Kuliah ke-4 STERILISASI DALAM FERMENTASI
Tujuan Instruksional Khusus :
• Mahasiswa mampu menjelaskan sterilisasi dalam proses fermentasi
•
•
Produk fermentasi diperoleh bila mikroorganisme tumbuh pada media yang sesuai Bila terkontaminasi, maka : Produktivitasnya menurun akibat kompetisi mikrobia Kontaminan mendominasi kultur dan mengganti mikrobia yang diinginkan. Mempengaruhi kualitas produk, misalnya pada produksi protein sel tunggal. Kesulitan dalam ekstraksi produk Kontaminan akan mendegradasi produk, misalnya pada produksi antibiotik. Kontaminan berupa bakteriofag dapat menyebabkan sel mikrobia menjadi lisis.
•
Usaha-usaha untuk menghindari kontaminasi : Penggunaan kultur murni Tergantung Sterilisasi medium proses fermentasi Sterilisasi tangki fermentasi dan derajat Sterilisasi bahan tambahan konsekwensi Pemeliharaan kondisi aseptik.
Cara-Cara Sterilisasi • Metode kimia Untuk peralatan yang sensitif terhadap panas → ethylene oxide (gas untuk alat → 70% ethanol-air (pH=2) untuk alat/permukaan → 3% sodium hypochlorite untuk alat • Proses pemanasan • Radiasi UV untuk permukaan Sinar X untuk cairan Metode umum : pemanasan basah atau kering
Cara-Cara Sterilisasi ...... • Sonikasi (sonik /getaran ultrasonik) • Sentrifugasi kecepatan tinggi • Filtrasi untuk bahan yang sensitif panas dan udara
Proses Sterilisasi • Dilakukan pada reaktor baik dalam kondisi kosong maupun yang sudah diisi dengan media • Reaktor dipanaskan engan uap jenuh (suhu 121 -141oC) menggunakan sistem pindah panas (double jacket atau alat penukar panas lainnya) dengan waktu sesuai dengan yang diinginkan reaktor didinginkan
Waktu dan Suhu Sterlisasi dari beberapa mikroorganisme
STERILISASI MEDIUM • Caranya : - dengan filtrasi presipitasi - dengan pemanasan yang utama pemanasan basah mudah, ekonomis
KINETIKA KEMATIAN TERMAL MIKROBA 1. Laju Kematian • Terdiri atas : - laju kematian logaritmik - laju kematian non logaritmik a. Laju Kematian Logaritmik • Terdapat pada kultur murni • Laju kematian logaritmik secara matematik :
dN kN …………….Pers.1 dt N= konsentrasi mikrobia (jumlah/ml) k = konstanta laju kematian spesifik (menit-1) t = waktu (menit)
• Integrasi dari persamaan (1) dengan batasan N = No dan t = to menghasilkan : ............Pers 2) atau Nt kt No
e
Nt ln kt……..Pers 3) No
No = jumlah mikrobia pada awal sterilisasi Nt = jumlah mikrobia pada akhir sterilisasi
Nt No
Nt ln No
Waktu (t)
Slope = k
Waktu (t)
Gambar 1. Proporsi sel hidup pada mikrobia yang mengalami sterilisasi berdasarkan persamaan 2 dan 3.
• Slope kurva = k Nilai absolut k = pengukuran resistensi termal organisme, semakin kecil nilai k maka resistensi mikroba terhadap aktivitas termal semakin tinggi.
