk mengetahui adanya 2,3butanadiol karena dalam uji ini yang terdeteksi adalah pembentukan asetoin. Namun karena asetoin merupakan senyawa awal dalam pembentukan 2,3-butadiol dan selalu diperoleh secara serentak, sehingga uji VP dapat digunakan untuk menentukan adanya 2,3-butadiol (Lay, 1994). Hasil penelitian menunjukkan isolat Gram positif yaitu isolat A, C, E, G, dan H serta isolat Gram negatif yaitu isolat B menunjukkan hasil yang negatif terhadap uji VP. Hal ini terlihat dengan tidak berubahnya warna medium setelah ditambahkan larutan indikator KOH 40% dan alfanaftol 5%. Hasil negatif ini menunjukkan bahwa ke-6 isolat tersebut tidak menghasilkan 2,3-butanadiol
38
ataupun asetoin. Kalaupun ada, jumlahnya tidak mencukupi untuk mengubah warna medium setelah ditambahkan indikator. Kedua isolat lainnya yaitu isolat D (Gram Negatif) dan F (Gram positif) menunjukkan hasil yang positif, dengan terbentuknya komplek warna lembayung pada medium. Hal ini membuktikan bahwa isolat tersebut menghasilkan 2,3-butanadiol atau asetoin. Hasil penelitian yang telah dilakukan Fadlya (2008), isolat BAL yang diisolasi dari beberapa sumber menunjukkan hasil yang negatif terhadap uji VP. Tabel 3. Hasil uji TSIA, MR-VP, Motilitas, dan Katalase Nama Isolat A B C D E F G H
Slant Kuning Kuning Kuning Kuning Kuning Kuning Kuning Kuning
Uji TSIA Butt Gas Kuning Kuning Kuning Kuning Kuning Kuning Kuning Kuning -
H2 S -
Uji MR Merah Merah Merah Merah Merah Merah Merah Merah
Uji VP
Motilitas
Katalase
Kuning Kuning Kuning Lembayung Kuning Lembayung Kuning Kuning
-
-
Motilitas merupakan kemampuan suatu mikroba bergerak sendiri (Volk, 1988). Sifat motilitas pada bakteri dapat dilihat dengan pertumbuhan yang menyebar disekeliling tempat penusukan kultur atau adanya penyebaran yang berwarna putih seperti akar disekitar inokulasi, yang berarti bahwa bakteri ini memiliki flagel (Fardiaz, 1993). Berdasarkan hasil pengamatan diketahui bahwa kedelapan baik isolat Gram positif maupun Gram negatif merupakan bakteri non-motil. Hal ini dapat dilihat dengan tidak adanya rambatan di sekitar bekas tusukan jarum ose seperti pada gambar di bawah ini.
39
A
B
C
D
E
F
G
H
Gambar 8. Hasil Uji Motilitas Hampir semua sel bakteri spiral dan sebagian sel bakteri yang berbentuk batang bersifat motil (bergerak), sedangkan bakteri yang berbentuk bulat bersifat non motil (tidak bergerak). Savadago et al. (2006) menjelaskan bahwa bakteri asam laktat terdiri dari sekelompok bakteri Gram positif, tidak membentuk spora serta berbentuk batang dan bulat yang bersifat non motil. Menurut Cullimore (2000) bakteri asam laktat bak yang bersifat Gram Positif maupun yang besifat bipolar (Gram positif dan Gram negatif) memiliki sifat non-motil. Uji katalase digunakan untuk mengetahui aktivitas katalase pada bakteri yang diuji. Kebanyakan bakteri memproduksi enzim katalase yang dapat memecah H2O2 menjadi H2O dan O2. Enzim katalase diduga penting untuk pertumbuhan aerobik karena H2O2 yang dibentuk dengan pertolongan berbagai enzim respirasi bersifat racun terhadap sel mikroba. Berikut ini adalah hasil uji katalae terhadap isolat bakteri probiotik terlihat pada gambar di bawah ini.
40
C
A
D
H
B
E
F
G
Gambar 9. Hasil Uji Katalase Hasil uji menunjukkan bahwa kedelapan isolat baik isolat Gram positif maupun Gram negatif menunjukkan hasil yang negatif terhadap uji katalase. Hal ini dibuktikan dengan tidak terbentuknya gelembung udara (O2) pada saat isolat dimasukkan ke dalam larutan H2O2. Djide dan Sartini (2008) mengemukakan bahwa dari hasil uji biokimia berupa uji katalase terhadap bakteri asam laktat menunjukkan hasil yang negatif. Mekanisme enzim katalase memecah H2O2 yaitu saat melakukan respirasi, bakteri menghasilkan berbagai macam komponen salah satunya H2O2. Bakteri yang memiliki kemampuan memecah H2O2 dengan enzim katalase maka segera membentuk suatu sistem pertahanan dari toksik H2O2 yang dihasilkannya sendiri. Bakteri katalse positif akan memecah H2O2 menjadi H2O dan O2 dimana parameter yang menunjukkan adanya aktivitas katalase tersebut adalah adanya gelembung-gelembung oksigen. Bakteri katalase negatif tidak menghasilkan gelembung-gelembung. Hal ini berarti H2O2 yang diberikan tidak dipecah oleh bakteri katalase negatif sehingga tidak menghasilkan oksigen. Bakteri katalase negatif tidak memiliki enzim katalase yang mengurai H2O2.
