PRACTICA 4 CROMATOGRAFIA EN PAPEL INTRODUCCIÓN

LABORATORIO DE BIOQUIMICA I

PRACTICA 4 CROMATOGRAFIA EN PAPEL INTRODUCCIÓN La cromatografía (del griego chroma, color + graphein, escribir) fue descrita en 1903 por el británico ruso Mikhail Tswett, quien separó pigmentos de hojas de plantas mediante el uso de adsorbentes sólidos, es decir, un sólido a cuya superficie se unen las sustancias. La cromatografía incluye una serie de métodos analíticos de separación que tienen como característica general el estar constituidos de una fase estacionaria y una fase móvil, entre las que se distribuyen diferencialmente las sustancias a separar. Cuando la fase móvil, la que arrastra a las partículas que se van a separar, es un líquido (solvente o mezcla de solventes) se denomina cromatografía de líquidos. Si la fase móvil es un gas se denomina cromatografía de gases. En cuanto a la fase estacionaria, ésta puede ser de composición variada. Si dicha fase se utiliza un papel filtro, se denomina cromatografía en papel. La cromatografía en papel, desarrollada en 1941 por Archer Martin y Richard Synge, es una técnica en la que se plica un pequeño volumen de la muestra cerca de uno de los extremos de una hoja de papel filtro. Este tipo de cromatografía es ascendente, cuando el papel se sujeta a la parte superior de la cámara y se sumerge en el solvente que se encuentra en el fondo, haciendo que éste se mueva hacia arriba por capilaridad. Al realizarse la separación, los solutos de la mezcla original migran a lo largo del papel con diferentes velocidades, dependiendo de su solubilidad en el solvente, separándose. Si los compuestos son coloridos se puede ver fácilmente las manchas que deja sobre el papel, el caso contrario, hay que teñirlos con algún reactivo. La relación de migración de una sustancia (Rf), puede expresarse de acuerdo con la siguiente fórmula:

Rf =

Distancia recorrida por la muestra Distancia recorrida por la mezcla eluyente

Cada sustancia exhibe un valor de Rf característico en relación con un sistema disolvente dado y con el empleo de un tipo determinado de soporte. La cromatografía en papel puede aplicarse como técnica para la separación de aminoácidos y péptidos. Los aminoácidos proteicos son los ácidos carboxílicos portadores de funciones amina en el carbono α, como se muestra en la siguiente figura:

PRACTICA 4 CROMATOGRAFIA EN PAPEL


COOH H3N

+

C R

H

COO pK 1

H3N

+

C R

-

H

COO pK 2

H2N C

-

H

R

Existen veinte diferentes tipos de aminoácidos que forman a las proteínas (polipéptidos). De acuerdo con su grupo R, los aminoácidos se pueden clasificar en: no polares, polares sin carga, polares con carga negativa y polares con carga positiva. El aspartame (L-aspartil-Lfenilalanina metiléster) es un edulcorante que se elabora industrialmente y tiene el sabor dulce y puro del azúcar de mesa (sacarosa), pero solo añaden cantidades mínimas de calorías. Se utiliza en una gran variedad de alimentos dietéticos, como refrescos, yogurt, goma de mascar y endulzantes de mesa. Este dipéptido formado por los aminoácidos fenilalanina y ácido aspártico, tiene, entre otros nombres comerciales, los de Nutrasweet y Canderel. En la actualidad el uso del aspartame se ha generalizado en la elaboración de productos dietéticos, ante el amplio número de investigaciones que el aspartame es seguro para el consumo humano. Sin embargo, algunas investigaciones cuestionan el uso de este producto, ya que durante su metabolismo en los organismos, el aspartame se descompone en los aminoácidos fenilalanina y el ácido aspártico y en alcohol metílico. Los aminoácidos y los péptidos, entre ellos los dipéptidos como el aspartame, puede ser separados, dependiendo de su solubilidad, en solventes polares o no polares utilizando técnicas analíticas de separación como la cromatografía en papel. OBJETIVO GENERAL Determinar la presencia de un edulcorante artificial en una muestra problema mediante su (Rf) y ver sus propiedades de solubilización comparándolo con los Rf de los aminoácidos que lo componen. OBJETIVO PARTÍCULAR • • •

