โรคซัลโมเนลโลซ ิสSalmonellosis

1

โรคซัลโมเนลโลซิส (Salmonellosis)

บทนํา ในบรรดาแบคทีเรียที่กอใหเกิดการติดเชื้อ และการระบาดในคนนั้น ซาลโมเนลลา เปน ตัว อย างที่ดี ของแบคทีเ รี ย ที่ มี การวิวัฒนาขนานไปกับวิวัฒนาของมนุษย แตเดิม แบคทีเรียในกลุมนี้สวนใหญอาศัยอยูในสัตวและกอใหเกิดโรคในสัตว มีเพียงไมกี่ชนิดเปน pathogen ของคนโดยตรง และอาศัยอยูในคน แตปจจุบันนี้ซาลโมเนลลาจากสัตวหลาย ชนิดทําใหเกิดการติดเชื้อในคนและอาศัยเปน carrier อยูใ นคนไดเปนเวลานาน ทั้งนี้เพราะ ซาลโมเนลลาสามารถปรับตัวไดดี ทําใหสามารถอยูไดในสภาวะแวดลอมที่เปลี่ยนแปลงไป ในสังคมมนุษย ไมวาจะเปนเรื่องของเทคโนโลยีใหม ๆ เชนการผลิตอาหารกระปองอาหาร แชแข็ง หรือขบวนการตางๆ ในการเตรียมอาหารสําเร็จรูปทั้งอาหารที่ยังไมสุก และอาหารที่ สุกแลว ซึ่งในปจจุบันนี้เกิดขึ้นมากมายเพื่อสนองความตองการของประชาชนที่เพิ่มขึ้น โดยเฉพาะในประเทศไทยที่ประจักษกันดีวามีอาหารมากมายใหซื้อขายกัน โดยเฉพาะอยาง ยิง่ ทีเ่ รียกวาประเทศไทยเปนครัวอาหารโลก จําเปนอยางยิ่งตองควบคุม ปองกัน พรอมทั้ง หาทางหยุดยั้งเชื้อ Salmonella มิใหแพรกระจายไปในอาหาร สิ่งแวดลอมตาง ๆ เพิ่มขึ้น นอกจากนี้การสาธารณสุขและการพัฒนาสิ่งแวดลอม และการเพิ่มของประชากร และสังคม ก็เปนสิ่งที่เอื้ออํานวยตอการปรับตัวของเชื้อ Salmonella เขามาสูคนไดมากขึ้น เอกสารนี้มีวัตถุประสงคที่จะทบทวนความรูดานจุลชีววิทยา ระบาดวิทยา อาการ ของโรค พยาธิกําเนิด การวินิจฉัย การรักษา การควบคุมและการปองกัน ของเชื้อ Salmonella ใหแกผูที่ใหความสนใจในเชื้อ Salmonella เรียบเรียงโดย อรุณ บางตระกูลนนท1, สุมณฑา วัฒนสินธุ2 และชัยวัฒน พูลศรีกาญจน1 1 WHO National Salmonella and Shigella Center, สถาบันวิจัยวิทยาศาสตรสาธารณสุข นนทบุรี 2 ภาควิชาวิทยาศาสตรและเทคโนโลยีการอาหาร คณะวิทยาศาสตรและเทคโนโลยี ม.ธรรมศาสตร

2 จุลชีววิทยาของ Salmonella แบคทีเรียในกลุมนี้จัดไดวาเปน pathogens ทีพ่ บไดทุกหนทุกแหงและทั่วโลก โดย เขามามีบทบาทไมเฉพาะแตในคน และสัตวเลี้ยงของคนเทานั้น หากยังพบไดในสัตวทั่ว ๆ ไป เชน สัตวเลื้อยคลาน นก และแมลงตาง ๆ เปนแบคทีเรียกลุมใหญกลุมหนึ่ง เปน แบคทีเรียแกรมลบ รูปรางเปนแทงสั้น ไมสรางสปอร อยูในสกุล Enterobacteriaceae เชน เดียวกับเชื้อ E.coli ประวัติของเชื้อซัลโมเนลลาเดิมเรียกวา paratyphoid bacteria สวนชื่อ สกุลไดเปลี่ยนไปโดยตั้งใหเปนเกียรติ D.E.Salmon นักแบคทีเรียชาวอเมริกัน ซึ่งไดรวมกับ Theobald Smith ทีไ่ ดทาการแยกเชื ํ ้อนี้จากสุกรที่ปวยโรคอหิวาต เชื้อที่แยกไดนี้ตอมาเรียก วา Salmonella Choleraesuis ใน ค.ศ.1885 และในป ค.ศ.1888 Gartner แยกเชื้อไดจากมาม ผูป ว ยที่ตายดวยโรคอาหารเปนพิษระบาดในประเทศเยอรมัน คือ Salmonella Enteritidis ป ค.ศ. 1892 Loffler แยก Salmonella Typhimurium ไดจากหนูขาวที่มีอาการโรคคลาย ไทฟอยด จนกระทั่ง Schottmiille สามารถแยกถึงความแตกตางระหวาง Salmonella Paratyphi A และ Salmonella Paratyphi B ไดในป 1990 การคนพบ Salmonella สายพันธุ ใหมทแี่ ยกไดจากผูปวยและสัตว ที่ปวยดวยโรคตาง ๆ มีมากขึ้น ทําใหเกิดความยุงยากใน การตั้งชื่อสายพันธุใหม ๆ เหลานี้ จนกระทั่งในป ค.ศ. 1926 Kauffmann, Edwards และ Ewing ไดรวมกันจัดทําหนังสือ Kauffmann – White Schema ขึน้ เพื่อเปนเอกสารสําคัญแยก ลักษณะทางแอนติเจนของ Salmonella (Ewing W.H.,1986) ลักษณะของเชื้อซัลโมเนลลา แหลงที่อยูอาศัยตามธรรมชาติ และนิสัยการเจริญเติบโต ลักษณะของเชื้อซัลโมเนลลา : ซัลโมเนลลาเปนแบคทีเรียแกรมลบ รูปรางเปนแทง สั้น ไมสรางสปอร อยูในสกุล Enterobacteriaceae เชนเดียวกับเชื้อ E.coli สมาชิกในสกุลนี้ เจริญเติบโตในสภาวะที่มีหรือไมมีอากาศก็ได (facultative anaerobe) เคลื่อนที่ไดโดยอาศัย แซรอบตัว (peritrichous flagella) และอาศัยอยูในลําไสของคนและสัตว สมบัติทางชีวเคมี แสดงในตารางที่ 1

เรียบเรียงโดย อรุณ บางตระกูลนนท1, สุมณฑา วัฒนสินธุ2 และชัยวัฒน พูลศรีกาญจน1 1 WHO National Salmonella and Shigella Center, สถาบันวิจัยวิทยาศาสตรสาธารณสุข นนทบุรี 2 ภาควิชาวิทยาศาสตรและเทคโนโลยีการอาหาร คณะวิทยาศาสตรและเทคโนโลยี ม.ธรรมศาสตร

3 ตารางที่ 1 สมบัติทางชีวเคมีที่สําคัญของเชื้อซัลโมเนลลา Biochemical test Reaction Glucose + Lactose Sucrose Catalase reaction + Oxidase reaction Nitirte reduction + Lysine decarboxylase + Arginine dehydrolase + w / o H2S Ornithine dehydrolase + w / o H2S Indole Citrate +/ MR + VP Phenylalanine Urease Gelatin G+C (mole% of DNA) 50-53 ที่มา : พัฒนาจาก Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, 1984 นอกจากสมบัติ ทางชี ว เคมี แ ลว ในการจํ าแนกสปชีของซัลโมเนลลายังอาศัย ลักษณะทางพันธุกรรมของเชื้อที่ปรากฏบนผิวเซลลและบนแซ (flagella) ที่แบคทีเรียใช เคลื่อนที่ ตามแบบแผนที่เรียกวา Kauffmann-White Scheme (Brenner, 1984; Ewing, 1986) ทําใหการจําแนกสปชีของเชื้อซัลโมเนลลามีความแมนยํามากขึ้น ทั้งนี้ลักษณะบนผิวเซลล (O-antigen) ไดถูกจําแนกออกเปน 64 group โดยอาศัย somatic antibodies ทีเ่ ตรียมขึ้นมา สําหรับลักษณะทางพันธุกรรมบน flagella ใช H-antibodies จําแนกออกเปน 2 Phases คือ Phase-1 (หรือ phase ทีจ่ ําเพาะ) ประกอบดวยเชื้อซัลโมเนลลาเพียงไมกี่สปชี และ Phase-2 (หรือ group Phase ) ซึ่งประกอบดวยเชื้อซัลโมเนลลาสวนใหญ H-antigen ของเชื้อซัลโม เนลลาอาจทําปฏิกิริยาตกตะกอนกับ antibodies ของ Phase-1 หรือ Phase-2 หรือทั้ง 2 Phase เรียบเรียงโดย อรุณ บางตระกูลนนท1, สุมณฑา วัฒนสินธุ2 และชัยวัฒน พูลศรีกาญจน1 1 WHO National Salmonella and Shigella Center, สถาบันวิจัยวิทยาศาสตรสาธารณสุข นนทบุรี 2 ภาควิชาวิทยาศาสตรและเทคโนโลยีการอาหาร คณะวิทยาศาสตรและเทคโนโลยี ม.ธรรมศาสตร

4 สําหรับ H-antigen Phase-1 ใชอกั ษรภาษาอังกฤษตัวเล็กเปนสัญลักษณ สวน H-antigen Phase-2 ใชตัวอักษรเลขอะราบิคเปนสัญลักษณ เชน S. Choleraesuis (6, 7: c :1, 5) หมาย ความวาเชื้อนี้มี O-antigen O: 6 และ 7 (groupC) H-antigen Phase-1 คือ c และ H-antigen Phase-2 คือ 1 และ 5 หรือ S. Enteritidis ( 9,12 :gm :-) หมายความวาเชื้อนี้มี O-antigen O:9 และ 12 (group D) H-antigen Phase-1 คือ g,m เพียง Phase เดียวเทานั้น วิวฒ ั นาการทางการศึกษาเกี่ยวกับสิ่งมีชีวิตในระดับโมเลกุล ไดเปลี่ยนโฉมรูปแบบ การจัดจําแนกสปชีของซัลโมเนลลา (Salmonella’s Taxonomic scheme) ทีอ่ าศัยเทคนิคทาง เซโรวิทยามาเปนเทคนิคทางจีนส (DNA-DNA hybridization and Multilocus Enzyme Electrophoresis เรียกยอวา MEE) ซึ่งแบงเชื้อซัลโมเนลลาออกเปน 2 สปชีดังนี้ Salmonella enterica (S. enterica) และ Salmonella bongori (S. bongori) แตละ species จําแนกออกเปน หลายสปชียอย (subspecies) มีไมนอยกวา2,500 ซีโรวาร S. enterica จําแนกเปน 6 subspecies ไดแก subspecies I : Salmonella enterica subsp. enterica subspecies II : Salmonella enterica subsp. salamae subspecies IIIa : Salmonella enterica subsp. arizonae subspecies IIIb : Salmonella enterica subsp. diarizonae subspecies IV : Salmonella enterica subsp. houtenae subspecies VI : Salmonella enterica subsp. indica สวน subspecies V ( Salmonella enterica subsp. bongori ) จาก เดิม ไดเปลี่ยนเปน species คือ Salmonella bongori การเปลี่ยนแปลงดังกลาวนําไปสูพัฒนาการของวิธีการเขียน ชื่อ serovars ใหม หลักการเขียน Salmonella serovar กรณีที่ I เชื้อ Salmonella ที่อยูใน species enterica subspecies enterica (ทีม่ กี ารตั้งชื่อ) ดังตัวอยาง Salmonella (ตัวเอน) subspecies (ตัวตรง) enterica (ตัวเอน) serotype (or serovar : or ser.) Typhimurium (ตัวแรกเขียนตัวใหญ ไมตองเขียนตัวเอน) เขียนไดดังนี้


5 Salmonella enterica subspecies enterica serovar Typhimurium ในทางปฏิบัติ นิยมเขียนสั้นลงวา Salmonella serovar Typhimuriumหรือ Salmonella Typhimurium หรือ S. Typhimurium Salmonella serovar Bangkok หรือ Salmonella Bangkok หรือ S. Bangkok Salmonella serovar Ratchaburi หรือ Salmonella Ratchaburi หรือ S. Ratchaburi กรณีที่ II Salmonella พบใน species และ subspecies อื่นนอกเหนือจากกรณีที่ I ไดแก S. enterica subspecies II, IIIa, IIIb, IV, VI และ S. bongori subspecies V การเขียน serovar จะเขียนในรูปของโครงสรางเทานั้น ดังตัวอยาง S. enterica subspecies II มี O-antigen 6 และ 8 มี H-antigen Phase I คือ b และ H-antigen Phase II คือ 1,5 นํามาเขียนดังนี้ Salmonella (ตัวเอน) subspecies (ตัวตรง) salamae (ตัวเอน) serovar 6, 8 : b :1,5 ดังตัวอยาง Salmonella enterica subspecies salamae serovar 6, 8 : b :1,5 ในทางปฏิบัตินิยมเขียนยอวา Salmonella II 6, 8 : b : 1,5 หรือ S. II 6, 8 : b : 1,5 การตั้งชื่อ serovars ของเชื้อ Salmonella นั้น เชื้อ Salmonella ทีพ่ บจะตองอยูใน species enterica และ subspecies enterica เทานั้น และตั้งชื่อตามหลักภูมิศาสตรของสถานที่ พบเชื้อเปนครั้งแรกเชน Salmonella Bangkok และ Salmonella Ratchaburi WHO Collaborating Center for Reference and Research on Salmonella Institut Pasteur, Paris, France เปนหนวยงานที่ทําหนาที่รวบรวมและรายงานจํานวน serovar ที่พบทั่ว โลกไวใน Antigenic Formula of the Salmonella serovar โดยในแตละปจะมีการตรวจพบ Salmonella serovar ใหม ๆ เพิ่มขึ้น เชนในป 1997 มีจํานวน 2,435 serovars และตอมาในป 2001 มีเพิ่มขึ้นเปน 2,501 serovars โดยเฉพาะ S. enterica subsp. enterica (subspecies I) มี จํานวน 1,478 serotypes (serovars) เปน Salmonella ที่จัดอยูใน O group A, B, C1, C2, D, E1, E2, E3 และ E4 ซึ่งสวนมากพบในสัตวเลือดอุน ( Michel Y. Popoff 1997,2001 )


