Volume 5, Nomor 9, Oktober 2015
ISSN 2085-7764
JURNAL KESEHATAN
RAJAWALI Jurnal Ilmu-Ilmu Kesehatan
JURNAL ENAM BULANAN Hubungan Cara Menyusui Dengan Kejadian Payudara Bengkak Pada Ibu Nifas Di Puskesmas Parongpong Periode Mei Tahun 2015 Gambaran Penilaian Status Gizi Riwayat Kehamilan Pada Ibu Bersalin Dan Berat Badan Bayi Baru Lahir Di Puskesmas Melong Asih Kota Cimahi Tahun 2014 Pola Asuh, Kecerdasan Emosional, Dan Anak Usia Pra Sekolah (3-6 Tahun) Di Tk-Nurul Ikhlas Cibiru Bandung Peran Bidan Dalam Mendukung Pemberian Air Susu Ibu Pengujian Konsentrasi Gel Agarosa 1% Dan 1,2% Pada Elektroforesis DNA Mycobacterium Tuberculosis Perbandingan Hasil Pemeriksaan Hitung Jenis Leukosit Menggunakan Metode Manual Dengan Laser-Based Flowcytometry Diterbitkan oleh Sekolah Tinggi Ilmu Kesehatan (STIKes Rajawali Bandung)
JURNAL KESEHATAN RAJAWALI Jurnal Ilmu-Ilmu Kesehatan Volume 5, Nomor 9, Oktober 2015
ISSN 2085-7764
Jurnal Kesehatan Rajawali merupakan jurnal ilmu-ilmu kesehatan yang memuat naskah hasil penelitian bidang ilmu keperawatan, kebidanan dan analis kesehatan. Diterbitkan 6 bulan sekali pada bulan Maret dan Oktober
Penanggungjawab Tonika Tohri. S.Kp., M.Kes Pemimpin Redaksi Eny Kusmiran, S.Kp., M.Kes Wakil Pimpinan Redaksi Ally Kafesa, S.ST.,M.Si Redaksi Pelaksana Iga Retia, S.ST
Redaksi Rustandi, dr., M.P.H. H. Rachmat Sobarna, dr., Sp.O.G. Handarini, S.Pd.,M.Si Istianah S.Kep. Ners Erni Hernawati, S.S.T.,M.M
Sekretaris Redaksi Artha Kusumawardani, S.ST Humas Faruk Rasyid, S.E. Tata Usaha Fotuho Woruwu, S.E.
Alamat Redaksi Sekolah Tinggi Ilmu Kesehatan Rajawali Jalan Rajawali Barat Nomor 38 Bandung Email:
[email protected]
Vol.5, No.9, Oktober 2015;19-23
PENGUJIAN KONSENTRASI GEL AGAROSA 1% DAN 1,2% PADA ELEKTROFORESIS DNA Mycobacterium Tuberculosis Suyarta Efrida Pakpahan
ABSTRACT Introduction: Tuberculosis (TB) is an infectious disease caused by Mycobacterium tuberculosis. Indonesia as the country with the highest number of TB patients to 4th in the world after India, China, and South Africa (WHO). Failure prevention of tuberculosis, one of which caused by errors in the diagnostic process. The purpose of this study to determine the concentration of 1% agarose gel to produce quality tape / band DNA better than the concentration of 1.2% agarose gel electrophoresis of DNA Mycobacterium tuberculosis. This research method is experimental study, in which as many as 15 samples used sputum samples with positive test results on microscopic examination Ziehl Neelsen. Research data obtained are then processed by descriptive statistical tests. The result of data processing obtained on average processing image J at a concentration of 1% agarose gel that is higher than 0.57 cm2 on 1.2% agarose gel concentration is 0.42 cm2.The conclusions of this study there are differences in test results between agarose gel concentration of 1% to 1.2% agarose electrophoresis of Mycobacterium tuberculosis DNA.
Keywords: Concentration of agarose gel, Mycobacterium tuberculosis.
