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Regulação do Complexo Piruvato Desidrogenase (regulação alostérica e por modificação covalente) O complexo é formado por 3 enzimas e 5 coenzimas...

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Metabolismo de Carboidratos.

Profa.Dra. Leticia Labriola Abril 2012

Oxidação Completa da Glicose C6H12O6 + 6O2 +

6CO2 + 6H2O

36-38ADP + 36-38 Pi

+ 36-38ATP

Via glicolítica gastou: 1 glicose, 2 ADP, 2 Pi, 2 NAD+ gerou: 2 ATP, 2 NADH, 2 Pyr Falta:

“Usar” Pyr → Formação de AcCoA e Krebs “Reciclar” NADH → Transporte de elétrons Gerar CO2 → Formação de AcCoA e Krebs Formar ATPs → Fosforilação oxidativa

NAD – Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo (coenzima)

NADH

FAD – Flavo Adenina Dinucleotídeo (grupo prostético)

(Vit B2)

aa

AGL

estágio 1 produção de Acetil-CoA

Glicose glicólise

A Respiração Celular ocorre em 3 estágios

1 – nutrientes são oxidados e geram Acetil-CoA

piruvato

(Glicólise, β-oxidação e oxidação de aminoácidos) coenzimas são reduzidas

Acetil-CoA estágio 2 oxidação de Acetil-CoA oxaloacetato

cadeia respiratória

coenzimas são reduzidas

citrato

ciclo de Krebs

transportadores de e-

2 – Acetil-CoA é oxidado a CO2 no Ciclo de Krebs

3 – Coenzimas são oxidadas, transferindo os e- para O2, formando água e armazenando a energia envolvida na forma de ATP, na Cadeia Respiratória (Cadeia de Transporte de e- + Fosforilação Oxidativa estágio 3 transferência de ee fosf. oxidativa

Coenzima A (CoA) grupo reativo tiol

adenina

β-mercaptoetilamina ácido pantonênico ribose 3´- fosfato

3´-fosfoadenosina difosfato Acetil-CoA

o grupo acetil proveniente da descarboxilação do piruvato se une à CoA através do grupo tiol desta

O piruvato proveniente da glicólise é uma das principais fontes de Acetil-CoA

Descarboxilação oxidativa Remoção irreversível de um CO2 do piruvato, gerando o grupo acetil que se liga à coenzima A (CoA), formando Acetil-CoA

piruvato desidrogenase Piruvato

Complexo Multienzimático

3 enzimas (PDH) piruvato desidrogenase diidrolipoil transacetilase diidrolipoil desidrogenase

Acetil-CoA

5 coenzimas

Formação de Acetil-CoA

Formação de Acetil-CoA - 5 coenzimas / grupos prostéticos: tiamina pirofosfato (TPP) FAD Coenzima A NAD ácido lipóico - 5 vitaminas: tiamina (B1) riboflavina (B2) ácido pantotênico (CoA) (B5) niacina (nicotinamida) (B3) ácido lipóico

Cofatores do Complexo da Piruvato Desidrogenase

Piruvato desidrogenase (E1) • tiamina pirofosfato (TPP)

vitamina precurssora tiamina (B1)

Diidrolipoil transacetilase (E2) • coenzima A (CoA)

ácido pantotênico (B5)

Diidrolipoil desidrogenase (E3) • flavina adenina dinucleotídeo (FAD) • nicotinamida adenina dinucleotídeo (NAD+) Diidrolipoil transacetilase (E2) • ácido lipóico

riboflavina (B2) niacina (B3)/nicotinamida

não deriva de vitaminas

Formação de Acetil-CoA

Regulação da Piruvato Desidrogenase

-ATP, NADH, Acetil-CoA +AMP, NAD+

Regulação do Complexo Piruvato Desidrogenase (regulação alostérica e por modificação covalente) O complexo é formado por 3 enzimas e 5 coenzimas Os produtos da via, NADH e acetil-CoA, bem como ATP são efetores alostéricos negativos das enzimas do complexo As enzimas do complexo têm resíduos de serina, modificáveis por fosforilação As enzimas do complexo quando fosforiladas (por quinases) são inativas As enzimas do complexo quando desfosforiladas (por fosfatases) são ativas Além das 3 enzimas, o complexo tem uma quinase e uma fosfatase associadas NADH, Acetil-CoA e ATP ativam a quinase (e inibem o complexo) A diminuição de NADH, Acetil-CoA e ATP ativam a fosfatase (e ativam o complexo) A insulina ativa fosfatases no geral, tendo o mesmo efeito, bem como o Ca2+ e Mg2+ O excesso de acetil-CoA e NADH provenientes da β-oxidação durante o jejum inibem a síntese de acetil-CoA a partir de piruvato, favorecendo a gliconeogênese