6 ACTUAL NUMBER OF SEROVARS IN EACH SPECIES AND SUBSPECIES Year 1997 2001 1,435 1,478 serovars S. enterica subsp. enterica 485 498 serovars salamae 94 94 serovars arizonae 321 327 serovars diarizonae 69 71 serovars houtenae 11 12 serovars indica 20 21 serovars S. bongori Total 2,435 2,501 serovars แหลงที่อยูอาศัยตามธรรมชาติ : เชือ้ ซัลโมเนลลาอาศัยอยูในทางเดินอาหาร ลําไส ของสัตวตาง ๆ เชน นก สัตวเลื้อยคลาน สัตวเลี้ยง คน และบางทีก็พบในแมลง แมวาแหลง กําเนิดของเชื้อคือลําไสของสัตว แตบอยครั้งที่พบเชื้อซัลโมเนลลาตามรางกายสวนอื่น ๆ ของสัตวดวย (Jay, 1996) เนือ่ งจากสัตวจะปลอยเชื้อซัลโมเนลลาผานทางอุจจาระซึ่งจะแพร ผานแมลงและสัตวอื่น ๆ ขยายวงกวางออกไป ดวยเหตุนี้เชื้อซัลโมเนลลาอาจพบในนํ้า โดย เฉพาะในนํ้าสกปรก และในอาหารที่มีแมลงวันตอม เมื่อคนและสัตวบริโภคอาหารและนํ้า ทีม่ เี ชือ้ นีเ้ ขาไป บางครั้งจะแสดงอาการปวยออกมา แตบางครั้งก็กลายเปนพาหนะ (carrier) คือไมแสดงอาการปวยทั้ง ๆ ทีม่ เี ชือ้ ซัลโมเนลลาอยูในรางกาย มนุษยผูนั้นอาจกลายเปน พาหะของเชื้อตอไป มนุษยและสัตวขับเชื้อซัลโมเนลลาออกจากทางเดินอาหารทางอุจจาระ อรุณ บางตระกูลนนท และคณะไดทําการสํารวจอุจจาระของผูสัมผัสอาหารที่ปฏิบัติงานใน อุตสาหกรรมอาหารแชแข็ง พบอัตราผูเปนพาหะของเชื้อซัลโมเนลลาสูงสุดรอยละ 15.38 อัตราผูเปนพาหะของเชื้อซัลโมเนลลาสูงสุดในฤดูรอน และตํ่าสุดในฤดูฝน (อรุณ บาง ตระกูลนนท และคณะ, 2545) เชือ้ ซัลโมเนลลาในอุจจาระของมนุษยและสัตวสามารถแพร กระจายไปในดิน นํ้า และสิ่งแวดลอม ปนเปอนเขาสูหวงโซอาหารไดหลายทาง ซึ่งจะเปน อันตรายอยางยิ่ง ถานําสัตวที่มีเชื้อซัลโมเนลลามาใชเปนอาหาร ทําใหผูบริโภคมีความเสี่ยง สูงตอการเกิดโรคอาหารเปนพิษ ในทางระบาดวิทยา จําแนกแหลงที่อยูอาศัยหรือโฮสทของเชื้อซัลโมเนลลาออก เปน 3 แหลงดังนี้ (Jay, 1996) เรียบเรียงโดย อรุณ บางตระกูลนนท1, สุมณฑา วัฒนสินธุ2 และชัยวัฒน พูลศรีกาญจน1 1 WHO National Salmonella and Shigella Center, สถาบันวิจัยวิทยาศาสตรสาธารณสุข นนทบุรี 2 ภาควิชาวิทยาศาสตรและเทคโนโลยีการอาหาร คณะวิทยาศาสตรและเทคโนโลยี ม.ธรรมศาสตร

7 (ก) เชือ้ ซัลโมเนลลาที่อาศัยคนเปนโฮสต เชื้อซัลโมเนลลาในกลุมนี้เปนโรคติดตอ ในคนเทานั้นไดแก S. Typhi ทําใหเกิดโรคไทฟอยด (Typhoid fever) เปนสปชีที่มีอันตราย รุนแรงมากที่สุด สวนS. Paratyphi A, S. Paratyphi B และ S. Paratyphi C ทําใหเกิดโรคไข รากสาดนอย (paratyphoid fever) ซึง่ มีอาการคลายกับอาการของไขไทฟอยด แตรุนแรง นอยกวาไขรากสาดนอยเปนโรคติดตอในคนเชนเดียวกับอาการของไขไทฟอยด มีระยะเวลา ฟกตัวนาน ผูปวยมีอุณหภูมิของรางกายสูงมาก มีผลทําใหอัตราการตายสูง และอาจตรวจ พบเชื้อ S. Typhi ในเลือด ในอุจจาระ และในปสสาวะของผูปวยดวย (ข) เชือ้ ซัลโมเนลลาที่ปรับตัวตามโฮสต เชือ้ ซัลโมเนลลาในกลุมนี้เปนเชื้อที่แพร จากสัตว ที่เปนโรคหรือเปนพาหะมาสูคน เนื่องจากอาศัยอยูในสัตว เมื่อนําสัตวมาใชเปน อาหารก็จะแพรมาสูคน และทําใหคนเปนโรคได ตัวอยางเชน S. Gallinarum และ S. Pullorum ซึ่งอาศัยเปดไกเปนโฮสต S. Dublin อาศัยวัวเปนโฮสต S. Abortus-equi อาศัยมาเปนโฮสต S. Abortus-ovis อาศัยแกะเปนโฮสต S. Choleraesuis อาศัยสุกรเปน โฮสต และ S. Enteritidis พบมากในไขและในสัตวปกที่มีชีวิต เปนตน (Jay, 1996) (ค) เชื้อซัลโมเนลลาที่ไมเลือกโฮสต เปนเชื้อซัลโมเนลลานอกเหนือจาก 2 กลุมที่ กลาวมาแลว สามารถแพรจากคนและ สัตวเปนโรค รวมทั้งอาหาร นํ้า ดิน และสิ่งแวดลอม ไดแก เชื้อซัลโมเนลลาสวนใหญที่ทําใหเกิดโรคอาหารเปนพิษ นับเปนซัลโมเนลลาที่มี ความสําคัญ และจะตองควบคุมผานกิจกรรมการจัดการสุขาภิบาลอาหารที่ดี เพื่อตัดวงจร การแพรกระจายของโรค เชื้อในกลุมนี้เรียกวา non typhoidal salmonellosis ทําใหเกิดโรค Salmonellosis ซึง่ สวนใหญจะทําใหเกิดอาการทางลําไสและบาง serovar เทานั้นที่บุกรุกเขา กระแสโลหิตและทําใหเกิดการติดเชื้อในระบบอื่นๆ Salmonellosis มิใชโรคติดเชื้อรายแรง ทีส่ ว นใหญตองรับการรักษาโดยปจจุบันทันดวน ผูที่ไดรับเชื้ออาจมีอาการไมมากแตก็มีผล กระทบตอสุขภาพโดยทั่วไปและตอประสิทธิภาพของการทํางาน ซึ่งมิสามารถคํานวณออก มาเปนคาของการสูญเสียที่ชัดเจน สถานการณปจจุบันในประเทศไทยที่ยังขาดการบริการ ทางหองปฏิบัติการที่จะชวยใหสามารถวินิจฉัยโรค Salmonellosis ไดถูกตองสวนทางกับ การเจริญเติบโตของอุตสาหกรรมผลิตเนื้อสัตว และอาหารสําเร็จรูปที่เห็นความสําคัญของ การควบคุมคุณภาพดานจุลลินทรียมากนอยตางกัน ตลอดจนการเคลื่อนตัวของประชากร เขาสูเมืองใหญๆ และการเกิดธุรกิจการจําหนายอาหารที่ไมถูกสุขลักษณะซึ่งปรากฎใหเห็น อยูโ ดยทัว่ ไป เหลานี้เปนสิ่งที่ควรจะคาดคะเนไดวาหากยังไมสามารถลดการปนเปอนของ Salmonella ในเครื่องอุปโภคของคนแลวการติดเชื้อจาก Salmonella จะมีแตการเพิ่มขึ้นให เรียบเรียงโดย อรุณ บางตระกูลนนท1, สุมณฑา วัฒนสินธุ2 และชัยวัฒน พูลศรีกาญจน1 1 WHO National Salmonella and Shigella Center, สถาบันวิจัยวิทยาศาสตรสาธารณสุข นนทบุรี 2 ภาควิชาวิทยาศาสตรและเทคโนโลยีการอาหาร คณะวิทยาศาสตรและเทคโนโลยี ม.ธรรมศาสตร

8 เปนอุสรรคตอความหวังในการนําสาธารณสุขที่ดีมาใหแกประชากรชาวไทย (พนิดา ชัย เนตร, 2531) นิสัยการเจริญเติบโตของซัลโมเนลลา (ก) อุณหภูมิ ซัลโมเนลลาเจริญไดดีที่อุณหภูมิปานกลาง แมวาจะมีรายงานวาเชื้อ ซัลโมเนลลาในบางสายพันธุสามารถเจริญไดที่อุณหภูมิตํ่ากวา 5OC (D’Aoust, 1991) ก็ตาม สําหรับอุณหภูมิสูงสุดที่เชื้อนี้เจริญได คือ 49.5 OC (ICMSF, 1996) ดวยเหตุนี้ การปฏิบัติ อยางถูกตองเพื่อเก็บรักษาอาหารรอนหรืออุนอาหารเพื่อใหปลอดภัยจากเชื้อซัลโมเนลลา ตามที่ USDA/FSIS แนะนําจึงใชอุณหภูมิ 63 OC เปนเกณฑ (แมวาในทฤษฎีที่อุณหภูมิ 55 OC จะสามารถทําลายเชื้อซัลโมเนลลาไดแลวก็ตาม) (ข) pH ความสัมพันธระหวางความเปนกรด-ดาง กับการเจริญเติบโตของเชื้อซัล โมเนลลาแสดงใน ตารางที่ 2 คา pH ตําสุ ่ ดที่เชื้อซัลโมเนลลาชนิดที่ทนกรดมากที่สุดจะเจริญ ไดอยูที่ pH 3.8 และ pH สูงสุดอยูที่ 9.5 ชวง pH ทีเ่ ชื้อซัลโมเนลลาสวนมากเจริญไดดีอยู ระหวาง 7-7.5 ทัง้ นีข้ นึ้ อยูกับสภาวะแวดลอมที่เชื้อเจริญเติบโตและชนิดของซัลโมเนลลา แตละสปชีดวย จากการทดลองของชุงและกอฟเฟรท (Chung and Goepfert,1970) พบวา กรดที่ใชปรับ pH ของอาหารเลี้ยงเชื้อในหองปฏิบัติการมีผลตอการปรับตัวของเชื้อซัลโม เนลลา กลาวคือ ในกรณีที่ใชกรดเกลือและกรดซิตริกปรับ pH เชื้อซัลโมเนลลาปรับตัวกับ การเปลี่ยนแปลงของ pHไดมากกวาการใชกรดนํ้าสม หรือกลาวอีกนัยหนึ่งวาเชื้อซัลโมเนล ลาไวตอกรดนํ้าสมมากกวากรดเกลือและกรดซิตริก


9 ตารางที่ 2 คา pH ตําสุ ่ ดที่เชื้อซัลโมเนลลาเจริญไดภายใตสภาวะที่เพาะเลี้ยง ในหองปฏิบัติการ กรดที่ใช pH กรดเกลือ 4.05 กรดซิตริก 4.05 กรดตารตาริก 4.10 กรดกลุโคนิก 4.20 กรดฟูมาริก 4.30 กรดมาลิก 4.30 กรดแลคติก 4.40 กรดซัคซินิก 4.60 กรดกลูทาริก 4.70 กรดอะดิพิก 5.10 กรดพิเมริก 5.10 กรดอะซิติก 5.40 กรดโพรพิโอนิก 5.50 หมายเหตุ : ใช Tryptone – yeast extract – glucose broth เปนอาหารเลี้ยงเชื้อ โดยเฉพาะเชื้อ ซัลโมเนลลา ที่ 104 เซล/มล (ใช S. Anatum, S. Tennessee หรือ S. Senftenberg) ที่มา : Chung and Goepfert, 1970 (ค) วอเตอรแอคติวิตี้ (aw) มีผลตอการเจริญเติบโตของเชื้อซัลโมเนลลา กลาวคือ เชื้อซัลโมเนลลาเจริญไดในชวงที่มี aw แคบมาก คือคา aw ตํ่าสุดอยูที่ 0.94 สวนคา awสูงสุด อยูในชวง 0.99 – 1.00 ในสภาวะที่สิ่งแวดลอมเอื้อตอการเจริญเติบโตของเชื้อซัลโมเนลลา เชน มีอาหาร เหมาะสม มี aw เหมาะสม มีอุณหภูมิเหมาะสม เชื้อซัลโมเนลลาสามารถปรับตัวตอการ เปลี่ยนแปลงของ pH ไดมากกวาปกติ ฉะนั้น ปจจัยรวม (Combined effects) จึงมีความ สําคัญในแงของการประยุกตมาใชเพื่อควบคุมเชื้อซัลโมเนลลามากกวาปจจัยใดปจจัยหนึ่ง เพียงปจจัยเดียว เรียบเรียงโดย อรุณ บางตระกูลนนท1, สุมณฑา วัฒนสินธุ2 และชัยวัฒน พูลศรีกาญจน1 1 WHO National Salmonella and Shigella Center, สถาบันวิจัยวิทยาศาสตรสาธารณสุข นนทบุรี 2 ภาควิชาวิทยาศาสตรและเทคโนโลยีการอาหาร คณะวิทยาศาสตรและเทคโนโลยี ม.ธรรมศาสตร

10 ตารางที่ 3 ปจจัยดานอุณหภูมิ pH และ aw ทีม่ ีผลตอการเจริญเติบโตของเชื้อซัลโมเนลา สภาวะ คาตํ่าสุด คาเหมาะสม คาสูงสุด อุณหภูมิ 5.2 35-43 46.2 PH 3.8 7-7.5 9.5 aw 0.94 0.99 >0.99 * เชือ้ ซัลโมเนลลาสวนมากไมเจริญที่อุณหภูมิตํ่ากวา 7OC ที่มา ICMSF, 1996, P.225 พยาธิกําเนิด

1. การกระตุนใหเซลลลําไสกลืนกินเชื้อ Salmonella ลักษณะพื้นที่ผิวของเซลลลําไสมี microvilli และรูปรางคลายนิ้วมือ เปนการเพิ่มพื้น ทีผ่ วิ ในการดูดซึมสารอาหาร กลไกการกอโรคเริ่มจากการที่เชื้อ Salmonella เคลื่อนที่เขาสู ผนังเยื่อหุมเซลลลําไส คลายกับการเขาสูเซลลลําไสของเชื้อ E.coli โดยใชขบวนการพิเศษ คลายการฉีดเชื้อเขาเซลลที่ เรียกวาระบบ injector Type 3 เพื่อใหโปรตีนของเชื้อผานผนัง เรียบเรียงโดย อรุณ บางตระกูลนนท1, สุมณฑา วัฒนสินธุ2 และชัยวัฒน พูลศรีกาญจน1 1 WHO National Salmonella and Shigella Center, สถาบันวิจัยวิทยาศาสตรสาธารณสุข นนทบุรี 2 ภาควิชาวิทยาศาสตรและเทคโนโลยีการอาหาร คณะวิทยาศาสตรและเทคโนโลยี ม.ธรรมศาสตร

11 เซลลเจาบานเขาสู cytoplasm โปรตีนของเชื้อที่เขาไปจะกระตุนเซลลเจาบานและเปลี่ยน ระบบ cytoskeleton ของเซลลเปนผลใหเชื้อแบคทีเรียถูกกลืนกินอยูภายในเซลลเจาบาน 2. การหลบหนีกลไกปองกันการติดเชื้อและการเพิ่มจํานวนของเชื้อ Salmonella กลไกการปองกันตัวของเซลลเจาบานปกติเมื่อเชื้อแบคทีเรียซึ่งจัดวาเปนสิ่งแปลก ปลอมเขาสูเซลลจะถูกกลืนกินและถูกยอยทําลายดวยเอนไซมภายใน lysosome แตสําหรับ เชื้อ Salmonella มันสามารถทําบางอยางที่รวดเร็วเพื่อหลบหลีกกลไกการปองกันนี้ โดยการ ทําใหโครงสรางของ vacuole เปลี่ยนแปลงและมี toxic lysosomesมายับยั้งการยอยเชื้อจาก นั้นเชื้อ Salmonella จะเริม่ แบงตัวภายใน vacuoleทําให vacuole โตขึ้น ปจจุบันนี้ยังไมทราบ แนนอนวาเชื้อ Salmonellaหลบหนีจากเซลลเจาบานไปสูเซลลอื่นไดอยางไร อาการของผูปวยและความเปนพิษของเชื้อซัลโมเนลลา


