4. Metodologi 4.1. Pengambilan sampel tanah dan jaringan tanaman Untuk nematoda parasit tumbuhan tertentu, seperti nematoda puru akar Meloidogyne spp. , menimbulkan tanda serangan dan kerusakan akar yang khas pada tanaman yang terserang sehingga mudah untuk dikenali. Akan tetapi sebagian besar serangan nematoda parasit tumbuhan tidak memperlihatkan tanda serangan yang jelas sehingga sulit untuk dilihat secara langsung di lapangan. Disamping itu, secara umum gejala yang nampak di atas permukaan tanah hampir tidak bisa dibedakan dengan gejala tanaman kekurangan unsur hara tertentu atau karena serangan patogen. Nematoda parasitik tumbuhan merupakan organisme yang mikroskopis dan mempunyai pola penyebaran di lapangan yang tidak teratur (irregular). Kehidupan nematoda tidak terlepas dari habitat tanah, karena sebagian atau seluruh siklus hidupnya berada di dalam tanah sebelum menginfeksi tanaman inangnya. Mengingat sifat-sifat tersebut, maka diperlukan sampel tanah dan jaringan tanaman untuk dapat mendiagnosis apakah nematoda sebagai penyebab pertumbuhan tanaman yang kurang balk dan juga dalam upaya pengelolaan nematoda pada suatu pertanaman. Beberapa hal yang perlu diperhatikan dalam pengambilan sampel untuk nematoda adalah :
a. Jumlah dan kedalaman cuplikan (core) tanah yang disesuaikan dengan jenis tanaman dan luas lahan yang akan diambil sampel
b. Pola pengambilan sampel yang represantatif c. Waktu pengambilan sampel d. Cara penangangan dan penyimpanan sampel Standar umum yang dipergunakan untuk menentukan jumlah dan kedalaman cuplikan tanah adalah 10 — 20 cuplikan untuk luas pertanaman kurang dari 1 Ha dan 30 cuplikan atau Iebih untuk luas pertanaman lebih dari 1 Ha dengan kedalaman cuplikan 7,5 — 15cm untuk tanaman muda atau tanaman semusim dan 25- 40cm untuk tanaman tahunan. Pola pengambilan sampel balk tanah maupun jaringan tanaman dapat dilakukan dengan pola diagonal atau zigzag terhadap lahan pertanaman, terutama di
Universitas Gadjah Mada
sekitar daerah perakaran. Hindarkan pengambilan sampel nematoda di daerah permukaan tanah, karena kemungkinan besar hanya akan didapatkan nematoda safrofag (non parasitik tumbuhan). Hal itu disebabkan karena nematoda parasit tumbuhan mempunyai kecenderungan untuk mengelompok atau terpusat di daerah sumber makanannya yaitu daerah rhizosphere perakaran. Disamping itu, kondisi suhu dan kelembaban yang sangat berfluktuasi di sekitar permukaan tanah dapat menurunkan populasi nematoda parasit secara cepat. Waktu pengambilan sampel untuk nematoda disesuaikan dengan tujuan kita melakukan sampling. Untuk pengelolaan nematoda, pengambilan sampel dapat dilakukan sebelum atau setelah panen untuk mengetahui populasi awal sehingga dapat dilakukan upaya pengendalian sebelum terjadi peningkatan populasi lebih lanjut. Untuk keperluan diagnosis apakah suatu tanaman terserang nematoda, pengambilan sampel dapat dilakukan ketika tanaman memperlihatkan kenampakan/gejala terserang nematoda. Secara normal, sampel nematoda yang diambil segera mungkin diproses di laboratorium. Untuk sampel dengan jumlah besar, maka perlu dilakukan penyimpanan sampel. Untuk menjaga agar sampel yang diambil dari lapangan tetap terjaga dengan balk dan dapat memberikan informasi yang akurat tentang nematoda yang menjadi sasaran, maka perlu dilakukan penanganan dan penyimpanan sampel yang tepat. Berikut adalah beberapa hal yang harus dilakukan untuk menjaga agar sampel nematoda tetap terjaga balk :
1. Setiap sampel yang diambil berikan label yang berisi keterangan lengkap, termasuk varietas tanaman, lokasi pengambilan sampel, dan tanggal pengambilan
2. Letakkan sampel di tempat yang teduh dan hindarkan dari sinar matahari langsung karena suhu yang tinggi ( dia atas 40°C) akan mematikan nematoda
3. Hindarkan penempatan sampel di atas mesin kendaraan bermotor secara langsung, kecuali sampel diletakkan / disimpan dalam tempat yang bersuhu dingin, misalnya refrigerator atau styroform
4. Secara normal, sampel nematoda yang diambil sesegera mungkin diproses di laboratorium. Untuk sampel dengan jumlah besar, maka perlu dilakukan penyimpanan sampel dan sebaiknya tidak lebih dari satu minggu dari waktu pengambilan sampel sudah harus dilakukan analisa sampel.
Universitas Gadjah Mada
5. Usahakan penyimpanan sampel di tempat yang sejuk dengan suhu 10 15 °C untuk menjaga agar tidak banyak terjadi perubahan jumlah populasi nematoda dalam sampel. Hal penting yang perlu dipersiapkan sebelum melakukan pengambilan sampel adalah menyiapkan peralatan, diantaranya : cethok, sekop, bor tanah, gunting tanaman, kantong plastik, serta alat tulis untuk keperluan labeling data sampel ( kondisi dan nama lokasi, jenis dan umur tanaman, tanggal pengambilan sampel ).
