Yosua – 125100601111007 Kelas K
DASAR BIOTEKNOLOGI RESUME JURNAL PRINSIP PEMISAHAN ASAM NUKLEAT MELALUI ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA Judul
:
Principles of Nucleic Acid Separation by Agarose Gel Electrophoresis Pengarang
:
Muhittin Yılmaz*, Cem Ozic and İlhami Gok University of Kafkas, Department of Biology, Faculty of Sciences, Kars, Turkey Resume jurnal
:
1. Latar Belakang Dewasa ini telah banyak dilakukan isolasi DNA yang bertujuan untuk mengembangkan ilmu pengetahuan terutama dalam ilmu Genetika. Isolasi DNA telah banyak dilakukan dan dikembangkan di dunia ilmiah karena teknologi – teknologi modern telah menjamah ilmu genetika. Isolasi DNA ini dapat dilakukan dengan cara dan bahan sederhana, hingga dengan teknologi modern. Mengenai hal ini, pada dasarnya isolasi DNA dapat dilakukan dari berbagai sumber, antara lain organ manusia, darah, daun, daging buah, kalus, akar batang, daging dan sisik ikan. Namun, penggunaan tumbuhan sebagai sumber lebih banyak dilakukan dalam pengisolasian DNA dewasa ini. Pengisolasian DNA pada sumber dilakukan terutama untuk pengenalan DNA secara lebih jelas karena dari isolasi ini DNA dapat terpisah dari kumpulannya, yaitu kromosom. Setelah dilakukan isolasi, biasanya DNA akan dielektroforesis. Elektroforesis dilakukan untuk memisahkan, mengidentifikasi, mengkarekterisasi dan purifikasi dari molekul DNA/ RNA. Elektroforesis merupakan cara pengamatan DNA dengan bantuan sinar Ultra violet. Cara pemisahan dengan elektroforesis ini merupakan alat pendukung yang sangat pokok dalam teknologi DNA rekombinan, dengan aplikasi yang begitu luas baik untuk pemisahan untai tunggal atau untai ganda
Yosua – 125100601111007 Kelas K
molekul DNA. Elektroforesis digunakan untuk pengamatan DNA dalam penampakan flouresensinya. Berdasarkan hal-hal tersebut diatas dan tak lepas dari tujuan peningkatan khazanah ilmu pengetahuan terutama dalam bidang ilmu Genetika, maka kami mengadakan praktikum isolasi hingga elektroforesis DNA.
2. Manfaat Isolasi DNA diperlukan untuk analisis genetik, yang digunakan untuk tujuan ilmiah, medis, atau forensik. Manfaat elektroforesis gen antara lain untuk mengetahui ukuran fragmen DNA dari produk PCR, memisahkan produk DNA dari hasil digesti yang berbeda ukuran, kemudian disequencing, dan juga untuk pemurnian atau purifikasi DNA. Elektroforesis dapat diaplikasikan untuk berbagai macam kegiatan seperti berikut : 1. Membandingkan gen homolog dari spesies yang berbeda, mengetahui susunan sekuens berbagai genom. 2. DNA fingerprinting. 3. Mendeteksi kelainan genetik. 4. Mendeteksi lokasi dan jumlah mRNA dalam sel atau jaringan tertentu. 5. Mengetahui aktivitas gen selama perkembangan berbagai tipe sel organisme atau percobaan perlakuan gen. 6. Mempelajari evolusi tingkat molekular. 7. Mengetahui variasi genetik yang ada di alam. 8. Menentukan atau mengidentifikasi berat molekul DNA, RNA, dan protein tertentu. 9. Mengidentifikasi persamaan dan perbedaan genetik antar individu. 10. Mengetahui jumlah fragmen DNA yang diklon dalam rekombinan DNA plasmid. 11. Menganalisa fragmen DNA yang diamplifikasi lewat PCR.