10 1 N/No
T=54oC
10-1 T=56oC
10-2 10-3
T=58oC
10-4
T=60oC
10-5 0
2
4
6
8
10
Waktu (Menit)
Gambar 2. Laju kematian tipikal bagi sel-sel vegetatif E.coli
b. Laju Kematian Non Logaritmik • Sering terdapat pada spora bakteri • Penyebab penyimpangan : germinasi spora, teknik eksperimen yang belum baik. ln N
ln
Waktu
Nt No
ln
Waktu
Nt No
Waktu
.............. = Kultur murni ________ = Organisme Sensitif - - - - - - - = Organisme Resisten
Gambar 3. Penyimpangan kurva pada proses sterilisasi akibat kultur campuran dan aktivasi spora
• Urutan kejadian untuk model kematian non logaritmik diusulkan oleh Prokop and Humprey (1970) inaktivasi spora terjadi dengan cara : kR
kR
NR Ns Spora resisten
intermediet sensitif
ND mati
• Persamaan diferensial untuk model ini : dN R k R N R dt
………………….4)
dN s k R N R ks N s dt
………………...5)
NR = konsentrasi spora resisten (jumlah/ml) Ns = konsentrasi spora sensitif (jumlah/ml) ND = spora yang mati (jumlah/ml) kR = laju inaktivasi spesifik spora resisten (menit-1) ks = laju inaktivasi spesifik spora sensitif (menit-1) t = waktu (menit)
• Penyelesaian persamaan (5) : N kR ks t [exp( kst ) exp( k R )] No k R ks kR
Pers 6)
N = kosentrasi sel hidup yang dapat diperoleh kembali setiap saat = Ns+ NR (jumlah/ml) No = konsentrasi sel hidup awal (jumlah/ml)
• Pada sterilisasi medium fermentasi, kosentrasi dan tipe mikrobia seringkali tidak diketahui, sehingga digunakan resistensi termal relatif mikrobia untuk merancang siklus sterilisasi
Tabel 1. Resistensi relatif dari berbagai mikrobia terhadap panas uap air. Mikrobia Bakteri vegetatif dan khamir Spora bakterial
Spora Kapang Virus dan Bakteriofag
Resistensi Relatif 1.0 3 x 106
2 – 10 1-5
spora bakteri lebih resisten terhadap panas uap air siklus sterilisasi dirancang berdasarkan destruksi spora bakteri
2. Pengaruh Suhu Terhadap Kinetika Kematian • Teori yang sering digunakan : Teori Arrhenius
k Ae
E / RT
E ln k ln A RT
………..Pers (7) ………..Pers (8)
E = energi aktivasi kematian (kal/mol) R = konstanta gas (kal/molo K) T = suhu (oK) A = konstanta Arrhenius (menit-1)
• Kombinasi persamaan (3) dan persamaan (7) menghasilkan : No ln A..e E / RT Nt No ln N
………..Pers 9)
= kriteria sterilisasi atau Del factor = V = suatu destruksi sel mikrobia terhitung akibat kenaikan suhu pada waktu tertentu.
V A.t.e
( E / RT )
E V ln t ln( ) RT A
…………Pers 10) atau
…………Pers 11)
3. Sterilisasi Media Secara Batch • Informasi yang diperlukan : a) Profil peningkatan dan penurunan suhu dalam media b) Jumlah mikrobia awal c) Karakteristik kurva destruksi mikrobia oleh panas. Pada umumnya dipilih spora bakeri yang tahan panas yaitu Bacillus stearothermophillus. d) Resiko/derajat kontaminasi yang ditoleransi, misalnya 1 sel dalam 1000 atau Nt = 10-3 sel hidup.
• Bila jumlah mikrobia awal pada media = 1011 sel hidup, dan derajat kontaminasi yang ditoleransi 10-3, maka harga del factor : No 1011 V ln ln 3 Nt 10
= ln 1014 = 32.2
diperoleh sejak pemanasan, sterilisasi sampai pendinginan, sehingga : Vtotal = Vpemanasan + Vsuhu sterilisasi + Vpendinginan
• Perhitungan del factor selama pemanasan dan pendinginan : Dari persamaan 10 : V A.t.e( E / RT ) Pada periode ini suhu dianggap konstan sehingga perubahan hanya terjadi pada suhu sterilisasi. Perubahan suhu secara grafis digambarkan sebagai berikut : Suhu
t1
t2
t3
t4
t5
t6
Waktu Gambar 4. Metode grafis yang digunakan untuk menggambarkan hubungan waktu dan suhu serta perhitungan harga V.
