PENGARUH KOMPOSISI FASA GERAK PADA PENETAPAN KADAR ASAM BENZOAT DAN KAFEIN DALAM KOPI KEMASAN MENGGUNAKAN METODE KCKT (KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI) Auliya Puspitaningtyas, Surjani Wonorahardjo, Neena Zakia Jurusan Kimia FMIPA Universitas Negeri Malang Email:
[email protected],
[email protected],
[email protected] Abstrak: Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui pengaruh komposisi fasa gerak terhadap penetapan kadar asam benzoat dan kafein, serta mengetahui kadar asam benzoat dan kafein dalam kopi kemasan. Tahapan penelitian ada dua langkah pokok yaitu (1). Optimasi kondisi analisis yang meliputi penentuan masing-masing λ maksimum asam benzoat dan kafein menggunakan Spektrofotometer UV-Vis, standart asam benzoat dan kafein dianalisis dalam berbagai komposisi fasa gerak menggunakan KCKT, dan pemilihan komposisi fasa gerak yang baik untuk analisis asam benzoat dan kafein menggunakan KCKT; (2) Penetapan kadar asam benzoat dan kafein dalam sampel, sebelumnya dilakukan beberapa tahapan yaitu pretreatment sampel untuk memisahkan asam benzoat dan kafein dari masing-masing sampel, pembuatan kurva kalibrasi larutan standart asam benzoat dan larutan standart kafein menggunakan komposisi fasa gerak terpilih, dan analisis sampel menggunakan komposisi fasa gerak terpilih. Fasa gerak terpilih yang digunakan adalah campuran metanol dan buffer asetat dengan perbandingan 50:50 dan 60:40. Kadar asam benzoat pada komposisi fase gerak 50:50 sampel A 20,5 ppm dan sampel B 12 ppm, untuk komposisi fase gerak 60:40 sampel A 35 ppm dan sampel B 41,5 ppm. Kadar kafein pada komposisi fase gerak 50:50 sampel A 6,5 ppm dan sampel B 11,5 ppm, untuk komposisi fase gerak 60:40 sampel A 22 ppm dan sampel B 37 ppm. Kata kunci: fasa gerak, asam benzoat, kafein, kopi kemasan, KCKT
Abstract: This research is done to determine the effect of mobile phase composition on benzoic acid and caffeine and determine benzoic acid and caffeine in instant coffee package. This study conducted in the laboratory which consists of several steps: (1). Optimization of analysis condition that comprise determining each λ maximum of benzoic acid and caffeine using UV-Vis Spectrophotometer, benzoic acid and caffeine standard analyzed on various mobile phase composition using HPLC, the best selection of mobile phase composition for benzoic acid and caffeine using HPLC , (2) Determination benzoic acid and caffeine contains in samples, previously done several steps, sample pretreatment for separating benzoic acid and caffeine from sample, making the calibration curve for benzoic acid and caffeine solution standard, and analysis of sample using selected mobile phase composition. The selected mobile phase is the mixture of methanol and buffer acetate within comparison 50:50 and 60:40. The content of benzoic acid at mobile phase composition 50:50 for sample A 20,5 ppm and sample B 12 ppm, at mobile phase composition 60:40 for sample A 35 ppm and sample B 41,5 ppm. The content of caffeine at mobile phase composition 50:50 for sample A of 6.5 ppm and sample B 11.5 ppm, at mobile phase composition of 60:40 for sample A 22 ppm and sample B 37 ppm. Key word: mobile phase, benzoic acid, caffeine, instant coffee package, HPLC
PENDAHULUAN
Jenis bahan pengawet yang sering digunakan dalam makanan untuk menghambat pertumbuhan jamur, ragi, dan beberapa bakteri adalah asam benzoat. Bahan pengawet ini biasanya digunakan dalam bentuk garam benzoat yang lebih mudah larut dalam air dibanding bentuk asamnya yaitu natrium benzoat (PerMenKes No.772, 1988). Selain bahan pengawet, beberapa minuman kemasan juga mengandung kafein yang berfungsi
