TÉCNICAS PARA DIAGNÓSTICO MOLECULAR. A busca por alternativas rápidas e eficazes de diagnóstico são cada vez mais
necessárias, uma vez que contribuem para a erradicação de enfermidades antes que estas provoquem sinais clínicos irreversíveis e taxas de mortalidade elevada. Em vista disso, o diagnóstico molecular, representado pelas técnicas de PCR e Sequenciamento, possui alta sensibilidade e especificidade, utiliza quantidade reduzida de volume amostral, e rapidez na detecção de patógenos, constituindo uma alternativa a ser explorada. A PCR (Reação de Polimerização em Cadeia) é uma metodologia que se baseia na amplificação exponencial seletiva de uma região específica do DNA de um organismo. Suas aplicações são inúmeras, desde o diagnóstico médico, mapeamento genético, detecção de doenças hereditárias, clonagem de genes, testes de paternidade, até identificação de bactérias que causam doenças em piscicultura… De fato, a PCR revolucionou várias áreas como a Biologia Molecular, Patologia, Farmácia, Botânica, Medicina Forense e valeu o prêmio Nobel, em 1993, a Kary Mullis. Um ciclo de PCR consiste em três fases: desnaturação do DNA molde (a ± 95°C), anelamento dos primers (a ±64°C) e polimerização do DNA (a 72°C). Na 1ª etapa fazse a separação das cadeias de dupla hélice de DNA através do calor. Esta separação é essencial para que, na 2ª fase, dois primers se liguem às sequências dos pares de bases complementares da cadeia molde. Estes primers são desenhados e sintetizados de modo a ligarem-se às extremidades opostas de cada uma das cadeias de DNA molde que se pretende amplificar. Os primers servem, portanto, de ponto de partida para a replicação de DNA e, na última etapa, faz-se a sua extensão. A enzima responsável por esta polimerização é a DNA polimerase termo-estável (Taq), tendo sido isolada a partir da bactéria termofílica Thermus aquaticus que vive em elevadas temperaturas. Para executar este ciclo usa-se um termociclador, que faz variar de forma rigorosa o tempo e a temperatura ao longo do ciclo. Normalmente são repetidos cerca de 30 ciclos, o que demora apenas algumas horas. Assim, duas novas cadeias são sintetizadas a partir da cadeia molde em cada ciclo completo de PCR logo dá-se um crescimento exponencial, havendo ao fim de n ciclos 2n vezes mais cópias do que no início (CARRAPATA, et al., 2005). Já o sequenciamento de é uma série de métodos bioquímicos que têm como finalidade determinar a ordem das bases nitrogenadas adenina (A), guanina (G), citosina
(C) e timina (T) da molécula de DNA, seja um único gene ou o genoma completo de um organismo. As sequencias de DNA são "lidas" por máquinas de sequenciamento automático, capazes de ler até 1000 nucleotídeos ou bases de uma só vez. Um algoritmo de montagem de genoma é então utilizado para reunir todas as partes e colocá-las na ordem original, detectando todos os locais onde existe coincidências entre pedaços distintos de DNA. As partes coincidentes podem ser fundidas, unindo dois pedaços de DNA. O processo é repetido até montar a sequência completa (Darnell et al., 1990).
TÉCNICAS PCR E SEQUENCIAMENTO Após coleta bacteriana com “swab” estéril nas lesões características do peixe, o “swab” será inserido em tubo estéril contendo meio de cultura apropriado para multiplicação bacteriana. Após incubação em estufa bacteriológica, será feita semeadura em meio semi-sólido adequado e incubado em temperatura ótima. Após isolamento e purificação das colônias bacterianas, a confirmação da identificação da espécie será feita com base na extração do DNA, PCR para amplificação do gene 16S rDNA e sequenciamento deste produto de PCR.
1 EXTRAÇÃO DNA BACTERIANO A metodologia utilizada será a recomendada pelo fabricante do kit Axyprep® miniprep para DNA genômico bacteriano (AXIGEN).
2 QUANTIFICAÇÃO DO DNA A quantificação das amostras extraídas (ng/μL) e a contaminação por proteínas será mensurada espectrofotometricamente através do aparelho NanoDrop® (Thermo Fisher Scientific). A concentração do DNA é estimada pela absorbância no comprimento de onda A260, em relação a uma amostra negativa (branco). Serão avaliadas também as relações dos comprimentos de onda A260/280 e A260/230. A primeira estima a contaminação por proteínas e a segunda por sais; os valores esperados nas relações para uma amostra de qualidade são 1,8-2,0 e ≥2,0, respectivamente.
3 REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR) Para a confirmação da cobertura e fidelidade dos primers 16S utilizados, as amostras de DNA genômico serão amplificadas pela PCR. A reação consistindo de:
tampão 10X (10mM Tris-HCl, 50mM KCl); 25mM dntp; 50mM MgSO4; Platinum Taq High Fidelity (Invitrogen); par de primers; DNA template; água ultra-pura q.s.p. 25 μl de reação. Os amplicons gerados serão confirmados por eletroforese em gel de agarose a 1,5%, diluído em tampão TAE 1X (Tris-acetato 40mM, EDTA 1mM; pH 8,0). A corrida será realizada seguindo as recomendações de Sambrook et al (2001).
4 PURIFICAÇÃO DOS PRODUTOS DE PCR Os produtos de PCR serão purificados pelo Kit MinElute (Qiagen) de acordo com instruções do fabricante.
5 SEQUENCIAMENTO DOS PRODUTOS DE PCR Os produtos de PCR das amostras serão amplificados com a enzima AmpliTaq polimerase e “BigDye Terminator” (Applied Biosystems) conforme as recomendações do
fabricante,
utilizando
o
conjunto
de
oligonucleotídeos
iniciadores).
O
sequenciamento será realizado em aparelho ABI PRISM 3730 (Applied Biosystems). As sequências obtidas serão visualizadas e manipuladas no programa Sequencher 5.0 (Gene Codes Corporation), no Crebio (UNESP Jaboticabal, SP). A posição do alinhamento será guardada e as sequências visualizadas no programa Bioedit (v.7.1.11). A sequência no formato fasta será exportada e utilizando-se a ferramenta BLASTn (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), o fragmento será comparado com as sequências
depositadas
no
GenBank
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/),
admitindo-se concordância de no mínimo 95% para confirmação da especificidade da sequência.
Fernanda de Alexandre Sebastião Bióloga, Mestre em Microbiologia Agropecuária FCAV/UNESP