Oxidação Completa da Glicose C6H12O6 + 6O2 +

6CO2 + 6H2O

36-38ADP + 36-38 Pi

+ 36-38ATP

Via glicolítica gastou: 1 glicose, 2 ADP, 2 Pi, 2 NAD+ gerou: 2 ATP, 2 NADH, 2 Pyr Form. de Acetil-CoA gastou: 2 NAD+, 2 Pyr gerou: 2 CO2, 2 NADH, 2 AcCoA

Reação Global - Ciclo de Krebs Acetil-CoA + 3NAD+ + FAD + GDP + Pi

2CO2 + 3NADH + FADH2 + GTP + CoA GTP + ADP

nucleosídeo difosfato quinase

GDP + ATP

Regulação do Ciclo de Krebs - NADH, ATP

+ADP

citrato sintase

Acetil-CoA + OxAc

Citrato

CoASH - NADH, ATP

+ADP

isocitrato desidrogenase

Isocitrato

NAD+

α cetoglutarato

NADH - NADH, ATP

α cetoglutarato

α cetoglutarato desidrogenase

CoASH

NAD+

NADH

CO2

Succinil-CoA

Regulação do Ciclo de Krebs piruvato +

(piruvato desidrogenase) -

Ca2+, Mg2+

*

Acetil-CoA

(citrato sintase) -

oxaloacetato

malato

*

fumarato

*

succinato

ATP, Acetil-CoA, NADH

ATP

ATP aumenta o KM da citrato sintase para acetilCoA

citrato cis-aconitato isocitrato -

+ * α-cetoglutarato Succinil * + Ca CoA 2+

*

Etapas que requerem coenzima oxidada (NAD+ ou FAD)

(isocitrato desidrogenase)

ATP ADP, Ca2+ (α-cetoglutarato desidrogenase)

Succinil-CoA NADH, GTP, ATP

Regulação do Ciclo de Krebs NADH, ATP +ADP

+ADP NADH, ATP

NADH, ATP ↓ ATP

Regulação Integrada

+ AMP

Frutose 6P

- citrato

(+ insulina no fígado)

Fosfofrutoquinase 2 ATP

ADP Pi

Frutose 2,6 P

Frutose 2,6 P

Frutose 2,6 bisfosfatase + PEP (+ glucagon no fígado)

Frutose 6P

Substrato do Ciclo de Krebs regulando Glicólise

GLICOSE

frutose 6-fosfato

ATP

(fosfofrutoquinase) -

Citrato

ADP

PIRUVATO

frutose 1,6-difosfato

O excesso de citrato indica abundância de precursores biossintéticos, e portanto a não necessidade de degradação de glicose

Destinos Metabólicos do Citrato Fonte de NADPH no citossol, para biossíntese redutora

Fonte de carbono para processos citossólicos biossintéticos, como ácidos graxos e esteróides

(enzima málica)

(fonte de acetil-CoA)

citrato

Regulador de outras etapas metabólicas (-) fosfofrutoquinase (+) Acetil-CoA carboxilase *

Ciclo de Krebs Geração de Energia

*Acetil-CoA carboxilase é a enzima que catalisa a formação de malonil-CoA a partir de acetil-CoA, o primeiro passo da síntese de ácidos graxos

Piruvato

NAD+

-ATP, NADH, Acetil-CoA

CoA

+AMP, NAD+ Piruvato desidrogenase CO2 NADH

Acetil-CoA

Citrato sintase

Citrato

- NADH, ATP

Oxaloacetato

+ADP ↓ ATP

Regulação do Ciclo de Krebs NADH, ATP +ADP

+ADP NADH, ATP

NADH, ATP ↑ ATP

Piruvato

NAD+

-ATP, NADH, Acetil-CoA

CoA

+AMP, NAD+ Piruvato desidrogenase

Piruvato carboxilase

CO2

CO2

NADH

ATP

Acetil-CoA

(biotina) +Acetil-CoA ADP + Pi

Citrato sintase

Citrato

- NADH, ATP

Oxaloacetato

+ADP ↑ ATP

Piruvato

NAD+

-ATP, NADH, Acetil-CoA

CoA

+AMP, NAD+ Piruvato desidrogenase

Piruvato carboxilase

glucagon

CO2

CO2

NADH

ATP

lipídeos

Acetil-CoA

(biotina) +Acetil-CoA ADP + Pi

Citrato sintase - NADH, ATP

Oxaloacetato

+ADP

Citrato

Inibição do Ciclo de Krebs por Falta de Oxaloacetato glicólise (jejum, fígado, gliconeogênese) PIRUVATO

β-oxidação intensa

proteólise

GLICOSE AMINOÁCIDOS

FOSFOENOLPIRUVATO

OXALOACETATO

OXALOACETATO (malato desidrogenase citoplasmática)

NADH NAD+

mitocôndria

citossol

O excesso de NADH da βoxidação desloca o equilíbrio em direção ao malato

cetogênese (recicla CoA) CITRATO

MALATO

MALATO Esta oxidação gera NADH citossólico que é transferido para a matriz mitocondrial por lançadeiras específicas

