Prosiding Seminar Nasional Kimia 2014 HKI-Kaltim
ISBN: 978-602-19421-0-9
UJI TOKSISITAS EKSTRAK DAUN (Myristica fragrans Houtt) DENGAN METODE BRINE SHRIMP LETHALITY TEST (BSLT) Binawati Ginting1 , Tonel Barus2 , Lamek Marpaung2 , Partomuan Simanjuntak 3,4 1. Universitas Syiah Kuala, 2. Universitas Sumatera Utara, 3. LIPI Cibinong, 4. Universitas Pancasila ABSTRAK Tumbuhan Pala (Myristica fragrans Houtt) termasuk dalam famili Myristicaceae. Penelitian tentang ekstraksi daun Pala dan uji toksisitasnya dengan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) telah dilakukan. Ekstraksi 3 Kg (3000 g) daun Pala dengan metanol diperoleh ekstrak metanol 417,60 g (13,92%). Ekstrak metanol d i larutkan ke dalam et il asetat diperoleh ekstrak et il asetat 104,1 g (5,96%). Hasil part isi ekstrak etil asetat dengan n-heksana diperoleh esktrak n-heksana 67,24 (68,53%) dan total flavonoid 32,76 g (31,47%). Hasil uji akt ivitas sitotoksik ekstrak etil asetat, total flavonid metanol, dan nheksana dengan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) berturut-turut LC50 15,34 pp m; 30,92 pp m; 89,72 pp m dan 118,00 pp m. Kata kunci: Pala Myristica fragrans Houtt), Myristicaceae, ekstrak daun Pala, toksisitas, BSLT I. PENDAHULUAN Pala (Myristica fragrans Houtt) termasuk salah satu tanaman dalam famili Myristicaceae. Akibat nilainya yang tinggi sebagai rempah-rempah, buah dan biji pala telah men jadi ko modit i perdagangan yang penting sejak masa Ro mawi. Biji Pala mengandung minyak atsiri 7-14%. Bubuk Pala dipakai sebagai penyedap untuk roti atau kue, puding, saus, sayuran, dan minu man penyegar. Minyaknya juga dipakai sebagai campuran parfu m atau sabun (Preedy et al, 2011). Masyarakat negara India menggunakan biji Pala sebagai obat aborsi, antikembung, narkotik, dan sebagai sarana untuk menginduksi menstruasi, wasir, muntah kronis, rematik, ko lera, psikosis, kram perut dan mual. Minyak biji Pala juga bersifat sebagai antiseptik, analgesik, dan sifat antiremat ik (Gupta and Deepak, 2011), namun pengujian sifat sitotoksik dari daun Pala belu m dilakukan. Salah satu metode pengujian sifat toksisitas dari suatu bahan atau senyawa adalah metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT). Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) adalah salah satu metode uji toksisitas yang banyak digunakan dalam penelusuran senyawa bioaktif yang bersifat toksik dari bahan alam. Metode ini dapat digunakan sebagai bioassay guided fractionation dari bahan alam, karena mudah, cepat, murah dan cukup reproducible. Uji toksisitas dengan metode BSLT ini merupakan uji toksisitas akut dimana efek toksik dari suatu senyawa ditentukan dalam waktu singkat, yaitu rentang waktu selama 24 jam setelah pemberian dosis uji. Prosedurnya de ngan menentukan nilai LC50 dari aktivitas ko mponen aktif tanaman terhadap larva Artemia salina Leach. Suatu ekstrak d ikatakan toksik berdasarkan metode B LT ji a arga LC < 000 μg/ ml (pp m) (Carballo, 2002). LC50 adalah konsentrasi dari suatu senyawa kimia di udara atau dalam air yang dapat menyebabkan 50% kematian pada suatu populasi hewan uji atau makhluk h idup tertentu. Penggunaan LC 50 dimaksudkan untuk pengujian ketoksikan dengan perlakuan terhadap hewan uji secara berkelo mpok yaitu pada saat hewan uji dipaparkan suatu bahan kimia melalu i udara maka hewan uji tersebut akan menghirupnya atau percobaan toksisitas dengan media air. Nilai LC50 dapat digunakan untuk menentukan tingkat efek