UJI-UJI ANTIMIKROBA

03/10/2014

UJI-UJI ANTIMIKROBA KIMIA BIOESAI PS-S2 KIMIA IPB 2014

Uji Suseptibilitas Antimikrobial ► Metode

Difusi

 Menggunakan cakram filter, mengandung sejumlah antibiotik dengan konsentrasi tertentu ► Metode

Dilusi

 Berbagai konsentrasi antibiotik dalam media kaldu  Umumnya penentuan MIC dan MBC

Dr.T.V.Rao MD

2

1

03/10/2014

Metode untuk Mendeteksi Antibiotik ► Metode

Diffusi: The Kirby-Bauer test

-Metode ini berdasarkan difusi antibiotik pada agar yang diinokulasi mikroorganisme. - Efek dari antibiotik diekspresikan dengan terbentuknya suatu zona pertumbuhan yang terhambat.

Pengukuran sensitivitas mikroorganisme terhadap antibiotik ► Pengukuran

dengan Uji Difusi Cakram (disk diffusion test).

► Larutan

antibiotik/sampel uji dengan konsentrasi tertentu dikeringkan pada kertas cakram.

►

kemudian diletakan pada permukaan agar yang sudah dioleskan mikroba yang standar.

2

03/10/2014

Mengapa harus memakai metode standar? Faktor-faktor yang mempengaruhi diameter zona 1. Diffusi antibiotik 2. Medium 3. Kedalaman agar 4. Hidrasi medium 5. Ukuran Inokulum 6. Kecepatan tumbuh inokulum 7. Waktu Pre-inkubasi 8. Waktu Inkubasi

Metode paling umum dan standar: Kirby-Bauer (NCCLS), Calibrated Dichotomous Sensitivity (CDS) Method

► Efektivitas

antibiotik berhubungan dengan zona inhibisi pertumbuhannya. Makin luas diameternya, makin potensi sample antibiotik tsb..

R

I

S R - Resistant I - Intermediate S - Susceptible

3

03/10/2014

Metode Agar Difusi Cakram ►

Medium

Mueller Hinton

ketebalan 4 mm pH 7.2 to 7.4

►

CakramAntibiotik storage temperature

-20oC minimum

►

Inokulum

McFarland 0.5

(108 bacteria/mL)

►

Inkubator

temperatur 35oC

►

Atmosphere

udara ambient

7

7

Galur Standar utk

quality assurance

Presisi dan akurasi dilakukan dengan menggunakan galur terkontrol Suseptibilitasnya sudah diketahui. Galur Standard  Staphylococcus aureus ATCC 25923  Escherichia coli ATCC 25922  Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

4

03/10/2014

Prosedur  Persiapkan kultur murni berumur 18-24 jam pada medium non selektif.  Sesuaikan kekeruhan sekitar standar kekeruhan 0.5 McFarland

Sample Dr.T.V.Rao MD

0.5 McFarland Standard 9

Pindahkan koloni secara aseptik utk perbanyakan Pilih 4-5 koloni murni dari plat agar dan pindahkan ke dalam tabung media kaldu spt kaldu tryptic-soy. Inkubasi semalam pada 35°C atau sampai diperoleh kekeruhan sesuai standar 0.5 McFarland,

Dr.T.V.Rao MD

10

5

03/10/2014

McFarland 0.5 dan tabung berisi mikroorganisme yang disesuaikan kekeruhannya

11

Dr.T.V.Rao MD

Inokulasi pada lempeng secara merata ►

►

Dr.T.V.Rao MD

Dalam 15 menit setelah distandarkan, ambil dengan aplikator steril dan tanam pada lempeng agar Muller Hinton secara rotasi berulang kali. Yakinkan utk menyerap kelebihan cairannya pada sisi lempeng. Biarkan 3-5 menit agar kelebihan cairan mengering atau terabsorb. 12

6

03/10/2014

Memilih cakram antibiotik dan memasangkannya

Select disks

Dr.T.V.Rao MD

13

HATI- HATI ► ► ► ► ►

Medium agar harus pH 7.2 to 7.4 pada suhu ruangan. Permukaan harus lembab tanpa tetesan air. Cakram antibiotik harus disimpan pada 8°C atau disimpan pada -14°C Sebelum digunakan biarkan dahulu pada suhu ruangan Jangan gunakan yang sudah kadaluarsa Inkubasi pada 32 oC selama 16-18 jam

Dr.T.V.Rao MD

14

7

03/10/2014

Hasil  Antibiotik berdifusi ke dalam agar  konsentrasi antibiotik terus berkurang menjauh dari cakramnya  Setelah inkubasi, perhatikan daerah bening pada permukaan agar dan disebut sbg zona inhibisi

Bacterial growth incubation

Dr.T.V.Rao MD

Zone of inhibition 15

Masalah dengan uji cakram inokulum sesuai dan inokulum yang kebanyakan

16

Dr.T.V.Rao MD

16

8

03/10/2014

Masalah dengan difusi cakram

cakram yang dipasang dengan benar

cakram dipasang tidak tepat

17

Dr.T.V.Rao MD

Metode Dilusi ►

Minimum Inhibition Concentration (MIC)  Konsentrasi terendah suatu antimikroba yang menghambat pertumbuhan bakteri.

►

Minimum Bactericidal Concentration (MBC) or Minimum Lethal Concentration (MLC)  Konsentrasi terendah dari suatu antimikroba yang menunjukkan kurang dari 0.1% inokulum awal masih bisa bertahan

18

9

03/10/2014

Penentuan MIC dengan metode dilusi kaldu ► Tabung

berisi kaldu dengan larutan antibiotik yang diencerkan dua kali lipat dan inokulum standar ► Setelah inkubasi semalam, MIC ditentukan berdasarkan tabung pertama pertumbuhan yang dihambat. ► Makin resisten suatu organisme, berarti MIC makin tinggi.

Metode Dilusi Kaldu ►Prosedur Buat pengenceran dua kali dari antibiotik dalam kaldu Mueller-Hinton, Tryptic Soy Broth  Inokulasi bakteri , inkubasi semalam. ►kontrols: tanpa inokulum, tanpa antibiotik  Tervisualisasi kekeruhan MIC  Kemudian subkultrul tabung yang tidak keruh selama semalan.  Ada pertumbuhan (bacterial count)  MBC 20

10

03/10/2014

Antibiotik diencerkan pada berbagai konsentrasi untuk menguji MIC

Grafik hasil uji MIC

11

03/10/2014

Minimum Inhibitory Concentration (MIC) Minimum Bactericidal Concentration (MBC)

Prinsip Uji Suseptibilitas

Dr.T.V.Rao MD

24

12

03/10/2014

Metode Dilusi Kaldu ► 100%

dari konsentrasi awal bakteri

 = 5*105 CFU/ml ► 0.1%

 = [(5*105)*0.1]/100 CFU/ml  = 500 CFU/ml ► Jumlah

bakteri sebaiknya kurang dari 5 CFU (colonoy forming unit) pada plat untuk kultur dengan 0.01 ml  500*0.01 = 5 CFU 25

Antimicrobial Gradient Testing E-test®

Read plates after recommended Incubation Read MIC where elipse intersects scale

13