ACETIL CoA

SUCCINIL CoA

PORFIRINAS (grupo heme)

α-CETOGLUTARATO

AMINOÁCIDOS

Piruvato

NAD+

-ATP, NADH, Acetil-CoA

CoA

+AMP, NAD+ Piruvato desidrogenase

Piruvato carboxilase

CO2

CO2

NADH

ATP

Acetil-CoA

(biotina) +Acetil-CoA ADP + Pi

Citrato sintase

Citrato

- NADH, ATP

Oxaloacetato

+ADP ↓ ATP, ↓ Oxaloacetato

Regulação do Ciclo de Krebs NADH, ATP +ADP

+ADP NADH, ATP

NADH, ATP ↓ ATP

Inibição do Ciclo de Krebs Jejum ou Atividade Física Prolongada (fígado) - Consumo do oxaloacetato para produção de glicose via gliconeogênese - Acúmulo de Acetil-CoA e NADH proveniente da intensa β-oxidação Abundância de aporte energético - Inibição das enzimas por excesso de ATP (e falta de ADP) e excesso de coenzimas reduzidas – NADH e FADH2 (falta de coenzimas oxidadas – NAD+, FAD) Envenenamentos O Arsênico na forma de sais de arsenito (AsO33-) ou sais orgânicos é tóxico porque se liga covalentemente a sulfidrilas, especialmente as vicinais, como no caso das lipoamidas, presentes na piruvato desidrogenase e α-cetoglutarato desidrogenase. O fluoracetato (acetato fluorado), presente nas folhas de certas plantas venenosas na África, Austrália e América do Sul é tóxico porque é convertido a fluoracetil-CoA e então convertido a fluorcitrato pela citrato sintase. Inibe a aconitase e o transporte de citrato através da membrana interna da mitocôndria. Potentíssimo: LD50 = 0,2mg/Kg de peso corpóreo em ratos (ingerido, inalado ou absorvido pela pele) – Produção, Comercialização e uso proibidos pela OMS

Regulação do Ciclo de Krebs em outros níveis (isoformas, nível de expressão, transporte) Há diferentes isoformas das enzimas do complexo piruvato desidrogenase A expressão das isoformas parece ser tecido dependente e dieta dependente Dietas ricas em lipídeos ativa algumas, enquanto outras são favorecidas por dietas ricas em carboidratos – processo pouco compreendido! Estas enzimas mitocondriais são produzidas no citossol. Não só o nível de expressão influencia o ciclo, como também a velocidade de transporte destas para a mitocôndria

Deficiência de Piruvato Desidrogenase

- Crianças com acidose lática, acúmulo de piruvato e alanina - Geralmente em casamentos cossangüíneos - Acometimento cerebral - Dieta hipocalórica (predomínio de gorduras sobre carboidratos)

1. Indicar as vitaminas necessárias para a produção de acetil-CoA a partir de piruvato, e a localização intracelular desta reação. 2. Indicar a localização celular das enzimas do ciclo de Krebs e descrever os passos irreversíveis do ciclo. Indicar as vitaminas necessárias. 3. Escrever a reação global da metabolização da acetil-CoA pelo ciclo de Krebs. 4. Descrever a regulação do ciclo de Krebs em função das relações de ATP/ADP e NADH/NAD+. (Recorde também quais os efeitos de mudanças nos níveis de ATP/ADP e NADH/NAD+ na glicólise e neoglicogênese.) 5. Quais dos compostos a seguir aumentam a concentração de oxaloacetato em uma suspensão de mitocôndrias: acetil-CoA, piruvato, glutamato, citrato, ácidos graxos? Justifique, e explique porque estes compostos são gliconeogênicos. 6. Descrever os mecanismos de regulação da piruvato desidrogenase e piruvato carboxilase. Como essa regulação afeta a velocidade das reações do ciclo de Krebs? Como afeta a gliconeogênese? 7. Indicar a direção preferencial da reação catalisada pela aconitase se reagentes e produtos estiverem em concentrações equivalentes. Qual o composto que se acumula quando o ciclo de Krebs é inibido por altas relações ATP/ADP e NADH/NAD+? Relacionar a atividade da via glicolítica com a atividade da isocitrato desidrogenase. 8. O beriberi, uma doença causada pela deficiência de tiamina (vitamina B1), é caracterizado pelo acúmulo de piruvato, especialmente após refeições ricas em carboidratos. Explique porque ocorre este acúmulo. 9. A síndrome de Wernicke-Korsakoff é caracterizada por confusão mental, ataxia, oftalmoplegia e letargia, observada normalmente em alcoólatras crônicos. Esta síndrome pode ser revertida completamente através da administração de tiamina. Baseado nesses dados, explique a causa da doença e porque compromete principalmente as funções cerebrais. 10. A deficiência de biotina, uma doença rara, causa intolerância a exercício e hipoglicemia de jejum. Explique esse quadro clínico.