41
Uji TSIA (Triple Sugar Iron Agar) menurut Russel (1992) umumnya digunakan terutama untuk mengidentifikasi Enterobacteriaceae dengan bakteri saluran pencernaan yang bersifat gram negatif yang lain dilihat dari kemampuannya dalam mengkatabolisme glukosa, laktosa, atau sukrosa dan membebaskan sulfida dari FeSO4 (Harley dan Prescott, 2002). Dalam medium TSIA mengandung 3 macam gula (glukosa, laktosa, dan sukrosa), indikator merah dan ferosulfat (Lay, 1994). Pada uji TSIA dapat diketahui terjadinya fermentasi glukosa, laktosa, dan/atau sukrosa, produksi gas dari glukosa, dan produksi hidrogen sulfida (H2S). Tabel 4 : Identifikasi Hasil Fermentasi Bakteri pada Medium TSIA (Fadlya, 2008) : Agar Miring (Slant) Merah (basa) Kuning (asam)
Agar Tegak (Butt) Kuning (asam) Kuning (asam)
Kuning (asam) Merah (basa)
Merah (basa) Marah (basa)
Katerangan Hanya glukosa yang difermentasi Glukosa, laktosa, dan/atau sukrosa difermentasi Laktosa dan sukrosa difermentasi Ketiga gula tidak difermentasi
Pembentukan H2S dapat diamati dengan terbentuknya warna kehitaman pada bekas goresan, dan pembentukan gas dapat dilihat dengan terbentuknya rongga pada bagian bawah agar (Fadlya, 2008). Hasil uji menunjukkan bahwa pada bagian Slant dan Butt medium TSIA kedelapan isolat setelah inkubasi 1x24 jam menunjukkan warna kuning yang berarti besifat asam. Hal ini menandakan telah terjadi fermentasi glukosa, laktosa, dan atau sukrosa pada isolat Gram positif maupun Gram negatif, karena sukrosa dan laktosa memiliki konsentrasi yang lebih tinggi sehingga dapat dimanfaatkan sebagai bahan fermentasi selanjutnya jika glukosa habis dan akan menghasilkan asam yang ditandai dengan warna kuning pada media setelah inkubasi 24 jam. Malaka dan Laga (2005) menjelaskan
42
bahwa ada jenis bakteri asam laktat yang mampu untuk menfermentasi ketiga jenis gula yang terdapat dalam medium TSIA, yaitu glukosa, laktosa, dan sukrosa. Berikut adalah gambar hasil uji TSIA.
A
B
C
H
G
E
F
D
Gambar 10. Hasil Uji TSIA (Triple Sugar Iron Agar) Hasil uji menunjukkan bahwa pada bagian Slant dan Butt medium TSIA kedelapan isolat setelah inkubasi 1x24 jam menunjukkan warna kuning yang berarti besifat asam. Hal ini menandakan telah terjadi fermentasi glukosa, laktosa, dan atau sukrosa pada isolat Gram positif maupun Gram negatif, karena sukrosa dan laktosa memiliki konsentrasi yang lebih tinggi sehingga dapat dimanfaatkan sebagai bahan fermentasi selanjutnya jika glukosa habis dan akan menghasilkan asam yang ditandai dengan warna kuning pada media setelah inkubasi 24 jam. Malaka dan Laga (2005) menjelaskan bahwa ada jenis bakteri asam laktat yang mampu untuk menfermentasi ketiga jenis gula yang terdapat dalam medium TSIA, yaitu glukosa, laktosa, dan sukrosa. Untuk melihat kemampuan ke delapan isolat bakteri probiotik asam lakat dalam menghambat pertumbuhan bakteri patogen maka dilakukan uji daya
43
hambat terhadap bakteri patogen tersebut. Bakteri uji yang digunakan yaitu Escherichia coli (Gram negatif) dan Staphylococcus aureus (Gram Positif) dengan waktu inkubasi selama 2 x 24 jam untuk mengetahui kemampuannya dalam menghambat pertumbuhan bakteri patogen (antibakteri) apakah bakteri probiotik yang diuji bersifat bakteriostatik atau bakteriosida. Bakteri asam laktat (BAL) biasanya memproduksi bakteriosin yang merupakan peptida dengan sifat sebagai antibakteri yang menyerang suatu strain. Bakteriosin mampu meningkatkan kemampuan dari BAL terhadap pencegahan dari pertumbuhan bakteri yang berbahaya disamping karena menghasilkan lingkungan yang asam bagi bakteri lain (Jeevaratnam, et al., 2003). Surono (2004) menjelaskan bahwa beberapa jenis bakteri asam laktat menghasilkan bakteriosin, suatu peptida yang bersifat antibakteri, toksin yang berupa protein yang dapat mencegah pertumbuhan bakteri. Tabel 5 : Hasil Pengukuran Zona Bening Pada Uji Daya Hambat
