LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI “ISOLASI DNA KASAR”
Disusun Oleh:
Nama NIM Kelompok Asisten
: Ika Nursa’adah : 115040213111009 : Kamis, 07.30 WIB : Sony Eko .P
PROGRAM STUDI AGROEKOTEKNOLOGI FAKULTAS PERTANIAN UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG 2012
BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang DNA merupakan materi genatik yang yang mengkode semua informasi yang dibutuhkan untuk proses metabolisme dalam setiap organisme. Molekul DNA ini terikat membentuk kromosom, dan ditemukan di nukleus, mitokondria dan kloroplas. DNA yang menyusun kromosom ini merupakan nukleotida rangkap yang tersusun heliks ganda (double helix), dimana basa nitrogen dan kedua ”benang” polinukleotida saling berpasangan dalam pasangan yang tetap melalui ikatan hidrogen dan antara nukleotida yang satu dengan nukleotida yang lain dihubungkan dengan ikatan fosfat. Isolasi DNA adalah suatu tekhnik yang digunakan untuk memperoleh DNA murni, yaitu tanpa protein dan RNA dari suatu sel dalam jaringan. Pada proses isolasi DNA ini, sel eukariotik harus dihancurkan terlebih dahulu melalui cara mekanik dan enzimatis. Hal ini disebabkan membran sel dari membran inti sebagian besar tersusun atas lipida, Oleh karena itu pada praktikum ini digunakan detergen untuk mengikat atau menurunkan tegangan permukaannya. 1.2 Tujuan Mahasiswa atau praktikan dapat mengetahui macam metode isolasi DNA, mengetahui tahap isolasi DNA, serta mengetahui manfaat isolasi DNA 1.3 Manfaat Memberikan pengetahuan kepada mahasiswa cara melakukan isolasi DNA dengan bahan yang sederhana.
BAB II TINJAUAN PUSTAKA 1.1 Definisi Isolasi DNA 1. Isolasi DNA merupakan langkah mempelajari DNA.salah satu prinsip isolasi DNA yaitu dengan sentrifugasi.sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya.molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung (Mader, 1993). 2. DNA issolation is the use of DNA for analysis or manipulation usually requires that it is isolated and purified to a certain extent. Terjemahan: Isolasi DNA merupakan kegunaan DNA untuk dianalisa atau dimanipulasi yang harus diisolasi terlebih dahulu dan murni kandungannya (Wilson, Keith and John, 2010). 1.2 Macam metode isolasi DNA 1. Teknik Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) Teknik pengujian polimorfisme DNA berdasarkan pada amplifikasi dari segmen-segmen DNA acak yang menggunakan primer tunggal yang sekuen nukleotidanya ditentukan secara acak. Primer tunggal ini biasanya berukuran 10 basa. PCR dilakukan pada suhu anealing yang rendah yang memungkinkan primer menempel pada beberapa lokus pada DNA. Aturan sederhana untuk primer adalah terdiri atas 18- 28 susunan basa dengan persentase G+C 50-60% (Subandiyah,2006). 2. Metode CTAB Menghasilkan pita DNA yang berukuran tebal dan dapat memisahkan DNA dari polisakarida karena adanya perbedaan karakteristik kelarutan (differensial of solubility). Disamping deperoleh fragmen DNA, dengan metode CTAB juga akan diperoleh RNA dengan pita tipis yang terletak jauh berada di bawah pita DNA. Keberadaan pita RNA tergantung bahan yang diekstraksi (Prasetyo, 2008). 3. Phenol:chloroform Mengunakan senyawa Phenol-choloroform-isoamyl alcohol, Metode standard untuk ekstraksi DNA,Akhir-akhir ini ditinggalkan, karena sifat toksik phenol.
4. SaltingOut enggunakan garam konsentrasi tinggi (NaCl 6 M), untuk medenaturisasi protein menggunakan Proteinase K untuk denaturasi protein. 5. Guanidine isothiocyanate Metode ini lebih cepat dibanding dua metode sebelumnya, Thiocyanate bersifat toksik, untuk lisis dinding sel , Memerlukan chloroform untuk denaturasi protein. 6. Silica Gel Silica gel dapat mengikat DNA dengan perantaraan garam/buffer tertentu (NaI), Cepat, tetapi recovery DNA kurang (Barnum 2005). 7. PCR (Polymerase Chain Reaction) Merupakan suatu teknik perbanyakan (amplifikasi) potongan DNA secara in vitro pada daerah spesifik yang dibatasi oleh dua buah primer oligonukleotida. Primer yang digunakan sebagai pembatas daerah yang diperbanyak adalah DNA untai tunggal yang urutannya komplemen dengan DNA templatnya. Proses tersebut mirip dengan proses replikasi DNA secara in vivo yang bersifat semi konservatif (Giri, 2004). 2.3 Tahap isolasi DNA 1. Isolasi jaringan Tahap pertama yang dilakukan yaitu mengisolasi jaringan yang ingin digunakan. 2. Pelisisan dinding dan membran sel Tahap selanjutnya yaitu melisiskan dinding dan membran sel dengan cara penggerusan (homogenasi), sentrifugasi dengan kecepatan lebih dari 10.000 rpm atau dengan menggunakan larutan pelisis sel atau buffer ekstraksi. Inti sel harus dilisiskan, karena substansi gen yang diinginkan ada didalamnya. Penambahan larutan pelisis sel ini bertujuan untuk melisiskan sel yang tidak mengandung DNA agar sel yang mengandung inti sel dapat diisolasi atau dipisahkan dari komponenkomponen sel lainnya yang tidak berfungsi. 3. Pengekstraksian dalam larutan Selanjutnya supernatan yang terbentuk dibuang dan kemudian dilakukan ekstraksi di dalam larutan. Hal tersebut bertujuan agar didapat ekstrak.