4.2. Ekstraksi-isolasi nematoda Ekstraksi-isolasi nematoda adalah suatu proses untuk memisahkan nematoda dari habitat hidupnya balk tanah maupun jaringan tanaman, sebelum dilakukan kajian lebih lanjut, diantaranya identifikasi dan penghitungan populasi nematoda. Dikenal beberapa metode ekstraksi-isolasi nematoda dari sampel tanah maupun jaringan tanaman, diantaranya : Corong Baermann, White head tray technique (nampan saring). Sentrifuse, kombinasi dekantasi-penyaringan Cobb's, elutriasi, flotasi, penyaringan dan Fenwick. Pemilihan metode yang akan dipergunakan untuk ekstraksi-isolasi nematoda sangat ditentukan dengan ketersediaan fasilitas, objek nematoda yang ditargetkan, ukuran sampel, jumlah sampel, tipe tanah dan lain sebagainya. Dua contoh metode ekstraksi-isolasi yang sederhana, mudah dikerjakan, dan tidak perlu peralatan mahal adalah metode Corong Baermann dan Whitehead tray (nampan saring). Kedua metode tersebut dapat dipergunakan untuk ekstraksi-isolasi nematoda balk dari sampel tanah maupun jaringan tanaman. a. Prosedur ekstraksi - isolasi nematoda dengan metode corong Baermann
Atur saringan dalam corong yang sudah dilengkapi dengan slang plastik dan penjepit (klem) pada ujung bawah. Lapisi di atas saringan dengan kertas tissue atau kain blacu.
Ambil sampel tanah yang sebelumnya sudah diaduk rata, sebanyak 100 ml dan ratakan secara perlahan-lahan di atas kertas tissue atau kain blacu tersebut
Dari bagian tepi corong, tuangkan air sampir menyentuh permukaan tanah
Universitas Gadjah Mada
Biarkan selama kurang lebih 24 jam, agar nematoda keluar dari tanah, menembus kertas tissue/kain blacu, masuk dan mengendap di dalam air pada ujung bawah slang plastik.
Tampung suspensi nematoda dalam air dengan beker glass dengan cara membukan penjepit slang dan menampung air bagian bawah sebanyak 50 100 ml.
Suspensi nematoda slap diamati
b. Prosedur ekstraksi - isolasi nematoda dengan metode nampan saring Prosedur cara ekstraksi-isolasi dan prinsip kerja metode nampan saring hampir sama dengan metode corong Baermann. Pada metode nampan saving, corong diganti dengan nampan yang berfungsi untuk merendam atau menginkubasi tanah atau jaringan akar yang diratakan pada kertas tissue di atas saringan. Metode ini dapat dipergunakan untuk volume sampel yang lebih besar, 200 — 300 ml tanah atau 20 — 50 gr jaringan akar disesuaikan dengan ukuran nampan dan saringan yang digunakan. Metode ini cocok dipergunakan untuk mendapatkan bahan inokulum karena hanya nematoda yang hidup, sehat, dan aktif saja yang dapat diisolasi.
4.3. Preparasi nematoda untuk pengujian mikroskopi Setelah proses ekstraksi-isolasi, jumlah nematoda yang diperoleh dapat dinyatakan per satuan unit sampel. Untuk jaringan tanaman dapat dinyatakan per satuan berat, misalnya per 5 gram akar). Sedangkan sampel tanah dinyatakan dalam satuan volume, misalnya per 100 ml tanah. Jika hasil ekstraksi didapat nematoda dalam jumlah kecil, semua nematoda dapat dihitung dengan mengamati menggunakan mikroskup, jika perlu volume aimya dikurangi sebelum diamati dengan cara penyaringan menggunakan saringan 20pm atau 35 pm atau pengetapan dengan slang platik berukuran kecil. Apabila diperoleh nematoda dengan jumlah yang besar, maka suspensi nematoda perlu diencerkan terlebih dahulu. Untuk mengidentifikasi jenis nematoda yang diperoleh dari hasil ekstraksiisolasi, dapat diakukan secara langsung pada nematoda yang masih hidup atau dibuat preparat awetan. Agar supaya memudahkan pengamatan, nematoda dibuat menjadi inaktif dengan cara pemanasan beberapa detik pada suhu sekitar 30 - 50 o
C. Pemanasan dapat dilakukan dengan cara meletakkan nematoda dalam 1 tetes
Universitas Gadjah Mada
air pada gelas benda, selanjutnya dipanaskan dengan lempeng pemanas.Pada kondisi inaktif, beberapa jenis nematoda memberikan bentuk posisi tubuh yang khas
sehingga
memudahkan
pengamatan.
Sebagai
contoh
nematoda
Helicotylenchus memberikan bentuk tubuh seperti huruf G. Proses membuat preparat awetan nematoda didahului dengan memfiksir nematoda. Beberapa larutan fiksatif yang dapat diperunakan diantaranya FA ( Formalin Acetic acid glacial) :4:10 atau FA :1; FAA ( Formalin Acetic acid glacial Alchohol); dan Formalin-glyserol.
Universitas Gadjah Mada