Nama Isolat A B C D E F G H
Diameter Zona Hambat (mm) Escherichia coli Staphylococcus aureus 1 x 24 jam 2 x 24 jam 1 x 24 jam 2 x 24 jam 9,51 10,50 10,92 12,01 9,03 14,01 9,21 9,69 9,11 10,20 9,02 9,07 12,02 12,50 10,50 10,50 12,32 24,89 8,93 9,03 11,50 11,93 9,50 10,23 8,04 17,05 9,55 10,12 8,00 9,03 8,47 9,50
Secara umum bakteriosin dihasilkan selama masa tumbuh cepat (Exponential growth phase) pada siklus pertumbuhan mikroba, namun nisin dihasilkan dalam jumlah besar setelah sel mencapai fase stasioner. Nisin merupakan bahan antimikroba yang berperan menghambat pertumbuhan bakteri 44
gram positif termasuk pembentuk spora. Hasil uji menunjukkan bahwa kedelapan isolat probiotik Bal baik yang bersifat Gram positif maupun Gram negatif, mampu menghambat pertumbuhan bakteri patogen. Hal ini dapat dilihat dengan terbentuknya zona bening disekitar paper disk yang sebelumnya telah direndam dalam suspensi isolat. Akan tetapi menurut Tagg et al. (1976) dalam Surono (2004) kriteria bakteriosin (antimikroba) yang dihasilkan oleh bakteri gram positif yaitu, suatu jenis protein, bersifat bakteriosidal tidak hanya bakteriostatik, mencegah pertumbuhan bakteri sejenis, dan mempunyai tempat perlekatan yang spesifik bagi patogen, yang membedakannya dengan senyawa antimikroba lainnya. Dari tabel 5 diatas dapat dilihat bahwa, sebagian besar isolat bersifat bakteriosidal yaitu kemampuan untuk menghasilkan bakteriosin yang membunuh bakteri lain, dan sebagian kecil bersifat bakteriostatik yaitu kemampuan yang hanya dapat menghambat pertumbuhan bakteri lain. Pada uji terhadap Escherichia coli semua isolat bakteri memiliki kemampuan untuk menghasilkan bakteriosida, yang dilihat dari bertambahnya ukuran zona bening dari 1x24 jam ke 2x24 jam. Isolat E memiliki daya hambat yang paling besar terhadap Escherichia coli yaitu 12,32 mm pada inkubasi 1x24 jam dan 24,89 mm pada inkubasi 2x24 jam. Sedangkan untuk Staphylococcus aureus semua isolat memiliki kemampuan bakteriosidal, kecuali isolat D yang memiliki ukuran zona bening yang sama besarnya pada 1x24 jam dan 2x24 jam. Hal ini menunjukkan bahwa sisolat D hanya berkemampuan untuk menghambat pertumbuhan Staphylococcus aureus (bakteriostatik). Pada uji daya hambat terhadap Staphylococcus aureus isolat A
45
memiliki zona bening yang paling besar yaitu 10,92 mm pada inkubasi 1x24 jam dan 12,01 mm pada inkubasi 2x24 jam. Hasil uji daya hambat pada penelitian ini sesuai dengan Surono (2004) yang menyatakan bahwa kebanyakan bakteriosin yang dihasilkan oleh probiotik bersifat bakterisidal yaitu membunuh bakteri dan bukan hanya menghambat, sebagai akibat dari hilangnya kemampuan potensi membran.
46
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN
V.1 Kesimpulan Berdasarkan hasil isolasi dan karakterisasi yang dilakukan dalam penelitian dapat disimpulkan bahwa : 1. Hasil isolasi bakteri probiotik dari saluran pencernaan itik pedaging Anas domesticus diperolah 8 isolat. 2. Keseluruhan isolat tersebut menunjukkan karakteristik bakteri probiotik asam laktat seperti bersifat Gram positif (isolat A, C, E, F, G, dan H) maupun Gram negatif (isolat B dan D). Isolat probiotik BAL yang berbentuk batang (basil) yaitu isolat A dan C tergolong genus Lactobacillus dan isolat probiotik BAL yang berbentuk bulat (coccus) yaitu isolat B, D, E, F, G, dan H tergolong genus Streptococcus atau Diplococcus. 3. Semua isolat tergolong Bakteri Probiotik BAL, baik yang bersifat Gram positif maupun yang bersifat Gram negatif, memiliki kemampuan untuk menghasilkan senyawa yang mampu untuk membunuh bakteri patogen sehingga bersifat bakterisidal. V.2 Saran Bakteri probiotik yang telah didapatkan dapat digunakan untuk penelitianpenelitian selanjutnya seperti pengaplikasiannya terhadap industri pakan peternakan unggas sebagai pakan probiotik.