toksik suatu senyawa sehingga dapat juga untuk memprediksi potensinya sebagai antikanker. Berdasarkan uraian di atas dilakukan penelitian uji sitosiksik ekstrak daun Pala terhadap Kista atau larva Artemia salina Leach dengan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT). II. METODOLOGI PENELITIAN 2.1. Tempat dan Waktu Penelitian Penelit ian ini d ilakukan di Laboratoriu m penelitian Kimia Organik Bahan Alam Jurusan Kimia FM IPA Universitas Su matera Utara-Medan dan Laboratoriu m Kimia Bahan Alam Puslit Bioteknologi LIPI Cibinong. Penelitian ini d ilakukan pada bulan Februari sampai dengan Mei 2014. 2.2. Sampel Sampel yang digunakan dalam penelit ian ini adalah daun Pala (Myristica fragrans Houtt) yang diperoleh dari Desa Salam Tani Dsn. Kuta Tualah Kec. Pancur Batu Kab. Deli Serdang, Provinsi Su matera Utara.
2.3. Bioindikator Bioindikator yang digunakan dalam penelitian ini adalah Kista Artemia salina Leach yang diperoleh dari Lab. Mikrobiologi FMIPA USU, Provinsi Su matera Utara. HKI-Kaltim
Prosiding Seminar Nasional Kimia 2014 HKI-Kaltim
ISBN: 978-602-19421-0-9
2.4. Alat dan B ahan Peralatan yang digunakan pada penelitian ini meliputi berbagai alat gelas meliputi rotary evaporator, erlen meyer, gelas ukur, cawan petri, timbangan, corong pisah, neraca elektronik, autoklaf, inkubator, kawat ose, autoklaf, blank disc, kapas, dan inkubator. Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian in i adalah: dietil eter, reagen Liberman -Bourchard (asam asetat glasial-H2 SO4(P )), reagen Mayer (kaliu m tetra iodo merkurat), reagen Dragendorf (Bi(NO 3 )3 ) dan reagen Wagner (I2 dalam KI), n-heksana, metanol, etil astat. Bahan yang digunakan untuk uji sitotoksik adalah air laut, etanol dan DM SO. 2.5. Prosedur Penelitian 2.5.1. Persiapan Sampel Daun pala diambil, dibersihkan dari kotoran selanjutnya dikeringkan di udara terbuka dalam ruangan sehingga tidak terkena panas matahari langsung. Kemudian dihaluskan dan ditimbang sebanyak 3 kg (3000 g). 2.5.2 Ekstraksi/Maserasi Maseraasi 3 Kg daun Pala dimaserasi dengan pelarut metanol selama 24 jam, d isaring sehingga diperoleh filtrat dan residu. Terhadap residu dilaku kan maserasi lagi seperti perlakuan sebelumnya sampai filtrat yang diperoleh berwarna jernih. Filtrat hasil maserasi diuapkan pelarutnya sehingga diperoleh ekstrak metanol. Ekstrak metanol yang diperoleh dilarutkan dalam etil asetat, disaring. Filtrat yang diperoleh diuapkan sehingga diperoleh ekstrak etil asetat. Ekstrak etil asetat dipartisi dengan n-heksana sehingga diperoleh ekstrak etil asetat yang bebas tanin. Ekstrak etil asetat yang diperolah dihidrolisis dengan 500 mL HCl 6% dipanaskan selama 1 jam, kemud ian disaring. Campuran d ipartisi dengan kloroform. Fraksi kloroform diuapkan sehingga diperoleh total flavonoid bebas glukosida (g ula). Ekstrak kental metanol, etil asetat, n-heksana, dan total flavonoid yang diperoleh diuji aktiv itas sitotoksiknya terhadap Kista Artemia salina Leach. 2.5.3. Uji Fi toki mia a. Uji alkaloi d Sampel 3 g dilarutkan dengan 1 mL ammonia , kemudian digerus. Selan jutnya ditambahkan kloroform digerus dan disaring. Filtrat yang dihasilkan ditambah 10 mL asam sulfat 2 N, dikocok kuat -kuat, did iamkan sampai larutan asam sulfat dan kloroform memisah. Lap isan asam sulfat diambil dan dibagi dalam tiga tabung, masing -masing tabung diuji untuk mengetahui keberadaan alkalo id menggunakan reagen Mayer, reagen Dragendorf dan pereaksi Wagner (Milles, 1994). b.
