Firman Sebayang
Jurnal KOMUNIKASI PENELITIAN Volume 17 (5) 2005
ISOLASI DAN PENGUJIAN AKTIVITAS ENZIM α‐ AMILASE DARI Aspergillus niger DENGAN MENGGUNAKAN MEDIA CAMPURAN ONGGOK DAN DEDAK Firman Sebayang Departemen Kimia FMIPA USU Abstrak Telah dilakukan ekstraksi enzim α-amilase dari Aspergillus niger yang ditumbuhkan dalam media pertumbuhan campuran onggok dan dedak. Ekstrak kasar enzim α-amilase dimurnikan lebih lanjut dengan pengendapan menggunakan (NH4)2SO4 60%. Kadar protein enzim dianalisa dengan metode Lowry. Pengujian aktivitas enzim α-amilase menggunakan metode Bernfeld, yaitu dengan mengukur kandungan maltosa yang dihasilkan dari hidrolisa amilum. Aktivitas spesifik ekstrak kasar enzim α-amilase adalah 5.45 unit/mg protein pada pH 6.0 suhu o 60 C. Setelah pemurnian dengan (NH4)2SO4 60% aktivitas spesifik enzim α-amilase meningkatmenjadi 8.50 unit/mg protein pada pH 6.0 suhu 60 oC. Kata kunci: Isolasi enzim α-amilase, Aspergillus niger
A. PENDAHULUAN Dalam proses pengolahan hasil-hasil pertanian selain dihasilkan produk yang dikehendaki juga sering dihasilkan produk samping berupa limbah. Onggok yang merupakan hasil samping dari proses pengolahan ubi kayu menjadi tepung tapioka masih mengandung pati yang cukup tinggi sekitar 60-70%. Sedangkan menurut Judoamidjojo kandungan dari pati dalam onggok sekitar 60%. Jumlah pati yang tersisa dalam ampas tapioka tergantung pada teknik pembuatan tapioka. Oleh karena itu analisa kimia dari onggok dapat memberikan hasil yang berbeda-beda. Selama ini pendayagunaan onggok belum optimal, masih terbatas sebagai makanan ternak sehingga nilai ekonomis dan daya gunanya kecil sekali. Masih tingginya kadar pati dalam onggok cukup potensial digunakan dalam sistem fermentasi media padat meskipun kadang-kadang memerlukan penambahan sumber nitrogen dan unsur mineral lainnya. Di samping itu dedak sebagai limbah dari proses pengolahan gabah menjadi beras mengandung karbohidrat protein relatif masih tinggi serta mengandung vitamin dan mineral. Dengan penerapan bioteknologi akan dapat diupayakan dalam hal memanfaatkan potensi yang masih dimiliki oleh limbah industri pangan tersebut sehingga memberikan nilai tumbuh yang cukup berarti.
81
Dalam penelitian digunakan campuran antara onggok dan dedak sebagai media pertumbuhan kapang Aspergillus niger dalam upaya memproduksi enzim α-amilase secara fermentasi dengan metode kultur semipadat. Enzim α-amilase adalah enzim yang berfungsi untuk memecah ikatan α-1,4 glikosida dari molekul pati menjadi maltosa. α-amilase merupakan salah satu enzim ekstraseluler komersial yang mempunyai nilai ekonomis yang tinggi, sehingga banyak digunakan dalam berbagai bidang industri seperti industri pati, roti, alkohol, kertas, tekstil, gula, dan industri detergen. Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi serta karakterisasi ekstrak kasar enzim α-amilase dari kapang Aspergillus niger yang ditumbuhkan pada media campuran onggok dan dedak. B. 1.
BAHAN DAN METODE
Penyediaan Suspensi Biakan Aspergillus niger Biakan Aspergillus niger ditanam pada 5 ml media agar miring PDA (Potato Dextrosa Agar) dalam tabung reaksi, diinkubasi pada suhu 37 oC selama 5 hari. Ke dalam biakan tersebut ditambahkan 2 ml akuades steril. Spora yang terbentuk dikerok dengan jarum ose agar terlepas dari agar sehingga diperoleh suspensi biakan Aspergillus niger.