47
DAFTAR PUSTAKA
Adams, C. 2009. Probiotics - Protection Against Infection: Using Nature's Tiny Warriors To Stem Infection. Available at: http://probiotic.org/ lactobacillus-rhamnosus.htm. Opened : Nopember 24, 2010. Begley, M., C. Hill, and C. G. M. Gahan. 2006. Bile Salt Hydrolase Activity in Probiotics. Appl. Environ. Microbiol. 72 (3):1729-1738. Belviso, S., M. Giordano, P. Dolci and G. Zeppa. 2009. In vitro cholesterollowering activity of Lactobacillus plantarum and Lactobacillus paracasei strains isolated from the Italian Castelmagno PDO cheese. Dairy Sci. Technol. 89 : 169-176. Budiansyah, Agus. 2004. Pemanfaatan Probiotik dalam Meningkatkan Penampilan Produksi Ternak Unggas. Prog. Pascasarjana IPB. Bogor. Campbell, N. A., Reece, J. B., dan Mitchell, L. G., 2003, Biologi, Erlangga, Jakarta. Collado, M. C., E. Isolauri, S. Salmien, and Y. Sanz. 2009. The impact of probiotic on gut health. Curr Drug Metab. 10(1):68-78. Cullimore, R.D. 2000. Principal Atlas For Bacterial Identification. Lewis Publisher. United States of America. Ditjennak, 2006, Direktorat Jendral Peternakan Republik Indonesia, Jakarta. Djide, M. N., dan Sartini, 2008, Isolasi, Identifikasi Bakteri Asam Laktat dari Kol Brassica oleracea L. dan Potensinya sebagai Antagonis Vibrio harveyi In Vitro, Torani, Vol.18 (3) : 211-216. Djide, M. N., dan Wahyudin E. 2008. Isolasi Bakteri Asam Laktat dari Air Susu Ibu, dan Potensinya dalam Menurunkan Kadar Kolesterol secara In Vitro. Majalah Farmasi dan Farmakologi. Vol. 12(3) Dommels, Y.E.M., R.A. Kemperman, Y.E.M.P. Zebregs, and R.B. Draaisma. 2009. Survival of Lactobacillus reuteri DSM 17938 and Lactobacilus rhamnosus GG in the Human gastrointestinal Tract with Daily Consumption of a Low-Fat Probiotic Spread. Appl. Environ. Microbiol. 75 (19) : 6198-204. Ducluzeau, R. Gouet, Ph. And Williams, P.E.V.. 1991 Probiotics in ruminants. In : Rumen Microbial Metabolism And Ruminant Digestion, pp. 343 –
48
346. Ed. J.P. Jouany, Institut National de La Recherche Agronomique, 147, rue de l’Universite – 75338, Paris cedex 07. Dwyana, Z. dan Gobel, R. B. 2011. Mikrobiologi Umum. Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Universitas Hasanuddin. Makassar. Fadlya, 2008, Isolasi dan Identifikasi Bakteri Proteolitik dari Limbah Tahu, Universitas Hasanuddin, Makassar. FAO/WHO. 2001. Joint FAO/WHO Expert Consultation on Evaluation of Health and Nutritional Properties of Probiotics in Food Including Powder Milk with Live Lactic Acid Bacteria. Amerian Córdoba Park Hotel, Córdoba, Argentina. FAO/WHO. 2002. Joint FAO/WHO Working Group Report on Drafting Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food. London. Fardiaz, S., 1993, Analisis Mikrobiologi Pangan, PT. Raja Grafindo Persada, Jakarta. Fuller, R., 1986. Probiotics. J.Appl. Bact., 61 : 1S - 7S. Gunawan dan M.M.S. Sundari, 2003, Pengaruh Penggunaan Probiotik dalam Ransum terhadap Produktivitas Ayam. Fakultas Peternakan. Institut Pertanian Bogor. Bogor. Granato, D., G. F. Branco, A. G. Cruz, J. D. A. F. Faria, and N. P. Shah. 2010. Probiotic Dairy Products as Functional Foods. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety 9: 455–470. Harley, J. P. dan Prescott, L. M., 2002, Laboratory Exercises in Microbiology, The McGraw-Hill Compenies. Havenaar, R., B. T. Brink, and J. H. J. Huis IN’T Veld. 1992. Selection of Strains for Probiotics Use. In: Probiotics the Scientific Basis. R. Fuller (Ed). Chapman & Hall, London. pp. 209-224. ISAPP. 2009. Clarification of the Definition of a Probiotic. Available at; www.isapp.net. Opened : Nopember 21, 2010. Iskandar, S., D. Zainuddin, T. Susanti., A.R. Setioko dan U. Hidayat. 1995. Kinerja anak itik jantan Mojosari diberi pakan yang disimpan dengan tepung zeolit atau arang tempurung kelapa. J. Ilmu Peternakan. 8(2): 32 – 37. Isolauri, E, Y. Sütas, P. Kankaanpää, H. Arvilommi and S. Salminen. 2001. Probiotics: effects on immunity. Am. J. Clin. Nutr. 73 (2) : 444 – 450.