Uji Steroi d, Terpenoi d dan Saponin Sampel 2 g d igerus halus, selanjutnya diekstraksi dengan metanol panas. Filt rat yang diperoleh dipekatkan sehingga diperoleh ekstrak metanol. Ekstrak metanol kemudian diekstraksi lagi dengan n-heksana. Residu yang tidak larut dalam n-heksana dikocok kuat-kuat, adanya busa yang stabil selama 30 menit menunjukkan adanya saponin. Ekstrak n-heksana diuji dengan pereaksi Liberman-Burchard. Warna biru atau hijau menunjukkan adanya steroid dan warna merah terpenoid. c.
Uji flavonoi d Sampel 3 g ditambahkan etil asetat, kemudian dipanaskan selama 15 menit hingga pelarutnya tinggal sedikit, kemudian ditambahkan FeCl3 . Bila timbu l warna hijau keh itaman menunjukkan adanya flavonoid . 2.5.4. Uji Toksisitas Dengan Metode BSLT a. Penetapan Kista Artemia salina Leach Kista A. salina Leach ditimbang kurang lebih 50 mg dan dimasukan ke dalam Erlen meyer yang berisi 500 mL air laut yang sudah disaring, kemudian dipasang aerator. Biarkan salama 48 jam dengan pencahayaan lampu TL agar menetas sempurna. Larva yang sudah menetas dipipet ke dalam botol percobaan dan diberi ekstrak sesuai perlakuan. b.
Persiapan sampel Pembuatan larutan ekstrak 2000 pp m. Sebanyak 20 mg ekstrak dit imbang dengan teliti, kemud ian dilarutkan dalam 10 mL air laut. Untuk ekstrak yang sukar larut, dapat ditambahkan dengan DMSO 1% (5 tetes) untuk men ingkatkan kelarutan. Konsentrasi 200 pp m d ibuat dengan memipet 2 mL elstrak 2000 pp m dan ditambahkan air laut sampai 20 mL. Konsentrasi 20 pp m d ibuat dengan memipet 2 mL larutan konsentrasi 200 pp m dan ditambahkan air laut sampai 20 mL. Larutan sampel 500 pp m dibuat dengan cara memipet 2,5 mL larutan ekstrak 2000 pp m dan ditambahkan air laut diaddkan sampai 10 mL. Konsentrasi 100 pp m dibuat dengan cara memipet larutan ekstrak 200 pppm sebanyak 5 mL
HKI-Kaltim
Prosiding Seminar Nasional Kimia 2014 HKI-Kaltim
ISBN: 978-602-19421-0-9
dan ditambahkan air laut 5 mL. Larutan sampel 10 pp m dibuat dengan cara memasukkan 5 mL larutan ekstrak 20 pp m dan ditambahkan 5 mL air laut. c.
