Pemeriksaan Penunjang Imunologi (immunoassay) Putu Oky
1
Definisi Immunoassay • Immunoassay adalah tes atau uji yang digunakan untuk mengukur adanya antigen atau antibodi pada sampel (spesimen bilogikal) • Immunoassay dapat digunakan mendeteksi analyte yang ingin diukur • Analyte sesuatu yg diukur dengan tes laboratorium dapat berupa Ag atau Ab dalam serum • Tujuan immunoassay ini adalah untuk mendiagnosa suatu penyakit, mengukur aktivitas komponen imun dalam tubuh (komplemen, fagositosis, dst) 2
Prinsip Immunoassay • Prinsip immunoassay reaksi ikatan spesifik Ab-Ag membentuk kompleks Ag-Ab • Utk deteksi Antigen : digunakan Antibodi (monoklonal ataupun polikonal ) sehingga membentuk kompleks Imun (Ag-Ab) kompleks imun dapat diukur secara kualitatif atau kuantitatif • Serology : metode utk mendeteksi dan mengukur titer antibodi dalam serum darah dengan menambahkan Ag spesifiknya • 2 tipe Antibodi yang digunakan dlm immunoassay: poliklonal dan monoklonal 3
Pembuatan Antibodi monoklonal spesifik
Sel B
4
Antibodi Poliklonal Jika hewan coba diimunisasi dengan protein X (Ag) yg memiliki banyak epitop terhadap antibodi klon sel B memproduksi antibodi thd protein X Antibodi mungkin akan membentuk sejumlah paratop protein yang berbeda Campuran Ab yg diproduksi oleh respon terhadap antigen merupakan antibodi poliklonal 5
• Sampel yang diuji dapat berasal dari : – Antigen sample • Cairan tubuh yang mengandung mikroba penginfeksi dan toksin mikroba (mengandung Ag) Cth : Urine, feces, blood, skin, pus, swab, cairan amnion, mucous, etc. – Blood antiserum sample • Antiserum/ antisera darah mengandung Ab terhadap infeksi tertentu jika pasien terinfeksi oleh patogen yang dicurigai maka pada serumnya akan mengandung Ab terhadap patogen tsb. • Pengujian Ab pada darah setidaknya terdeteksi 2 minggu seteah imfeksi awal 6
Titer • Titer : sejumlah Ab yang terdapat pada antiserum Dapat digunakan untuk menentukan sejauh mana suatu penyakit mengalami peningkatan pada infeksinya • Tes Aglutinasi Direct dapat digunakan untuk mendeteksi titer Ab pada seseorang • Kondisi dimana seseorang tidak memiliki Ab sama sekali lalu Ab meningkat “seroconversion” 7
Komponen Penting Dalam Immunoassay a. b. c. d.
Spesifisitas Antibodi Valensi Antibodi Aviditas Antibodi Ukuran Kuantitas reaksi Ag-Ab
8
a. Spesifisitas Antibodi • Ikatan Ag-Ab spesifik key-lock • Namun terkadang terjadi reaksi silang Ab berikatan dengan Ag lain yg memiliki struktur mirip terjadi jika kemurnian Ag rendah Ab yang sangat spesifik : yang memiliki binding site yang hanya dimiliki oleh Ag dg struktur molekul yang unik Spesifisitas Ag-Ab dipengaruhi : 1. Spesifisitas Ab yang ditambahkan pd sampel 2. Kemurnian Ag (tidak ada Ag lain yg mengkontaminasi) 9
b. Valensi Antibodi • Jumlah binding site yang potensial dari Ab terhadap Ag yg spesifik • Valensi Ab minimal 2 umumnya
10
c. Aviditas Antibodi • Ukuran kekuatan Ab untuk mengikat Ag • Ab dg Aviditas besar kecenderungan mengikat Ag yang banyak • Aviditas refleksi afinitas (besarnya daya ikat) dan jumlah binding site (valensi)
11
d. Ukuran Kuantitas Reaksi Ag-Ab • Derajat imunitas, kadar Antibodi atau bahan tertentu dalam serum harus dapat diukur dinyatakan dalam suatu satuan/ unit tertentu • Beberapa cara penentuan : 1. Kualitatif : ada atau tidak adanya suatu bahan, baik Ab atau Ag dalam serum (uji + atau - ) cth : presipitasi pada uji VDRL, perubahan warna pada penentuan Hbs Ag 12
2. Semikuantitatif : kadar Ab atau Ag pada serum dengan cara pengenceran serum secara progresif • Kuantitas Ab dinyatakan dalam titer • Cth : uji Widal 3. Kuantitatif : kadar Ab ditentukan dengan membuat kurva baku standar terlebih dahulu terhadap kekeruhan (OD) didapat nilai korelasi Contoh : ELISA 13
Macam Immunoassay • Terdapat beberapa metode yang digunakan utk mendeteksi Ag-Ab, antara lain : • Immunoassay tak berlabel : a. Uji Presipitasi b. Uji Aglutinasi c. Uji Hemaglutinasi d. Lisis Imun e. Uji Netralisasi 14
• Immunoassay berlabel : a. b. c. d.