12

อาการของผูปวย : ผูปวยที่ไดรับเชื้อซัลโมเนลลามีอาการจําแนกออกไดเปน 3 แบบ (ICMSF,1996) ได (ก) อาการของระบบทางเดินอาหาร (Gastroenteritis) โดยทั่วไปเกิดจากเชื้อ ซัลโมเนลลาที่ไมเลือกโฮสต ทําใหเกิดโรคอาหารเปนพิษ ชวงระยะเวลาฟกตัวของโรคอยู ระหวาง 5 ชัว่ โมง ถึง 5 วัน แตปกติสัญญาณบอกอาการของโรคมักเริ่มขึ้นประมาณ 12-36 ชั่วโมง หลังจากไดรับเชื้อ ในกรณีทไี่ ดรับเชื้อเปนจํานวนมาก อาการจะปรากฏขึ้นเร็วกวา ปกติหรือถาบุคคลไวตอเชื้อมากเปนพิเศษ อาการก็จะปรากฏเร็วขึ้นกวาปกติดวย อาการของ ผูป วยประกอบดวย ทองเดิน คลื่นไส ปวดทอง ไขสูงปานกลาง หนาวสั่น อาการทองรวง จะรุนแรงตางกันตามลักษณะการถายอุจจาระ เชน อุจจาระอาจมีลักษณะเหลวคลายนํ้าซุป ผัก จนถึงการถายเปนนํ้าและเกิดอาการขาดนํ้าขึ้น (dehydration) ในบางครั้งผูปวยอาจ อาเจียน ออนเพลีย เบื่ออาหาร ปวดศรีษะ กระสับกระสาย โดยทั่วไปอาการดังกลาวจะ ปรากฏอยูนาน 2-5 วัน ถานําสิ่งขับถายของผูปวยไปตรวจวิเคราะหในชวงนี้มักจะพบเชื้อ ซัลโมเนลลาเปนจํานวนมาก เมื่อเวลาผานไปจํานวนของเชื้อซัลโมเนลลาจะลดลง แตผูปวย บางรายอาจขับถายเชื้อซัลโมเนลลาที่มิใชไทฟอยดหลังจากนี้ไปแลวอีก 3 เดือนก็เปนได เรียบเรียงโดย อรุณ บางตระกูลนนท1, สุมณฑา วัฒนสินธุ2 และชัยวัฒน พูลศรีกาญจน1 1 WHO National Salmonella and Shigella Center, สถาบันวิจัยวิทยาศาสตรสาธารณสุข นนทบุรี 2 ภาควิชาวิทยาศาสตรและเทคโนโลยีการอาหาร คณะวิทยาศาสตรและเทคโนโลยี ม.ธรรมศาสตร

13

(ข) อาการไขไทฟอยด (Enteric fever) เกิดเนื่องจากเชื้อ S. Typhi, S. Paratyphi A, S. Paratyphi B (S. Schottmuelleri) และ S. Paratyphi C (S. Hirschfeldii) สวนเชื้อ S. Typhimurium นัน้ มีรายงานวาเปนเชื้อไขไทฟอยดของหนู ระยะเวลาฟกตัวของเชื้อไข ไทฟอยดอยูระหวาง 7-28 วัน (ขึ้นอยูกับปริมาณของเชื้อที่ไดรับ) เฉลี่ยประมาณ 14 วัน ผู ปวยมีอาการไมสบาย ปวดศรีษะ ไขขึ้นสูงมากและทรงอยูหลายวัน ปวดทองและปวดเมื่อย ตามรางกาย ออนเพลีย ถายอุจจาระมีลักษณะเหลวคลายนํ้าถั่ว (pea-like) หรือเหลวเปนนํ้า นอกจากนีย้ ังมีอาการคลื่นไส อาเจียน ไอ มีเหงื่อออกตามตัว หนาวสั่น และเบื่ออาหาร มีจุด แดงตามลําตัว แผนหลังและหนาอก หัวใจเตนชาและออน ทองบวมนํ้า มามโต บางครั้งมี เลือดออกจากชองทองหรือจมูกดวย ผูปวยอาจหมดความรูสึก อาการทุเลาชา (ประมาณ 1-8 สัปดาห) และบางครั้งผูปวยอาจเปนพาหะของโรคไปอีกหลายเดือนหรือเปนปก็ได ในกรณี นี้มักพบเชื้อซัลโมเนลลาในถุงนํ้าดี เรียบเรียงโดย อรุณ บางตระกูลนนท1, สุมณฑา วัฒนสินธุ2 และชัยวัฒน พูลศรีกาญจน1 1 WHO National Salmonella and Shigella Center, สถาบันวิจัยวิทยาศาสตรสาธารณสุข นนทบุรี 2 ภาควิชาวิทยาศาสตรและเทคโนโลยีการอาหาร คณะวิทยาศาสตรและเทคโนโลยี ม.ธรรมศาสตร

14

(ค) อาการติดเชื้อในกระแสโลหิต (Bacteremia/Septicemia) เกิดจากเชื้อซัล โมเนลลาเขาไปในกระแสโลหิต สืบเนื่องจากเชื้อฟกตัวในลําไสเล็ก แลวเขาสูกระแส โลหิต ผูปวยอาจจะมีไขสูง ปวดหลัง ปวดทอง และเจ็บหนาอก หนาวสั่น เหงื่อออกตามลํา ตัว ไมสบาย เบื่ออาหาร นํ้าหนักลด อาการที่เกิดขึ้นอาจเปนแบบสั้น ๆ หรือเปนเรื้อรังก็ได เชื้อซัลโมเนลลาที่เปนสาเหตุรวมถึง S. Typhi, S. Choleraesuis และ S. Dublin เชื้อซัลโมเนล ลาจากกระแสโลหิตอาจเขาไปอยูตามอวัยวะตาง ๆ ของรางกาย (Archer and Young, 1988; Smith et al, 1993) ความเปนพิษ : เชือ้ ซัลโมเนลลาอาจจะเขาไปอยูในชองวาง (lumen) ของลําไส เล็กสวนปลาย และเพิ่มจํานวนขึ้น หลังจากนั้นจะไชผานผนังลําไสเล็กเขาสูระบบทอนํ้า เหลือง และจะทําลายเม็ดเลือดขาว จากนั้นจะเขาไปในกระแสโลหิต ทําใหเลือดเปนพิษ (Septiceamia) เรียบเรียงโดย อรุณ บางตระกูลนนท1, สุมณฑา วัฒนสินธุ2 และชัยวัฒน พูลศรีกาญจน1 1 WHO National Salmonella and Shigella Center, สถาบันวิจัยวิทยาศาสตรสาธารณสุข นนทบุรี 2 ภาควิชาวิทยาศาสตรและเทคโนโลยีการอาหาร คณะวิทยาศาสตรและเทคโนโลยี ม.ธรรมศาสตร

15

เปนที่ยอมรับกันแลววา อาการเปนพิษของเชื้อซัลโมเนลโลซีสเกี่ยวของกับสารพิษ 2 ชนิด คือ enterotoxin และ cytotoxin คูปอลและดีเบล (koupal and Deibel, 1975) เปนคน แรกทีแ่ สดงใหเห็นถึงความเปนพิษของ enterotoxin ในป ค.ศ. 1975 ลักษณะของความเปน พิษคลายกับพิษของ E.coli โดยมีการเพิ่มขึ้นของ cAMP (cyclic adenosine monophosphate) ในลําไส และชักนําใหของเหลวในรางกายสัตวทดลองตกตะกอน แตแตกตางจาก E.coli ตรงที่ enterotoxin ที่เชื้อซัลโมเนลลาผลิตไดมีปริมาณนอยกวา และยากมากกวาในการ จําแนกสารพิษออกจากเซลลของแบคทีเรีย ยิ่งกวานั้น enterotoxin ของเชื้อซัลโมเนลลายัง คลายสารพิษของเชื้ออหิวาต (Choleratoxin-CT) ในดานลักษณะทางชีวภาพและทางพันธุ กรรม กระนั้นก็ตามเชื้อซัลโมเนลลากอใหเกิดอาการคลายบิดดวย คือมีการทําลายเนื้อเยื่อ ในระบบทางเดินอาหาร ซึ่งเปนอาการที่รุนแรงมากกวาที่จะเกิดจาก enterotoxin แตเพียง อยางเดียว ดวยเหตุนี้ คูและคณะ (Koo et al,1984) จึงทําการตรวจหา cytotoxin จากสารสกัด เรียบเรียงโดย อรุณ บางตระกูลนนท1, สุมณฑา วัฒนสินธุ2 และชัยวัฒน พูลศรีกาญจน1 1 WHO National Salmonella and Shigella Center, สถาบันวิจัยวิทยาศาสตรสาธารณสุข นนทบุรี 2 ภาควิชาวิทยาศาสตรและเทคโนโลยีการอาหาร คณะวิทยาศาสตรและเทคโนโลยี ม.ธรรมศาสตร

16 ของเชือ้ ซัลโมเนลลา ตามที่มีนักวิจัยชาวยุโรปเคยศึกษาในเรื่องนี้ไวตั้งแตป ค.ศ.1962 เมื่อ เติมสารสกัดของเชื่อซัลโมเนลลาลงในเซลลเยื่อบุลํ าไสเล็กของกระตายหรือเซลเวอโร (Vero cells; เปนเซลชนิด monolayer ทีป่ ระกอบดวย cell line ตอเนื่องกัน ไดจากไตของลิง ชนิดหนึ่ง (African green monkeys) ใชสําหรับการทดลองทางชีวภาพ (bioassay) เพื่อหา ความเปนพิษของ E.coli ) ปรากฏวาเกิดการยับยั้งกระบวนการสังเคราะหโปรตีนขึ้น (Koo and Peterson, 1983; Koo et al, 1984) ดังนัน้ นักวิจัยจึงสรุปวาการทําลายเซลลของเชื้อซัล โมเนลลาที่เกิดขึ้นกับเยื่อบุลําไสเล็กหรือเซลเวอโรนั้นเปนผลมาจาก cytotoxin นั่นคือ อาการเปนพิษของเชื้อซัลโมเนลลาเกิดจากสารพิษประเภท enterotoxin และ cytotoxin ระบาดวิทยา เชื้อ Salmonella เปนเชือ้ ที่กอใหเกิดอาการทองเสียในมนุษยและสัตว สามารถตรวจ พบเชื้อในมนุษยหรือสัตวที่ปวยจากอุจจาระ โดยผูติดเชื้อไดรับเชื้อจากการกินอาหารดิบ หรือทีไ่ มผานการปรุงใหสุก หรืออาหารที่ปนเปอนเชื้อ โดยที่แตละซีโรวารของเชื้อมีความ แตกตางกันโดยมีเชื้อมากกวา 2500 ซีโรวาร ในสหรัฐอเมริกาพบวา S. Typhimurium และ S. Enteritidis เปนซีโรวารที่ระบาดมาก แตในประเทศไทยนั้นพบวา S. Welteverden เปนซี โรวารที่กอใหเกิดการติดเชื้อในคนและสัตวไดมากกวา 2 ซีโรวารดังกลาวขางตน ผูปวยที่ติดเชื้อ Salmonella มีอาการปวยที่แตกตางกันตั้งแตทองเสีย ถายเหลวเปน นําสี ้ เขียว หรือ ถายมีมูกหรือมีเลือดปน ปวดทองมีลักษณะปวดเกร็งที่หนาทอง ปวดเบง สวนใหญมีไขหรือมีไขเรื้อรัง อาจมีอาการติดเชื้อนอกระบบทางเดินอาหารรวมดวย เชื้อ Salmonella อาศัยอยูในทางเดินอาหารของมนุษยและสัตวทุกชนิด รวมถึงนก ดวย การติดตอของเชื้อ Salmonella เกิดขึ้นเนื่องจากการที่มนุษยรับประทานอาหารที่ปน เปอนเชื้อจากอุจจาระสัตว การปนเปอนของเชื้อในอาหารนั้นไมไดทําใหอาหารสีและกลิ่น ตางไปจากปกติ อาหารที่พบไดบอยวามีการปนเปอนคืออาหารที่ไดจากสัตว เชน เนื้อสัตว ไก นม หรือไข แตอาหารทั้งหมดแมกระทั่งพืชสามารถปนเปอนเชื้อนี้ได วัตถุดิบอาหารที่ ไดจากสัตวพบไดเสมอวามีการปนเปอนเชื้อ แตอยางไรก็ตามพบวาการปรุงอาหารใหสุก สามารถทําลายเชื้อ Salmonella ได อาหารเกิดการปนเปอนไดจากการไมลางมือของผูติดเชื้อ ที่สัมผัสอาหาร หรือผูที่ลืมลางมือดวยสบูหลังเขาหองนํ้า เชื้อ Salmonella อาจพบไดในอุจจาระของสัตวเลี้ยง โดยเฉพาะอยางยิ่งที่มีอาการ ทองเสีย และผูเลี้ยงสัตวสามารถติดเชื้อไดถาไมลางมือหลังสัมผัสอุจจาระสัตวเหลานี้ สัตว เลือ้ ยคลานเปนแหลงเก็บกักเชื้อ Salmonella ผูเลี้ยงสัตวควรลางมือทุกครั้งทันทีหลังสัมผัส เรียบเรียงโดย อรุณ บางตระกูลนนท1, สุมณฑา วัฒนสินธุ2 และชัยวัฒน พูลศรีกาญจน1 1 WHO National Salmonella and Shigella Center, สถาบันวิจัยวิทยาศาสตรสาธารณสุข นนทบุรี 2 ภาควิชาวิทยาศาสตรและเทคโนโลยีการอาหาร คณะวิทยาศาสตรและเทคโนโลยี ม.ธรรมศาสตร

17 สัตวเลีย้ งชนิดนี้ แมวาสัตวเลื้อยคลานเหลานี้จะมีสุขภาพดี ผูใหญควรระมัดระวังเด็กใหลาง มือหลังจับสัตวเลื้อยคลานเหลานี้ทุกครั้ง เกณฑในการวินิจฉัยเพื่อการรักษา (Diagnostic Criteria for Treatment) 1. เกณฑทางคลีนิก (Clinical Ctiteria) ไมมีลักษณะทางคลีนิกที่ชัดเจน 2. เกณฑการตรวจทางหองปฏิบัติการ (Labotatory Criteria) - ทั่วไป ตรวจอุจจาระพบ WBC > 20 cell/HPE - จําเพาะ เพาะเชื้อจาก อุจจาระ ปสสาวะ เลือด ไขกระดูก นํ้าไขสันหลัง หรือของเหลวจาก อวัยวะที่สงสัยมีการติดเชื้อ พบ Salmonella spp. ที่นอกเหนือจาก S. Typhi และ S. Paratyphi การรักษา (Treatment) 1. การรักษาตามอาการ ผูที่ติดเชื้อ Salmonella สามารถหายไดเองภายใน 4 ถึง 7 วัน และบอยครั้งพบวาไม ตองการการรักษา มีผูปวยจํานวนนอยที่มีอาการสูญเสียนํ้าอยางรุนแรง หรือมีการติดเชื้อ นอกระบบทางเดินอาหาร ผูปวยเหลานี้จําเปนตองไดรับสารนํ้าทดแทนผานทางเสนเลือด และรักษาการติดเชื้อดวยยาตานจุลชีพ ดังนี้ Ampicillin, Gentamicin, Trimethoprim/ Sulfamethoxazole (Bactrim หรือ Co-Trimoxazole) หรือ Ciprofloxacin อยางไรก็ตามพบ วามีเชื้อ Salmonella บางซีโรวารที่มีการตานยาตานจุลชีพทั้งนี้เปนผลเนื่องจากการใชยาตาน จุลชีพผสมในอาหารสัตวเพื่อเรงการเจริญเติบโต 2. การรักษาแบบจําเพาะ เมือ่ ตรวจพบแบคทีเรียที่เปนสาเหตุ โดยใชสารตานจุล ชีพในกรณี - การติดเชื้อนอกระบบทางเดินอาหาร หรือการติดเชื้อในกลุมที่มีความเสี่ยง สูง ไดแก เด็กอายุตํ่ากวา 1 ป ผูสูงอายุ (มากกวา 65 ป) ผูป วยที่ไดรับยากด การทํางานของระบบภูมิคุมกัน ผูป ว ยโรคเบาหวาน ผูปวยโรคตับแข็ง และ เรียบเรียงโดย อรุณ บางตระกูลนนท1, สุมณฑา วัฒนสินธุ2 และชัยวัฒน พูลศรีกาญจน1 1 WHO National Salmonella and Shigella Center, สถาบันวิจัยวิทยาศาสตรสาธารณสุข นนทบุรี 2 ภาควิชาวิทยาศาสตรและเทคโนโลยีการอาหาร คณะวิทยาศาสตรและเทคโนโลยี ม.ธรรมศาสตร