3. Metode Elektroforesis gel merupakan salah satu teknik utama dalam biologi molekular. Prinsip dasar teknik ini adalah bahwa DNA, RNA, atau protein dapat dipisahkan oleh medan listrik. Dalam hal ini, molekul-molekul tersebut dipisahkan
Yosua – 125100601111007 Kelas K
berdasarkan laju perpindahannya olehgaya gerak listrik di dalam matriks gel. Laju perpindahan tersebut bergantung pada ukuran molekul bersangkutan. Elektroforesis gel biasanya dilakukan untuk tujuan analisis, namun dapat pula digunakan sebagai teknik preparatif untuk memurnikan molekul sebelum digunakan dalam metodemetode
lain
seperti spektrometri
massa, PCR, kloning, sekuensing DNA,
atauimmuno-blotting yang merupakan metode-metode karakterisasi lebih lanjut. Gel yang
digunakan
biasanya
merupakan polimer bertautan
silang
(crosslinked) yang porositasnya dapat diatur sesuai dengan kebutuhan. Untuk memisahkan protein atau asam
nukleat berukuran
kecil
(DNA, RNA,
atau oligonukleotida), gel yang digunakan biasanya merupakan gel poliakrilamida, dibuat
dengan
konsentrasi
berbeda-beda
antara akrilamida dan
zat
yang
memungkinkan pertautan silang (cross-linker), menghasilkan jaringan poliakrilamida dengan ukuran rongga berbeda-beda. Untuk memisahkan asam nukleat yang lebih besar (lebih besar dari beberapa ratus basa), gel yang digunakan adalah agarosa (dari ekstrakrumput laut) yang sudah dimurnikan. Dalam proses elektroforesis, sampel molekul ditempatkan ke dalam sumur (well) pada gel yang ditempatkan di dalam larutan penyangga, dan listrik dialirkan kepadanya. Molekul-molekul sampel tersebut akan bergerak di dalam matriks gel ke arah salah satu kutub listriksesuai dengan muatannya. Dalam hal asam nukleat, arah pergerakan adalah menujuelektroda positif, disebabkan oleh muatan negatif alami pada rangka gula-fosfat yang dimilikinya. Untuk menjaga agar laju perpindahan asam nukleat benar-benar hanya berdasarkan ukuran (yaitu panjangnya), zat seperti natrium hidroksida atau formamidadigunakan untuk menjaga agar asam nukleat berbentuk lurus. Sementara itu, protein didenaturasi dengan deterjen (misalnya natrium dodesil sulfat, SDS) untuk membuat protein tersebut berbentuk lurus dan bermuatan negatif. Setelah proses elektroforesis selesai, dilakukan proses pewarnaan (staining) agar molekul sampel yang telah terpisah dapat dilihat. Etidium bromida, perak, atau pewarna "biru Coomassie" (Coomassie blue) dapat digunakan untuk keperluan ini. Jika molekul sampel berpendar dalam sinar ultraviolet (misalnya setelah "diwarnai" dengan etidium bromida), gel difoto di bawah sinar ultraviolet. Jika molekul sampel mengandung atom radioaktif,autoradiogram gel tersebut dibuat. Pita-pita (band) pada lajur-lajur (lane) yang berbeda pada gel akan tampak setelah proses pewarnaan; satu lajur merupakan arah pergerakan sampel dari "sumur" gel. Pita-pita yang berjarak sama dari sumur gel pada akhir elektroforesis
Yosua – 125100601111007 Kelas K
mengandung molekul-molekul yang bergerak di dalam gel selama elektroforesis dengan kecepatan yang sama, yang biasanya berarti bahwa molekul-molekul tersebut berukuran sama. "Marka" atau penanda(marker) yang merupakan campuran molekul dengan ukuran berbeda-beda dapat digunakan untuk menentukan ukuran molekul dalam pita sampel dengan meng-elektroforesis marka tersebut pada lajur di gel yang paralel dengan sampel. Pita-pita pada lajur marka tersebut dapat dibandingkan dengan pita sampel untuk menentukan ukurannya. Jarak pita dari sumur gel berbanding terbalik terhadap logaritma ukuran molekul.
4. Cara kerja Adapun prosedur kerja dalam melakukan elektroforesis DNA menggunakan teknik elektroforesis gel agarosa sebagai berikut : *Bahan dan Alat 1. DNA marker, misalnya DNA λ yang dipotong dengan HindIII 2. Sampel DNA, misalnya : a. DNA kromosom bakteri, b. DNA plasmid hasil isolasi (uncut) c. DNA plasmid hasil restriksi (cut) 3. Agarosa 4. Larutan buffer TAE 50x (242 g tris-base; 57,1 g asam asetat glacial; 100 ml EDTA 0,5 M pH 8; dilarutkan dalam akuades hingga 1000 ml) 5. Akuades 6. Gelas Ukur 1000 ml 7. Labu Erlenmeyer 50 ml 8. Tabung mikrosentrifuga 9. Sarung tangan 10. Seperangkat mikropipet beserta tipnya (Bio-Rad dan Axygen Scientific) 11. Kertas parafilm 12. seperangkat alat elektroforesis 13. Loading dye 6x (0,25% bromophenol blue; 0,25% xylene cyalol; 15% ficoll tipe 4000; EDTA 120 mM) 14. larutan Etidium Bromid (EtBr)
Yosua – 125100601111007 Kelas K