PENDAHULUAN Penyakit Tuberkulosis (TB) merupakan penyakit menular yang disebabkan oleh Mycobacterium tuberculosis. Penyakit ini merupakan penyebab utama kematian akibat penyakit infeksi di seluruh dunia setelah HIV. Di Indonesia, penyakit ini masih menjadi masalah kesehatan di masyarakat. Hal ini dibuktikan dengan Indonesia sebagai negara dengan pasien TB terbanyak ke-4 didunia setelah India, Cina, dan Afrika Selatan (WHO) 1. Kegagalan penanggulangan penyakit tuberkulosis, salah satunya dikarenakan kesalahan pada proses diagnosis. Pada umumnya metode diagnosis penyakit tuberkulosis dilakukan secara konvensional seperti pemeriksaan mikroskopis dan kultur. Namun, metode tersebut memiliki banyak kelemahan. Pada pemeriksaan mikroskopis hasil pemeriksaan yang didapatkan kurang sensitif dan tidak spesifik terhadap spesies bakteri M. tuberculosis. Pemeriksaan mikroskopik memerlukan bakteri 2 minimal 10.000 sel/ml . Pemeriksaan kultur merupakan metode gold standar, tetapi memerlukan 3 waktu yang cukup lama (paling cepat sekitar 6 minggu) untuk mendapatkan hasil pemeriksaan . Dalam mengatasi keterbatasan cara diagnosis tersebut, sejumlah penelitian mengembangkan metode berdasarkan pada amplifikasi DNA menggunakan metode PCR. Metode PCR merupakan metode yang cepat, sensitif dan spesifik jika dibandingkan dengan pemeriksaan kultur. Tahap pertama yang dilakukan dalam metode PCR adalah proses isolasi DNA. Isolasi DNA ini digunakan untuk memperoleh DNA murni yang dilakukan dengan proses melisiskan membran sel, yang dilanjutkan dengan tahap ekstraksi dan pemisahan DNA dari berbagai komponen 4 sel yang tidak diinginkan seperti protein dan RNA . Setelah proses isolasi DNA, kemudian konsentrasi DNA diukur menggunakan spektrofotometer untuk mengetahui kemurnian DNA yang dilakukan pada panjang gelombang 260nm-280nm. Metode PCR (Polymerase Chain Reaction) merupakan metode amplifikasi (penggandaan) DNA dengan cepat segmen DNA tertentu yang spesifik 5.. Hasil metode PCR selanjutnya divisualisasikan pada elektroforesis Elektroforesis gel agarosa merupakan metode standar yang digunakan untuk identifikasi, pemisahan, dan purifikasi fragmen 6. DNA Konsentrasi gel agarosa yang digunakan dalam proses elektroforesis merupakan salah satu faktor yang berpengaruh dalam laju migrasi DNA untuk memisahkan molekul DNA berdasarkan berat 7 molekul . Penggunaan gel dengan konsentrasi yang berbeda, dapat menghasilkan perbedaan ukuran Pengujian Konsentrasi Gel Agarosa 1% dan 1,2% Pada Elektroforesis DNA Mycobacterium tuberculosis (Suyarta Efrida Pakpahan) |
19
Vol.5, No.9, Oktober 2015;19-23 fragmen DNA. Molekul DNA berbanding terbalik dengan konsentrasi gelnya yaitu konsentrasi gel agarosa yang rendah memberikan resolusi yang baik untuk fragmen yang besar antara band yang dekat ukurannya8. Penelitian mengenai hasil elektroforesis DNA menggunakan Mycobacterium tuberculosis telah dilakukan oleh Bahar dan Chintia. Pada kedua penelitian tersebut, terdapat perbedaan metode isolasi DNA dan konsentrasi gel agarosa yang digunakan pada saat elektroforesis yakni isolasi DNA dengan metode boom yang dilanjutkan elektroforesis menggunakan konsentrasi gel agarosa 1% oleh dan isolasi DNA metode salting out dengan elektroforesis menggunakan konsentrasi gel agarosa 1,2% 8,9. Hingga saat ini belum diketahui bagaimana perbedaan hasil elektroforesis DNA Mycobacterium tuberculosis menggunakan metode isolasi DNA yang sama dan menggunakan konsentrasi gel agarosa 1% dan 1,2% pada saat elektroforesis. Berdasarkan latar belakang diatas, penulis bermaksud melakukan penelitian ”Pengujian Konsentrasi Gel Agarosa 1% dan 1,2% pada Elektroforesis DNA Mycobacterium tuberculosis.