4. Purifikasi Tahap ini bertujuan untuk membersihkan hasil ekstrak dari zat-zat lainnya. Pada larutan tersebut kemudian diberikan RNAse dan diinkubasi selama 10 menit pada suhu 65°C. Hal tersebut bertujuan untuk mengoptimalkan kerja enzim yang sangat dipengaruhi oleh temperatur. Penambahan RNAse berguna untuk menyingkirkan kontaminasi RNA sehingga DNA dapat diisolasi secara utuh. 5. Presipitasi Tahap terakhir, yaitu presipitasi bertujuan untuk mengendapkan protein histon, sehingga untai-untai DNA tidak lagi menggulung (coiling) dan berikatan dengan protein histon, yang menyebabkan DNA menjadi terlihat. Tahap presipitasi dilakukan dengan cara meneteskan larutan presipitasi protein dan kemudian divortex yang bertujuan untuk menghomogenkan larutan. Larutan presipitasi protein terdiri atas amonium asetat yang jika berikatan dengan protein mengakibatkan terbentuknya senyawa baru dengan kelarutan lebih rendah, sehingga menyebabkan protein mengendap. Larutan tersebut kemudian disentrifugasi kembali selama 5 menit dengan kecepatan 13.000 rpm. Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas ( Fauziah, 2010) 2.4 Manfaat isolasi DNA Isolasi DNA diperlukan untuk analisis genetik, yang digunakan untuk tujuan ilmiah, medis, atau forensik. Para ilmuwan menggunakan DNA di sejumlah aplikasi, seperti pengenalan DNA ke dalam sel dan binatang atau tanaman, atau untuk tujuan diagnostik. Dalam obat aplikasi yang terakhir adalah yang paling umum. Di sisi lain, ilmu forensik perlu memulihkan DNA untuk identifikasi individu (bagi pemerkosa misalnya, pencuri kecil, kecelakaan, atau korban perang), penentuan ayah, dan pabrik atau identifikasi hewan (Anggie, 2011).
BAB III METODELOGI 3.1 Alat, Bahan dan Fungsi 3.1.1 Alat : 1. Pisau 2. Timbangan 3. Mortar dan pestle 4. Beaker glass 5. Spatula 6. Pipet 7. Tabung reaksi 8. Kertas label 9. Rak tabung reaksi 3.1.2 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.
: mengupas dan memotong Mangga : menimbang bahan :menghaluskan mangga :mencampur bahan : mengaduk bahan :mengambil bahan/ekstrak :tempat ekstrak diamati : memberi tanda :menyangga tabung reaksi
Bahan Mangga arum manis: bahan untuk isolasi Detergen Bukrim : meluruhkan dinding sel Rinso cair : meluruhkan dinding sel Rinso bubuk : meluruhkan dinding sel Aquades : pelarut Garam : memisahkan benang-benang DNA Alkohol dingin : melihat DNA yang berupa benang Halus dan putih
3.2 Cara Kerja
Kupas manga arum manis
Timbang mangga 5 gram
Haluskan dengan mortar
Masukkan dalam beaker glass
Tambah aquades 50 ml
Tambah garam & detergen @2,5 gram
Aduk hingga homogen biarkan 10 menit
Ekstrak bahan
Ambil 5ml dengan pipet
Masukkan tabung reaksi
Masukan etanol dingin 0.6 ml
Amati supernatant setelah 10 menit 3.3 Analisa Perlakuan Tahap yang dilakukan pertama kali yaitu kupas kulit manga timbang mangga arum manis 5gr dengan 3x penimbangan. Setelah itu haluskan mangga dengan mortar. Setelah selesai di haluskan masukkan dalam gelas beaker. Gelas beaker digunakan untuk mencampur mangga dengan bahan yang lain. Tambahkan aquades ( 50 ml), tambahkan garam dan deterjen masing-masing 2,5 gram, lalu aduk bahan hingga homogen.dengan dibiarkan 10 menit. Detergen berguna untuk meluruhkan membrane dan dinding sel. Setelah bahan homogen ambil ekstrak bahan 5 ml dengan pipet, lalu masukkan tabung reaksi.setelah itu beri ethanol dingin 0,6 ml. Ethaonol dingin digunakan untuk mempresipitasi DNA. Amati supernatan warna dan gumpalan yang terjadi.