Uji bi oakti vitas Uji b ioaktiv itas dilakukaan dengan memasukkan 15 ekor larva udang A. salina Leach yang beru mur 48 jam ke dalam botol yang telah berisi larutan ekstrak dan air laut. Untuk setiap konsentrasi dilakukan 3 kali ulangan (triplo ). Sebagai kontrol adalah air laut yang tidak diberi ekstrak sampel. Botol percobaan disimpan di bawah pencahayaan lampu TL. Pengamatan dilaku kan setelah 24 jam. Ju mlah larva udang yang mati dicatat kemudian dihitung persentase kematiannya. Data yang diperoleh diolah dengan menggunakan analisis probit dengan program SPSS 11.5 dengan prosedur sebagai berikut 1. Klik program SPSS 11.5 2. Pertama masukkan data meliputi konsentrasi, ju mlah total larva dan ju mlah larva mati dengan mengklik Analyse;
Regresi;
Probit Response frequency = ju mlah larva mati Total observe = ju mlah larva hidup Factor = kosongkan Covariete =konsentrasi
III. HASIL DAN P EMBAHAS AN 3.1. Isolasi Daun Pal a (Myristica fragrans Houtt) Maserasi daun 3 Kg daun pala dengan metanol diperoleh 417,60 g (13,92%) ekstrak metanol. Ekstrak metanol dilarutkan dengan etil asetat diperoleh 104,1 g (5,96%) ekstrak etil asetat daun Pala (Ginting, 2013). Hasil partisi ekstrak etil asetat dengan n-heksana diperoleh ekstrak etil asetat bebas tanin 32,76 g (31,47%). Hasil hirolisis ekstrak etil asetat bebas tanin dengan HCl 6% dipero leh 1,8 g (5,5%) total flavonoid (bebas glukosida). Ekstrak kental metanol, etil asetat, n-heksana, dan total flavonoid diuji aktivitas sitotoksiknya terhadap Kista Artemia salina Leach. 3.2. Uji Fi toki mia Masing-masing ekstrak metanol dan ekstrak et il asetat dianalisis secara fitokimia untuk menentukan kandungan metabolit sekunder yang terdapat dalam tu mbuhan tersebut. Uji fitokimia yang dilaku kan alkaloid, steroid, terpenoid, flavonoid, tanin dan saponin. Hasil u ji fitokimia ekstrak metanol dan etil asetat, n-heksana dan total flavonoid daun Pala ditunjukkan pada Tabel 1.
No 1
2 3 4 5 6
Tabel 1. Hasil uji fitoki mia ekstrak metanol dan etil asetat daun Pala Ekstrak Uji Fitokimi a n-heksana Metanol Etil asetat Total Flavonoi d Alkaloid - Meyer - Dragendrof + + - Wagner Steroid Terpenoid + + + Flavonoid + + + Saponin Tanin + -
Berdasarkan Tabel 1 menunjukkan hasil uji fitokimia ekstrak metanol daun Pala mengandung senyawa alkalo id , flavonoid, terpenoid dan tanin, sedangkan ekstrak etil asetat mengandung senyawa alkalo id, flavonoid dan terpenoid. Senyawa tanin tidak terdapat pada ekstrak etil asetat disebabkan karena senyawa tanin hanya larut dalam pelarut protik (Ginting, 2013). Ekstrak n-heksana mengandung senyawa golongan terpenoid. Pada ekstrak total flavonoid mengandung hanya golongan flavonoid. 3.3 Uji Toksisitas Dengan Metode BSLT Ekstrak kental metanol, et il asetat, n-heksana, dan total flavonoid yang diperoleh diuji aktiv itas sitotoksiknya terhadap Kista Artemia salina Leach. Hasil u ji sitotoksik ekstrak metanol, et il asetat, n-heksana, dan total flavonoid daun Pala terhadap Kista Artemia salina Leach ditunjukkan pada Tabel 2.
