Jurnal Dinamika, April 2016, halaman 74-82 ISSN 2087 - 7889
Vol. 07. No. 1
PENGENALAN ENZIM AMILASE (ALPHA-AMYLASE) DAN REAKSI ENZIMATISNYA MENGHIDROLISIS AMILOSA PATI MENJADI GLUKOSA Ariandi Program Studi Biologi, Fakultas Sains Universitas Cokroaminoto Palopo Email:
[email protected] ABSTRAK Amilase (Alpha-amylase) adalah enzim yang mengkatalisis hidrolisis dari alpha-1, 4glikosidik amilosa pati menghasilkan glukosa. Jumlah glukosa yang dihasilkan selama reaksi enzimatis diukur dengan menggunakan pereaksi dinitrosalycilic acid (DNS) pada panjang gelombang 550 nm. Semakin tinggi nilai absorbansi yang dihasilkan, semakin banyak pula gula pereduksi (glukosa) yang terkandung dalam sampel.Larutan DNS yang awalnya berwarna kuning akan bereaksi dengan gula reduksi sehingga menimbulkan warna jingga kemerahan. Kurva standar glukosa nilai persamaan y= 0,0034x + 0,1818, R²=0,9875yang berarti data tersebut termasuk teliti.Berdasarkan data absorbansi glukosa tereduksi yang dihasilkan dari hidrolisis pati oleh enzim alphaamilaseterlihat bahwa semakin lama waktu kinerja enzim amilase, semakin menurun nilai absorbansinya yang berarti kadar glukosanya semakin menurun (fluktuatif), kemungkinan kenaikan suhu menyebabkan terjadinya proses denaturasi, bagian sisi aktif enzim akan terganggu dan menyebabkan konsentrasi enzim menjadi berkurang sehingga kecepatan reaksinya pun akan menurun. Pengujian pati sisa; persamaan untuk kurva standar pati, y= 8.6x+0.021, nilai R2=0,9908, semua larutan sampel berwana kuning dan nilai absorbansinya sangat rendah (hampir mendekati nol), hal ini berarti kemungkinan hampir semua pati yang terkandung dalam larutan telah terhidrolisis oleh enzim alpha amilase menjadi glukosa. Apabila terdapat amilosa pati dalam larutan akan berpengaruh dalam pembentukan intentitas warna warna biru-hitam, hal ini disebabkan oleh adanya molekul iodium (Ion-ion triiodida) yang terikat dalam kumparan helix amilosa pati. Kata Kunci: Alpha-amylase, glukosa, amilosa pati sehingga mereka dapat digunakan oleh
PENDAHULUAN Amilase
diklasifikasikan
sebagai
tubuh. Amilase juga disintesis dalam
saccharidase (enzim yang memotong
buah
polisakarida).
menyebabkan
Amilase
merupakan
enzim pencernaan, terutama dilakukan
tanaman
selama buah
pematangan,
menjadi
lebih
manis.
oleh pankreas dan kelenjar ludah.
Enzim amilase banyak digunakan
Fungsi utama dari enzim amilase adalah
dalam industri. Hal ini digunakan
untuk memecah pati dalam makanan
dalamindustri
pembuatan
dan
fermentasi bir untuk konversi pati
Ariandi (2016)
menjadi
gula
terfermentasi.
industri
tekstil,
amilase
Pada
digunakan
oligosakarida dan monosakarida. Alphaamilase
adalah
endo-amilase.
untuk merancang tekstil, kemudian pada
Exoamylases menghidrolisis alpha 1,4-
industri deterjen, amilase tercampur
glikosidik linkage hanya dari non-
dengan enzim protease dan lipase
pereduksi ujung rantai polisakarida luar.
sebagai pencuci noda pakaian dan
Exoamylases termasuk beta-amilase dan
dalam industri makanan digunakan
glucoamylases
untuk pembuatan sirup manis, untuk
amyloglu-cosidases) (Aiyer, 2005).