• Harga V untuk setiap bagian : V1 = k1t, V2 = k2t, V3 = k3t dst. • Nilai k1, k2 dst dicari dengan persamaan Arrhenius sedangkan harga t dapat dilihat dari kurva seperti pada Gambar 4. • Dengan menggunakan persamaan Arrhenius, maka nilai k untuk spora B.stearothermophillus dapat dilihat pada Gambar 5.
Gambar 5. Korelasi antara kecepatan kematian spesifik (k) spora B.stearothermophilus dengan suhu pemanasan
• Contoh : Diketahui suhu sterilisasi 121oC dengan total del factor 32.2. Jika kenaikan suhu dari 100oC ke 121oC dicapai selama 30 menit dan penurunan suhu dari 121oC ke 100oC dicapai dalam waktu 17 menit, berapakah total waktu sterilisasi? • Jawab : Dari Tabel 2 diperoleh nilai del factor pada suhu 121oC = 12.549, maka : Vpemanasan 100-121oC = 12.549 x30 = 17.93 21
Vpendinginan 121-100oC = Vsuhu sterilisasi 121oC = V121oC
=
k121oC.t121oC
12.549 x17 21
= 10.16
32.2 – 17.93 – 10.16 = 4.11 t121oC
=
4.11 = 1.62 menit 2.54
total waktu sterilisasi = 30 + 1.62 + 17 = 48.62 menit
• Perhitungan waktu pada suhu sterilisasi (121oC) Vtotal = Vpemanasan + Vsuhu sterilisasi + Vpendinginan Misal : Vtotal = 32.2 Vpemanasan = 9.8, Vpendinginan = 10.1, maka : Vsuhu sterilisasi = 32.2 – 9.8 – 10.1 = 12.3 Diketahui nilai k untuk B.stearothermophillus pada suhu 121oC adalah 2.54/menit, maka waktu untuk suhu sterilisasi adalah : V = kt t = V/k = 12.3/2.54 = 4.84 menit pada suhu 121o C • Bila kontribusi pemanasan dan pendinginan diabaikan selama proses sterilisasi, maka : = 12.68 menit pada 121oC. Vtotal 32.2 t 12.68 k 2.54
Gambar 7. Proses Sterilisasi Secara Batch
Perencanaan Dalam Proses Sterilisasi Media • Asumsi : Kerusakan bakteri terjadi di atas suhu 100oC Penetrasi panas atau pendinginan di atas suhu 100oC adalah linier. o Scale up proses sterilisasi secara Batch : Dasar perhitungan del factor : total kontaminan yang ada dalam media dan bukan volume media Jika ukuran fermenter bertambah maka total sel awal juga naik, tapi probabilitas sel yang digunakan untuk mencapai tingkat sterilisasi tertentu harus tetap sehingga nilai V akan naik.