18 ผูปวยโรคตอมลูกหมากที่ตองใส Prosthetic valve ใหรักษาโดยใชยาตาน จุลชีพ Norfloxacin หรือ Ceftriaxone หรือ Ciprofloxacin - ผูประกอบอาหารที่เปนพาหะควรใหเปลี่ยนแผนกหรือเลี่ยงการเตรียมหรือ ปรุงอาหาร โดยมิตองใหสารตานจุลชีพ

ผูปวยที่มีอาการทองเสียสามารถหายเปนปกติได แมวาจะพบเชื้อไดเปนระยะเวลา นานหลังจากไมมีอาการทองเสียแลวหลายเดือน มีผูปวยจํานวนเล็กนอยที่ติดเชื้อ Salmonella แลวมีอาการอื่น ๆ เชน เจ็บปวดตามขอ ระคายเคืองตา และปวดกระเพาะปสสาวะ เรียก อาการเหลานี้วา Reiter’s Sydrome ผูป ว ยที่มีอาการปวยเรื้อรังเปนเดือนหรือป สามารถนําไป สูอาการขออักเสบที่ยากตอการรักษา เนื่องจากการใชยาตานจุลชีพรักษามักไมไดผลในผู ปวยที่มีอาการขออักเสบแลว การควบคุมและปองกัน ยังไมมีวัคซีนปองกันผูติดเชื้อ Salmonella โดยพบวาการบริโภคเนื้อสัตวและผลิต ภัณฑอาหารจากสัตวมีโอกาสที่จะไดรับเชื้อจากการปนเปอน ผูบริโภคจึงไมควรกินอาหาร ดิบหรือไข เนื้อไก หรือเนื้อ ที่ไมผานการปรุงใหสุก อาหารบางชนิดเชน ไขที่มักใชเปนสวน ประกอบในการทําอาหารโดยไมผานการปรุง เชน นํ้าสลัด อาหารประเภทเนื้อสัตว ตองปรุง ใหสกุ ดีพอ นํ้านมและผลิตภัณฑนํ้านม ตองผานการฆาเชื้อดวยเทคนิค pasteurized การปนเปอนขามจากอาหารเปนสิ่งที่ตองระมัดระวัง อาหารที่ยังไมผานการปรุงให สุกตองเก็บไวแยกตางหากจากอาหารที่ปรุงสุกแลว และแยกออกจากอาหารที่พรอมบริโภค มือ เขียง โตะ มีด และอุปกรณเครื่องใชในการประกอบอาหารควรลางหลังจากใชรวมกับ อาหารที่ยังไมผานการปรุง ลางมือทุกครั้งกอนประกอบอาหาร และระหวางสัมผัสอาหาร ตางชนิดกัน เรียบเรียงโดย อรุณ บางตระกูลนนท1, สุมณฑา วัฒนสินธุ2 และชัยวัฒน พูลศรีกาญจน1 1 WHO National Salmonella and Shigella Center, สถาบันวิจัยวิทยาศาสตรสาธารณสุข นนทบุรี 2 ภาควิชาวิทยาศาสตรและเทคโนโลยีการอาหาร คณะวิทยาศาสตรและเทคโนโลยี ม.ธรรมศาสตร

19 ผูปวยที่ติดเชื้อ Salmonella ไมควรเปนผูเตรียมอาหารหรือนํ้า จนกวาจะตรวจไมพบ เชื้อ Salmonella เปนระยะเวลานานพอสมควร ผูเลี้ยงสัตวควรลางมือทุกครั้งหลังสัมผัสอุจจาระสัตว โดยพบวาสามารถพบเชื้อ Salmonella จากสัตวเลื้อยคลานที่ปกติ ดังนั้นทุกคนควรลางมือทันทีหลังสัมผัสสัตวเลื้อย คลาน สัตวเลื้อยคลาน (รวมถึงเตา) ไมเหมาะสําหรับเปนสัตวเลี้ยงของเด็ก หรือเลี้ยงในบาน ที่มีเด็กทารก การปองกัน การทราบจํานวนผูปวย Salmonellosis มีความจําเปนอยางมากทางดานสาธารณสุข ทัง้ ยังตองหาซีโรวารของเชื้อเพื่อเปรียบเทียบกับซีโรวารอื่น ๆ ที่พบจากแหลงใกลเคียงกัน ถาหากเกิดการปวยในชวงเวลาเดียวกัน อาจเกิดจากแหลงรานอาหาร อาหาร หรือนํ้าประปา จําเปนตองใชมาตรการปองกันทางดานสาธารณสุขที่ถูกตอง การปองกันบางขั้นตอนตองทําเปนประจําทุกวัน เชน การ Pasteurized นํานม ้ และ การเตรียมนํ้าประปา มีผลการตอการปองกันเชื้ออยางมาก ในสหรัฐอเมริกาป ค. ศ. 1970 พบ วาเตาเปนสัตวเลี้ยงที่เปนแหลงรังของโรค Salmonella และตอมาในป ค. ศ. 1975 ไดมีการ ออกกฎหมายหามการขายเตาเปนสัตวเลี้ยงขึ้น สําหรับการพัฒนาดานความสะอาดของฟารม เลีย้ งสัตว กระบวนการในโรงเชือด และการเก็บเกี่ยวผักและผลไม ตลอดจนการบรรจุหีบ หอ เหลานี้สามารถปองกันการติดเชื้อ Salmonellosis ทีเ่ กิดจากปนเปอนเชื้อ การใหการ ศึกษาแกพนักงานโรงงานผลิตอาหารเปนแนวทางขั้นพื้นฐานในความปลอดภัยดานอาหาร และการสุมตรวจเชื้อจากรานอาหาร อาจปองกันการปนเปอนขาม และอาหารอื่น ๆ ที่ใชมือ สัมผัสที่สามารถทําใหเกิดการระบาด การบริโภคไขที่ผานการปรุงสุกในรานอาหาร โรง พยาบาล และสถานเลี้ยงเด็กออน เปนการปองกันที่สําคัญอยางมาก ในอนาคตการใชรังสี หรือวิธีการอื่น ๆ อาจสามารถลดการปนเปอนเชื้อจากอาหารดิบไดมากขึ้น


20 วิธีเก็บสิ่งสงตรวจหาเชื้อ Salmonella เนื่องจากเชื้อ Salmonella สามารถตรวจพบไดจากคน อาหาร นํ้า อาหารสัตว มูล สัตว และสิ่งแวดลอมตาง ๆ โดยผูเรียบเรียงมีวัตถุประสงคเพื่อเปนแนวทางในการเก็บสิ่งสง ตรวจ และวิธีการตรวจหาเชื้อ Salmonella จากสิ่งสงสัยใหกับผูเขารวมการอบรมไดทราบ แนวทางเบื้องตน I. วิธีเก็บอุจจาระหรือ rectal swab จากผูปวย ,ผูท ี่เปนพาหะ โดยทัว่ ไปแลวมีหลักเกณฑคลายกับการเก็บสิ่งสงตรวจอื่นๆ เพื่อการเพาะเชื้อ โดยยึด หลักเกณฑดังนี้คือ(อรุณ บางตระกูลนนท, 2541) 1. ความสัมพันธกับการไดรับยาปฏิชีวนะ ควรเก็บสิ่งสงตรวจกอนผูปวยจะไดรับสาร ตานจุลชีพเพราะสารตานจุลชีพที่ไดรับเขาไปจะลดจํานวนเชื้อใหนอยลง ทําให โอกาสตรวจพบเชื้อลดลง โดยเฉพาะในผูปวยถาไดรับสารตานจุลชีพแลวจะตรวจ ไมพบเชื้อ Salmonella จําเปนตองหยุดสารตานจุลชีพกอน 2-3 วัน จึงจะตรวจพบ เชือ้ ได หากมีความจําเปนไมอาจหยุดการใชสารตานจุลชีพ ควรแจงใหเจาหนาที่ หองปฏิบัติการทราบเพื่อจะไดเลือกใชวิธีการเพาะเชื้อที่ลดผลกระทบจากสารตาน จุลชีพนัน้ เชนโดยการเติมเอนไซมเพนนิซิลลินเนส หรืองดการเจือจางสิ่งสงตรวจ กอนการเพาะเชื้อ 2. ตําแหนง ลักษณะสิ่งตรวจที่ดี ควรเก็บสิ่งสงตรวจจากบริเวณหรือตําแหนงที่มี โอกาสพบเชือ้ มากที่สุด เชนในกรณีที่อุจจาระได ควรแนะนําใหผูปวยเก็บอุจจาระ สวนทีม่ มี ูก หรือมูกปนเลือดบริเวณดังกลาวจะมีเชื้ออยูจํานวนมาก 3. ความสัมพันธกับระยะเวลาของโรค ควรเก็บสิ่งสงตรวจในชวงระยะเวลาของการ ดําเนินโรคที่จะมีโอกาสพบเชื้อมากที่สุด ในกรณีของ Salmonella และ Shigella คือ ในระยะ 3 วันแรก เมื่อเริ่มมีอาการอุจจาระรวง หลังจากนี้ไปแลวโอกาสจะพบเชื้อมี นอยลงตามลําดับ 4. ปริมาณที่เหมาะสม ควรเก็บสิ่งสงตรวจใหไดปริมาณมากพอ เพื่อใหสามารถใช ในการตรวจไดครบสมบูรณของแตละวิธี การเก็บอุจจาระสําหรับการเพาะเชื้อควร เก็บประมาณ 0.5-2 กรัม และควรเก็บใสภาชนะที่สะอาดและปราศจากเชื้อ 5. วิธีการเก็บสิ่งสงตรวจ สําหรับการตรวจหา Salmonella จากลําไส นอกจากจะสง เปนอุจจาระแลว สวนใหญมักใชสําลีพันปลายไมทํา rectal swabโดยนําไม swab จุม ลงใน Cary Blair เพื่อใหสําลีติดนํ้ายาและออนตัวเพื่อสะดวกเวลาสอดเขาไปใน เรียบเรียงโดย อรุณ บางตระกูลนนท1, สุมณฑา วัฒนสินธุ2 และชัยวัฒน พูลศรีกาญจน1 1 WHO National Salmonella and Shigella Center, สถาบันวิจัยวิทยาศาสตรสาธารณสุข นนทบุรี 2 ภาควิชาวิทยาศาสตรและเทคโนโลยีการอาหาร คณะวิทยาศาสตรและเทคโนโลยี ม.ธรรมศาสตร

21 ทวารหนักใหลึกเขาไปประมาณ 1-1.5 นิ้ว และควรตรวจดูวามีอุจจาระติดอยูที่ไม swab หากไมมีอุจจาระติดอยูที่ไม swab ให swab ซํ้าใหม 6. การนําสงหองปฏิบัติการ ควรรีบนําสงหองปฏิบัติการทันทีหลังจากเก็บ เพื่อจะได รับผลการตรวจที่นาเชื่อถือ การเก็บสิ่งสงตรวจและตั้งทิ้งไวที่หอผูปวยจะทําให โอกาสตรวจพบเชื้อ Salmonella และ Shigella ลดลง เนื่องจากอัตราการตายของเชื้อ เพิม่ ขึน้ และถูกบดบังจากเชื้อประจําถิ่นในลําไส ซึ่งจะเพิ่มจํานวนขึ้นอยางมากมาย 7. ขอมูลของคนไข ควรใหขอ มูลเกี่ยวกับประวัติการปวยของผูปวย โดยเฉพาะอยาง ยิง่ การวินจิ ฉัยเบื้องตนของแพทย เพื่อเจาหนาที่หองปฏิบัติการจะไดใชเปนขอมูล ประกอบในการเลือกใชอาหารเลี้ยงเชื้อ และเทคนิคการเพาะเลี้ยง เพื่อใหสามารถ ตรวจพบเชื้อสาเหตุที่สงสัยไดมากที่สุด ภาชนะสําหรับเก็บและนําสงอุจจาระ จําเปนตองใชภาชนะที่สะอาด และปราศจากเชื้อ สามารถเก็บรักษาจุลชีพที่มีอยู โดยไมมีการลดหรือเพิ่มจํานวนขณะนําสงหองปฏิบัติการ ภาชนะที่ใชเก็บอุจจาระสงตรวจ นัน้ มีหลายชนิดทั้งชนิดที่ใชครั้งเดียวทิ้ง และที่สามารถนํากลับมาใชไดอีก หองปฏิบัติการ สามารถเลือกใชไดตามความสะดวก และงบประมาณของหองปฏิบัติการ แตวัตถุประสงค หลักก็คอื ตองการรักษาจุลชีพไมใหลดจํานวนลงขณะนําสงหองปฏิบัติการ วิธีการหนึ่งที่ สามารถหลีกเลี่ยงปญหานี้ก็โดยการเก็บสิ่งสงตรวจใสในอาหารที่เรียกวา Transport media ซึ่งประกอบดวยสารอาหารและเกลือแรเพื่อชวยรักษาจุลชีพใหคงมีชีวิตอยูไดในชวงระยะ เวลาหนึ่ง แตจะไมทําใหจุลชีพเพิ่มจํานวนขึ้น

1.

2.

