ISOLASI, PEMURNIAN DAN PENENTUAN PARAMETER KINETIKA KATALASE DARI KENTANG (Solanum tuberosum L)
TESIS Karya tulis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister dari Institut Teknologi Bandung
Oleh
IKEU KARTIKA NIM : 20506025 Program Studi Kimia
INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG 2008
2
Surat Pernyataan Pelimpahan Hak Cipta dan Keaslian Karya Tulis
Yang bertanda tangan dibawah ini : Nama : Ikeu Kartika NIM
: 20506025
Menyatakan bahwa Penulis Tesis dengan judul : ISOLASI, PEMURNIAN DAN PENENTUAN PARAMETER KINETIKA KATALASE DARI KENTANG (Solanum tuberosum L) Di bawah bimbingan Dr. Rukman Hertadi Adalah benar-benar tesis tersebut hasil karya tulis berdasarkan data eksperimen perhitungan/permodelan Penulis selama melakukan Tugas Akhir Magister di Program Studi Kimia ITB. Bandung, 11 Juni 2008 Ikeu Kartika
i
ABSTRAK
ISOLASI, PEMURNIAN DAN PENENTUAN PARAMETER KINETIKA KATALASE DARI KENTANG (Solanum tuberosum L) Oleh Ikeu Kartika NIM : 20506025
Katalase (EC 1.11.1.6) merupakan enzim yang mengkatalisis reaksi penguraian hidrogen peroksida menjadi air dan oksigen ditemukan dalam sel peroksisom kentang. Tahap ekstraksi pertama adalah homogenisasi kentang dengan menggunakan blender, kemudian disentrifugasi selama 30 menit dengan kecepatan 20.000g. Aktivitas katalase dan kandungan protein dari ekstrak kasar enzim (EKE) yang dihasilkan ditentukan dengan metode Aebi dan Bradford. Hasil aktivitas total EKE adalah 47958,3 unit dengan kandungan protein 14001,39 mg sehingga aktivitas spesifik enzim katalasenya adalah 3,425 unit/mg protein. Pemurnian ekstrak kasar enzim (EKE) dimulai dengan fraksinasi ammonium sulfat. Enzim pada fraksi 20-80% memberikan aktivitas spesifik terbesar yaitu sebesar 7,17 unit/mg protein dengan hasil yang diperoleh 41,15 % dan tingkat kemurnian sekitar 2 kali lipat dibanding EKE-nya. Pemurnian lebih lanjut dilakukan dengan kromatografi kolom penukar anion DEAE-selulosa dimana elusinya menggunakan gradien konsentrasi NaCl. Enzim murni yang dihasilkan mempunyai aktivitas spesifik sebesar 57,88 unit/mg protein dengan perolehan hasil sebesar 27,92 % dan tingkat kemurnian sekitar 17 kali lipat dibanding EKEnya. Setelah dipekatkan, larutan enzim murni terlihat pada pita hasil SDS-PAGE dengan bobot molekul sebesar 59 kDa. Parameter kinetika katalase hasil pemurnian ditentukan dengan metode kecepatan awal menghasilkan harga Vmaks 4,89 Ms-1 dan KM 1,13.10-3 M. Selain itu, dimodifikasi metoda sederhana untuk menentukan parameter kinetika katalase yang digambarkan dalam preparatory problem 36 International Chemistry Olympiad (IChO) 2006. Metoda ini didemonstrasikan di depan guru yang tergabung dalam MGMP (Musyawarah Guru Mata Pelajaran) Kimia Kota Bandung dan juga di depan siswa beberapa SMU/MA di Kota Bandung. Untuk mengetahui tanggapan mereka dilakukan kuisioner. Berdasarkan data hasil kuisioner, tanggapan guru dan siswa cukup baik. Kata kunci : katalase, pemurnian, parameter kinetika, kentang.