Separar aminoácidos y péptidos mediante el uso de la cromatografía en papel. Determinar el corrimiento cromatográfico de un aminoácido polar y uno no polar, comparando el Rf de cada uno de ellos. Separar e identificar por medio de la técnica de cromatografía en papel, el aspartame presente en el refresco dietético, comparando su Rf con el del Canderel.



MATERIALES Y METODO 1 7 1 1 1 1 1 1 1 1

MATERIALES Hoja de Papel Whatman No2 para cromatografía Capilares de Vidrio Cámara para Cromatografía en papel Placa de Calentamiento Probeta de 100 mL ALUMNOS Atomizador de Vidrio de 50 o 100 mL Pliego de Cartulina Regla de 30 cm Par de guantes desechables Secadora de Cabello

1 1 1 1

ALUMNOS Tijeras Sobre de Canderel o de Nutrasweet Lata con refresco normal sin colorante Lata con refresco de Dieta sin colorante REACTIVOS Ácido Aspártico Fenilalanina Ninhidrina Butanol Acido Acético Isopropanol acetona

Soluciones • Solución de isopropanol al 10% (v/v) • Solución de ácido aspártico 0.002M (0.026 en 100 mL de isopropanol al 10%) • Solución de fenilalanina 0.002M (0.033g en 100 mL de isopropanol al 10%) • Solución de Ninhidrina al 0.2% (0.2g en 100 mL de acetona). • Solución de butanol: acido acético: agua, en proporción 12:3:5 (v/v) • Canderel al 1% (1g en 100 mL de agua) METODO 1. Colocar un volumen de la mezcla butanol: acido acético: agua en la cámara para cromatografía, tal que no sobrepase el nivel de 1 cm y taparla para que se sature a temperatura ambiente (25ºC). Si la temperatura ambiente es baja, se debe colocar la cámara cerca de una placa de calentamiento dentro de la campana de extracción de vapores. 2. Usar guantes para cortar un fragmento de 20 x 9 centímetros de una hoja de papel Whatman, el cual debe colocarse sobre la superficie de una cartulina nueva. Marcar el fragmento de papel con una flecha que indique el sentido en que correrán las muestras, el cual viene señalado en la caja de papel Whatman (ver figura) 3. En el lado más angosto del papel Whatman, y considerando el sentido en que correrán las muestras, trazar con lápiz una línea a un centímetro del borde. Sobre ésta línea marcar cinco puntos equidistantes, dejando un margen de 0.5cm en cada extremo (ver figura). 4. Tomar una alicota de fenilalanina, utilizando un capilar de punta adelgazada, y ponerla sobre uno de los puntos marcados en el papel. Secar la aplicación con la secadora de cabello. Realizar cinco aplicaciones secando en cada ocasión. Hacer lo mismo con el ácido aspártico, Canderel o Nutrasweet, refresco normal y de dieta. 5. Cuando se hayan aplicado las alícuotas de las cinco muestras, hacer dos perforaciones en la parte superior de la hoja y colocar dos hilos de aproximadamente 30cm de largo (ver figura) 6. Colocar la hoja de papel dentro de la cámara de cromatografía, sosteniéndola mediante los hilos en una posición tal que sea humedecida en forma homogénea por la mezcla butanol: acido acético: agua, pero si que las PRACTICA 4 CROMATOGRAFIA EN PAPEL


manchas de las sustancias a separar sean cubiertas por la mezcla. El papel debe mantenerse en esta posición vertical durante todo el procedimiento. Para ello se deben sujetar los hilos a las paredes externas de la cámara cromatográfica con un trozo de cinta adhesiva. Cerrar la cámara y colocarla dentro de la campana de extracción del laboratorio. 9cm