วิธีการนําสงอุจจาระและ rectal swab หากสามารถเก็บแลวนําสงหองปฏิบัติการไดทันที ใหผูปวยถายอุจจาระลงใน ภาชนะทีส่ ะอาดและปราศจากเชื้อแลวนําสงหองปฏิบัติการ หากภาชนะที่ผูปวย ถายลงนั้นไมเหมาะสมตอการสงตอใหใชชอน หรือไมที่ใชสําหรับกดลิ้นผูปวย ตักอุจจาระประมาณ 0.5-2 กรัม โดยเลือกบริเวณที่เปนมูกเลือด หรือมูกปนเลือด ใสในขวดแกวหรือกลองพลาสติกที่สะอาดและปราศจากเชื้อ หากไมสามารถนําสงหองปฏิบัติการไดภายใน 2-3 ชั่วโมง ควรเก็บอุจจาระ ประมาณ 0.5-2 กรัมใสใน transport mediumไดแก Cary blair transport medium หรือ Amies หรือ Stuart transport medium หรือ Buffered glycerol saline


22 solution แลวรีบสงใหเร็วที่สุดที่จะทําได หากตองการแยกเชื้อ Shigella ควรใช Buffed glycerol saline solution จะไดผลดีกวา Cary blair transport medium 3. ในกรณีที่เก็บสิ่งสงตรวจโดยการใช swab เชน เมื่อมีการระบาดของโรคอุจจาระ รวงหรือในกรณีที่ตองการตรวจหาผูที่เปนพาหะของโรค ใหเก็บสิ่งสงตรวจโดย การทําความสะอาด บริเวณโดยรอบทวารหนักดวยสบู และนํ้าสะอาด จากนั้นใช swab ที่ปราศจากเชื้อจุมดวย sterile isotonic solution หรือ sterile broth สอดผาน ทวารหนัก ลึกเขาไป 1-1.5 นิ้วหมุนเบาๆให swab ไดสัมผัสกับ ผนังของเยื่อบุ ทวารหนักใหมากที่สุด แลวนํา swab จุมลงในอาหารของ transport medium กรณี ตองการตรวจหาเชื้อ Vibrio cholerae สามารถเก็บ rectal swab ใสในอาหารเพิ่ม จํานวนเชื้อ Alkaline Peptone Water (APW) แทนก็ได ถาเวลาในการนําสงไม เกิน 2 ชั่วโมง หมายเหตุ Cary blair transport medium Cary และ Blair เปนผูคิดสูตรอาหาร ชนิดนีข้ ึ้นโดยการใช inorganic buffer แทน glycerophosphate ใน Stuart transport medium ซึ่งจะชวยลดปญหาจากการที่แบคทีเรียประจํ าถิ่นเจริญบดบังเชื้อกอโรคไดในระดับหนึ่ง นอกจากนี้ Cary และ Blair ยังพบวาอาหารชนิดนี้สามารถถนอมเชื้อกอโรคในลําไสไดนาน สามารถตรวจพบ Shigell, Salmonella, V. cholerae และ Y. pestis ไดนาน 75 วัน จากคําแนะนําขององคการอนามัยโลก อาหารถนอมเชื้อมีอายุ 5-8 เดือนหลังจากได เตรียมขึ้น ทัง้ นีข้ นึ้ อยูกับการเก็บ หากเก็บไวในอุณหภูมิ 4 oC และอยูในที่มืดจะเก็บไวได นาน ฉะนั้นควรสังเกตอาหารถนอมเชื้อหากมีการเปลี่ยนสีจากเดิมที่มีสีขาวขุน หรือมีการ ปนเปอนของเชื้อ หรืออาหารถนอมเชื้อแหง


23 II. วิธีการเก็บตัวอยาง จากภาชนะและอุปกรณตรวจหา Salmonella ควรใชไม swab ที่มีสําลีพันไมขนาดใหญที่ผานการทําใหปราศจากเชื้อแลว และ ดําเนินการดังนี้คือ 1. นําไม swab จุมลงใน 0.85 % NSS หรือ อาหารเลี้ยงเชื้อชนิดที่เปนนํ้าเชน Buffered Peptone Water (BPW) หรือ Nutrient Broth (NB) และ Tryptic Soy Broth (TSB) 2. นําไปปายภาชนะหรืออุปกรณที่จะตรวจใหทั่ว 3. นําไม swab ที่ปายแลวมาใสในอาหารเลี้ยงเชื้อชนิดที่เปนนํ้าหรือ ใสลงใน Cary-Blair 4. เขียนเบอร ชนิดของภาชนะและอุปกรณที่ทําการ swab 5. เขียนสถานที่เก็บ วัน เวลา และชื่อผูเก็บตัวอยาง 6. สงมายังหองปฏิบัติการทันที III. การวิเคราะหนํ้าและวิธีการเก็บตัวอยางนํ้า การวิเคราะหนํ้าทางจุลชีววิทยานั้น การเก็บตองเลือกเก็บใหเหมาะสมเพื่อใหไดตัว อยางนํ้าที่จะสามารถตรวจพบเชื้อเชน การขนสงและการเตรียมตัวอยางเปนเรื่องที่สําคัญมาก ตองใชวิธีปราศจากเชื้อ (Aseptic Techniques) ไมเกิดความเบี่ยงเบนหรือลําเอียง ในการเก็บ ตัวอยางนํามาวิ ้ เคราะหปริมาณนํ้าตองเพียงพอสําหรับการวิเคราะห การนําสงตัวอยางไปยัง หองปฏิบัติการเปนสิ่งที่ตองระมัดระวัง และตองดําเนินการอยางเขมงวดตองทําโดยใหคุณ ภาพทางดานจุลชีววิทยาของนํ้าไมเปลี่ยนแปลงไปจากเดิมที่ทําการเก็บตัวอยาง เพือ่ มิใหการ วิเคราะหและการแปรผลผิดพลาดจากความเปนจริง 1. อุปกรณสําหรับเก็บตัวอยาง 1.1 ภาชนะทีใ่ ชเก็บตัวอยาง ควรเปนภาชนะที่ใหม อาจเปนขวดแกวหรือขวด พลาสติก ที่ยังไมเคยบรรจุสารอื่นๆมากอนหากบรรจุมากอนควรเปนชนิดที่งายตอการลาง เชน ภาชนะบรรจุนํ้าดื่ม นํ้าหวาน สุรา เปนตน ไมควรเปนภาชนะที่บรรจุนํ้าปลา หรือนํ้ามัน เพราะยากแกการลางและการทําความสะอาด ควรลางภาชนะและฝาจุก ดวยผงซักฟอก หรือ นํายาล ้ างภาชนะจนแนใจวาสะอาด จากนั้นผานการฆาเชื้อ โดยใชความรอนชื้นที่ 121 oC เวลา 15 นาที หรือความรอนแหงที่ 170 oC เวลา 2 ชั่วโมง การใชความรอนชื้นหรือความ รอนแหงขึน้ อยูกับชนิดของภาชนะ และกอนเก็บตัวอยางตองลางดวยนํ้าที่จะเก็บอีกครั้งหนึ่ง สําหรับขวดเก็บตัวอยางนํ้าเพื่อใชเก็บตัวอยางนํ้าที่มีคลอรีน ตองหยดสารละลาย โซเดียมไทโอซัลเฟต (Na2S2O3 5H2O) ความเขมรอยละ 3 จํานวน 0.1 มิลลิลิตร ลงในขวด เรียบเรียงโดย อรุณ บางตระกูลนนท1, สุมณฑา วัฒนสินธุ2 และชัยวัฒน พูลศรีกาญจน1 1 WHO National Salmonella and Shigella Center, สถาบันวิจัยวิทยาศาสตรสาธารณสุข นนทบุรี 2 ภาควิชาวิทยาศาสตรและเทคโนโลยีการอาหาร คณะวิทยาศาสตรและเทคโนโลยี ม.ธรรมศาสตร

24 เก็บตัวอยางนํ้าขนาด 120 มิลลิลิตร กอนการทําใหปราศจากเชื้อ ซึ่งเมื่อนําขวดดังกลาวไป เก็บนําที ้ ่มีคลอรีนปริมาณโซเดียมไทโอซัลเฟตนี้จะทําใหนํ้าที่มีคลอรีนตกคาง (residual chlorine) 5 ppm เปนกลางได ทําใหสามารถปองกันการตายของเชื้อจากคลอรีนในนํ้า ซึ่ง อาจจะเกิดขึ้นในระหวางการสงตัวอยางมายังหองปฏิบัติการ 1.2 กลองบรรจุภาชนะที่เก็บตัวอยาง ควรเปนชนิดที่เก็บความเย็นได เพือ่ รักษาคุณ ภาพนําและการเปลี ้ ่ยนแปลงของเชื้อจุลินทรียในขณะสงตัวอยาง 1.3 นํ้ายาฆาเชื้อ เอทิลแอลกอฮอล 70 % และ สําลี 1.4 ตะเกียงแอลกอฮอร ในกรณีที่ตองใช 1.5 เทอรโมมิเตอร อุณหภูมิตั้งแต - 20 ถึง 100 oC เพื่อใหทราบอุณหภูมิที่เก็บ 2. วิธีการเก็บตัวอยางนํ้า การเก็บตองไมเปดขวดเก็บตัวอยางจนกวาจะทําการบรรจุตัวอยาง เมื่อเก็บตัวอยาง ซึ่งเปนตัวแทนของนํ้าที่จะตรวจโดยวิธีปราศจากเชื้อแลวใหเหลือชองวางของอากาศในขวด อยางนอย 2.5 เซนติเมตร (เพื่อใหสามารถเขยาขวดเพื่อผสมตัวอยางกอนทําการวิเคราะห) แลวรีบปดฝาจุกทันทีปริมาณการเก็บตัวอยางจะตองเพียงพอในการตรวจวิเคราะห แหลงนํ้าตาง ๆ ที่นําสงตรวจ นําประปาหรื ้ อนํ้าที่ไหลจากวาลวนํ้า เตรียมขวดแกวที่สะอาดปราศจากเชื้อมีจุกปด สนิทขนาด 500 มิลลิลิตร ทําความสะอาดวาลวนํ้าโดยเช็ดดวยสําลีชุปแแอกอฮอล 70 % หรือใชไฟเผา กอนแลวปลอยใหไหลทิ้งประมาณ 400 มิลลิลิตร แลวเปดจุก(หรือฝาขวด)ทัน ที ระวังอยาใหจุกหรือฝาขวดสัมผัสมือหรือสิ่งอื่นใด เพื่อปองกันการปนเปอนของเชื้อบักเต รีจากภายนอกปดฉลากแลวเตรียมนําสงวิเคราะห เก็บจากบอบาดาล บอบาดาลชนิดเครื่องสูบโยกดวยมือ ใหสูบนํ้าทิ้งประมาณ 5 นาที กอนเก็บตัวอยาง หากไมมีเครื่องสูบนํ้าใหเก็บตัวอยางโดยตรงจากบอ โดยใชขวดเก็บ ซึง่ ถวงนําหนั ้ กโดยตรงที่กนขวดหรือใชเครื่องมือเก็บตัวอยาง โดยหลีกเลี่ยง การปนเปอน จากสิ่งสกปรกบนผิวนํ้า แหลงนํ้าดิบ การเก็บตัวอยางนํ้าจากแหลงนํ้าดิบโดยตรงไดแก แมนํ้า ธารนํ้า ทะเลสาบ อางเก็บนํ้า นํ้าพุหรือบอนํ้าตื้น ไมควรเก็บตัวอยางใกลฝงมากเกินไป หรือเก็บตัว อยางทีห่ า งแหลงนํ้ามากเกินไปโดยพิจารณาตามความเหมาะสม เชนเก็บจากแหลงชุมชน หรือบริเวณทีม่ นี ักทองเที่ยวเปนจํานวนมาก วิธีการเก็บเปดจุกหรือฝาขวดใชมือจับบริเวณ กนขวดควํ่าปากขวดลงใตผิวนํ้าประมาณ 50 เซนติเมตร แลวจึงคอยๆเอียงปากขวดขึ้นเพื่อ เรียบเรียงโดย อรุณ บางตระกูลนนท1, สุมณฑา วัฒนสินธุ2 และชัยวัฒน พูลศรีกาญจน1 1 WHO National Salmonella and Shigella Center, สถาบันวิจัยวิทยาศาสตรสาธารณสุข นนทบุรี 2 ภาควิชาวิทยาศาสตรและเทคโนโลยีการอาหาร คณะวิทยาศาสตรและเทคโนโลยี ม.ธรรมศาสตร

25 รับนํา้ ในกรณีนํ้านิ่งใหเอียงขวดและกนขวดไปขางหนาในทิศทางขนานเพื่อรับนํ้าแลวรีบ ยกขวดขึ้นโดยเร็วปดฝาขวดปดฉลาก นําบริ ้ โภคบรรจุขวด และนํ้าแร เก็บตัวอยางโดยการสุมจากบริเวณที่ผลิตหลาย ๆ ตําแหนง ในโรงงานผลิตโดยเก็บนํ้าจาก 6 ขวด ตอ 1 ตัวอยาง ในขนาดบรรจุ 1,000 ลบ.ซม. (1 ลิตร) หรือสุมจากสถานที่จําหนาย จากหลาย ๆ กลอง ในกรณีที่บรรจุถุงที่ไมรั่วและใน กรณีที่ขนาดบรรจุมากกวา 4,000 ลบ.ซม. (4 ลิตร) ขึ้นไปใหสุม 2 ขวด นําผลิ ้ ตนํ้าแข็ง เก็บตัวอยางจากจุดกอนเขาซองนํ้าแข็ง นําภาชนะที่เตรียมไวแลวลาง ดวยนําตั ้ วอยางกอน จึงเก็บตัวอยางใหเต็มภาชนะปดจุก หรือฝาใหสนิท หากใชภาชนะ หลายๆใบ ควรบรรจุพรอมกันในวันและเวลาเดียวกัน นําแข็ ้ งกอน หรือ Cube เลือกแบงนํ้าแข็งกอนจากหลาย ๆ ซอง โดยแบงเปนกอน ๆ ขนาดพอบรรจุในภาชนะได หากตัดกอนใหญเกินไปจะบรรจุไดนอย จึงควรทําเปนกอน เล็กๆหลายกอนบรรจุใหเต็มปดฝาใหสนิท ถาเปนนํ้าแข็ง Cube สุมตัวอยางโดยเลือกตัดจาก หลาย ๆ จุด ในเครื่องทํานํ้าแข็งเครื่อง เดียวกัน นําทุ ้ กชนิดที่กลาวมานี้ใหสงถึงหองปฏิบัติการภายใน 12 ชัว่ โมง นับแตเวลาเก็บ หากเร็วกวานี้ไดยิ่งดี ถาเปนนํ้าแข็งควรรักษาการเปนกอนแข็งจนถึงหองปฏิบัติการ สวนนํ้า ชนิดอืน่ ๆ นอกจากนํ้าแข็ง ควรรักษาที่อุณหภูมิประมาณ 20 -30 องศาเซลเซียส ไมควรให รอนไปกวานั้น เพราะอาจไดผลการวิเคราะหที่คลาดเคลื่อน


26 IV. วิธีการเก็บตัวอยางอาหารสงตรวจหาจุลินทรีย อุปกรณในการใชเก็บอาหารสงตรวจ O 1. ภาชนะที่บรรจุอาจใชขวดแกว มีจกุ ปดสนิท ทําใหปราศจากเชื้อโดยอบที่อณ ุ หภูมิ 107 C นาน 1 ชั่วโมงหรือใชถุงพลาสติกที่ปราศจากเชื้อ หรือสะอาด ภาชนะควรมีความจุอยางนอย 250 ml. 2. ใชอุปกรณที่ปราศจากเชื้อ หรือที่สะอาดตักตัวอยางอาหาร บรรจุลงในภาชนะโดยระวัง อยาใหมีการปนเปอนจากบักเตรีภายนอก ใหไดปริมาตรประมาณอยางนอย 200 กรัม ปดจุก และรัดปากถุงใหแนน ปดฉลาก วิธีการเก็บอาหาร :- ใชวิธีปราศจากเชื้อ ( Aseptic Technique) 1. ภาชนะตักและใสตัวอยางที่ปราศจากเชื้อและ หลีกเลี่ยงการจับตองดวยมือ 2. สุม ตัวอยางจากสวนตางๆใหมากที่สุดเทาที่จะทําได 3. ถาอาหารถูกเปดทิ้งไว ควรตักอาหารใหตํ่ากวาผิวหนา 1 นิ้ว 4. ถาเปนชิ้นสวนสัตวหรือปลาทั้งตัว ควรสุมเนื้อบริเวณชองทอง ลําไส และทางเดิน อาหาร เนื้อบริเวณหัวและหางบาง 5. อาหารแตละตัวอยางควรเก็บไมตํ่ากวา 500 กรัม 6. กรณีที่เกิดการระบาดของโรคอาหารเปนพิษตองเก็บอาหารที่เหลือจากผูปวยรับ ประทานนําสงหองปฏิบัติการใหหมด 7. อาหารแหงควรเก็บประมาณ 6-7 หอขึ้นอยูกับขนาดตัวอยาง 8. อาหารกระปองควรสุมประมาณ 12 กระปอง