HKI-Kaltim
Prosiding Seminar Nasional Kimia 2014 HKI-Kaltim
ISBN: 978-602-19421-0-9
Tabel 2. Hasil uji toksisitas ekstrak metanol, etil asetat, n-heksana, dan total flavonoi d dengan metode BSLT KONS ENTRAS I (ppm) 10 Jlh larva hidup
Ekstrak
Jumlah larva hidup
Jumlah larva mati
1
2
3
M etanol
9
8
8
25
Ekstrak etil asetat
6
6
5
Ekstrak n-heksana
9
11
Total flavonoid
7
5
Keterangan :
100 Jlh larva hidup
500
Jumlah larva hidup
Jumlah larva mati
1
2
3
20
8
5
5
18
17
28
4
2
2
9
29
16
5
5
9
21
24
1
0
Jlh larva hidup
Jumlah larva hidup
Jumlah larva mati
LC50 (ppm)
1
2
3
27
0
0
0
0
45
89,72
8
37
0
0
0
0
45
15,34
9
19
26
0
0
0
0
45
118,00
6
7
38
0
0
0
0
45
30,92
ju mlah kista/larva pada masing-masing konsentrasi adalah 15 ekor, total untuk tiga kali perulangan = 45 ekor
Berdasarkan Tabel 2 diatas dapat dilihat bahwa ekstrak etil asetat daun Pala mempunyai aktivitas sitotoksik yang paling kuat dengan nilai LC50 15,34 pp m yang diikuti berturut-turut total flavonoid, ekstrak metanol dan ekstrak nheksana dengan LC50 30,92 p m; 89,72 pp m dan 118,00 ppm. Sifat sitotoksik dari ekstrak etil asetat bebas tanin diduga karena dalam ekstrak ini mengandung golongan flavonoid yang masih mengikat gugus gula (glikosida), d iketahui senyawa yang mengandung gugus OH lebih bersifat aktif untuk membunuh kista Artemia salina Leach. Hal ini berbeda dengan total flavonoid yang sudah dipisahkan glikosidanya (gula) mempunyai akt ivitas sitotoksik yang lebih rendah dibandingkan dengan ekstrak etil asetat yang mengandung glikosida. Ekstrak metanol mempunyai akt ivitas sitotoksik yang lebih kuat dibandingkan dengan ekstrak n-heksana. Hal ini diduga karena pada ekstrak metanol mengandung senyawa flavonoida yang mengandung glikosida sehingga senyawa ini masih berperan menyumbang akt ivitas sitotoksik, sedangkan pada ekstrak n-heksana hanya mengandung golongan terpenoid yang sifat toksistasnya lebih rendah. Dalam hal in i senyawa flavonoid diduga yang menyumbang keaktifan dalam menghambat pertumbuhan larva Artemia salina Leach dengan cara merusak struktur dinding sel, menghambat kerja en zim, menghambat fungsi membran sel, dan atau menghambat sintesis protein dan asam nukleat. IV. KESIMPULAN DAN SARAN 4.1 Kesimpul an Hasil uji aktivitas sitotoksik ekstrak etil asetat, total flavonid metanol, dan n-heksana dengan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) berturut-turut LC50 15,34 ppm; 30,92 ppm; 89,72 pp m dan 118,00 ppm. 4.2. Saran 1. Perlu dilakukan isolasi dan penentuan struktur terhadap total flavonoid daun Pala mengingat mengingat ekstrak tersebut mempunyai akt ivitas sitotoksik yang kuat 2. Perlu d ilakukan pengujian antikan ker dari ekstrak etil asetat dan total flavonoid karena senyawa -senyawa yang mempunyai aktiv itas sitotoksik biasanya juga bersifat sebagai antikanker DAFTAR PUSTAKA Carballo JL., 2002. Comparison between two brine shrimp assays to detect in vitro cytotoxicity in marine natural products. BM C Biotechnology. Ginting, B., 2013, Prosiding Seminar Nasional Kimia 2013, Un iversitas Sumatera Utara . Gupta, A.D., and Deepak Rajpurohit, 2011, antioxidant and antimicrobial activity of nutmeg (Myristica fragrans Houtt), Nuts & Seeds in Health and Disease Prevention. Preedy, V.R., Ronald Ross Watson,Vinood B. Patel, 2011, Nuts and Seeds in Health and Disease Prevention, academic press is an imprint of elsevier.
HKI-Kaltim