49
James, J., Baker, C. dan Swain, H., 2008, Prinsip – Prinsip Sains untuk Keperawatan, Erlangga, Jakarta. Jeevaratnam, K., Jamuna, M. dan Bawa, A. S., 2003, Biological Preservation of Foods – Bacteriocins of Lactid Acid Bacteria, Defence Food Research Laboratoty, India. Khan, M. S. dan Wiyana, A., 2011, Karakteristik Ketahanan Bakteri Asam Laktat Indigeneous Kefir Sebagai Kandidat Bakteri Probiotik pada Kondisi Saluran Pencernaan In Vitro , Institit Pertanian Bogor, Bogor. Khedid. K dan Faid, M. 2006. Characterization of Lactic Acid Bacteria Isolated from the One Humped Camel Milk Produced in Morocco. Microbiology Reseach. Vol. 164: 81-91. Kusmiati dan Malik, A. 2002. Aktivitas Bakteriosin dari Bakteri Leuconostoc mesenteroides Pbac1 pada Berbagai Media. Kusumawati, N; Bettysri, L J; Siswa S; Ratihdewanti dan Hariadi. 2003. Seleksi Bakteri Asam Laktat Indigenous sebagai Galur Probiotik dengan Kemampuan Menurunkan Kolesterol. Journal Mikrobiologi Indonesia. Vol. 8(2): 39-43. Lay, B. W., 1994, Analisis Mikroba di Laboratorium, PT. Raja Grafindo Persada, Jakarta. Lay, B. W. dan Hastowo. 1992. Mikrobiologi. Institut Pertanian Bogor. Bogor. Lee, J., Y. Kim, H. S. Yun, J. G. Kim, S. Oh, and S. H. Kim. 2010. Genetic and Proteomic Analysis of Factors Affecting Serum Cholesterol Reduction by Lactobacillus acidophilus A4. Appl. Environ. Microbiol. 76(14): 48294835. Leeson, S. and J.D. Summer. 1996. Commercial Poultry Nutrition. 2nd Ed. University Books. University of Guelph. Guelph, Ontario, Canada. Mac
Farland, G.T. dan J.H. Cummings, 1998. http://ighawaii.com/naturally/newsletter/biotic.htmlProbiotic and Prebiotic. Department of Molecular and Cellular Pathology, University of Dundee, Ninewells Hospital Medical School, Wysong Health Letter. Diakses pada tanggal 17 Februari 2013 pukul 21.00 Wita.
Mahdavi, A.H; H.R. Rahmani dan J. Pourreza. 2005. Effect of Probiotic Supplements on Egg Quality and Laying Hen's Performance.International Journal of Poultry Science. Vol. 4 (7): 488492.
50
Malaka, R. dan Laga, A., 2005, Isolasi dan Identifikasi Lactobacillus bulgaricus Strain Ropy dari Yakult Komersial, Sains dan Teknologi, Vol. 5, No. 1: 50 – 58. Nettles, C.G and Barefoot, S.F. 1993. Biochemical and Genetic Characteristics of Bacteriocin of Food-Associated Lactic Acid Bakteria. J. Food Prot. Vol. 56: 338-356. Ooi, Lay-Gaik and Min-Tze Liong. 2010. Cholesterol-Lowering Effects of Probiotics and Prebiotics: A Review of in Vivo and in Vitro Findings. Int. J. Mol. Sci. Vol. 11: 2499-2522. Parker, R.B., 1974. Probiotics, the other half of antibiotic story. Anim.Nutr.Heath 29 : 4 – 8. Pereira, D. I. A., A. L. McCartney, and G.R. Gibson. 2003. An In Vitro Study of the probiotic Potential of a Bile-Salt-Hydrolyzing Lactobacillus fermentum Strain, and Determination of Its Cholesterol-Lowering Properties. Appl. Environ. Microbiol. 69 (8):4743-4752. Prado, F. C., J. L. Parada, A. Pandey, and C. R. Soccol. 2008. Trends in nondairy probiotic beverages. Food Res. Int. 41: 111-123. Purwadaria, T., I. P. Kompiang, J. Darma, Supriyati, and E. Sudjatmika. 2003. Isolation and Screening of Microbes for Poultry Probiotics and Their Growth on Different Sugar Resources. JITV 8(2): 76-83. Purwati, E. 2011. Effect Of Probiotics In Lactococcus Plantarum Origin Blondo On The Quality Cholesterol Egg Of Layer Chicken. Telah diseminarkan pada International Seminar Faculty of Animal Husbandry, Universitas Padjadjaran, Jatinangor Campus pada tanggal 6-7 Agustus 2011. Rahayu, E. S. dan Margino, S., 1997, Bkateri Asam Laktat : Isolasi dan Identifikasi, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta. Raihana, N., 2011, Profil Kultur dan Uji Sensitivitas Bakteri Aerob dari Infeksi Luka Operasi Laparotomi di Bangsal Bedah RSUP DR. M. Djamil Padang, Universitas Andalas, Padang. Russel, J. B., 1992, Another Explanation for The Toxicitry of Fermentation Acid at Low pH : Anion Accumulation versus Uncoupling, J. Appl. Bacterial 73 : 363 – 370.