Tapa

20cm

Cámara Cromatográfica Fase Móvil 1 cm

0.5cm 0.5cm

7. Dejar correr la cromatografía durante dos horas aproximadamente. Sacar el papel de la cámara, marcar con un lápiz la posición donde llego el disolvente después del tiempo y dejar secar al aire. 8. Para revelar la posición de las sustancias que se corrieron en la cromatográfica, se rociará el papel con una solución de ninhidrina contenida en el atomizador. El rociado se realiza en forma homogenea y a una distancia de unos 10 cm. Secar el papel en una estufa a 100ºC por diez minutos. 9. Una vez seco el papel. Marcar con un lápiz los limites de las manchas que aparecen y tomar la distancia entre el centro de la mancha y el punto de aplicación. A partir de estos datos y distancia a la que llego el solvente, determinar el Rf de cada uno de los compuestos que se aplicaron en el papel, mediante la formula mencionada en la introducción. Las soluciones utilizadas en esta práctica pueden eliminarse en la tarja, manteniendo la llave del agua abierta para diluir y al terminar lavar la tarja. RESULTADOS 1. Elaborar un cuadro donde mencione el Rf de cada aminoácido (fenilalanina y ácido aspártico), así como los de la muestra de Canderel o Nutrasweet, refresco normal y refresco de dieta. 2. Determine el Rf de cada muestra y ordene los valores en forma ascendente.



ANALISIS DE RESULTADOS Entregar al profesor los resultados obtenidos para su recopilación grupal. El análisis de los resultados aplicara para todos los equipos. Después de alcanzar los resultados individuales; compare el CV obtenido entre los equipos. 1. ¿Todas las muestras presentan el mismo Rf? 2. ¿De que depende el desplazamiento de cada muestra? 3. ¿El aspartame o Nutrasweet esta presente en alguno de los refrescos probados? 4. Si tu respuesta fue afirmativa ¿Cómo llegaste a esa coclusion? 5. El Rf de los refrescos normal y de dieta ¿Es el mismo? ¿Por qué? CUESTIONARIO 1. 2. 3. 4.

¿Qué son las fase estacionaria y móvil de un sistema cromatográfico? ¿Cómo se puede modificar la fase móvil en un sistema cromatográfico? ¿Qué es el Rf de una sustancia? Investigue las características de los aminoácidos utilizados en la práctica y como se clasifican. 5. Investigue los Rf reportados en la literatura para los aminoácidos aquí utilizados, anote el sistema de fase móvil y fase estacionaria utilizados para obtenerlos. 6. Realice una investigación sobre el uso actual del aspartame. Anote los posibles beneficios y perjuicios del uso del producto. BIBLIOGRAFIA 1. Ayres, G. 1970. Análisis Químico Cuantitativo, 2ª Edición, Harper & Row Latinoamericana, México. 2. Boyer, R. 2000. Conceptos de Bioquímica. Internacional Thompson Editores, México. 3. Day, R. A. Jr., Underwood, A. L. 1989. Química Analítica Cuantitativa 5ª Ed., Prentice-Hall Hispanoamericana, México. 4. Harris, D. C. 1992 Análisis Químico Cuantitativo. Grupo Editorial Iberoamericana, México 5. Pickering, W. F. 1976. Química Analítica Moderna. Editorial Reverté, España. 6. Voet, D. y Voet, G. J. 1995 Bioquímica, Omega Ediciones, Barcelona. 7. Vogel A. I. 1983. Textbook of Cuantitative Inorganic Análisis. 4ª Edición, Editorial Richard Clay (The Chauser Press) Ltd. Bungay, Gran Bretaña. 8. Mathews C. K., Van Holde K. E., Ahern K. G. 2003. Bioquímica. Addison-Wesley, España. 9. http://www.nietoeditores.com.mx/articulos.php?id_sec=1&id_art=20 10. http://www.uprm.edu/biology/profs/velez/cromatografias.htm 11. http://web.indstate.edu/theme/nwking/biomolecules.htmls.


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