• Contoh : Proses sterilisasi skala pilot plant dengan 1000 l tangki media mengandung kontaminan 106/ml, diinginkan proses sterilisasi dengan probabilitas kontaminan 1/1000 maka : (106 x103 x103 ) 15 V ln ln 10 34.5 3 10
Bila digunakan tingkat sterilisasi yang sama tetapi pada skala produksi 10.000 l media, (106 x103 x104 maka : V ln ln 1016 36.8 103
4. Sterilisasi Kontiniu • Keuntungan : 1) Mudah dalam pengawasan proses 2) Reduksi kapasitas uap 3) Reduksi waktu siklus sterilisasi 4) Potensial dalam pengembangan hasil produk fermentasi • Cara : Medium dipanaskan secara tidak langsung dalam pipa atau plat dan penyangga panas Dengan injeksi uap
Gambar 8. Proses sterilisasi secara kontiniu
Flow diagram of a typical continuous injector flash cooler steriliser Cooling water in
Cooling water out
Unsterile medium in
Steam in
Venturi valve
Cooling heat exchanger
Pre- heat heat exchanger Expansion valve
Sterile medium out
Holding coil
Expansion chamber
6. Sterilisasi Fermenter
• Jika media disterilisasi terpisah, maka fermenter juga harus disterilisasi • Cara : Mengalirkan uap panas pada suhu 121oC selama 20 menit Semua bagian yang kontak langsung dengan media harus disterilisasi
7. Sterilisasi Udara
• Pada proses fermentasi aerob diperlukan aliran udara steril ke dalam media secara kontiniu. • Cara : - dengan pemanasan - dengan filtrasi lebih umum di industri • Ada 2 jenis filter : 1. Filter absolut : ukuran pori lebih kecil dari partikel/mikroba yang disaring. Contoh : 0.2 Efisien, tapi cepat mengalami pressure drop sehingga harus sering diganti.
2. Filter fibrous : Ukuran pori lebih besar dari partikel/mikroba yang disaring. Misal : 0.5 – 1.5 Banyak digunakan untuk sterilisasi udara pada industri fermentasi Terbuat dari kapas, kapas gelas atau kapas baja.
8. Perencanaan Sterilisasi Udara • Contoh : dibutuhkan udara steril untuk fermenter berukuran 10 m x 60 m x 100 m proses fermentasi. Dari percobaan sebelumnya diperoleh kecepatan aliran udara optimum 0.15 m/detik pada nilai k = 1.535/cm. Dimensi filter =
N ln kx NO Udara dalam pabrik mengandung 200 mikroba/m3, sehingga : No = total mikroba = volume udara x 200 = 10 x 60 x 100 x 200 = 12 x 106 mikroba
• Derajat kontaminasi yang ditoleransi = N = 10-3 10-3 ln = - kx ln 8.33 x 10-11 = -1.535 x 12x106 x = 15.12 cm tebal filter = 15.12 cm Luas area filter yang digunakan = Volume aliran udara kecepatan linier 10 r2 = m2 radius (r) filter = 0.59 m 0.15 x 60
SOAL • Hitunglah waktu yang dibutuhkan untuk proses sterilisasi media fermentasi berikut : Jumlah awal bakteri pada media : 5 x 1012 per m3, dan jumlah akhir yang diinginkan adalah 1 per 1000. Volume media 40 m3 dengan suhu awal 25oC. Media disterilisasi dengan sistem pemanasan langsung menggunakan uap jenuh dalam sebuat fermentor. Uap dengan tekanan 345 kPa (tekanan absoult) diinjeksikan dengan kecepatan 5,000 kg/jam, dan injeksi uap dihentikan ketika suhu sudah mencapai 122oC. Suhu media ditahan pada 122oC. Panas yang hilang selama waktu pemanasan dapat diabaikan, kemudian media didinginkan dengan cara melewatkan air suhu 20oC dengan kecepatan 100 m3/jam melalui koil pendingin hingga suhu akhir media mencapai 30oC. Luas permukaan koil adalah 40 m3, and laju pindah panas overall (U) = 2500 kJ/jam.m2.K. Resistensi panas spora bakteri adalah : • kdo = 5.7 x 1039 per jam • Ed = 2.834 x 105 kJ / kmol Nilai Panas spesifik media (c) = 4.187 kJ/kg.K dan densitasnya (ρ) = 1000 kg/m3
Studi Kasus 1
Carilah proses persiapan media fermentasi untuk pembuatan Bir (dari Wort) Bandingkan dengan persiapan media untuk produksi penisilin
Studi Kasus 2 • Cari perbedaan antara proses sterilisasi dengan sistem pemanasan langsung dan sistem pemanasan tidak langsung (menggunakan alat penukar panas) • Berikan contoh aplikasi masing-masing pada industri pangan.