METODE PENELITIAN Penelitian ini dilakukan untuk menentukan konsentrasi gel agarosa yang dapat menghasilkan band/pita yang jelas pada saat visualisasi menggunakan alat elektroforesis pada pemeriksaan bakteri Mycobaterium tuberculosis. Kriteria Sampel yang digunakan adalah sampel sputum dengan hasil pemeriksaan positif pada pemeriksaan mikroskopis pewarnaan Basil Tahan Asam (BTA). Sampel yang digunakan sebanyak 15 sampeli dari Puskesmas Melong Asih dan Puskesmas Cibeureum serta dari RSAU Dr. M. Salamun. Sputum dicampur dengan larutan NaOH 1N dengan perbandingan 1:1. didiamkan selama 30 menit. Dari campuran tersebut diambil 1,5 mL, masukkan ke dalam tabung eppendorf dicentrifuge selama 5 menit pada kecepatan 11.000xg lalu pellet diambil kemudian ditambahkan 250 l buffer lisis dan 5 l proteinase K diinkubasi pada suhu 55ºC selama 1jam kemudian diinkubasi kembali pada suhu ruang selama 5 menit, lalu ditambahkan 300 l fenol. Selanjutnya divortex selama 5 menit, disentrifuge 5 menit pada kecepatan 14.000xg. Selanjutnya dipindahkan fase atas A l (sesuai banyaknya fase atas yang terbentuk, minimal 200 l). Fase atas(A) + (0,1xA) l NaOAC +(1,4xA) l etanol absolut lalu dibolak-balik perlahan lalu campuran tersebut disimpan pada suhu -20ºC selama 30 menit. Campuran kemudian disentrifuge selama 15 menit pada kecepatan 14.000xg sehingga terbentuk supernatan dan filtrat. Selanjutnya dekantasi supernatan tambahkan 200 l etanol 70%, sentrifuge 5 menit dengan kecepatan 10.000xg. Supernatan dibuang keringkan dengan menggunakan alat speed vac. DNA dilarutkan dengan menambahkan 25 l H2O free RNAse. DNA diukur konsentrasinya menggunakan alat spektrofotometer. Agar didapatkan hasil elektroforesis yang baik, diperlukan proses isolasi DNA yang benar. Konsentrasi DNA yang layak diamplifikasi 1,8-2,0. Hasil isolasi DNA tersebut kemudian diamplifikasi menggunakan metode PCR (Polymerase Chain Reaction) dan divisualisasikan dengan metode elektroforesis menggunakan dua konsentrasi gel agarosa yang berbeda yaitu konsentrasi gel agarosa 1% dan 1,2%. Pembuatan gel agarosa; agarosa serbuk ditimbang sesuai dengan konsentrasi yang akan dibuat (1,0% dan 1,2%) dilarutkan dalam buffer TAE 1x dipanaskan pada hotplate hingga mendidih dan berwarna jernih. Setelah mendidih, gel didinginkan hingga suhu ±55ºC lalu ditambahkan Cybr green sebanyak 1,5 l dan dihomogenkan. Gel selanjutnya dimasukkan kedalam cetakan yang telah disisipkan sisir elektroforesis dibagian sisi-sisinya. Gel dibiarkan membeku (± selama 30 menit). Lakukan elektroforesis hasil PCR. Hasil PCR dilihat menggunakan alat UV translluminator/gel dokumen. Lihat fragmen DNA yang terbentuk dan dibandingkan dengan kontrol positif dan marker Hind III 281-310 pb. Hasil : Positif : terbentuk pita/band yang sejajar dengan kontrol positif dan ada diantara 281-310 pb. Negatif : tidak terbentuk pita/band. Luas area ketebalan pita/band DNA yang terbentuk dari hasil elektroforesis kemudian diolah menggunakan software image J.