Firman Sebayang
Proses
Jurnal KOMUNIKASI PENELITIAN Volume 17 (5) 2005
penyediaan
suspensi
biakan
Aspergilus niger dapat dilihat pada Gambar 1.
Sediaan jamur Aspergillus niger Dibiakkan pada tabung reaksi yang berisi 5 ml media PDA Diinkubasi pada suhu 37 oC selama 5 hari
Hasil biakan Ditambahkan 2 ml akuades steril Spora dikerok dengan jarum ose agar terlepas dari agar
Suspensi biakan Aspergillus niger
Gambar 1. Penyedian Suspensi Biakan Aspergillus niger 35 g campuran onggok dan dedak (1:1) Ditambahkan 29 ml urea 0,14% Ditambahkan 71 ml akuades Ditambahkan 3 ml suspensi biakan Aspergillus nig Hasil biakan Ditambahkan 100 ml akuades Dishaker selama 2 jam Disentrifugasi 15’ , 2500 rpm, 4 oC Supernatan
Ditambahkan CaCl2 20% (1:40) Didiamkan selama 1 jam Disentrifugasi 15’ , 2500 rpm
Supernatan Diambil 100 ml Ditambahkan (NH4)2SO4 sampai konsentrasi 60% Disentrifugasi selama 20’ , 5000 rpm, 4oC
Endapan Disuspensikan dalam larutan bufer fosfat Didialisis dengan menggunakan kantong selopan
Enzim amilase
Diukur kadar proteinnya
Diukur aktivitasnya
Aktivitas spesifik
Gambar 2. Produksi Enzim α-amilase dari Aspergillus niger
82
Firman Sebayang
Produksi Enzim α-amilase dari Aspergillus niger Ke dalam labu erlenmeyer 250 ml dimasukkan 35 gram campuran onggok dan dedak (1:1), 29 ml urea 0,14% dan 71 ml akuades yang masing-masing telah disterilisasi secara terpisah pada suhu 120 oC selama 15 menit. Lalu diinokulasikan dengan 3 ml biakan Aspergillus niger dan diinkubasi selama 8 hari pada suhu kamar sehingga kultur padat tersebut dipenuhi misellium. Ke dalam hasil biakan ditambahkan 100 ml akuades dan dishaker selama 2 jam, lalu disentrifugasi selama 15 menit pada putaran 2500 rpm dengan suhu 4 oC. Pada supernatan yang diperoleh ditambahkan CaCl2 20% (1 ml CaCl2 untuk 40 ml supernatan), dibiarkan selama 1 jam dan disentrifugasi kembali selama 15 menit dengan putaran 5000 rpm pada suhu 4 oC . Ke dalam 100 ml supernatan (ekstrak kasar enzim) ditambahkan perlahan-lahan sambil diaduk 60%, kemudian disentrifugasi (NH4)2SO4 kembali pada putaran 5000 rpm selama 20 menit. Endapan yang diperoleh disuspensikan dalam bufer lalu dilakukan dialisa menggunakan kantong selopan sampai bebas sulfat. Enzim α-amilase yang diperoleh ditentukan aktivitas serta Kadar proteinnya. Diagram proses produksi enzim α-amilase dari Aspergillus niger dapat dilihat pada Gambar 2. 2.