untuk merangsang sistem saraf pusat sehingga dapat mengusir rasa kantuk dan lelah secara sementara. Jenis minuman kemasan tersebut antara lain jenis minuman ringan, minuman berenergi, teh kemasan, dan kopi kemasan. Pada penelitian sebelumnya McDevitt et al (1998) menganalisis asam benzoat dan kafein pada minuman ringan menggunakan spektrofotometri ultra violet (UV), dan El-Ziney (2009) menganalisis kandungan asam benzoat yang terdapat pada beberapa minuman ringan dan minuman berenergi dengan GC-MS (Gas Chromatography-Mass Spectrometer). Metode spektrofotometri UV memiliki kelebihan antara lain sampel dapat langsung dianalisis meskipun tanpa preparasi dan sampel tidak perlu dibuat berwarna dengan penambahan reagent tertentu. Sedangkan kelemahannya antara lain, penentuan kadar sampel berdasarkan banyaknya sinar yang diserap oleh sampel sehingga hasil yang diperoleh belum tentu sesuai dengan kadar yang sebenarnya. Selain itu, banyak kemungkinan terjadi interferensi dari senyawa lain yang juga menyerap sinar pada panjang gelombang UV tersebut, sehingga dapat menimbulkan bias pada hasil analisis (Riyadi, 2009). Pada metode GC-MS, sampel yang akan dianalisis harus memenuhi persyaratan antara lain sampel mudah menguap, mudah diuapkan, dan tidak rusak karena panas (Anonymous, 2012). Perlu adanya metode lain yang mampu menutupi kelemahan yang dimiliki oleh metode spektrofotometri UV dan GC-MS. Salah satu metode yang dapat digunakan yaitu metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi yang selanjutnya disingkat dengan KCKT. Metode KCKT termasuk suatu teknik kromatografi kolom dengan fase gerak berupa cairan dan fase diam berupa padatan yang terdapat pada kolom. Kelebihan yang dimiliki oleh KCKT antara lain mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran dengan baik, memiliki kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi, dapat menggunakan berbagai detektor, kolom dapat digunakan kembali, memisahkan zat yang labil dan tidak mudah menguap, dilakukan pada suhu kamar, serta ideal untuk pemisahan ion dan molekul besar (Johnson dan Stevenson, 1991). Metode analisis KCKT dapat digunakan untuk analisis secara kualitatif maupun kuantitatif senyawa-senyawa yang terdapat dalam sampel. Penelitian yang menggunakan metode KCKT dilakukan oleh Ree, M dan Stoa, E (2011) untuk menetapkan kandungan aspartam, asam benzoat, kafein, dan sakarin dalam minuman ringan bebas gula. Fase gerak yang digunakan adalah campuran metanol dengan buffer fosfat pH 3 (20:80), kolom XB-C18 (50 L x 4,6 mm), dengan panjang gelombang 220 nm dan 270 nm. Penelitian lain juga dilakukan oleh Techakriengkrai, I dan Surakarntul, R (2007) menggunakan metode KCKT untuk menganalisis asam benzoat dan asam sorbat pada minuman ringan menggunakan fase gerak metanol dengan buffer ammonium asetat (60:40), dan penelitian yang dilakukan oleh Saad, B dkk (2004) juga menggunakan metode KCKT untuk menganalisis bahan pengawet pada makanan dengan fase gerak metanol dengan buffer ammonium asetat (50:50). Fase gerak yang digunakan oleh Techakriengkrai, I dan Surakarntul, R (2007) dan Saad, B dkk (2004) berbeda dengan penelitian yang dilakukan oleh Ree, M dan Stoa, E (2011). Perbedaan dari ketiga penellitian tersebut terletak pada jenis buffer yang digunakan yaitu buffer ammonium asetat dan buffer fosfat, sedangkan pelarut yang lain sama-sama menggunakan metanol. Techakriengkrai, I dan Surakarntul, R (2007) dan Saad, B dkk (2004) menggunakan jenis fase gerak yang sama dengan perbandingan komposisi yang berbeda. Hasil dari ketiga penelitian yang diperoleh tidak dapat dibandingkan karena sampel yang digunakan berbeda. Dalam KCKT, fase gerak selain