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Hasil Dokumentasi
1. Bukrim
2. Rinso bubuk
3. Rinso cair
4.2 Pembahasan Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan,dapat disimpulkan bahwa jenis detergen berpengaruh penuh terhadap isolasi DNA. Dari data diketahui bahwa deterjeb bukrim memberikan pengaruh yang paling besar dalam isolasi DNA. Pada rinso bubuk dan riso cair endapan tidak terlihat secara benar. Hal itu dimungkinkan pada saat pengambilan sampel tidak mengambil larutan bagian tengah, sehingga yang diamati kurang begitu jelas pada rinso bubuk dan riso cair . Kandungan senyawa kimia bukrim untuk melisiskan sel terdapat dalam konsentrasi yang tinggi. Apabila sampel pada rinso bubuk dan rinso cair dapat diamati, Kandungan detergen tersebut berbeda, misalnya lauryl sulfat yang dapat berfungsi sama dengan dodesil sulfat dan disodium EDTA, serta kandungan zat pewarna dan zat aktif pemutih yang biasanya ada dalam detergen. Menurut Jamilah (2005: 95) diantara detergen bubuk, detergen cair,dan padat,detergen bubuk menghasilkan warna yang paling baik, yaitu putih, detergen krim memberikan warna yang kurang baik karena menyebabkan warna filtrat mendekati warna
detergen, sehingga isolasi DNA yang dihasilkan berwarna sama atau hampir sama dengan filtrat. Sementara pada isolat yang dihasilkan dari filtrat yang menggunakan detergen cair tidak menunjukkan adanya prespitasi DNA yang baik, kalaupun ada, konsentrasi dan viskositasnya sangat rendah. Pernyataan Jamilah tersebut dapat kita berikan pada isolasi DNA yang terjadi pada buah dengan konsentrasi air tinggi. Selain itu semakin encer filtrat, maka DNA yang terpresipitasi akan semakin sedikit.
BAB V PENUTUP 5.1 Kesimpulan Pada praktikum isolasi DNA kasar didapatkan hasil bahwa jenis detergen berpengaruh penuh terhadap isolasi DNA. Detergen yang mempunyai daya rusak paling besar yaitu detergen Bukrim. Pada rinso bubuk dan riso cair endapan tidak terlihat secara benar. Hal itu dimungkinkan pada saat pengambilan sampel tidak mengambil larutan bagian tengah, sehingga yang diamati kurang begitu jelas pada rinso bubuk dan riso cair . Kandungan senyawa kimia bukrim untuk melisiskan sel terdapat dalam konsentrasi yang tinggi. Apabila sampel pada rinso bubuk dan rinso cair dapat diamati, Kandungan detergen tersebut berbeda, misalnya lauryl sulfat yang dapat berfungsi sama dengan dodesil sulfat dan disodium EDTA, serta kandungan zat pewarna dan zat aktif pemutih yang biasanya ada dalam detergen. 5.2 Saran Sudah baik ^_^
DAFTAR PUSTAKA Anggie,2011.Manfaat Isolasi DNA. http://anggiemyblog.blogspot.com/2011/04/laporan-isolasi-dna.html diakses tanggal 30 november 2012 Barnum, Susan R. 2005. Biotechnology an Introduction, 2nd edition. USA : Thomson Brooks/Cole. Fauziah, L. 2010. Isolasi DNA. Available on http://misspurplepharmacy.blogspot. com/2010/01/isolasi-dna.html. Diakses tanggal 28 november 2012. Giri-Rahman EA . 2004. Regulasi Ekspresi Gen Pada Organisme Bakteri. Bandung : KPP Bioteknologi Bandung. Jamilah. 2005. Pengaruh Berbagai Macam Detergen, Penambahan Enzim, dan Ekstrak Nanas (Ananas comusus (L) Merr) Terhadap Hasil Isolasi DNA Berbagai Macam Buah Sebagai Topik Praktikum Matakuliah Genetika. Skripsi tidak diterbitkan. Malang: Universitas Negeri Malang Mader,S.S.1993.Biology.Wm.C Brown Publishers: Lowa Prasetyo, A. 2008. Karakterisasi virus pada tanaman jarak pagar (Jatropha curcas L.). Fakultas Pertanian Universitas Gadjah Mada. Skripsi.(Tidak Dipublikasikan) Wilson,keith and john walker,2010.Principles and Techniques of Biochemistry and molecular Biology.Cambridge University Press,New York.