15. UV transluminator 16. Kaca mata UV 17. kamera digital *Cara Kerja 1. Buat 250 ml larutan buffer TAE 1x dengan cara mencamnpurkan 5 ml TAE 50x ke dalam 245 ml akuades. 2. Buat gel agarosa 1% dengan cara menimbang agarosa 0,2 g untuk dilarutkan ke dalam bufer TAE 1x hingga volume 20 ml. Larutan agarosa dididihkan hingga larut sempurna. 3. Siapkan baki gel agarosa, lekatkan selotip di tiap ujung baki gel agarosa (pastikan bahwa selotip melekat kuat dan tidak ada lubang pada masingmasing ujung baki). 4. Pasang sisir elektroforesis di salah satu ujung baki gel agarosa dengan posisi hampir menyentuh dasar baki. 5. Periksalah suhu larutan agarosa dengan cara menempelkan erlenmeyer ke tangan, jika suhunya sudah turun hingga sekitar 50-60 0C, tambahkan 1 µl etidium bromid (PERINGATAN KERAS!!, gunakan sarung tangan karena bersifat karsinogenik). 6. Larutan agarosa dihomogenkan sebentar, kemudian tuangkan larutan ke dalam baki gel agarosa, biarkan hingga larutan berubah menjadi gel yang padat. 7. ambil sisir dengan hati-hati, lepaskan selotip dari ujung-ujung baki. 8. masukkan baki yang telah berisi gel agarosa ke dalam tangki elektroforesis yang telah diisi dengan larutan bufer TAE 1x (pastikan bahwa gel terendam seluruhnya dalam TAE). 9. siapkan sekitar 5 cm kertas parafilm di dekat tangki elektroforesis. 10. masukkan 10 µl sampel DNA dan 2 µl loading dye 6x ke dalam sumuran gel agarosa dengan cara mencampurkan kedua bahan tersebut terlebih dahulu secara merata pada kertas parafilm menggunakan mikropipet. 11. buatlah catatan mengenai nomor sumuran dan jenis sampel DNA yang dimasukkan.
Yosua – 125100601111007 Kelas K
12. hubungkan kabel dari sumber arus ke tangki elektroforesis (pastikan bahwa kabel yang tersambung ke kutub negatif berada di dekat sumuran; jika tidak demikian, ubahlah posisi baki/gel ke arah sebaliknya). 13. nyalakan sumber arus, aturlah volatase dan waktu running hingga diperoleh angka 70 V dan 45 menit dengan cara menekan tombol yang sesuai pada sumber arus. 14. jalankan elektroforesis (lakukan running) dengan cara menekan tombol run pada sumber arus. 15. elektroforesis akan berhenti apabila waktu yang ditetapkan sudah habis, yang ditandai oleh adanya bunyi alarm. Matikan sumber arus dan angkatlah baki dari tangki elektroforesis. 16. keluarkan gel dan letakkan di atas UV transluminator (letakkan selubung kaca hitam di atas UV transluminator). 17. nyalakan UV transluminator, amati pita-pita DNA yang tervisualisasi. *Hasil Pita-pita DNA hasil elektroforesis dengan nomor sumuran dan jenis sampelnya.
Perkirakan
ukuran
masing-masing
fragmen/pita
dengan
membandingkannya dengan posisi migrasi pada DNA marker. Metode ini didasarkan pada pergerakan molekul bermuatan dalam media penyangga matriks stabil, di bawah pengaruh medan listrik. Media yang umum digunakan adalah sel agarosa atau poliakrilamid. Elektroforesis gel agarosa digunakan untuk memisahkan fragmen DNA yang berukuran lebih besar dari 100 pb dan dijalankan secara horizontal, sedangkan elektroforesis poliakrilamid dapat memisahkan 1 pb dan dijalankan secara vertical. Elektroforesis poliakrilamid biasanya digunakan untuk menentukan DNA (sekuensing). Larutan yang bermuatan negatif dimasukkan ke dalam sumur-sumur yang terdapat pada gel agarosa dan diletakkan di kutub negatif, apabila dialiri arus listrik dengan menggunakan larutan buffer yang sesuai maka DNA akan bergerak ke kutub positif. Laju migrasi DNA dalam medan listrik berbanding terbalik dengan massa DNA. Migrasi DNA terutama ditentukan oleh ukuran panjang dan bentuk DNA. Fragmen DNA yang berukuran kecil akan bermigrasi lebih cepat dibandingkan yang berukuran besar, sehingga elektroforesis mampu
Yosua – 125100601111007 Kelas K
memisahkan fragmen DNA berdasarkan ukuran panjangnya. Untuk visualisasi maka ditambahkan larutan etidium bromida yang akan masuk diantara ikatan hydrogen pada DNA, sehingga pita fragmen DNA akan kelihatan dibawah lammpu UV. Panjang amplikon bisa diperkirakan dengan membandingkannya dengan pita DNA standar. Karena pita-pita atau puncak-puncak protein terlalu rapat cenderung saling tumpah-tindih, metode pemisahan satu dimensi, seperti elektroforesis gel poliakrilamida SDS atau kromatografi, hanya mampu menguraikan protein dalam jumlah yang relatif kecil (umumnya kurang dari 50). Sehingga digunakan elektroforesis gel dua dimensi yang menggabungkan dua prosedur pemisahan yang berbeda. metode ini dapat menguraikan lebih dari 1000 macam protein melalui pemetaan dua dimensi.