berfungsi sebagai pembawa komponen-komponen campuran menuju detektor, fase gerak merupakan salah satu faktor penentu keberhasilan proses analisis (Hendayana, 2010). Terhadap kopi kemasan yang digunakan sebagai sampel dilakukan ekstraksi pelarut sebelum dianalisis menggunakan KCKT. Ekstraksi pelarut merupakan metode pemisahan yang sering digunakan dalam laboratorium untuk mengisolasi satu atau lebih komponen dari suatu campuran (Khopkar, 1990). Prinsip metode ekstraksi pelarut didasarkan pada distribusi zat terlarut dalam dua pelarut yang tidak saling bercampur. Ekstraksi terhadap kopi kemasan dilakukan untuk menghilangkan unsur lain yang mungkin akan mengganggu proses analisis. Oleh karena itu dilakukan penelitian tentang pengaruh komposisi fase gerak pada penentuan kadar asam benzoat dan kafein yang terdapat pada kopi kemasan dengan metode KCKT menggunakan fase gerak campuran metanol dan buffer ammonium asetat. METODE Rancangan Penelitian
Tahap penelitian meliputi dua langkah pokok yaitu: (1) Optimasi kondisi analisis yang meliputi beberapa tahap yaitu (a) Penentuan masing-masing λ maksimum asam benzoat dan kafein menggunakan Spektrofotometer UV-Vis, (b) Standart asam benzoat dan kafein dianalisis dalam berbagai komposisi fase gerak menggunakan KCKT, (c) Pemilihan komposisi fase gerak yang baik untuk analisis asam benzoat dan kafein menggunakan KCKT; (2) Penetapan kadar asam benzoat dan kafein dalam sampel, sebelumnya dilakukan beberapa tahapan yaitu (a) Pretreatment sampel untuk memisahkan asam benzoat dan kafein dari masing-masing sampel, (b) Pembuatan kurva kalibrasi larutan standart asam benzoat dan larutan standart kafein menggunakan komposisi fase gerak terpilih (b) Analisis sampel menggunakan komposisi fase gerak terpilih. Prosedur Kerja 1. Ektraksi Asam Benzoat dan Kafein dalam Sampel Kopi Ekstraksi asam benzoat dilakukan dengan mengambil sebanyak 150 mg kopi bubuk kemasan dimasukkan ke dalam labu takar 250 mL dan ditambah dengan larutan NaCl jenuh secukupnya, larutan tersebut dibuat basa dengan menambahkan larutan NaOH 10%, selanjutnya ditambah larutan NaCl jenuh sampai tanda batas dan diaduk konstan selama 2 jam kemudian disaring sehingga diperoleh filtrat yang bebas bubuk kopi. Filtrat hasil saringan diambil sebanyak 25 mL dan dimasukkan dalam corong pisah 100 mL untuk diekstraksi menggunakan kloroform, sebelumnya ditambah dengan HCl sebanyak 1,25 mL. Ekstraksi dilakukan secara bertingkat dengan 18,5 mL; 12,5 mL; 10 mL; 7,5 mL kloroform. Fase organik dari hasil ekstraksi dimasukkan dalam gelas kimia 250 mL yang telah berisi air sebanyak 50 mL, selanjutnya didestilasi untuk menghilangkan fase organiknya (kloroform) sehingga diperoleh asam benzoat yang terlarut dalam air. Sedangkan untuk ekstraksi kafein, sebanyak 25 g kopi bubuk kemasan dimasukkan dalam timbel, kemudian dimasukkan dalam rangkaian alat sohlet yang telah berisi 300 mL metanol, selanjutnya diekstraksi selama 3 jam. Ekstrak kopi dalam metanol disaring dengan pompa vakum menggunakan kertas saring Whatman Φ 41. Ekstrak kopi yang telah disaring diambil sebanyak 100 mL untuk dimasukkan dalam gelas kimia 250 mL yang telah berisi 12,5 g MgO. Campuran tersebut selanjutnya
ditambah dengan 75 mL air dan diaduk konstan disertai pemanasan selama ± 10 menit. Setelah itu, campuran disaring, residu sisa penyaringan dicuci dengan 125 mL dan 63 mL air panas secara bergantian. Filtrat dari kedua penyaringan dicampurkan dan disaring kembali menggunakan pompa vakum. Selanjutnya, keseluruhan filtrat yang dihasilkan ditambah dengan H2SO4 10% sebanyak 12,5 mL. Campuran tersebut dipanaskan dan diuapkan sampai tersisa 1/3 volume awal, setelah itu disaring dalam keadaan panas dan didinginkan. Setelah dingin, filtrat dimasukkan dalam corong pisah 250 mL dan diekstraksi dengan 7,5 mL kloroform. Lapisan organik hasil ekstraksi dimasukkan dalam gelas kimia 500 mL dan ditambah dengan larutan NaOH 1% sampai warnanya hilang, kemudian ditambah air dengan volume sama dengan volume larutan NaOH 1% yang ditambahkan dan didestilasi untuk menghilangkan pelarut organiknya. 