วิธเี ก็บรักษาอาหาร,การนําสงตัวอยางอาหาร 1.อาหารที่เก็บไดแลวควรปดภาชนะที่ใสอาหารอยางดีนําสงภายใน 1-4 ชม.โดยใชความ เย็น เชน นําแข็ ้ งแหงหรือใชนํ้าแข็งที่สะอาด 2. ในกรณีที่ไมสามารถหานํ้าแข็งไดตอ งนําสงตัวอยางภายใน 1 ชม. 3.ในกรณีที่หองปฏิบัติการยังไมสามารถทําการวิเคราะหไดทนั ที่ตองเก็บไวในตูเย็นที่ อุณหภูมิตํ่ากวา 7 oC 4. ถาเปนอาหารแชแข็งตองเก็บโดยวิธีแชแข็ง ตามสภาพของอาหารนั้น 5. หองปฏิบัติการตองรีบเตรียมอุปกรณใน การตรวจวิเคราะห 6. พยายามทําการวิเคราะหในวันเดียวกับวันทีไ่ ดรับตัวอยาง เรียบเรียงโดย อรุณ บางตระกูลนนท1, สุมณฑา วัฒนสินธุ2 และชัยวัฒน พูลศรีกาญจน1 1 WHO National Salmonella and Shigella Center, สถาบันวิจัยวิทยาศาสตรสาธารณสุข นนทบุรี 2 ภาควิชาวิทยาศาสตรและเทคโนโลยีการอาหาร คณะวิทยาศาสตรและเทคโนโลยี ม.ธรรมศาสตร

27

การตรวจวิเคราะห : ในสภาวะที่เชื้อซัลโมเนลลาอาจจะเกิดการบาดเจ็บหรือมีอยู เปนจํานวนนอย ควรจะผานขั้นตอนกระตุนที่เรียกวา Pre-enrichment step เสียกอน จาก นัน้ จึงผานอาหารเลี้ยงเชื้อเหลวที่เลือกเฉพาะชนิด (Selective Enrichment) แลวนําไปแยก เชือ้ บนวุนอาหารอาหารที่เลือกเฉพาะชนิดตอไป (Selective Differential Plating) ซึ่งสรุป เปนขั้นตอนไดดังนี้ ขั้นที่ 1 ขัน้ กระตุนใหเชื้อบาดเจ็บแข็งแรง (Pre-enrichment) ใชอาหารเลี้ยงเชื้อที่ กระตุน ใหเชื้อแบคทีเรียที่บาดเจ็บเจริญ โดยไมมีสารยับยั้งแบคทีเรียผสมอยูดวย ตัวอยาง เชน buffered peptone water, nutrient of lactose broths (ICMSF,1978) Pre enrichment ไดแก Buffered Peptone Water, Lactose Broth, Tryptone Soya Broth, Nutrient Broth อาหารประเภทเนื้อ และผลิตภัณฑเนื้อ , ผัก , ผลไม ควรสุมจากจุดตางๆ หลายๆ จุดใหไดอาหารหนัก 25 กรัมตอ per-enrichment 225 ml อาหารประเภทของแหง ถาอาหารมีนํ้าหนักเบาใชนํ้าหนักอาหาร 11 กรัมตอ per-enrichment 99 ml


28 ขั้นที่ 2 ขั้นเพาะเลี้ยงในอาหารเลี้ยงเชื้อเหลวที่เลือกเฉพาะชนิด (Selective Enrichment Step) หลังจากกระตุนใหเชื้อซัลโมเนลลา (ที่อาจมีในอาหาร) แข็งแรงขึ้นแลว จึงนํามาเพาะลงในอาหารเลี้ยงเชื้อเหลวซึ่งเติมสารยับยั้งจุลินทรียที่ไมตองการ (เลือกเฉพาะ เชื้อซัลโมเนลลา) ตัวอยางเชน สี (dyes), tetrathionate, selenite อุณหภูมริ ะยะเวลาบมเพาะ เชื้อจะตองเหมาะสมกับเชื้อซัลโมเนลลา ซึ่งจะมีผลทําใหเชื้อซัลโมเนลลาเจริญไดดีกวา แบคทีเรียชนิดอื่น ๆ และปรากฏโคโลนีขึ้นเมื่อนําไปเพาะเลี้ยงบน selective differential plating media หรือนําไปจําแนกเชื้อโดยใชเทคนิคอื่น ตามปกติใชเวลาบมเพาะเชื้อประมาณ 16-24 ชัว่ โมง อุณหภูมิที่ใชบมเพาะเชื้อซัลโมเนลลาโดยทั่วไปอยูที่ 35-40OC แตบอยครั้ง พบวาการบมเพาะเชื้อที่ 41-43OC มีโอกาสใหไดเชื้อซัลโมเนลลาเพิ่มขึ้น เนื่องจากเชื้อ แบคทีเรียอื่นที่ไวตออุณหภูมิไมเจริญรบกวนเชื้อซัลโมเนลลา ตัวอยางอาหารเลี้ยงเชื้อเหลว เลือกเฉพาะชนิดที่นิยมใช (Selective broth media) เชน Tetrathionate ที่เติม Brilliant Green, Selenite Cystein, Gram Nagative (GN) broth และMagnesium Chloride – malachite Green ของ Rappaport – Vassiliadis (Vassiliadis, 1983) ในทางปฏิบัติแนะนําใหใช selective broth media มากกวาชนิดหนึ่ง และอุณหภูมิในการบมเพาะเชื้อมากกวาหนึ่งสภาวะ เพื่อ เพิม่ โอกาสในการตรวจพบ การรายงานผลจะรายงานวา ตรวจพบ/ไมพบ ในปริมาณตัว อยางอาหารที่นํามาตรวจ Selective enrichment ไดแก Rappaport - Vassiliadis Broth, Selenite Cystine Broth, Tetrathionate Broth, Manitol - Selenite Cystine Broth

RV

SCB

TT

BPW


29 ขั้นที่ 3 ขัน้ แยกเชื้อบนวุนอาหารเลือกเฉพาะชนิด (Selective – Differential Plating Media) หลังจากผานขั้นตอนกระตุนดวยอาหารเลี้ยงเชื้อเหลวเลือกเฉพาะชนิดแลว จึงนํามา แยกเชื้อบน Plating media ในขัน้ ตอนนี้ใชอาหารเลี้ยงเชื้อเลือกเฉพาะชนิดที่เติมวุน อาทิ Bile salts, Deoxycholate, Brilliant Green, Bismuth Sulfide และสารปฎิชีวนะ อาหารเหลา นีจ้ าแนกเชื ํ ้อซัลโมเนลลาโดยอาศัยลักษณะโคโลนีที่ปรากฏบนวุนอาหาร สังเกตไดจากการ เปลี่ยนสีของ pH indicators ทีเ่ ติมลงในอาหารเลี้ยงเชื้ออันเปนผลจากความสามารถของเชื้อ ในการใชนํ้าตาลแลคโตสหรือซูโครสผานกระบวนการหมัก(fermentation) นอกจากนี้ยัง อาจตอบสนองตอความสามารถของเชื้อที่จะสรางกาซไขเนา (H2S) หรือความสามารถใน การดึงคารบอนไดออกไซด (decarboxylation) ออกจากกรดอะมิโนไลซีน (lysine) เปนตน วุนอาหาร (Plating media) ทีน่ ยิ มใช ไดแก Brilliant Green ทีเ่ ติม/หรือไมเติม sulphadiazine หรือ sulphapyridine, Xylose Lysine Deoxycholate (XLD) Agar, Bismuth Sulfide (BS) Agar, Hektoen Enteric (HE) Agar, MacConkey, Deoxycholate Citrate (DC) Agar และ Salmonella-Shigella (SS) Agar ในการใชวุนอาหารที่เลือกเฉพาะชนิดเพื่อแยกเชื้อซัลโมเน ลลา แนะนําใหใชอาหารเลี้ยงเชื้อมากกวาหนึ่งชนิดเชนกัน อาหารเลี้ยงเชื้อแบงออกเปน 3 ลําดับ Plating Media Low selective ไดแก Mac (Mac conkey), EMB , Endo Agar Intermediate selective ไดแก XLD , DCA , SS , HE , DHL High selective ไดแก BS (Bismuth sulfide) , , BGA New media Rm (Rambach) XLT4 (Xylose lysine Tergitol 4) DiaSalm MSRV (Modified Semi – solid Rappaport Vassiliadis agar)


30

วิธีการตรวจหาเชื้อ Salmonella จากอาหาร และตัวอยาง นําตัวอยางอาหารเพาะในPre-enrichment เชน Buffered Peptone Water หรือ Lactose Broth หรือ Trptone Soya Brothหรือ Nutrient Broth เขาตูอบเพาะเชื้อ 37 oC นาน 18 - 24 ชั่วโมงถายเชื้อลงใน • RV broth (Rappaport Vasilladis broth) และ TT broth (Tetrathionate broth) เขาตูอบเพาะเชื้อ 42 oC นาน 18 - 24 ชั่วโมง • จาก BPW นํามาเพาะลงใน MSRV (Modified Semi-solid Rappaport-Vassiliadis medium) โดยใช loop ตัก BPW มาหยดบนผิว MSRV 3 หยด ใหแตละหยดอยูหางกันพอสม ควร นํามาบมที่อุณหภูมิ 42 oC นาน 18 - 24 ชั่วโมง หลังจากนั้นนํามาเลือกเชื้อ Salmonella ใน MSRV ใหพิจารณาที่สีของ MSRV จะเปลี่ยนจากสีเขียวแกมนํ้าเงินใสเปนสีขาวขุน รอบ ๆ จุดที่หยดเชื้อลงไปเปนวงกวาง (เชื้อ Salmonella ทีม่ ี flagella จะเคลื่อนออกไปรอบ ๆ จุดทีห่ ยดเชื้อ) จากนั้นใช wire แตะเชื้อที่แผไปไกลที่สุดจากตําแหนงที่หยดเชื้อ นําไป เพาะใน TSI และ LIM เขาตูอบเพาะเชื้อที่ 37 oC นาน 18 - 24 ชั่วโมง (MSRV เหมาะสําหรับ ทีจ่ ะตรวจหาเชื้อ Salmonella ทีม่ ี flagella เทานั้น ถาเปนเชื้อ Salmonella ทีไ่ มมี flagella จะ ไมสามารถตรวจได) • มาเพาะลงบนอาหารเลี้ยงเชื้อ XLD agar (Xylose-Lysine Deoxycholate Agar ) และ BG agar (Brilliant Green Agar) หรือ SS agar (Salmonella, Shigella Agar), DHL agar (Deoxycholate Hydrogen Sulfide Lactose Agar) หรือ BS agar (Bismuth Sulfide Agar) และ BPW (Buffer Peptone Water) นําทั้งหมดเขาตูอบเพาะเชื้อ 37 oC นาน 18 - 24 ชัว่ โมงอานลักษณะโคโลนีบน XLD และ BG agar บน XLD มีลกั ษณะโคโลนีกลมขนาด ปานกลาง มีสีแดงและมีสีดําอยูตรงกลาง บน BG agar (Brilliant Green Agar) ลักษณะโค โลนีของเชื้อซัลโมเนลลาจะมีรูปรางกลม ขนาดปานกลาง สีชมพูขาวทึบแสง อาหารรอบๆ โคโลนีจะเปนสีแดง (สําหรับอาหารเลี้ยงเชื้อชนิดอื่นนั้น การเลือกลักษณะโคโลนีใหดูจาก คําอธิบายที่เขียนไว ) การเลือกลักษณะโคโลนีในอาหารเลี้ยงเชื้อแตละชนิดที่มีลักษณะ โค โลนีที่สงสัยวาเปนซัลโมเนลลา ควรเลือกไมนอยกวา 3-5 โคโลนี และโดยนํา 1 โคโลนีที่ สงสัยมาเพาะลงในอาหารเลี้ยงเชื้อ TSI (Triple Sugar Iron Agar) และ LIM (Lysine Indole Motility Medium) (เพราะฉะนั้น 3-5 โคโลนีหมายถึง ใชอาหารเลี้ยงเชื้อ TSI และ LIM 3-5 ชุด) นําเขาตูอบเพาะเชื้อ 37 oC นาน 18 - 24 ชั่วโมง สําหรับ BS ใหอานผลที่ 48 ชั่วโมง เรียบเรียงโดย อรุณ บางตระกูลนนท1, สุมณฑา วัฒนสินธุ2 และชัยวัฒน พูลศรีกาญจน1 1 WHO National Salmonella and Shigella Center, สถาบันวิจัยวิทยาศาสตรสาธารณสุข นนทบุรี 2 ภาควิชาวิทยาศาสตรและเทคโนโลยีการอาหาร คณะวิทยาศาสตรและเทคโนโลยี ม.ธรรมศาสตร