ii
ABSTRACT ISOLATION, PURIFICATION AND DETERMINATION KINETIC PARAMETERS OF CATALASE FROM POTATO TUBER (Solanum tuberosum L)
By Ikeu Kartika NIM : 20506025
Catalase (EC 1.11.1.6), is an enzyme catalyzing the decomposition of hydrogen peroxide into molecular oxygen and water have been extracted from peroxisome of the potato tubers cell. The first extraction step was homogenizing the potato tubers by using a blender, and then centrifuged them for 30 minutes at 20.000 g. Catalase activity and total protein concentration of the resulted crude extract were determined by Aebi and Bradford methods, respectively. The total catalase activity was 47958.3 units and total mass of proteins was 14001.39 mg, thereby its specific activity was 3.425 units/mg of protein. Purification of the crude extract was started by fractionation of ammonium sulfate. The results revealed that the fraction of 20-80% saturation exhibited a highest specific activity e.g. 7.17 units/mg of proteins with the yield of 41.15 % and the purity level was approximately as twice as its crude extract. Further purification step was conducted by applying the ammonium sulfate fraction into DEAE-cellulose column. NaCl gradient concentration was used as an eluent. The collected fractions were determined for its total catalase activity and protein concentration. The highest specific activity reached 57.88 units/mg of proteins with the yield of 27, 92 % and the purity level was approximately seventeen times larger than the origin crude extract. After concentrated the pure enzyme by lyophilizes then we applied it to SDS-PAGE and found that the molecular weight of the enzyme was about 59 kDa. Determination of the kinetic parameters of the pure enzyme gave Vmaks and KM about 4, 89 Ms-1 and 1.13 x 10-3 M, respectively. Besides, the above experiment, we also modified the simple methods for measuring kinetic parameters of catalase as described in the preparatory problems 36 of International Chemistry Olympiad (IChO) 2006. We demonstrated such method to high school teachers in collaboration with MGMP Kota Bandung and also to students in several high schools in Bandung. We analyzed their interest through the questioners given to them. We found that teachers and students were interested. Key words: Catalase, purification, kinetic parameters, potato.
iii
HALAMAN PENGESAHAN
ISOLASI, PEMURNIAN DAN PENENTUAN PARAMETER KINETIKA KATALASE DARI KENTANG (Solanum tuberosum L) Oleh IKEU KARTIKA NIM 20506025
Program Studi Kimia Institut Teknologi Bandung
Bandung, 11 Juni 2008 Mengetahui / Menyetujui : Pembimbing,
Dr. Rukman Hertadi NIP. 132164078
iv
HALAMAN PEDOMAN PENGGUNAAN TESIS
Tesis S2 yang tidak dipublikasikan terdaftar dan tersedia di Perpustakaan Institut Teknologi Bandung, dan terbuka untuk umum dengan ketentuan bahwa hak cipta ada pada pengarang dengan mengikuti aturan HaKI yang berlaku di Institut Teknologi Bandung. Referensi kepustakaan diperkenankan dicatat, tetapi pengutipan atau peringkasan hanya dapat dilakukan seizin pengarang dan harus disertai dengan kebiasaan ilmiah untuk menyebutkan sumbernya. Memperbanyak atau menyebutkan sebagian atau seluruh isi tesis haruslah seizin Direktur Program Pascasarjana, Institut Teknologi Bandung.
v
HALAMAN PERUNTUKAN
Kupersembahkan untuk suami dan anak-anakku tercinta, orangtua dan segenap saudara.