2. Pembuatan Larutan a. Pembuatan Larutan Penyangga Amonium Asetat pH 4 Sebanyak 7,7 gram amonium asetat dimasukkan dalam labu ukur 1000 mL, kemudian ditambah aquabides sampai kira-kira volume 900 mL dan ditambah dengan asam asetat glasial sampai pH 4 yang diukur menggunakan kertas indikator universal. Selanjutnya, campuran tersebut ditambahkan aquabides sampai batas. b. Pembuatan Larutan Induk Asam Benzoat dan Kafein Pembuatan larutan induk asam benzoat dan kafein masing-masing 100 ppm. Larutan induk asam benzoat dibuat dengan menimbang sebanyak 10 mg asam benzoat. Asam benzoat tersebut dimasukkan dalam labu ukur 100 mL, kemudian ditambah aquabides sampai batas dan dikocok sehingga dihasilkan larutan induk asam benzoat 100 ppm. Larutan induk kafein dibuat dengan menimbang sebanyak 10 mg kafein. Kafein tersebut dimasukkan dalam labu ukur 100 mL, kemudian ditambah aquabides sampai tanda batas dan dikocok. c. Pembuatan Larutan Standart Asam Benzoat dan Kafein Larutan induk asam benzoat dan kafein 100 ppm digunakan untuk membuat larutan standar. Larutan induk asam benzoat diencerkan dengan aquabides menjadi 5 ppm, 10 ppm, dan 20 ppm dengan cara mengambil 2,5 mL; 5 mL; dan 10 mL, kemudian dimasukkan dalam 3 labu ukur 50 mL yang berbeda secara berturut-turut. Larutan induk kafein diencerkan dengan aquabides menjadi 5 ppm, 10 ppm, 20 ppm dan 50 ppm dengan cara mengambil 2,5 mL; 5 mL; 10 mL; dan 25 mL, dimasukkan dalam 4 labu ukur 50 mL yang berbeda secara berturut-turut. d. Pembuatan Larutan Sampel Sebanyak 5 mL ekstrak asam benzoat dan kafein masing-masing diencerkan dalam labu ukur 50 mL dengan aquabides sampai tanda batas. Larutan yang akan dianalisis disaring terlebih dahulu menggunakan Cellulose Nitrate Membrane Filtrat 0,45 µm. 3. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum (λmaks) Penentuan λmaks dilakukan dengan menganalisis larutan standart asam benzoat dan kafein menggunakan spektrofotometer UV-Vis. λmaks (panjang gelombang maksimal) yang diperoleh digunakan untuk analisis larutan standart dan sampel pada instrument KCKT Shimadzu. 4. Optimasi Kondisi Analisis dengan KCKT Larutan standart asam benzoat dan kafein masing-masing 20 ppm dalam pelarut aquabides disuntikkan sebanyak 100 µL ke dalam kolom secara bergantian menggunakan fase gerak campuran matanol dan buffer asetat pH 4,4 dengan berbagai komposisi yaitu 10:90; 20:80; 30:70; 40:60; 50:50; 60:40; 70:30; 80:20; 90:10. Panjang
gelombang yang digunakan untuk mendapat kondisi optimum adalah panjang gelombang maksimum asam benzoat dan kafein yang diperoleh pada tahap sebelumnya. Komposisi yang memberikan hasil pemisahan terbaik berdasarkan waktu retensi dan bentuk puncak digunakan untuk pembuatan kurva kalibrasi dan analisis penetapan kadar asam benzoat dan kafein pada masing-masing sampel. 5. Penetapan kadar asam benzoat dan kafein Kondisi analisis terpilih digunakan untuk menganalisis 100 µL sampel disuntikkan ke dalam kolom dan diamati waktu retensi puncak-puncak yang dihasilkan oleh sampel. Apabila puncak-puncak tersebut mempunyai waktu retensi yang kurang lebih sama dengan waktu retensi puncak bahan baku pembanding asam benzoat dan kafein, maka dapat disimpulkan bahwa pada sampel terdapat zat-zat tersebut. Analisis Data