Berlabel Flouresens Berlabel Radioisotop Luminescent Assay (LIA) Berlabel Enzim
15
Immunoasay tak berlabel a. Uji presipitasi Bila suatu Ag terlarut bereaksi dg Abnya Beberapa macam cara/ uji presipitas yg sering dipakai : 1. Uji presipitasi lempeng/ slide cth : uji VDRL mikro 2. Uji presipitasi tabung 3. Uji presipitasi tabung kapiler cth : uji CRP 4. Uji presipitasi cincin terbentuk cincin presipitasi (uji +) 5. Imunoelektroforesis prinsip sama dengan elektroforesis 16
Liquid Precipitation
b. Uji Aglutinasi • Reaksi antara Ab-Ag seluler atau Ag permukaan sel • Macam-macam uji Aglutinasi : 1. Uji Aglutinasi lempeng cth : uji Widal Lempeng deteksi Ab thd S. Paratyphi 2. Uji Aglutinasi tabung - Dipakai jika aglutinasi berlangsung lambat 3. Uji Hambatan Aglutinasi utk menentukan Ag larut yg tdk diketahui identitasnya cth : uji konfirmasi RPHA (Reverse Passive Hemagglutination Test) utk penentuan HBs Ag 18
Uji aglutinasi : keberadaan Staphylococcus (antigen) direaksikan dengan IgG thd Staphylococcus Reaksi + jika ada kompleks imun 19
c. Uji Hemaglutinasi • Merupakan Uji Aglutinasi dari sel darah merah • Sel darah diaglutinasikan karena antigen yang ada pada darah • Mendeteksi Ab thd antigen sel darah merah • Sel darah merah yag diuji merupakan Ag pada tes agutinasi Cth : uji penentuan golongan darah • Jika darah memiliki Ag bergolongan A aglutinasi jika dengan keberadaan Ab thd Ag gol A 20
d. Lisis imun dan Fiksasi Komponen Kompleks imun tidak selalu terjadi antara Abx terhadap Ag pada permukaan sel Kompleks imun baru terbentuk jika ditambahkan antiimunoglobulin/ Ab thd Abx Sebagai ganti anti-imunoglobulin yaitu komplemen lisis sel Macam uji lisis imun : Uji Fiksasi Komplemen cth : deteksi Ab thd Virus, bakteri, fungi, parasit Interpretasi : + jika tidak hemolisis - hemolisis 21
22
Immunoassay berlabel 1. Berlabel flourescent • Uji immunoflourescent (IFA) ikatan/ kompleks Ag-Ab divisualisasikan dg adanya perpendaran flouresen dibawah mikroskop • Immunoflourecent : 1. Direct immunoflourescent : • Ab dilabel dg marker flourescent Ab secara langsung diberikan pada jaringan yg diinginkan 2. In-direct immunoflourescent • Menggunakan Ab yg tdk berlabel thd Ag yg diuji dengan Ab sekunder yang berlabel (yang berikatan spesifik dg Ab pertama) • Semakin banyak ikatan Ab sekunder sinyal floresen semakin meningkat 23
• Immunocytochemistry/ Immunofluorescence - Anti-alpha smooth muscle Actin antibody [1A4] (ab7817) staining alpha smooth muscle Actin (green) in Mouse primary colon myofibroblasts 24
Direct Immunoflourescent Fluorescent marker antibody
antigen
Frozen tissue section 25
Indirect immunofluorescece 2nd antibody with label
antigen
1st antibody
26
2. Berlabel radioisotop • uji laboratoris yg sensitif utk penentuan kadar beberapa bahan (hormon) • Diperlukan sampel dg bahan yg sedikit sudah dpt terdeteksi • Cth : Uji RIA (Radioimmunoassay) • Pelabelan dengan Radioisotop yg dipakai pada uji RIA : 3H, 14C, 57Co, 75Se, 125I, 131I • Keberadaan ik Ag-Ab yang berlabel diukur dengan gamma counter 27
3. Berlabel luminescent uji immunoluminescent (LIA) prinsip sama dg RIA dan IFA, hanya pada LIA label pada reaksi Ag-Ab menggunakan luminescent luminescent : a. bioluminescent : kunang2 b. chemiluninescent 4. Berlabel enzim pemberian label enzim pada Ag (ELISA) • Menggunakan enzim (ligan) yang membuat produk reaksi berwarna (chromogen) – intensitas warna menunjukkan jumlah Ag yang ada dalam sampel • Enzyme : horseradish peroxidase, phosphatase 28