vi
KATA PENGANTAR
Bismillahirrahmaanirrohiim, Puji syukur penulis panjatkan ke hadirat Illahi Rabbi karena atas rahmat dan hidayah serta inayah-Nya penulisan ini dapat diselesaikan dengan segala keterbatasan. Pada kesempatan ini penulis mengucapkan terimakasih kepada Dr. Rukman Hertadi selaku Pembimbing, atas segala saran, bimbingan dan nasehatnya dalam memecahkan masalah-masalah yang dihadapi mulai dari perencanaan, pelaksanaan penelitian sampai pada penulisan ini. Tak lupa penulis ucapkan terimakasih pula kepada : 1. Departeman Agama RI atas bantuan Beasiswa Pendidikan Pancasarjana yang diterima selama pendidikan program magister ini. 2. Seluruh staf pengajar dan karyawan pada program studi kimia ITB yang telah membagi ilmu/pengalaman selama pendidikan. 3. Seluruh Civitas Akademika Madrasah Aliyah Negeri (MAN) 2 Kota Bandung yang telah membantu penulis menyelesaikan program ini. 4. Rekan-rekan mahasiswa magister pengajaran kimia program beasiswa Depag angkatan 2006 yang telah menjadi sahabat terbaik penulis selama pendidikan. Semoga persahabatan dan jalinan silaturahiim kita selalu terjaga. 5. Seluruh mahasiswa S1, S2, dan S3 kelompok keahlian Biokimia yang telah membagi ilmu dan kebersamaan selama penelitian. 6. Semua pihak yang telah membantu penulis mulai dari perencanaan, pelaksanaan penelitian, penulisan dan juga proses pembelajaran di Program Studi Kimia ITB. Akhir kata pada Yang Maha Kuasa segala amal kebaikan akan terbalas, semoga karya sederhana ini bermanfaat adanya. Amin. Bandung, 11 Juni 2008 Penulis
vii
DAFTAR ISI
ABSTRAK ............................................................................................................... i ABSTRACT ............................................................................................................ ii HALAMAN PENGESAHAN................................................................................ iii HALAMAN PEDOMAN PENGGUNAAN TESIS .............................................. iv HALAMAN PERUNTUKAN ................................................................................ v KATA PENGANTAR ........................................................................................... vi DAFTAR ISI ........................................................................................................ vii DAFTAR LAMPIRAN ........................................................................................ viii DAFTAR GAMBAR ............................................................................................. ix DAFTAR TABEL ................................................................................................... x DAFTAR SINGKATAN DAN LAMBANG ........................................................ xi Bab I Pendahuluan ............................................................................................ 1 I.1 Latar Balakang ........................................................................................ 1 I.2 Rumusan Masalah ................................................................................... 2 I.3 Tujuan Penelitian .................................................................................... 2 I.4 Ruang Lingkup Penelitian ....................................................................... 2 I.5 Sistematika Penulisan ............................................................................. 3 Bab II Tinjauan Pustaka ..................................................................................... 4 II.1 Enzim ...................................................................................................... 4 II.2 Enzim Katalase........................................................................................ 7 II.3 Enzim Katalase dalam Kentang ( Solanum tuberosum L ) ..................... 9 II.4 Isolasi dan Pemurnian Enzim ................................................................ 10 II.5 Pembelajaran Kinetika Enzim di SMU / MA ....................................... 16 Bab III Metode Penelitian ................................................................................. 18 III.1 Alat ........................................................................................................ 18 III.2 Bahan .................................................................................................... 18 III.3 Pembuatan Bahan .................................................................................. 19 III.4 Cara Kerja Penelitian ............................................................................ 22 III.5 Demonstrasi Percobaan Kinetika Katalase ........................................... 