Kadar asam benzoat dan kafein ditentukan melalui persamaan garis yang diperoleh dari kurva kalibrasi. Nilai luas area setiap sampel yang dianalisis menggunakan KCKT disubstitusikan ke dalam persamaan garis, sehingga diperoleh kadar asam benzoat dan kafein. HASIL 1. Ekstraksi Asam Benzoat dan Kafein dalam Sampel Kopi a. Ekstraksi Asam Benzoat Fase organik hasil ekstraksi bertahap dikumpulkan dalam gelas kimia 250 mL yang telah berisi air sebanyak 50 mL. Campuran air dan fase organik tersebut selanjutnya didestilasi pada suhu ± 60°C untuk menghilangkan kloroform, setelah kloroform dalam campuran tersebut menguap seluruhnya destilasi dihentikan. Larutan sisa destilasi didinginkan, setelah dingin dilakukan analisis menggunakan KCKT. b. Ekstraksi Kafein Fase organik hasil ekstraksi dimasukkan dalam gelas kimia 500 mL dan ditambah dengan larutan NaOH 1% sampai warnanya memudar sekitar 50 mL, kemudian ditambah air dengan volume yang sama dengan volume NaOH 1% yang ditambahkan yaitu 50 mL, kemudian didestilasi untuk menghilangkan fase organik. Sisa hasil destilasi tersebut didinginkan dan dianalisis menggunakan KCKT. 2. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum Hasil dari pengukuran menggunakan spektrofotometer menunjukkan bahwa asam benzoat terdeteksi pada panjang gelombang 222 nm dan kafein terdeteksi pada panjang gelombang 272 nm. Panjang gelombang yang diperoleh selanjutnya digunakan untuk analisis larutan standart dan sampel pada instrument KCKT Shimadzu. 3. Komposisi Fase Gerak pada Instrumen KCKT (Kromatografi Cair Kinerja Tinggi) Shimadzu Data waktu retensi dan luas area komposisi fase gerak terpilih yang diperoleh dari standart asam benzoat dan kafein disajikan pada Tabel 1 dan 2. Tabel 1. Data Waktu Retensi dan Luas Area Komposisi Fase Gerak Terpilih Standart Asam Benzoat 200 ppm pada λ 222 nm Variasi fase gerak 50 : 50 60 : 40
Asam Benzoat Waktu retensi (menit) 5,452 4,130
Luas Area 17002267 17105220
Tabel 2. Data Waktu Retensi dan Luas Area Komposisi Fase Gerak Terpilih Standart Kafein 200 ppm pada λ 272 nm Kafein
Variasi fase gerak
Waktu retensi (menit) 3,955 3,457
50 : 50 60 : 40
Luas Area 13115831 13191438
4. Pembuatan Kurva Kalibrasi
Data hasil pengukuran larutan standart asam benzoat dan kafein untuk membuat kurva kalibrasi disajikan pada Tabel 3 dan 4. Tabel 3. Data Hasil Pengukuran Larutan Standart Asam Benzoat untuk Membuat Kurva Kalibrasi Luas Area Standart Asam Benzoat 50 : 50 60 : 40 465512 384563 848356 816085 1509538 167319
Konsentrasi (x) ppm 5 10 20
Tabel 4. Data Hasil Pengukuran Larutan Standart Kafein untuk Membuat Kurva Kalibrasi Luas Area Standart Kafein
Konsentrasi (x) ppm 5 10 20
50 : 50 393458 703796 1322745
60 : 40 324281 702109 1317473
Data yang dihasilkan selanjutnya digunakan untuk pembuatan kurva kalibrasi asam benzoat dan kurva kalibrasi kafein, sehingga diperoleh persamaan garis regresi pada masing-masing kondisi, persamaan regresi garis tersebut disajikan pada Tabel 5. Tabel 5. Persamaan Garis Regresi untuk Asam Benzoat dan Kafein Berdasarkan Kurva Kalibrasi Perbandingan Fase gerak 50:50 60:40
Asam Benzoat λ (222 nm) Persamaan Regresi y = 69104x + 13492 y = 85961x - 44554
Kafein λ (272 nm) r 0,998 1
Persamaan Regresi y = 61944x + 83984 y = 65545x + 16599
r 1 0,997
5. Hasil Kadar Asam Benzoat dan Kafein dalam Sampel Kopi Kemasan
Sampel yang digunakan adalah dua macam kopi bubuk kemasan yang telah mendapat perlakuan sehingga diperoleh ekstrak asam benzoat A dan B, serta ekstrak kafein A dan B. Hasil analisis dengan KCKT adalah waktu retensi dan luas area. Data luas area disubstitusikan ke persamaan garis regresi, selanjutnya dikalikan dengan faktor pengenceran sehingga diperoleh konsentrasi asam benzoat dan kafein dalam masing-masing sampel yang disajikan pada Tabel 6, 7, 8 dan 9. Tabel 6. Data Konsentrasi Ekstrak Asam Benzoat dalam Sampel Kopi Kemasan A Variasi fase gerak
λ
50:50 60:40
222
Konsentrasi (ppm) Persamaan Regresi Faktor Pengenceran 0,41 20,5 0, 7 35
Tabel 7. Data Konsentrasi Ekstrak Asam Benzoat dalam Sampel Kopi Kemasan B Variasi fase gerak
λ
50 : 50 60 : 40
222
Kadar Asam Benzoat (ppm) Persamaan Regresi Faktor Pengenceran 0,24 12 0,83 41,5
Tabel 4.12 Data Konsentrasi Ekstrak Kafein dalam Sampel Kopi Kemasan A Variasi fase gerak
λ
50;50 60:40
272