HASIL PENELITIAN Hasil dari grafik dibawah ini menunjukkan luas area pita/band DNA hasil elektroforesis dengan konsentrasi gel agarosa 1% dan 1,2% lalu diukur menggunakan image J. Penghitungan image J dilakukan dengan 10 kali pengulangan. Pengujian Konsentrasi Gel Agarosa 1% dan 1,2% Pada Elektroforesis DNA Mycobacterium tuberculosis (Suyarta Efrida Pakpahan) |
20
Vol.5, No.9, Oktober 2015;19-23
Data hasil luas area pita/band DNA hasil elektroforesis dengan konsentrasi gel agarosa 1% dan 1,2% yang telah diolah menggunakan image J, kemudian dilakukan uji statistik deskriptif menggunakan software SPSS. Tabel 4.2 menunjukkan hasil nilai rata-rata (mean), dan standar deviasi pada konsentrasi gel agarosa 1% dan 1,2%. Sedangkan tabel 4.3 menunjukkan hasil nilai tertinggi dan nilai terendah pada konsentrasi gel agarosa 1% dan 1,2%.
Tabel 4.2 Nilai rata-rata dan standar deviasi konsentrasi gel agarosa 1% dan 1,2%.
Konsentrasi Gel
Nilai rata-rata
Standar deviasi
Pengujian Konsentrasi Gel Agarosa 1% dan 1,2% Pada Elektroforesis DNA Mycobacterium tuberculosis (Suyarta Efrida Pakpahan) |
21
Vol.5, No.9, Oktober 2015;19-23
Agarosa Konsentrasi 1% Konsentrasi 1,2%
cm2 0,57 0,42
cm2 0,25 0,14
Tabel 4.3 Nilai tertinggi dan terendah pada konsentrasi gel agarosa 1% dan 1,2%
Konsentrasi Gel Agarosa Konsentrasi 1% Konsentrasi 1,2%
Nilai tertinggi cm2 0,99 0,73
Nilai terendah cm2 0,20 0,18
PEMBAHASAN Secara umum perbedaan hasil elektroforesis dapat dilihat dengan visualisasi secara langsung. Tetapi untuk memperoleh nilai ketebalan DNA maka hasil elektroforesis selanjutnya difoto menggunakan alat gel dokumen yang ditunjukkan pada gambar 4.1 dan gambar 4.2, selanjutnya hasil kemudian diolah menggunakaan software image J. Terdapat beberapa penelitian yang menggunakan software image J untuk mengukur ketebalan atau kerapatan pita/band DNA. Software image J digunakan untuk mengukur ketebalan pita/band DNA10. Prinsip pembacaan menggunakan image J adalah berdasarkan hasil ketebalan pita/band DNA dari sampel menjadi bentuk densitogram sehingga dapat diketahui luas area puncak masing-masing band DNA yang terpisah11. Hasil elektroforesis yang didapatkan sesuai dengan nilai pengukuran menggunakan image J, semakin tebal pita/band semakin besar nilai image J seperti yang dijelaskan pada penelitian Suci11 Pada grafik 4.1 dapat dilihat data hasil pemeriksaan menggunakan image J. Hasil pengukuran tersebut menunjukkan perbedaan nilai ketebalan dan tingkat kejelasan pita/band DNA pada konsentrasi gel agarosa 1% yang lebih tinggi dibandingkan konsentrasi 1,2%. Hasil data dari image J selanjutnya diuji menggunakan uji statistik deskriptif menggunakan software SPSS. Didapatkan nilai rata-rata (mean), standar deviasi, nilai tertinggi (maksimum) dan terendah (minimum) dari konsentrasi gel agarosa 1% dan 1,2% yang ditunjukkan pada Tabel 4.2 dan 4.3. Tabel 4.2 menunjukkan adanya perbedaan