31 • หมายเหตุ ในการตรวจหาเชื้อ Salmonella นัน้ ควรเลือกอาหารเลี้ยงเชื้อที่เชื้อ Salmonella ขึน้ ไดดไี มนอยกวา 2 - 3 ชนิดในการตรวจแตละครั้ง อาหารเลี้ยงเชื้อที่เลือกใช นัน้ ขึน้ อยูกับความถนัดของผูทํา Lab และการเลือกโคโลนีนั้นก็ไมควรเลือกโคโลนีนอยกวา 3 - 5 โคโลนี ในอาหารเลี้ยงเชื้อแตละชนิด ลักษณะโคโลนีของซัลโมเนลลาบนอาหารเลี้ยงเชื้อแตละชนิด 1. SS agar (Salmonella Shigella Agar), DHL agar (Deoxycholate Hydrogen Sulfide Lactose Agar) ลักษณะโคโลนีของเชื้อซัลโมเนลลาบนอาหารเลี้ยงเชื้อทั้ง 2 ชนิดนี้ จะมีลกั ษณะคลายกัน คือมีรูปรางกลมขนาดเล็ก โปรงแสงและไมมีสีหรือสีเหลืองซีด ขอบ เรียบ สวนมากจะสรางกาซโฮโดรเจนซัลไฟดสีดําตรงกลางโคโลนี 2. XLD agar (Xylose Lysine Deoxycholate Agar) ลักษณะโคโลนีของเชื้อซัล โมเนลลา มีรูปรางกลมขนาดปานกลาง มีสีแดงและมีสีดําอยูตรงกลาง และสราง ไฮโดรเจนซัลไฟดที่มีสีดําอยูตรงกลางโคโลนี 3. BS agar (Bismuth Sulfide Agar) ลักษณะโคโลนีของเชื้อซัลโมเนลลาจะเปนสีดํา เงาวาว อาหารที่อยูใตโคโลนีก็จะดํา BS จะยับยั้งแบคทีเรียกรัมบวก และแบคทีเรียพวกโค ลิฟอรมแตเชื้อซัลโมเนลลาจะเจริญบน BS ไดเปนอยางดี การสรางกาซไฮโดรเจนซัลไฟด ของเชื้อซัลโมเนลลาทํ าใหมีสารประกอบซัลเฟอรอยูในโมเลกุลและเมื่อเหล็กมีการตก ตะกอนจึงทําใหลักษณะของโคโลนีเปนสีนํ้าตาลเปนเงาวาว 4.BG agar (Brilliant Green Agar) ลักษณะโคโลนีของเชื้อซัลโมเนลลาจะมีรูปราง กลม ขนาดปานกลาง สีชมพูขาวทึบแสง อาหารรอบๆโคโลนีจะเปนสีแดง ทั้งนี้เนื่องจาก เชื้อซัลโมเนลลาเปนเชื้อที่ไมสลายนํ้าตาลแลคโตสและซูโครส สวนเชื้อที่สามารถสลายนํ้า ตาลแลคโตสหรือซูโครส โคโลนีจะเปนสีเหลืองเขียวและอาหารรอบๆโคโลนีจะเปนสี เหลืองเขียวดวย โดยปกติการเจริญของเชื้อสวนใหญจะถูกยับยังอยางสมบูรณโดยสีของบริล เลียนกริน ซึง่ สีนเี้ มือ่ มีในอาหารในความเขมขนที่เหมาะสมจะมีคุณภาพในการยับยั้งหรือ เลือกชนิดของเชื้อ บริลเลียนกรีนจะไปยับยั้งแบคทีเรียกรัมบวกไมใหขึ้นในอาหาร สวน พวก colonaerogenes group จะไมถูกยับยั้ง BG ประกอบไปดวย นํ้าตาลแลคโตส และ ซูโครส โดยมีฟนอลเรดเปนอินดิเคเตอร ซึ่งมีสีชมพูแดงใน pH ที่เปนดางคือ ชวง pH อยู ระหวาง 6.8 – 8.4 เชื้อซัลโมเนลลาเปนเชื้อที่ไมเฟอรเมนทนํ้าตาลแลคโตสและซูโครสดัง กลาวแลว จึงทําใหอาหารเลี้ยงเชื้อที่มีชวง pH เปนดาง โคโลนีจึงเปนสีชมพูแดงตามอาหาร เรียบเรียงโดย อรุณ บางตระกูลนนท1, สุมณฑา วัฒนสินธุ2 และชัยวัฒน พูลศรีกาญจน1 1 WHO National Salmonella and Shigella Center, สถาบันวิจัยวิทยาศาสตรสาธารณสุข นนทบุรี 2 ภาควิชาวิทยาศาสตรและเทคโนโลยีการอาหาร คณะวิทยาศาสตรและเทคโนโลยี ม.ธรรมศาสตร

32 สวนเชื้อที่สามารถใชนํ้าตาลแลคโตสและซูโครสจะทําใหอาหารเลี้ยงเชื้อที่มี pH เปนกรด ทําใหอาหารเลี้ยงเชื้อเปลี่ยนเปนสีเหลือง เชนเดียวกับสีของโคโลนี 5.MSRV agar (Modified Semi – solid Rappaport Vassiliadis agar) ลักษณะของเชื้อที่ ขึน้ บน MSRV ใหพิจารณาจากสีของ MSRV จะเปลี่ยนจากสีเขียวแกมนํ้าเงินใส เปนสีขาว ขุนรอบ ๆ จุดที่หยดเชื้อลงไป (เชื้อ Salmonella ทีม่ ี flagella จะเคลื่อนที่แผไปรอบ ๆ จุดที่ หยดเชือ้ ) จากนั้นใชเข็มเขี่ยแตะเชื้อ ณ จุดที่แผไปไกลที่สุดจากตําแหนงที่หยดเชื้อลงใน TSI และ LIM 6.Rambach agar ลักษณะโคโลนีของ Salmonella ทัว่ ๆ ไปจะใหสีแดงบนอาหารเลี้ยง เชื้อ ถาเปน Salmonella Typhi, Salmonella Paratyphi A โคโลนีใส มีเสนผาศูนยกลาง 1 – 4 มม. 7.Hektoen - Enteric Agar (H.E) ลักษณะโคโลนีของ Salmonella ที่สราง H2S จะมีสีนํ้า เงินเขียวและ ตรงกลางมีสีดํา กลม นูน ผิวเรียบเปนมัน มีเสนผาศูนยกลางประมาณ 3 มม. สวน Salmonella ทีไ่ มสราง ลักษณะโคโลนีสีนํ้าเงินเขียว กลมนูน ผิวเรียบ เปนมัน มีเสนผา ศูนยกลาง 1-3 มม.

ลักษณะโคโลนีของ Salmonella บนอาหารเลี้ยงเชื้อ

XLD

DHL


33

ลักษณะโคโลนีของ Salmonella บนอาหารเลี้ยงเชื้อ

HE

BG

BS

MSRV

การจําแนกชนิด (Identification) : การกลั่นกรองเบื้องตนใชอาหารเลี้ยงเชื้อที่ไม จํากัดชนิดของเชื้อ เชน Triple Sugar Iron Agar (TSI), Lysine Iron Agar (LIA), Gillies medium I และ II หรือ TSI, Urea Agar เปนตน สําหรับการจําแนกเชื้อในขั้นตอมาอาศัยการ ทดสอบปฏิกิริยาทางชีวเคมีของเชื้อบริสุทธิ์ ซึ่งตามปกติจะใชเวลาหลายวัน ในการทดสอบ ขัน้ แรกโดยทั่วไปทําการทดสอบ lysine, urease และ Indole กอน จากนั้นจึงทําการทดสอบ ปฏิกิริยาทางชีวเคมีอีก 14 อยาง เพื่อจําแนกสมาชิกในตระกูล Enterobacteriaceae ในระดับ genus (ในทางการคามีอุปกรณ test kits สําหรับจําแนกเชื้อจําพวก Enterobacteriaceae ในชื่อ การคาตาง ๆ กัน เชน Micro ID, Minitek, API20E, Entero-tube II และ Vitek เปนตน)


34

Organisms Salmonella Typhi Salmonella Paratyphi A Salmonella Choleraesuis Salmonella Pullorum Salmonella Gallinarum other Salmonella K = Alkaline A = acid

T S I - agar Slant Butt Gas H2S K A - + K A + K A + d K A + K A - K A + +(-)

L I M medium Lysin Indol Motility + + + + + + + + +(-)

การทดสอบทางซีโรวิทยา (Serological test) หลังจากผานการทดสอบทางชีวเคมีเบื้องตนโดย TSI และ LIM ไดเชื้อที่สงสัยวา เปน Salmonella แลวใหมาทําการทดสอบทางซีโรวิทยาโดยวิธี Slide agglutination โดยทํา การทดสอบระหวางเชื้อกับ แอนติซีรัม (Antiserum) จําเพาะมีขั้นตอนดังนี้ 1.หยด 0.85% NSS ลงบน Slide 1 หยด เขี่ยเชื้อจาก TSI มาละลายใน 0.85% NSS กวนใหเขากัน แลวสังเกตวาเกิดการจับกลุมภายใน 30 วินาที หรือไม หากเกิดการตก ตะกอนแสดงวา เชื้อดังกลาวไมสามารถทดสอบซีโรไทปไดเนื่องจากเชื้อ rough (เชื้อ rough หมายถึง เชื้อที่มีลักษณะโคโลนีไมเรียบ และจะตกตะกอนกับ 0.85% NSS และก็จะตก เรียบเรียงโดย อรุณ บางตระกูลนนท1, สุมณฑา วัฒนสินธุ2 และชัยวัฒน พูลศรีกาญจน1 1 WHO National Salmonella and Shigella Center, สถาบันวิจัยวิทยาศาสตรสาธารณสุข นนทบุรี 2 ภาควิชาวิทยาศาสตรและเทคโนโลยีการอาหาร คณะวิทยาศาสตรและเทคโนโลยี ม.ธรรมศาสตร

35 ตะกอนกับ antiserum ทุกชนิด จะไมสามารถที่จะวินิฉัยไดวาเปนเชื้อชนิดไหน) ถาไมตก ตะกอนใน 0.85% NSS จึงทดสอบตอได 2. หยด antiserum Salmonella Polyvalent A-67 และ Salmonella Polyvalent A-I บน Slide อยางละ 1 หยดและเขี่ยเชื้อจาก TSI มาทดสอบกับ antiserum ทั้ง 2 ชนิดกวนให เขากันดีกับ antiserum ทั้งสองชนิด เอียง Slide ไปมาหลาย ๆ ครั้ง สังเกตปฎิกิริยาการจับ กลุม ทีเ่ กิดขึน้ จะเห็นภายในเวลา 30 - 60 วินาที ถาตกตะกอนตอ antiserum ใดก็แสดงวาเชื้อ มี antigen ตอ antiserum นั้น แตเนื่องจากในขั้นตอนนี้ใช antiserum รวมหลายชนิดจึงยังไม สามารถบอกวาเปน group ใด อาจเปนชนิดใดชนิดหนึ่งระหวาง Salmonella group A ถึง Salmonella group I กรณีที่ใหผลบวก (+) Salmonella Polyvalent A-I แตถาใหผลลบ (-) Salmonella Polyvalent A-I แตใหผลบวกตอ Salmonella Polyvalent A-67 แสดงวาเชื้อนี้จะ อยูในระหวางชวง Salmonella group J ถึง Salmonella O:67 3. หลังจากนั้นใหทดสอบกับ antiserum เดีย่ วแตละ group คือ Salmonella group A, group B, group C, group D, group E ถึง group I ถาใหผล group ใดบวกใหรายงานวาเปน Salmonella group นัน้ เชน ใหผลบวกกับ Salmonella group B antiserum แสดงวาเชื้อที่นํามา จาก TSI นั้น เปน Salmonella group B 4. เมือ่ วินจิ ฉัยในเบื้องตนไดแลววาเปน Salmonella serogroup ใดใหสงมาทดสอบยืน ยันเชื้อที่ WHO National Salmonella and Shigella Center สถาบันวิจัยวิทยาศาสตรสาธารณ สุข กรมวิทยาศาสตรการแพทย นนทบุรี เพื่อตรวจในรายละเอียดวาเปน serovar ใดตอไป สวนประกอบของ Antiserum polyvalent 1.Salmonella polyvalent A-67 antiserum หมายถึง ใน antiserum ชนิดนี้จะประกอบดวย Salmonella group A + group B + group C + group D + ……….+ Salmonella group O:67 antiserum (หรือ O:1 + O:2 + O:3 + O:4 +………+ O:67 antiserum) 2.Salmonella polyvalent A-I antiserum หมายถึง ใน antiserum ชนิดนี้จะประกอบดวย Salmonella group A + group B + group C + group D +………..+ Salmonella group I (O:16) antiserum (หรือ O:1 + O:2 + O:3 + O:4 +…………+ O:16 antiserum) 3. Salmonella polyvalent O:17 - O:67 antiserum หมายถึง ใน antiserum ชนิดนี้จะ ประกอบดวย group J (O:17) + group K (O:18) +…………+ group Z (O:50) + O:51 +……….+ O:67 4.Salmonella group A, group B, group C antiserum หมายความวาใน antiserum ของ แตละ group จะมี O antiserum ของ group นั้นประกอบอยู เชน เรียบเรียงโดย อรุณ บางตระกูลนนท1, สุมณฑา วัฒนสินธุ2 และชัยวัฒน พูลศรีกาญจน1 1 WHO National Salmonella and Shigella Center, สถาบันวิจัยวิทยาศาสตรสาธารณสุข นนทบุรี 2 ภาควิชาวิทยาศาสตรและเทคโนโลยีการอาหาร คณะวิทยาศาสตรและเทคโนโลยี ม.ธรรมศาสตร

36 Salmonella group A จะมี O:1 + O:2 + O:12 antiserum Salmonella group B จะมี O:1 + O:4 + O:5 + O:12 + O:27 antiserum Salmonella group C จะมี O:6 + O:7 + O:8 + O:14 + O:20 antiserum เปนตน 5.Salmonella polyvalent H:H antiserum หมายความวา ใน antiserum ชนิดนี้จะ ประกอบดวย flagella ของเชื้อ Salmonella ทั้งหมด 2 เฟส คือตั้งแต flagella H:a + H:b + H:c + H:d + H:f +……….+ z59 + H:1 + H:2 +……….+H:7 6.Salmonella polyvalent H:L หมายความวา ใน antiserum ชนิดนี้จะประกอบดวย flagella ดังนี้ H:l + H:v + H:w + H:z13 + H:z28 antiserum 7.Salmonella polyvalent H:G หมายความวา ใน antiserum ชนิดนี้ประกอบดวย flagella ดังนี้ H:f + H:g + H:s + H:t + H:m + H:p + H:q 8.Salmonella polyvalent H:Unspecific anteserum หมายความวา ใน antiserum ชนิดนี้ ประกอบดวย flagella ทีเ่ ปน Phase 2 ทั้งหมด คือ H:1,2 + H:2 + H:5 + H:6 + H:7 + H:z6 antiserum เปนตน ในขณะนี้ไดมีการผลิต Antisera ใหมเพิม่ เติมเพื่อสะดวกในการหา groups งายขึ้นมีดังนี้ Salmonella Polyvalent OMA = O agglutinins of groups:ประกอบดวย 2(A)+4(B)+9(D1)+9,46(D2)+3,10(E1)+1,3,19(E4)+21(L) (O:1,2,12+4,5,12+9.12+3,10+1,3,10+21) Salmonella Polyvalent OMB = O agglutinins of groups :ประกอบดวย 7(C1)+8(C2-C3)+11(F)+13(G)+6,14(H) (O:6,7+6,8+8,20+11+13,22+13,23+6,14,24) Salmonella Polyvalent OMC = O agglutinins of groupsประกอบดวย 16+17+18+28+30+35+38 Salmonella Polyvalent OMD = O agglutinins of groups 39 +40+41+42+43+44+45 Salmonella Polyvalent OME = O agglutinins of groups 47 +48+50+51+52+53+61 Salmonella Polyvalent OMF = O agglutinins of groups 54 +55+56+57+58+59 Salmonella Polyvalent OMG = O agglutinins of groups 60 +62+63+65+66+67 เรียบเรียงโดย อรุณ บางตระกูลนนท1, สุมณฑา วัฒนสินธุ2 และชัยวัฒน พูลศรีกาญจน1 1 WHO National Salmonella and Shigella Center, สถาบันวิจัยวิทยาศาสตรสาธารณสุข นนทบุรี 2 ภาควิชาวิทยาศาสตรและเทคโนโลยีการอาหาร คณะวิทยาศาสตรและเทคโนโลยี ม.ธรรมศาสตร

37 สําหรับ Antiserum ทีใ่ ชในการหา flagella ก็ไดมกี ารจัดกลุมใหมเชนเดียวกันเปน ดังนี้คือ Salmonella Polyvalent HMA Salmonella Polyvalent HMB Salmonella Polyvalent HMC Salmonella Polyvalent HMD Salmonella Polyvalent HMIII

= = = = =

a + b + c + d + i + z10 + z29 e,h + e,n,x + G k + y + z + L + Z4 + r z35 + z36 + z38 + z39 + z 41 + z42 + z44 + z60 z52 + z53 + z54 + z55 + z57 + z61 (H factors of subspecies III only)

ฉะนั้นการเลือกใช antisera Salmonella เพื่อทดสอบเชื้อ Salmonella สามารถเลือก ใช Salmonella Polyvalent OMA, OMB, OMC, OMD, OME, OMF, OMG แทนไดซึ่งมี การรวม O-group ทีเ่ ฉพาะมากกวาและงายตอการหา group ตาง ๆ และเลือกใช HMA, HMB, HMC, HMD และ HMIII เพิ่มเติมเพื่อหา flagella ของเชื้อ Salmonella ใหงายยิ่งขึ้น ทางเลือกอื่น (Altemative methods) : วิธกี ารตรวจวิเคราะหและจําแนกเชื้อซัลโม เนลลาแบบดั้งเดิมเปนวิธีที่ใชแรงงานและระยะเวลาประมาณ 3-5 วัน เพียงเพื่อที่จะบอกวา มีแนวโนมวาพบเชื้อซัลโมเนลลาหรือไมเทานั้น ดังนั้น จึงมีการพัฒนาวิธีตรวจหาเชื้อซัลโม เนลลาที่รวดเร็วกวาเดิม ตัวอยางเชน วิธี Fluorescent antibody (Cherry et al, 1975; Thomson, 1981; Insalata and Chordash, 1984) วิธี DNA/DNA hybridization assays (DNAH) (Fitts et al,1983; Ewing, 1986) วิธี Enrichment Serology (Sperber and Diebel, 1969) วิธี Enzyme-linked immunosotbent assay (ELISA) (Minnich et al,1982; Mattingly and Gehle, 1984) วิธี Membrane filter – disc – immunoimmobilization (La Roche et al, 1981) และวิธี Salmonella phage tests (Welkos et al, 1974) แตวิธี ELISA และวิธี DNAH (ไมวาจะเตรียมจาก polyclonal หรือ monoclonal antibodies) และวิธี DNAH เปนวิธีที่ไดรับ การรับรองจาก AOAC แลว (Flowers et al, 1986 a,b) แสดงแผนภูมิการตรวจวิเคราะหหาเชื้อ Salmonella อาหาร, อุจจาระสัตว ตาม มาตราฐานขอกําหนดของ ISO 6579, FDA (Food and Drug Administration), AOAC (Association Official Analytical Chemists), BAM


38 Detection of Salmonella in Faces (ISO 6579) faces: W eight 25g of food to 225ml of buffered peptone water.

0.1 ml

0.1 ml

.