51
Saarela, M., G. Mogensen, R. Fondén , J. Mättö, and T.Mattila-Sandholm. 2000. Probiotic bacteria: safety, functional and technological properties. J. Biotechnol. 84(3):197-215. Samudra, R dan H. Arif. 2008. Warna kulit, lemak abdomen dan lemak karkas itik alabio (Anas plathyrhincosn borneo) jantan akibat pemberian azolla dalam ransum. Animal Production.Jurnal.hlm164-167. Sari, Ramdana. 2012. Karakterisasi Bakteri Probiotik yang Berasal dari Saluran Pencernaan Ayam Pedaging. Universitas Hasanuddin. Makassar. Savadago, Cheik, O. A. T., Imael, B. H. dan Alfred, T. S., 2006, Bacteriocins and Lactid Acid Bacteria – A Minireview, African Journal og Biotechnology, Vol. 5 (9), pp. 678 – 683. Saxelin, M .1997. Lactobacillus GG – a Human Probiotic Strain with Thorough Clinical Documentation. Food Rev Int. Vol. 13: 293–313. Senok, A. C. 2009. Probiotics in the Arabian Gulf Region. Food & Nutrition Researc. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC 2651754/pdf/FNR-53-1842.pdf. Opened: November 29, 2010. Setiabudi. 2011. Daftar kontrol makanan dan kandungan kolesterolnya. http://www. Metasolusisehat.com. Diakses pada hari Jumat, 1Maret 2013. Shah, N. P. 2007. Functional cultures and health benefits. Int. Dairy J. 17:1262-1277, Elsevier Inc, USA. Shitandi, A., M. Alfred, and M. Symon. 2007. Probiotic characteristic of lactococcus strain from local fermented Amaranthus hybrydus and Solanum nigrum. African Crop Science Confrence Proceedings 8:18091812. Siegumfeldt, H., Rechninger, B. K. dan Jacobsen, M., 2000, Dynamic Changes of Intracellular pH in Individual Lactid Acid Bacterium Celss in Respons To a Rapid Drop in Extracellular pH, Appl. Environ Microbiol 66 : 2330 – 2335. Sinurat, A.P., Miftah dan T. Pasaribu. 1993. Pengaruh sumber dan tingkat energy ransum terhadap penampilan itik jantan lokal. Proc. Seminar Penelitian dan Pengembangan Ternak. Balitnak, Ciawi, Bogor. Simadibrata, M. 2010. Probiotik-Peranannya dalam Dunia Medis. Universitas Indonesia. Jakarta.
52
Sujaya, I N., Y. Ramona, N.P. Widarini, N.P. Suariani, N.M.U. Dwipayanti, K.A. Nocianitri dan N.W. Nursini. 2008b. Isolasi dan Karakteristik Bakteri Asam Laktat dari Susu Kuda Sumbawa. J. Vet. 9 (2) : 52 – 59. Surono, IS. 2004. Probiotik, Susu Fermentasi dan Kesehatan. Tri Cipta Karya: Jakarta Tabbers, M.M. and M.A. Benninga. 2007. Administration of Probiotic Lactobacilli to Children With Gastrointestinal Problems : There is Still Little Evidence. Ned. Tijdschr. Geneeskd. 151 (40) : 2198 – 2202 Tensiska, 2008, Probiotik dan Prebiotik sebagai Pangan Fungsional, Universitas Padjadjaran. Jatinegara. Vélez, M. Perea. 2007. Identification and Characterization of Starter Lactic Acid Bacteria and Probiotics from Columbian Dairy Products. Journal of Applied Microbiology; ISSN; 1364-5072. Volk, 1988, Mikrobiologi Dasar, Erlangga, Jakarta. Weichselbaum, E. 2009. Probiotics and health: a review of the evidence. Nutrition Bulletin. 34:340–373. Yousefi, M and Karkoodi, K. 2007. Effect Probiotic Thepar® and Saccharomyces cerevisia Supplementation on Performance and Egg Quality of Laying Hens. International Journal of Paultry Science.Vol. 6(1):52-54 Yeong, S.W. 1994. Promoting growth efficiency in ducks. Poult. Int. (July). Yulinery, T., E. Yulianto dan N. Nurhidayat. 2006. Uji Fisiologis Probiotik Lactobacillus sp Mar 8 yang telah Dienkapsulasi Dengan Menggunakan Spray Dryer Untuk Menurunkan Kolesterol. Biodiversitas 7 (2) : 118 – 122.