rata-rata antara konsentrasi gel agarosa 1% dan 1,2% dengan selisih nilai mean sebesar 0,15 cm2 dan hasil yang lebih tinggi pada konsentrasi 1% yaitu 0,57 cm2 dan konsentrasi 1,2% yaitu 0,42 cm2. Hasil standar deviasi yang digunakan sebagai ukuran untuk membandingkan penyebaran dua kelompok pengamatan menunjukkan hasil 0,25 cm2 pada konsentrasi gel agarosa 1% dan 0,14 cm2 pada konsentrasi gel agarosa 1,2%. Sedangkan pada tabel 4.3 menunjukkan nilai tertinggi (maksimum) pada konsentrasi gel agarosa 1% yaitu 0,99 cm2 lebih tinggi dibandingkan konsentrasi gel agarosa 1,2% yaitu 0,73 cm2 dan nilai terendah (minimum) pada konsentrasi gel agarosa 1% yaitu 0,20 cm2 lebih tinggi pula dibandingkan konsentrasi gel agarosa 1,2% yaitu 0,18 cm2. Hasil penelitian dan pengolahan data menggunakan uji statistik deskriptif yang telah dilakukan terdapat perbedaan hasil penelitian pengujian konsentrasi gel agarosa 1% dan 1,2% yaitu nilai ratarata, hasil standar deviasi, nilai tertinggi (maksimum) dan nilai terendah (minimum) pada konsentrasi gel agarosa 1% lebih tinggi dibandingkan konsentrasi gel agarosa 1,2%. Lalu dapat dilihat pula dari hasil elektroforesis pada gambar 4.1 dan gambar 4.2, maka konsentrasi gel agarosa 1% memberikan hasil elektroforesis yang lebih baik. Migrasi DNA yang baik dipengaruhi oleh beberapa faktor yaitu ukuran molekul DNA, konformasi DNA, voltase yang digunakan dan konsentrasi gel agarosa yang digunakan. Pemisahan molekul-molekul efektif dengan cara menyeleksi terlebih dahulu gel yang tepat. Hal ini didukung oleh Sambrook yang mengungkapkan bahwa penggunaan konsentrasi agarosa merupakan salah satu faktor yang berpengaruh dalam laju migrasi DNA dan penggunaan gel dengan konsentrasi yang berbeda dapat mengatasi perbedaan ukuran fragmen DNA7. Konsentrasi gel agarosa yang rendah memberikan resolusi yang baik untuk fragmen yang besar antara band yang dekat ukurannya. Berdasarkan literatur tersebut, fragmen DNA Mycobacterium tuberculosis yang termasuk fragmen besar dapat menggunakan konsentrasi gel agarosa yang lebih rendah yaitu konsentrasi gel agarosa 1% untuk memberikan hasil resolusi yang baik .
Pengujian Konsentrasi Gel Agarosa 1% dan 1,2% Pada Elektroforesis DNA Mycobacterium tuberculosis (Suyarta Efrida Pakpahan) |
22
Vol.5, No.9, Oktober 2015;19-23 Penelitian ini memberikan informasi mengenai pengujian konsentrasi gel agarosa 1% dan 1,2% pada elektroforesis DNA Mycobacterium tuberculosis yang belum pernah dilaporkan sebelumnya. Informasi tersebut diharapkan dapat menambah referensi dan informasi mengenai penggunaan konsentrasi gel agarosa yang paling efisien yang dapat digunakan pada elektroforesis DNA Mycobacterium tuberculosis. Konsentrasi gel agarosa yang lebih rendah, dapat menghasilkan resolusi yang lebih baik untuk elektroforesis DNA Mycobacterium tuberculosis dan dapat mengurangi penggunaan agarosa pada proses pembuatan gel agarosa12.