10ml Tetrathionate Transfer 10ul

10ml RVSP. Broth loop / plate

XLD agar plates. XLD-T etra BGA agar plates. BGA-T etra

XLD agar plates. XLD-RVSP

37 O C 18 - 24 hr.

BGA agar plates. 37 O C 18 - 24 hr.

BGA-RVSP

Biochemical Tests

Streak on

TSI LIM

Nutrient agar (NA)

O-antigens

H-antigens


39 Detection of Salmonella in Faces (Modified) faces: W eight 25g of food to 225ml of buffered peptone water.

Transfer 10ul loop / plate 0.1 ml

0.1 ml

.

10ml Tetrathionate Transfer 10ul

10ml RVSP. Broth

BGA agar plates. BGA-T etra MSRV agar plates.

42O C 18 - 24 hr.

loop / plate

XLD agar plates. XLD-T etra

MSRV agar plates.

XLD agar plates. XLD-RVSP

37O C 18 - 24 hr.

BGA agar plates. 37O C 18 - 24 hr.

BGA-RVSP

MSRV agar plates. MSRV-RVSP

42O C 18 - 24 hr.

MSRV-RVSP

Biochemical Tests

Streak on

TSI LIM

Nutrient agar (NA)

O-antigens

H-antigens


40 D e te c tio n o f S a lm o n e lla in F o o d (IS O 6 5 7 9 ) Food W eight 25g o f foo d to 2 25m l of buffer ed pe pton e w ater.

0.1 m l

0.1 m l

.

10m l T etrathionat e T rans fer 10u l

10m l R VS P . B roth loop / pla te

XLD ag ar plates . XLD -T etra B G A agar p lates . B G A-T etra

XLD ag ar plates . XLD -R VS P

3 7 O C 1 8 - 24 hr .

B G A agar p lates . 3 7 O C 1 8 - 24 hr .

B G A-R VS P

B io c h e m ic a l T e s ts

S tre a k o n

T S I L IM

N u trie n t a g a r (N A )

O -a n tig e n s

H -a n tig e n s


41 D e te ct io n o f S alm o n e l la in F oo d ( M o d if y) Food W e ig h t 2 5 g o f fo o d to 2 2 5 m l o f b u ffe re d p e p to n e w a te r.

T ra n s fe r 1 0 u l lo o p / p la te 0 .1 m l

0 .1 m l

.

1 0 m l T e tra th io n a te T ra n s fe r 1 0 u l

1 0 m l R VS P . B ro th

B G A a g a r p la te s . B G A-T e tra M SR V agar p la te s .

4 2 O C 1 8 - 2 4 hr .

lo op / p la te

XL D a g a r p la te s . XL D -T e tra

M S R V a g a r p la te s .

XL D a g a r p la te s . XL D -R VS P

3 7 O C 1 8 - 2 4 hr .

B G A a g a r p la te s . 3 7 O C 1 8 - 2 4 hr .

B G A-R VS P

M S R V a g a r p la te s . M S R V-R VS P

4 2 O C 1 8 - 2 4 hr .

M S R V-R VS P

B io c h e m ic a l T es ts

S tr e a k on

T S I L IM

N u tr ie n t a g a r (N A )

O -an t ige n s

H -an t ige n s


42

FDA / AOAC BAM Salmonella Isolation Procedure Weight 25g of portions to 225ml of pre enrichment medium 24 –+ 2 h, 37 O C 1 ml

10 ml TT Broth 24 –+ 2 h, 37 O C

10 ml

10 ml

10 ml RV Broth 100 ml SC Broth 18 – 24 h, 37 O C 18 – 24 h, 42 O C

Bismuth Sulphite Agar Xylose lysine desoxycholate Agar Hektoen Entric Aagr

Biochemical Confirmation ( 2 or more colonies from each agar plate )

24 –+ 2 h, 37 O C

Streak on Nutrient agar (NA)


43

BSI / ISO Salmonella Isolation Procedure

Weight 25g of portions to 225ml of pre enrichment medium 16  20 h, 37 O C 0.1 ml 10 ml RV Broth 18  24 h, 42 O C

Brilliant Green Agar

Other solid selective medium

10 ml 100 ml SC Broth 18  24 h, 37 O C

24 h, 35  37 O C

24 h, 35  37 O C Streak on

Biochemical Confirmation ( 5 colonies from each agar plate ) Nutrient agar (NA)


44 การทํางานของ WHO National Salmonella and Shigella Center การเฝาระวังและติดตามหาความชุกของโรค Salmonellosis โดยไดรับเชื้อจากโรง พยาบาล และหนวยสาธารณสุขตาง ๆ ใหความสนใจหาซีโรวารในประเทศไทย เพื่อสํารวจ หาการระบาด และดําเนินการควบคุม NSSC ไดดํ าเนินการทดลองหาวิธีการตรวจเชื้อ Salmonella ดวยเทคนิคอื่น ๆ ใหงายยิ่งขึ้น เอกสารอางอิง พนิดา ชัยเนตร, ศุภวรรณ บุญสอง, อรุณ บางตระกลูนนท, ดํารง เชี่ยวศิลป. 2531. ซาลโม เนลโลลิสในประเทศไทย : จุลชีววิทยาและระบาดวิทยา. รามาธิบดีเวชสาร ปที่ 11 ฉบับที่ 4 หนา 233 –245 อรุณ บางตระกูลนนท 2541. การตรวจวินิจฉัยและตรวจยืนยันเชื้อ Non – Typhoidal Salmonella (NTS) การสัมมนาระดับชาติเพื่อกําหนดแนวทางการแกไขปญหา Non – Typhoidal Salmonellosis ในประเทศไทย ครั้งที่ 2 วันที่ 24 – 25 ธันวาคม 2541 ณ อาคาร 60 ป คณะสัตวแพทยศาสตร จุฬาลงกรณมหาวิทยาลัย อรุณ บางตระกูลนนท, ศรีรัตน พรเรืองวงศ, สุมณฑา วัฒนสินธุ และคณะ. 2545. การ สํารวจเชื้อโรคอาหารเปนพิษในอุจจาระของพนักงานในโรงงานผลิตอาหารแชแข็ง. นําเสนอในการประชุมวิชาการครั้งที่ 4 มหาวิทยาลัยแมโจ วันที่ 2 – 3 ธันวาคม 2545 ณ ศูนยการศึกษาและฝกอบรมนานาชาติ มหาวิทยาลัยแมโจ จังหวัดเชียงใหม Archer, D.L. and F. Young. 1988. W Contemporary issues : Diseases with a food vector. Clinical. Association Official Analytical Chemists. 2000. AOAC Official Method 999.08 Assurance® Gold Salmonella EIA for Visual or Instrumental Identification of Motile and Non – motile Salmonella in all foods. AOAC International 2000. Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology. 1984. N.R. Krieg and J.C. Holt (editors). Baltimore : Williams and Wilkins. Brenner, D.T. 1984. Facultatively anaerobic gram-negetive rods. In : Bergery’s Manual of Systematic Bacteriology (vol. 1) N.R. Krieg and J.C. Holt (editors). Baltimore : Williams and Wilkins. pp. 408 – 516.


45 Cherry, W.B., B.M. Thomason, J.B., Gladden, N. Holsing and A.M. Murlin. 1975. Detection of Salmonellae in foodstuffs, faeces and water by immunofluorescence. Ann. New York Academy of Science. 254: 350 – 68. Chung, K.C. and J.M. Goepfert. 1970. Growth of Salmonella at low pH. J.Food Sci. 35: 326 – 328. D’Aoust, J.Y. 1991. Psychrotrophy and foodborne Salmonella. Int. Food Microbiol. 12: 207 – 16. Ewing, W.H. 1986. The Taxonomy of Enterobacteriaceae, Isolation of Enterobacteriaceae and Preliminary indentification. The genus Salmonella. In : Edwards, p. and W.H. Ewing (editors). Identification of Enterobacteriaceae. 4th ed. New York : Elsevier. Pp. 1-91, 181 – 318. Fitts, R., M. Diamond, C. Hamilton and M. Neri. 1983. DNA – DNA hybridization assay for detection of Salmonella spp. In foods. Appl. And Environ. Microbiol. 46: 1146 – 51. Flowers, R.S., K. Eckner, D.A. Gabis, B.J. Robison, J.A. Mattingly and J.H. Silliker. 1986a. Enzyme immunoassay for detection of Salmonella in foods : Collaborative study. J. Assoc. Official Analytical Chemists. 69: 786 – 98. Flowers, R.S., K. Eckner, D.A. Gabis, B.J. Robison, J.A. Mattingly and J.H. Silliker. 1986b A DNA hybridization assay for the detection of Salmonella in foods : Collaborative study. J. Assoc. Official Analytical Chemists. 70: 521 – 9. http://www.hhmi.org/biointeractive/animations/salmonella/sal_print.htm http://www.cdc.gov/ncidod/dbmd/diseaseinfo/salmonellosis_g.htm http://www.info.gov.hk/fehd/safefood/library/salmonella/salmonella1.html Insalata, N.E. and R.A. Chordash. 1984. Flurescent antibody detection of Salmonellae. In : Speck, M.L. (editor), 2nd edtion. Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. Washington DC. American Public Health Association: 327 – 42. International Commission on Microbiological Specifications for Foods (ICMSF). 1978. Microorganisms in Foods I : Their Significance and Methods of Enumeration. (2nd ed.), Toronto: Univ. of Toronto Press: 160 – 72. เรียบเรียงโดย อรุณ บางตระกูลนนท1, สุมณฑา วัฒนสินธุ2 และชัยวัฒน พูลศรีกาญจน1 1 WHO National Salmonella and Shigella Center, สถาบันวิจัยวิทยาศาสตรสาธารณสุข นนทบุรี 2 ภาควิชาวิทยาศาสตรและเทคโนโลยีการอาหาร คณะวิทยาศาสตรและเทคโนโลยี ม.ธรรมศาสตร

46 International Commission on Microbiological Specifications for Foods (ICMSF). 1996. Salmonella Microorganisms in Foods 5. Blackie Academic & Professional. New York. Pp. 217 – 264 ISO 6579 :1993(E) 3rd ed. Microbiology – General guidance on method for the detection of Salmonella Jay, J.M. 1996. Chapter 23 : Foodborne Gastroenteritis Caused by Salmonella and Shigella. In: Modern Food Microbiology. 5th edition. Chapman & Hall (International Thomson Publishing) Singapore. Koo, F.C.W. and J.W. Peterson. 1983. Cell-free extracts of Salmonella inhibit protein synthesis and cause cytotoxicity in enkaryotic cells. Toxicon. 21:309 – 320. Koo, F.C.W., J.W. Peterson, C.W. Houston and N.C. Molina. 1984. Pathogenesis of experimental Salmonellosis: Inhibition of protein synthesis by cytotoxin. Infec. Immun. 43: 93 – 100. Koupal, L.P. and R.H. Diebel. 1975. Assay characterization, and localization of an enterotoxin produced by Salmonella. Infect. Immun. 11: 14 – 22. La Roche, R.N., V. Desai, B. Friedman and B. Swaminathan. 1981. Field evaluation of the membrane filter-disc immuno-immobilization technique in the detection of Salmonellae in egg products. Poultry Sci. 60: 2265 – 9. Mattingly, J.A. and W.D. Gehle. 1984. An improved enzyme immunoassay for the detection of Salmonella. J. Food Sci. 49: 807 – 9. Michel Y. Popoff. 1997 Antigenic formulas of the Salmonella serovars, 7th edition. WHO Collaborating Center for Reference and Research on Salmonella. Institut Pasteur, Paris, France Michel Y. Popoff. 2001 Antigenic formulas of the Salmonella serovars, 8th edition. WHO Collaborating Center for Reference and Research on Salmonella. Institut Pasteur, Paris, France Minnich, S.A., P.A. Hartman and R.C. Heimsch. 1982. Enzyme immunoassay for detection of Salmonellae in foods. Appl. Environ. Microbiol. 43: 877 – 83. NMKL method no 71,2nd ed., 1999: Salmonella. Detection in food. Nordic committee on เรียบเรียงโดย อรุณ บางตระกูลนนท1, สุมณฑา วัฒนสินธุ2 และชัยวัฒน พูลศรีกาญจน1 1 WHO National Salmonella and Shigella Center, สถาบันวิจัยวิทยาศาสตรสาธารณสุข นนทบุรี 2 ภาควิชาวิทยาศาสตรและเทคโนโลยีการอาหาร คณะวิทยาศาสตรและเทคโนโลยี ม.ธรรมศาสตร

47 food analysis. Post, D.E. Food – borne pathogens monograph number 1 Salmonella. Oxid. Smith, J.L., S.A. Palumbo and I. Walls. 1993. Relationships between foodborne bacteria pathogens and reactive arthritides. J. Food Safety. 13:209 – 236. Sperber, W.H. and R.H. Diebel. 1969. Accelerated procedure for Salmonella detection in dried foods and feeds involving only broth cultures and serological reaction. Appl. Microbiol. 17:533 – 9. Thomson, J.E., N.A. Cox, J.S. Bailey and M.N. Islam. 1981. Minimizing Salmonella contamination on broiler carcasses with polyhexamethylenebiguanide hydrochloride. J. Food Protect. 44:440 Vassiliadis, P. 1983. The Rappaport-Vassiliadis (RV) enrichment medium for the isolation of Salmonellae. an overview. J. Appl. Bacteriol. 54: 69 – 76. Welkos, S., M. Schreiber and H. Bare. 1974. Identification of Salmonella with the O-1 bacteriophage. Appl. Microbiol. 28: 618 – 22.


โรคซัลโมเนลโลซ ิสSalmonellosis

Recommend Documents