53
LAMPIRAN Lampiran 1. Skema Kerja Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Probiotik yang Berasal Dari Saluran Pencernaan Itik Pedaging Anas domesticus
Sampel (Usus Itik)
Isolasi Bakteri
Kultur Murni Bakteri
Karakterisasi Bakteri Probiotik
Uji Probiotik
Uji Ketah anan Terha dap Keasa man Lamb ung
Uji Ketah anan Terha dap Gara m Empe du
Uji Fisiologis Probiotik
Uji Ketah anan Temp eratur
Uji pH Opti mum
Uji Daya Hambat
Uji MR (Meth yl Red)
Uji Biokimia
Uji VP (Vog es Pros kaue r)
Uji Moti litas
Uji Katal ase
54
Uji TSIA (Tripl e Sugar Iron Agar)
Lampiran 2. Skema Kerja Isolasi Bakteri Probiotik Usus Ayam -
-
Mengambil saluran pencernaan (usus) itik segar Bagian anterior jejunum dan kloaka diikat sebelum dilepas dari badan itik Mengambil bagian dalam usus dengan menggunakan Scalpel (pisau Kecil) dan menghaluskannya dengan menggunakan mortar dan pastel lalu memasukkannya ke dalam Erlenmeyer steril Mengencerkan isi usus dengan NaCl fisiologis dengan perbendingan 1:1 1 mL sampel diinokulasikan pada medium MRSA
Kultur Bakteri -
Memilih setiap koloni yang terpisah Menyentuhkan jarum ose yang steril pada koloni bakteri kemudian digores pada media MRSA Inkubasi selama 2x24 jam Kultivasi secara berulang sampai didapat kultur murni
Satu Koloni Bakteri (murni)
-
Melakukan pengamatan morfologi bakteri meliputi bentuk koloni, bentuk tepi, warna, elevasi, dan bau
Stok Bakteri
55
Lampiran 3. Skema Kerja Pengecatan Gram Stok Bakteri -
Sebanyak satu ose (ose bulat) isolat diambil dari stok Dibuat ulasan pada gelas objek difiksasi
Preparat
Gram A -
Sebanyak 2-3 tetes gram A (kristal violet) diteteskan di atas permukaan preparat Dibiarkan selama 60 detik Dicuci dengan air mengalir dikeringanginkan
Gram B -
Sebanyak 2-3 tetes gram A (kristal violet) diteteskan di atas permukaan preparat Dibiarkan selama 60 detik Dicuci dengan air mengalir dikeringanginkan
Gram C -
Sebanyak 2-3 tetes gram A (kristal violet) diteteskan di atas permukaan preparat Dibiarkan selama 60 detik Dicuci dengan air mengalir dikeringanginkan
Gram D Pengamatan
Sebanyak 2-3 tetes gram A (kristal violet) diteteskan di atas permukaan preparat Dibiarkan selama 60 detik Dicuci dengan air mengalir dikeringanginkan -
Diamati di bawah mikroskop 56
Lampiran 4. Skema Kerja Uji Motilitas Stok bakteri
-
Sebanyak satu ose (ose bulat) diambil dari stok Diinokulasi pada medium SIM tegak dengan cara ditusuk
Medium SIM tegak
-
diinokulasi selama 2x24 jam
Pengamatan
57
Lampiran 5. Skema Kerja Uji Ketahanan terhadap Keasaman (pH) Medium MRSB -
-
Medium dimasukkan ke dalam dua erlenmeyer berbeda
ditambahkan HCl pekat sampai pH menjadi 2,5
-
ditambahk an HCl pekat sampai pH menjadi 3
Medium MRSB pH 3
Medium MRSB pH 2,5
-
Disterilkan dalam autoklaf
Medium MRSB-HCl
-
-
Ditambahkan satu ose (ose bulat) isolat dalam masing-masing medium Inkubasi selama 2x24 jam
Pengamatan
58
Lampiran 6. Skema Kerja Uji Ketahanan terhadap Garam Empedu Medium MRSB -
-
Medium dimasukkan ke dalam 2 erlenmeyer berbeda
-
Ditambahkan garam empedu sintetik 5%
Medium MRSB-Garam empedu
Ditamnbahkan garam empedu sintetik 1%
Medium MRSB-Garam empedu
-
Disterilkan di dalam autoklaf
Medium MRSB-Garam empedu
-
-
Ditambahkan 1 ose isolat (ose bulat) dalam masing-masing medium MRSB-Garam empedu 1% dan Medium MRSB-Garam empedu 5% Inkubasi selama 1-3x24 jam
Pengamatan
59
Lampiran 7. Skema kerja uji ketahanan temperatur Stok bakteri
-
Sebanyak 1 ose isolat (ose bulat) diinokulasikan pada medium MRSB dalam 3 tabung reaksi yang berbeda
Medium MRSB+isolat -