KESIMPULAN
1. Berdasarkan hasil penelitian dan pengolahan data “Pengujian konsentrasi gel agarosa 1% dan 1,2% pada elektroforesis DNA Mycobacterium tuberculosis” dapat disimpulkan bahwa: Rata-rata hasil pengolahan image J pada konsentrasi gel agarosa 1% yaitu 0,57 cm 2 lebih tinggi dibandingkan pada konsentrasi gel agarosa 1,2% yaitu 0,42 cm2. 2. Terdapat perbedaan hasil pemeriksaan elektroforesis DNA pada konsentrasi gel agarosa 1% dan 1,2% yaitu pada konsentrasi gel agarosa 1% band DNA terlihat lebih jelas dibandingkan pada konsentrasi gel agarosa 1,2%.
SARAN 1. Untuk tenaga kesehatan disarankan menggunakan metode diagnosis yang cepat dan tepat untuk mencegah terjadinya penyebaran penyakit tuberkulosis akibat keterlambatan diagnosis, alternatif pertama untuk mendeteksi dini penyakit tersebut perlu digunakan metode PCR (Polymerase Chain Reaction) dengan menggunakan konsentrasi gel agarosa 1% pada tahap visualisasi elektroforesis. 2. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut disarankan untuk melakukan penelitian konsentrasi gel agarosa pada Mycobacterium sp. dengan menggunakan sampel darah.
KEPUSTAKAAN 1. World Health Organization. Global Tuberculosis Report 2013. France: World Health Organization; 2013. 2. Lina M, Pratiwi S, Fera I. Sensitivitas metode PCR (Polymerase chain reaction) dalam mendeteksi isolat klinis Mycobacterium tuberculosis. 2002; 21(1): 7-14. 3. Perhimpunan Dokter Paru Indonesia. Tuberkulosis, pedoman diagnosis & penatalaksanaan di Indonesia. Jakarta: Perhimpunan Dokter Paru Indonesia; 2006 4. Fatchiyah. Biologi Molekuler Prinsip Dasar Analisis. Jakarta: Erlangga; 2011. p. 112-113. 5. Campbell, A. Biologi Moleculer. Jakarta: Erlangga; 2008. p. 437-438. 6. Sudjadi. Bioteknologi Kesehatan. Yogyakarta: Kanisius; 2008. p. 39-40. 7. Sambrook, Joseph. Moleculer Cloning A Laboratory Manual 3rd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2007. p. 5.4-5.6. 8. Bahar, Elizabeth. Aplikasi Metoda Loop Mediated Isothermal Amplification (LAMP) Terhadap Gen MPB64 (Rv3036c) Sebagai Diagnosis Cepat Infeksi M. Tuberculosis. Lampung 2013: 253-257. 9. Chintia, Dewita. Gambaran Hasil Pemeriksaan Mycobacterium tuberculosis Metode Pewarnaan BTA Ziehl Neelsen dan Metode Polymerase Chain Reaction (PCR) 10. I Nyoman, Rahmat A, Yuniar M. Pusat Ilmu Hayati Institut Teknologi Bandung. Penanda molekul DNA Mikrosatelit untuk Karakterisasi Bibit Jamur Kuping (Auricularia polytricha [Mont.] sacc.) 2008 Jan 7; 13(1): 12. 11. Suci, Fitriani. Bogor Agricultural University Scientific Repository : Diferensiasi Temulawak, Kunyit, dan Bangle Berdasarkan Interpretasi Kromatografi Lapis Tipis Menggunakan ImageJ: 2011; 12(5): 4-14. 12. Bintang Maria, Biokimia Teknik Penelitian. Jakarata: Erlangga; 2010; p.37. 13. Lee, S. RESEARCH NOTE. Modified gel preparation for distinct DNA fragment analysis in agarose gel electrophoresis. 2010. 27(2): 351-354.
Pengujian Konsentrasi Gel Agarosa 1% dan 1,2% Pada Elektroforesis DNA Mycobacterium tuberculosis (Suyarta Efrida Pakpahan) |
23