26 Bab IV Hasil dan Pembahasan .......................................................................... 27 IV.1 Isolasi Enzim katalase dari kentang ...................................................... 27 IV.2 Optimasi Reaksi Enzimatis katalase dari kentang ................................ 27 IV.3 Penentuan Aktifitas Spesifik EKE Katalase ......................................... 27 IV.4 Pemurnian Enzim katalase dari kentang ............................................... 28 IV.5 Penentuan Parameter Kinetika Katalase ............................................... 32 IV.6 Percobaan kinetika enzim katalase IChO 2006..................................... 33 Bab V Kesimpulan ........................................................................................... 37 V.1 Kesimpulan ........................................................................................... 37 V.2 Saran...................................................................................................... 37 DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................... 38 LAMPIRAN - LAMPIRAN.................................................................................. 40
viii
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran A. Fraksinasi Amonium sulfat .............................................................. 41 Lampiran B. Demonstrasi percobaan kinetika enzim katalase ............................. 42 Lampiran C. Kuisioner Percobaan Kinetika Enzim Katalase ............................... 44 Lampiran D. Penentuan Konsentrasi Substrat Optimum ...................................... 45 Lampiran E. Penentuan Aktifitas Spesifik EKE Katalase .................................... 46 Lampiran F. Penentuan aktifitas spesifik katalase hasil fraksinasi amonium sulfat ............................................................................................................................... 47 Lampiran G. Data hasil kromatografi kolom penukar anion DEAE-selulosa ...... 48 Lampiran H. Penentuan aktifitas spesifik katalase hasil kromatografi kolom penukar anion DEAE-selulosa .............................................................................. 49 Lampiran I. Penentuan aktifitas spesifik katalase akhir ........................................ 50 Lampiran J. Penentuan bobot molekul katalase hasil pemurnian berdasarkan pita hasil SDS-PAGE ................................................................................................... 51 Lampiran K. Penentuan parameter kinetika katalase dari kentang ....................... 52 Lampiran L. Hasil demonstrasi percobaan Kinetika Enzim Katalase IChO 2006 54
ix
DAFTAR GAMBAR
Gambar II-1 Gambar II-2 Gambar II-3 Gambar II-4 Gambar III-1 Gambar IV-1 Gambar IV-2 Gambar IV-3 Gambar IV-4
Plot Lineaweaver-Burk ................................................................... 6 Struktur heme Katalase dan Haemoglobin dengan K lambang untuk protein katalase dan G lambang untuk protein globin. ......... 7 Diagram proses katalitik anion superoksida ................................... 8 Mekanisme Reaksi Enzim Katalase ................................................ 8 (a) Kentang baru digali (b) Kentang sudah dicuci bersih ............. 18 Kromatogram penukar anion DEAE-Selulosa .............................. 30 Elektroferogram SDS-PAGE dari 1. Protein marker, 2. Ekstrak kasar enzim katalase 3. Fraksi 0-20%, 4. Fraksi 20-80%, 5. Fraksi 80-100%, dan 6.Hasil kromatografi kolom DEAE-selulosa. ........ 32 Diagram batang hasil kuisioner guru ............................................ 34 Diagram batang hasil kuisioner siswa ........................................... 35
x
DAFTAR TABEL
Tabel IV-1 Hasil fraksinasi ammonium sulfat ...................................................... 28 Tabel IV-2 Hasil akhir .......................................................................................... 31 Tabel IV-3 Hasil percobaan kinetika enzim katalase ............................................ 33
xi
DAFTAR SINGKATAN DAN LAMBANG
Singkatan
SOD TEMED UV
Pemakaian pertamakali pada halaman Amonium per sulphate 20 Bicinchonic Acid 14 Bovine Serum Albumin 14 Dietilaminoetil 13 Enzyme Commite 1 International Chemistry Olympiad 2 Musyawarah Guru Mata Pelajaran 3 Point of Hydrogen 9 Phenil Methyl Sulfuryl Fluoride 18 Sodium Dodesyl Sulphate Polyacrilamide Gel 14 Electrophoresis Superoksida dismutase 7 Tetrametiletilendiamine 18 Ultra Violet 14
Lambang
Arti
o
Derajat Celcius Ferrum (Besi) gravitasi Haemoglobin Kilo Dalton Konstanta Michaelis-Menten Molaritas Milli Molar Laju reaksi maksimum
APS BCA BSA DEAE EC IChO MGMP pH PMSF SDS PAGE
C Fe g Hb kDa KM M mM Vmaks
Nama
Pemakaian pertamakali pada halaman 14 7 2 7 2 13 7 3 9