Konsentrasi (ppm) Persamaan Regresi Faktor Pengenceran 0,13 6,5 0,44 22
Tabel 4.13 Data Konsentrasi Ekstrak Kafein dalam Sampel Kopi Kemasan B Variasi fase gerak
λ
50;50 60:40
272
Kadar Kafein (ppm) Persamaan Regresi Faktor Pengenceran 0,23 11,5 0,74 37
PEMBAHASAN 1. Ekstraksi Asam Benzoat dan Kafein dalam Sampel Kopi a. Ekstraksi Asam Benzoat
Bubuk kopi yang akan diekstraksi dilarutkan terlebih dahulu dalam larutan NaCl jenuh yang disertai dengan pengadukan secara konstan selama 2 jam dengan tujuan menjenuhkan larutan sampel agar asam benzoat yang terkandung dalam sampel terikat dalam larutan sebagai natrium benzoat. Larutan selanjutnya ditambah larutan HCl agar sifat larutan yang semula basa menjadi netral dan mengubah natrium benzoat yang terlarut dalam larutan kembali ke bentuk semula yaitu asam benzoat. Tahap ekstraksi dilakukan secara bertahap menggunakan kloroform dengan tujuan hasil ekstraksi lebih maksimal. Fase organik yang dihasilkan dari ekstraksi ditambahkan air untuk mencuci fase organik tersebut, selanjutnya dilakukan destilasi pada suhu ± 30oC untuk menghilangkan fase organik (kloroform) dari campuran sehingga hanya tersisa fase air. Suhu destilasi merupakan setengah dari titik didih kloroform, hal tersebut dilakukan agar penguapan terjadi secara perlahan sehingga kloroform terpisah dari fase air dengan baik. Fase air inilah yang dianalisis menggunakan KCKT. b. Ekstraksi Kafein Ekstraksi kafein dilakukan dengan metode soxhlet dengan pelarut yang berfungsi untuk melarutkan kafein yang terkandung dalam sampel. Kafein bersifat polar sehingga digunakan pelarut polar juga yaitu metanol agar kafein yang terdapat dalam sampel terlarut dalam pelarut tersebut. Ekstrak kopi hasil soxhlet ditambah dengan MgO dan air kemudian diaduk konstan selama ± 10 menit agar pencampuran merata sehingga zat selain kafein yang terkandung dalam ekstrak kopi tersebut berikatan dengan MgO, sehingga diperoleh larutan berwarna coklat orange. Saat pencampuran selesai, campuran disaring untuk memisahkan antara residu dan dan filtrat. Residu hasil penyaringan dibilas menggunakan air sebelum dibuang, tujuannya agar filtrat yang masih terdapat dalam residu tersebut ikut terbawa air dan bercampur dengan filtrat hasil penyaringan yang awal. Filtrat yang terkumpul ditambah dengan H2SO4 10% untuk membuat larutan menjadi bersifat asam karena larutan tersebut
bersifat basa akibat adanya Mg(OH)2 yang terbentuk dari pelarutan MgO dalam air pada tahap sebelumnya, kemudian diuapkan sampai tersisa 1/3 dari volume awal untuk menghilangkan kandungan air dan asam berlebih. Sisa larutan yang diuapkan kemudian diekstraksi menggunakan kloroform sehingga akan diperoleh fase organik yang akan mendapat perlakuan selanjutnya. Fase organik hasil ekstraksi ditambah dengan larutan NaOH 1% sampai warnanya memudar dan ditambah air sebanyak volume NaOH 1% yang ditambahkan, setelah itu larutan didestilasi pada suhu ± 30oC untuk menghilangkan fase organik (kloroform) dari campuran sehingga hanya tersisa fase air. Suhu destilasi merupakan setengah dari titik didih kloroform, hal tersebut dilakukan agar penguapan terjadi secara perlahan sehingga kloroform terpisah dari fase air dengan baik. Fase air inilah yang dianalisis menggunakan KCKT. 2. Komposisi Fase Gerak pada Penetapan Kadar Asam Benzoat dan Kafein