Masing-masing tabung diinkubasi selama 2x24 jam pada suhu yang berbeda yaitu 15OC, 37OC, dan 45OC
Pengamatan
60
Lampiran 8. Skema kerja uji MR (Methyl Red) Stok bakteri -
-
Sebanyak 1 ose isolat (ose bulat) diinokulasikan pada medium cair MR-VP Inkubasi selama 5x24 jam
Inokulum
-
Ditambahkan 5 tetes metilred inokulum
Pengamatan
61
Lampiran 9. Skema kerja uji Vp (Voges Preskauer)
Stok bakteri
-
-
Sebanyak 1 ose isolat (ose bulat) diinokulasikan pada medium cair MR-VP Inkubasi selama 3x24 jam
Inokulum
-
Ditambahkan 0,2 mL KOH dan 0,6 mL alfanaftol Dikocok selama 30 detik
Pengamatan
62
Lampiran 10. Skema kerja uji katalase
Stok bakteri
-
-
Sebanyak 1 ose isolat (ose bulat) diambil dari stok kultur Isolat dicelup pada Reagen H2O2
Pengamatan
63
Lampiran 11. Skema kerja uji TSIA (Triple Sugar Iron Agar) Stok bakteri
-
-
Sebanyak 1 ose isolat (ose lurus) diambil dari stok kultur kemudian ditusuk pada bagian tegak medium TSIA Sebanyak 1 ose isolat (ose bulat) diambil dari stok kemudian digores pada bagian miring media TSIA
Inokulum
Diinkubasi selama 2-3x24 jam
Pengamatan
64
Lampiran 12. Skema kerja uji daya hambat
Bakteri uji (Staphylococcus aureus dan Escherichia coli)
Stok bakteri probiotik
-
-
-
Sebanyak 1 ose (ose bulat) diambil dari stok dan diinokulasi pada medium NA miring Diinkubasi selama 5x24 jam
-
Sebanyak 1 ose (ose bulat) diinokulasikan pada medium NA miring Diinkubasi selama 24 jam
Inokulum -
Ditambahkan 5 mL aquades steril dan divorteks Diukur pada spektrofotometer
Suspensi bakteri probiotik -
-
Suspensi bakteri uji
Paper disk direndam dalam suspensi selama ± 10 menit Paper disk kemudian diletakkan di atas permukaan medium NA yang sebelumnya telah diinokulasikan bakteri uji
-
-
Sebanyak 1 mL bakteri uji diinokulasikan pada medium NA dengan metode tabur Biarkan memadat
Inokulum
-
Diameter zona hambat yang terbentuk diukur setiap 24 jam dengan menggunakan jangka sorong
Diinkubasi selama 2x24 jam
Pengamatan
65
Lampiran 13. Uji Daya Hambat Bakteri
A
A
(1)
(2)
B
B
Keterangan : (1) Waktu inkubasi 1 x 24 jam (2) Waktu inkubasi 2 x 24 jam A = Bakteri Escherichia coli B = Bakteri Staphylococcus aureus
66
Lampiran 14. Pemurnian isolat probiotik BAL dengan Metode Kuadran
67
Lampiran 15: Foto Prosedur Kerja
Usus Itik Pedaging Pengambilan isi dalam usus
Pembuatan media Proses pemurnian isolat
Pembuatan stok bakteri Proses inokulasi bakteri pada Uji MR-VP dan Temperatur
68
Proses Pengecatan gram
Inokulasi bakteri pada Uji motilitas
69
Lampiran 16. Tabel 6 : Hasil Karakterisasi Bakteri Probiotik BAL Karakterisasi
A
B
C
D
E
F
G
H
Positif (Basil) Non Motil
Negatif (Coccus) Non Motil
Positif (Basil) Non Motil
Negatif (Coccus) Non Motil
Positif (Coccus) Non Motil
Positif (Coccus) Non Motil
Positif (Coccus) Non Motil
Positif (coccus) Non Motil
2,5
+++
+++
+++
+
++
++
+
+++
3
+++
+++
+++
+
++
++
+
+++
1%
+++
++
+++
++
+
+
++
+++
5%
+++
+++
+++
++
+
+
+
+++
+ +++ ++ Positif
+ +++ ++ Positif
+ +++ ++ Positif
+ ++ + Positif
+ ++ + Positif
+ ++ + Positif
+ ++ + Positif
+ +++ ++ Positif
Negatif
Negatif
Negatif
Positif
Negatif
Positif
Negatif
Negatif
Asam
Asam
Asam
Asam
Asam
Asam
Asam
Asam
Asam
Asam
Asam
Asam
Asam
Asam
Asam
Asam
Negatif
Negatif
Negatif
Negatif
Negatif
Negatif
Negatif
Negatif
Negatif
Negatif
Negatif
Negatif
Negatif
Negatif
Negatif
Negatif
Pengecatan Gram Uji Motilitas Uji Ketahanan Terhadap Keasaman (pH) Uji Ketahanan Terhadap Garam Empedu
150C 370C 450C Uji MR (Methyl Red) Uji VP (Voges Preskauer) Uji Katalase Lereng (Slant) Tegak Uji TSIA (Butt) (Triple Sugar Iron Terbentuk Agar) Gas Terbentuk H2S
Uji Ketahanan Temperatur
Isolat
70