3. Pengujian Akivitas Enzim α-amilase Ke dalam 2 buah tabung reaksi dimasukkan masing-masing 1 ml larutan amilum 0,5%. Pada salah satu tabung ditambahkan 1 ml akuades. Kedua tabung diinkubasi selama 3 menit. Ke dalam masing masing tabung ditambahkan 2 ml pereaksi DNS (Asam Dinitro Salisilat) dan panaskan pada air mendidih selama 5 menit dan dinginkan segera pada air mengalir. Tentukan absorbansinya pada panjang gelombang 546 nm. Perlakuan ini dilakukan untuk variasi suhu inkubasi (50, 55, 60, 65, 70) oC serta variasi pH substrat (5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5). untuk mengetahui jumlah maltosa
83
Jurnal KOMUNIKASI PENELITIAN Volume 17 (5) 2005
yang dihasilkan digunakan kurva standart maltosa (Lampiran 1). 4. Penentuan Kadar Protein Penentuan kadar protein enzim dilakukan dengan metode lowry. Sebanyak 1 ml ekstrak kasar enzim direaksikan dengan 5 ml reagen C, kocok dan biarkan selama 10 menit pada suhu kamar. Tambahkan 0,5 ml reagen D (Folinciocalteu 1N) kocok dan biarkan 30 menit pada suhu kamar. Tentukan absorbansinya pada panjang gelombang 750 nm. Untuk mengetahui konsentrasi protein digunakan kurva standar protein Bovin Serum Albumin (BSA) (Lampiran 2). C. HASIL DAN PEMBAHASAN 1. Isolasi Enzim α-amilase Enzim α-amilase merupakan enzim ekstraseluler sehingga dalam proses isolasinya tidak memerlukan pemecahan sel. Pemanfaatan campuran onggok dan dedak cukup potensial digunakan sebagai media pertumbuhan kapang Aspergillus niger dalam upaya memproduksi enzim dalam sistem fermentasi media semi padat sehubungan dengan kadar pati, protein, vitamin serta mineral yang masih terkandung di dalamnya. Enzim α-amilase yang diperoleh dari Aspergillus niger lebih lanjut dilakukan isolasi (pemurnian) secara parsial dengan penambahan (NH4)2SO4 . Hal ini dimungkinkan karena garam berfungsi untuk merusak mantel air yang terdapat disekitar enzim (protein) sehingga protein akan mengendap. Pengendapan maksimum dipeoleh dengan penambahan (NH4)2SO4 60%. Selanjutnya dilakukan sentrifugasi dingin dan freezedrying sehingga diperoleh serbuk enzim kasar αamilase sebanyak 0,55 g dari 100 ml supernatan.
Firman Sebayang
Kondisi Optimum Kerja Enzim αamilase Dari hasil pengujian pengaruh pH terhadap aktivitas enzim diperoleh hasil sebagai berikut: 2.
Tabel 1. Pengaruh pH terhadap Aktivitas Enzim α-amilase pH Aktivitas (unit) 0.35 5 0.49 5.5 1.50 6.0 1.05 6.5 0.65 7.0 0.42 7.5 pH optimum enzim α-amilase adalah 6,0 (Kurva 1 pada lampiran). pH berhubungan dengan struktur enzim yang terdiri dari asam-asam amino. Perubahan pH dalam suatu larutan menunjukkan perubahan-perubahan jumlah ion H+ yang ada dalam larutan. Jumlah ion yang ada akan mempengaruhi struktur enzim yang terdiri dari asam-asam amino, terutama pada ikatan hidrogennya. Karena aktivitas enzim berkaitan erat dengan strukturnya maka perubahan struktur akan menyebabkan perubahan-perubahan aktivitas enzim. Sedangkan pada pH optimum jumlah ion H+ tidak mempengaruhi konformasi enzim sehingga konformasi substrat sama dengan konformasi enzim. Hal ini menyebabkan interaksi antara enzim dan substrat meningkat, sedangkan pada pH optimum aktivitas enzim paling tinggi. Dari hasil pengujian pengaruh suhu terhadap aktivitas enzim α-amilase diperoleh hasil sebagai berikut: Tabel 2. Pengaruh Suhu terhadap Aktivitas Enzim α-amilase Suhu (oC) Aktivitas (unit) 0.15 35 0.18 40 0.45 45 0.90 50 1.20 55 1.45 60 0.85 65 0.25 70
Jurnal KOMUNIKASI PENELITIAN Volume 17 (5) 2005
Suhu optimum enzim α-amilase adalah 60 oC (Kurva 2 pada lampiran). Sebelum mencapai suhu 60 oC terlihat bahwa aktivitas enzim kecil, hal ini disebabkan karena pada suhu tersebut energi aktivasi yang diperlukan enzim untuk mengkatalisis reaksi hidrolisis substrat amilum tidak cukup sehingga enzim tidak dapat bekerja dengan baik. Kenaikan suhu menyebabkan aktivitas enzim meningkat sampai mencapai suhu optimum. Setelah mencapai kondisi optimum terlihat bahwa aktivitas enzim menurun. Terjadinya penurunan aktivitas ini diperkirakan karena pada suhu tinggi struktur tertier enzim yang terdiri dari ikatan bukan kovalen atau elektrostatik, ikatan hidrogen, ikatan disulfida dan ikatan hidrofobik bila menyerap energi tinggi akan terjadi pemutusan dan mengakibatkan terjadinya pembukaan struktur tertier dan kuartener yang menyebabkan konformasi enzim berubah dan menyebabkan aktivitasnya menurun. D. KESIMPULAN 1.