Menggunakan KCKT (Kromatografi Cair Kinerja Tinggi) Berdasarkan hasil analisis larutan standar asam benzoat dan kafein menggunakan beberapa perbandingan komposisi fase gerak diperoleh komposisi fase gerak yang baik untuk analisis sampel kopi kemasan menggunakan KCKT. Komposisi fase gerak baik yang dimaksud didasarkan pada waktu retensi, puncak yang terbentuk, dan luas area yang dihasilkan untuk asam benzoat dan kafein sebagaimana telah dijelaskan sebelumnya. Komposisi fase gerak yang terpilih dari beberapa komposisi fase gerak yang digunakan untuk analisis yaitu 50:50 dan 60:40 pada panjang gelombang 222 nm untuk asam benzoat dan pada panjang gelombang 272 nm untuk kafein dengan waktu retensi masing-masing sebagaimana terdapat pada Gambar 5.3 dan 5.4. Komposisi fase gerak 60:40 lebih polar dibandingkan dengan komposisi fase gerak 50:50, kepolaran tersebut berpengaruh terhadap waktu retensi yang dihasilkan untuk asam benzoat dan kafein. Waktu retensi saat analisis menggunakan komposisi fase gerak 60:40 lebih cepat daripada menggunakan fase gerak 50:50. Kepolaran fase gerak berpengaruh juga terhadap hasil pemisahan, senyawa polar yang dipisahkan akan lebih banyak terbawa oleh komposisi fase gerak yang lebih polar. Waktu retensi asam benzoat lebih lama daripada waktu retensi kafein dikarenakan kafein lebih polar dibandingkan dengan asam benzoat sehingga asam benzoat tertahan lebih lama di fase diam. Komposisi tersebut menghasilkan kromatogram yang lebih baik untuk asam benzoat dan kafein dibandingkan dengan komposisi fase gerak yang lain yang menghasilkan kromatogram baik untuk salah satu senyawa saja. Komposisi fase gerak terpilih sesuai dengan penelitian yang telah dilakukan oleh Techakriengkrai, I dan Surakarntul, R (2007) yang menggunakan komposisi fase gerak 60:40, serta penelitian Saad, B dkk (2004) yang menggunakan komposisi fase gerak 50:50. Kromatogram asam benzoat dan kafein pada komposisi fase gerak 50:50 disajikan pada Gambar 1. /5.452
mV Detector A Ch2:222nm 500 250 0 -250 3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
6.0
6.5
7.0
7.5
8.0
8.5
9.0
9.5
m in
Gambar 1. Kromatogram Menggunakan Komposisi Fase Gerak 50:50 (a) Asam benzoat, (b) Kafein
Kromatogram asam benzoat dan kafein pada komposisi fase gerak 60:40 disajikan pada Gambar 2. /4.130
mV Detector A Ch2:222nm 500 250 0 -250 3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
6.0
6.5
m in
Gambar 2. Kromatogram Menggunakan Komposisi Fase Gerak 60:40 (a) Asam benzoat, (b) Kafein
3. Analisis Kadar Asam Benzoat dan Kafein dalam Kopi Kemasan dengan KCKT
Berdasarkan kromatogram asam benzoat yang dianalisis menggunakan komposisi fase gerak 50:50 diperoleh data luas area untuk sampel A adalah 42.047 dan sampel B adalah 30.732, dari data tersebut dapat diketahui konsentrasi masing-masing sampel dengan persamaan regresi asam benzoat pada komposisi fase gerak 50:50 yaitu y = 69104x + 13492, maka diperoleh masing- masing konsentrasi untuk sampel A 0,41 ppm dan sampel B 0,24 ppm. Kromatogram asam benzoat yang dianalisis menggunakan komposisi fase gerak 60:40 diperoleh data luas area untuk sampel A adalah 15.684 dan sampel B adalah 26.915, dari data tersebut dapat diketahui konsentrasi masing-masing sampel dengan persamaan regresi asam benzoat pada komposisi fase gerak 60:40 yaitu y = 85961x - 44554, maka diperoleh masing-masing konsentrasi untuk sampel A 0,7 ppm dan sampel B 0,83 ppm. Berdasarkan kromatogram kafein yang dianalisis menggunakan komposisi fase gerak 50:50 diperoleh data luas area untuk sampel A adalah 92.181 dan sampel B adalah 45.466, dari data tersebut dapat diketahui konsentrasi masing-masing sampel dengan persamaan garis regresi asam benzoat pada komposisi fase gerak 50:50 yaitu y = 61944x + 83984, maka diperoleh masing-masing konsentrasi untuk sampel A 0,13 ppm