ELISA • Enzyme Linked Immunosorbent Assay • Prinsip menggunakan reaksi perubahan warna (Colorimetric assay) • Enzim yg ditambahkan akan bereaksi dengan substrat memproduksi produk yg berubah warna • Direct - cth. Pada test kehamilan / test pack (hormon hCG)
• Indirect – Test HIV (rapid test)
ELISA iMark Microplate Absorbance Reader
Micro-plate reader
Positive result
96-well micro-plate
Imunohistokimia • Immunohistochemistry (IHC) mengkombinasikan teknik histologi, imunologi dan biokimia identifikasi komponen jaringan tertentu dg reaksi spesifik Ag atau Ab yang dapat divisualisasikan dg penempelan label • Label : flourescent, enzym, hapten, radioaktif • Ab mengikat Ag secara spesifik • Menunjukkan lokasi tertentu sel atau protein pada jaringan/ organ di preparat/ slide • Dapat digunakan untuk mengidentifikasi proses2 selular dalam jaringan/ organ, cth : apoptosis 32
Human ovarian Tumor, HE staining Sediaan tumor ovarium pada obyek glass Pada sediaan, ingin dilihat sel yg apoptosis
label
Pada sel yg apoptosis trdpt protein Fas L (sebagai Ag)
Di inkubasi dengan anti protein FasL (sebagai Ab) Label akan tervisualisasi jika ada kompleks Ag-Ab
Apoptotic cell
33
Aplikasi immunoassay 1. Deteksi hormon polipeptida ; cth : insulin and glucagon, hCG 2. Deteksi hormon steroid 3. Deteksi agen therapeutic pada pemantauan terapi obat; dan penyalahgunaan obat 4. Pengukuran enzim , protein dan komponen terlarut dalam darah lainnya; cth : pengukuran protein plasma, komplemen 5. Penggunaan penanda penyakit (disease marker) 34
Keuntungan menggunakan imunoasay : • • • •
sensitif untuk jumlah sampel yg rendah (ug/L (ppb) pemeriksaan cepat pemeriksaan relatif mudah dilakukan Pemeriksaan dapat dilakukan dimana saja (dg alat penunjang)
Kelemahan menggunakan imunoasay : •
reaksi silang /cross reaction – Ab mungkin dapat berikatan silang dg struktur Ag yg serupa • Relatif susah untuk menganalisa larutan yang bermacam-macam
Vaksinasi • Vaksinasi adalah aplikasi dari pirinsip imunoassay yang populer mengandung antigen dari suatu
mikroorganism (patogen) • Adanya paparan 1st Ag menginduksi sel B dan Sel T : respon adaptif • Paparan 2nd Ag menimbulkan respon yg lebih efektif dan cepat dibanding respon primer • Pada beberapa infeksi, respon primer terlalu lambat utk merespon
Vaksin
36
• Jika indvidu belum pernah terpapar Ag dari patogen X lalu diberikan vaksin (X) terjadi ekspansi sel memory dan peningkatan Ab spesifik thd patogen X mampu melindungi dari bahaya Ag serupa (X) pada paparan berikutnya • Vaksin : berisi organisme hidup/ organisme yg telah mati sama2 bersifat antigenik • Antigen pd vaksin dapat dibuat secara sintetik atau kloning gen dr organisme terkait • Imunitas ths penyakit infeksi dapat dicapai dg imunisasi/ imunoterapi 37
Imunoterapi Treatment of the disease by Inducing, Enhancing or Suppressing the Immune System.
Active Immunotherapy: -
Passive Immunotherapy: -
It stimulates the body’s own immune system to fight the disease.
It does not rely on the body to attack the disease, instead they use the immune system components ( such as antibodies) created outside the body.
Pasif (maternal)
Imunitas Adaptif
Natural Aktif (infeksi)
imunitas Artificial / buatan Imunitas innate
Pasif (antibodi transfer) Aktif (imunisasi) 39
Pustaka • Baratawijaya, 29, Imunologi dasar, edisi 9, UI Press. • Bush, RK., Diagnostic Test and AllergyChapter 1 • Handojo, I., 2003, Pengantar Imunoasai Dasar, Airlangga University Press, Surabaya • Zabriskie, JB., 2009, Essential Clinical : Immunological Techniques, Cambridge University Press 40
Thank You
41