2.
Ekstrak kasar enzim α-amilase dapat diproduksi dari kapang Aspergillus niger bila ditumbuhkan dalam media campuran onggok dan dedak. Enzim α-amilase bersifat ekstraseluler. Kondisi optimum ekstrak kasar enzim α-amilase adalah pada pH 6.5 dan suhu 60 oC menghasilkan aktivitas spesifik sebesar 5,45 unit/ mg protein. Setelah dilakukan pemurnian dengan (NH4)2SO4 60% aktivitas spesifik enzim amilase meningkat menjadi 8,50 unit/ mg protein.
E. DAFTAR PUSTAKA Satiawiharja, B., 1984, Fermentasi Media Padat dan Manfaatnya, Dept. Pendidikan dan Kebudayaan Indonesia, Jakarta. Prescott, S. C. and dunn C.G., 1982, Industrial Microbiology, the AVI. Pub. Co. Inc., Westp Portt, Connecticit. Allen, R. D., 1980, Feedstuffs Ingredient Analysis, Vol. 54, ed. 30, 25-30.
84
Firman Sebayang
Jurnal KOMUNIKASI PENELITIAN Volume 17 (5) 2005 Lowry, C.H., N.J. rosenrough, A. L. Farr, and R.J. Randall, 1951, Protein Measurement With Folin Phenol Reagent, J. Biol. Chem., 183.
Soeka, Y. S., dan djajasukma, E., 1993, Pengaruh Penambahan SumberSumber Nitrogen terhadap Aktivitas Enzim Amilase Aspergillus niger dalam Media Onggok dan Dedak, seminar hasil Litbang SDH Mikrobioligi LLI-Bogor, 165-171. Crueger, W., and, A. Crueger, 1984, Biotechnology: a Textbook of Industrial Microbiology, Brock, T.D., Editor, Science Tech., Madison, USA. Bernfeld, P., 1955, Methods in Enzymology, Acad. Press Inc., New York.
Sebayang, F., 1991, Konversi Penisilin Menjadi 6-Apa Oleh Enzim Penisilin Aasilase yang Diembilkan dengan K-Karrageenan dan Kitin, Tesis, ITB, Bandung.
85
Firman Sebayang
Jurnal KOMUNIKASI PENELITIAN Volume 17 (5) 2005
LAMPIRAN Lampiran 1.
Harga Absorbsi dari Berbagai Konsentrasi Maltosa dalam Pembuatan Kurva Standar Maltosa Konsentrasi Maltosa (mg/ml) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9
Absorbansi 0,115 0,231 0,334 0,442 0,523 0,642 0,738 0,823 0,971
86
Firman Sebayang
Jurnal KOMUNIKASI PENELITIAN Volume 17 (5) 2005
Persamaan Regresi: Y= 0.018+1. 035X Lampiran 2. Harga Absorbansi dari Berbagai Konsentrasi Larutan Bovin Serum Albumin (BSA) dalam Pembuatan Kurva Standar Protein Konsentrasi BSA (ug/ml) 30 40 50 60 70 80 90
Persamaan Regresi: Y=1,64.10-3 + 2,225. 10-3X
87
Absorbansi 0,06 0,099 0,113 0,138 0,153 0,188 0,195
Firman Sebayang
Jurnal KOMUNIKASI PENELITIAN Volume 17 (5) 2005
88