dan sampel B 0,44 ppm. Kromatogram kafein yang dianalisis menggunakan komposisi fase gerak 60:40 diperoleh data luas area untuk sampel A adalah 98.680 dan sampel B adalah 65.107, dari data tersebut dapat diketahui konsentrasi masing-masing sampel dengan persamaan regresi kafein pada komposisi fase gerak 60:40 yaitu y = 65545x + 16599, maka diperoleh masing-masing konsentrasi untuk sampel A 0,16 ppm dan sampel B 0,74 ppm. Konsentrasi masing-masing sampel yang telah diperoleh melalui persamaan garis selanjutnya dihitung berdasarkan banyaknya pengenceran yang dilakukan sebelum sampel tersebut dianalisis menggunakan KCKT, hal tersebut bertujuan untuk mengetahui konsentrasi asam benzoat dan kafein sebenarnya yang terkandung dalam 5 mL sampel yang telah diencerkan sebanyak 50 kali. Konsentrasi asam benzoat pada analisis menggunakan komposisi fase gerak 50:50 adalah 20,5 ppm untuk sampel A dan 12 ppm untuk sampel B, sedangkan konsentrasi asam benzoat yang dianalisis menggunakan komposisi fase gerak 60:40 adalah 35 ppm untuk sampel A dan 41,5 ppm untuk sampel B. Konsentrasi kafein pada analisis menggunakan komposisi fase gerak 50:50 adalah 6,5 ppm untuk sampel A dan 22 ppm untuk sampel B, sedangkan konsentrasi kafein yang dianalisis menggunakan komposisi fase gerak 60:40 adalah 22 ppm untuk sampel A dan 37 ppm untuk sampel B. PENUTUP Kesimpulan Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan serta analisis data, maka diperoleh kesimpulan sebagai berikut: (1) Fase gerak yang digunakan adalah campuran methanol dan buffer asetat dengan perbandingan 50:50 dan 60:40. Komposisi fase gerak yang memiliki tingkat kepolaran lebih tinggi mampu memisahkan asam benzoat dan kafein lebih cepat, serta menghasilkan kadar asam benzoat dan kafein lebih banyak yaitu komposisi fase gerak 60:40 (2) Kadar asam benzoat pada komposisi fase gerak 50:50 sampel A 20,5 ppm dan sampel B 12 ppm, untuk komposisi fase gerak 60:40 sampel A 35 ppm dan sampel B 41,5 ppm. Kadar kafein pada komposisi fase gerak 50:50 sampel A 6,5 ppm dan sampel B 11,5 ppm, untuk komposisi fase gerak 60:40 sampel A 22 ppm dan sampel B 37 ppm. Saran Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan serta kesimpulan, maka didapatkan saran-saran berikut sebagai bahan pertimbangan untuk penelitian selanjutnya: (1) Penggunaan metode selain ekstraksi pelarut untuk pretreatment dapat digunakan dalam penelitian selanjutnya (2) Fase gerak selain methanol dan buffer asetat pH 4 dapat digunakan pada penelitian selanjutnya untuk analisis menggunakan KCKT, serta sebagai perbandingan hasil yang diperoleh pada penelitian sebelumnya.
DAFTAR RUJUKAN El-ziney, M. G. 2009. Analysis of Benzoat and Sorbate in Saudi Dairy and Food Product with Estimation of Daily Exposure. Journal of Food Technology, 7 (4): 127-134. Johnson, E., and Stenvenson, R. 1991. Dasar Kromatografi Cair. Terjemahan dari Basic Liquid Chromatography, oleh Padmawinata. Bandung: Penerbit ITB
Khopkar, S.M. 1990. Konsep Dasar Kimia Analitik. Terjemahan Saptorahardjo. Jakarta: Universitas Indonesia Press. McDevitt, V. L. 1998. Analysis of Soft Drinks: UV Spectrophotometry, Liquid Chromatography, and Capillary Electrophoresis. Journal of Chemical Education, 75 (5): 625-629. Peraturan Menteri Kesehatan Nomor 772 Tahun 1988 tentang Bahan Pengawet Makanan. 1988. Jakarta: Menteri Kesehatan. Ree, M & Stoa, E. 2011. Simultaneous Determination of Aspartame, Benzoaic Acid, Caffeine, and Saccharine in Sugar-Free Beverages using HPLC. Concordia College Journal of Analytical Chemistry, (1): 73-77. Riyadi, W. 2009. Perbedaan Spektrometri dan Spektrofotometri, (Online), (http://wahyuriyadi.blogspot.com/2008/10/perbedaan-spektrometri-dan.html), diakses 30 Desember 2012. Saad, B., Bari, Md. F., Saleh, M. I., Ahmad, K., & Talib, M. K. M. 2004. Simultaneous Determination of Preservatives (Benzoic Acid, Sorbic Acid, Methylparaben and Propylparaben) in Foodstuffs Using High-Performance Liquid Chromatography. Journal of Chromatography. 1073: 393-397. Techakriengkrai, I., & Surakarnkul, R. 2007. Analysis of Benzoic Acid and Sorbic Acid in Thai Rice Wines and Distillates by Solid-Extraction and High Performance Liquid Chromatography. Journal of Food Composition and Analysis. 20: 220225.