(gamma-amilase,
meningkatkan konten diastase tepung,
Mekanisme kerja enzim α-amilase
untuk modifikasi makanan bayi, dan
terdiri dari dua tahap, yaitu : tahap
menghilangkan pati dalam produksi
pertama
jelly.
maltosa dan maltotriosa yang terjadi
Amilase
adalah
enzim
degadasi
amilosa
menjadi
yang
secara acak. Degadasi ini terjadi sangat
mengkatalisis hidrolisis dari alpha-1,4-
cepat dan diikuti dengan menurunnya
glikosidik
viskositas dengan cepat. Tahap kedua
polisakarida
untuk
menghasilkan dekstrin, oligosakarida,
terjadi
maltosa, dan
D-glukosa. Amilase
maltosa sebagai hasil akhir dan tidak
bisa berasal dari hewan, jamur, dan
acak. Keduanya merupakan kerja enzim
sumber
dan
α-amilase pada molekul amilosa. Pada
pancrelipase mengandung amilase yang
molekul amilopektin kerja α-amilase
berasal dari pankreas hewan, pankreas
akan menghasilkan glukosa, maltosa
biasanya babi. Amilase juga berasal dari
dan satu seri α-limit dekstrin, serta
malt barley dan jamur Aspergillus
oligosakarida yang terdiri dari empat
oryzae (Wang, 2009).
atau lebih glukosa yang mengandung
tanaman.
Pancreatin
Ada beberapa tipe amilase yang berbeda
ikatan
pembentukan
glukosa
α-1,6-glikosidik
dan
(Winarno,
Enzim ini diklasifikasikan
2010).Tujuan dari penelitian ini adalah
sesuai dengan cara memotong ikatan
untuk mengukur kadar glukosa yang
glysosidic.
Alpha-amilase
terbentuk dari reaksi enzimatis alfa
1,4-glikosidik,
alpha amilase dan mengukur kadar pati
menghidrolisis
alpha
secara acak menghasilkan dekstrin,
sisanya.
75
Pengenalan Enzim Amilase (Alpha-Amylase) dan Reaksi Enzimatisnya Menghidrolisis Amilosa Pati Menjadi Glukosa amilase
TINJAUAN PUSTAKA Ada beberapa tipe amilase yang
adalah
endo-amilase.
Exoamylases menghidrolisis alpha 1,4-
Enzim ini diklasifikasikan
glikosidik linkage hanya dari non-
sesuai dengan cara memotong ikatan
pereduksi ujung rantai polisakarida luar.
glikosidik.
Alpha-amilase
Exoamylases termasuk beta-amilase dan
1,4-glikosidik,
glucoamylases
berbeda
menghidrolisis
alpha
secara acak menghasilkan dekstrin,
(gamma-amilase,
amyloglu-cosidases) (Aiyer, 2005).
oligosakarida dan monosakarida. Alpha-
Gambar 1. Struktur kompleks pati dan Iodine. (Ophardt, Charles E. 2003. Elmhurst College; Virtual Chembook).
Enzim α-amilase memiliki gugus karboksil
dan
nitrogen
pada
diukur berdasarkan penurunan kadar
sisi
pati yang larut atau jumlah gula
aktifnya. Substrat membentuk komplek
pereduksi yang terbentuk (Judoamidjojo
adsorpsi dengan enzim dimana posisi
et al. 1992)
ikatan glukosidik dalam posisi saling berhadapan dengan gugus karboksil dan kelompok imidazol. Karboksil anion
METODE Proses
pengujian hidrolisis
pati:
menyerang bagian nukleofil C (1) dari
Mengisi setiap tabung reaksi dengan
substrat
larutan
yang
bertujuan
untuk
pati
0,05%,
kemudian
menetralkan rantai ion amidazol. Pada
menambahkan 0,5 ml larutan enzim
reaksi deglukosilasi, kelompok imidazol
alpha-amilase yang telah terencerkan
menjadi
memisahkan
1000 kali. Selanjutnya memasukkan
komponen air pada posisi C (1) (Naz,
sampel ke dalam penangas air pada
dasar
untuk
2002). Aktivitas enzim α-amilase dapat
76
Ariandi (2016)
suhu 90oC dan mengambil tabung pada
amilosa memiliki ikatan hidrogen antara
waktu 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60 menit.
atom
oksigen nomor 2 dan atom
Pengamatan gula yang terbentuk:
oksigen nomor 6 pada permukaan luar
mengambil sampel pada setiap tabung
helix dengan mengarah ke dalam cincin
sebanyak 1 ml dan menambahkan 3 ml
oksigen (Wang, 2009).
larutan
DNS,
kemudian
Ikatan alpha-1,4-D-glukosa dalam
memanaskannya selama 5 menit pada
amilosa pati akan kita lakukan reaksi
air mendidih lalu mendinginkannya.
enzimatis dengan enzim alpha amilase
Mengukur absorbansi sampel dengan
untuk mendegradasi ikatan tersebut.
spektrofotometer
panjang
Enzim alpha amilase dapat memecah
gelombang 550 nm. Membuat kurva
pati secara acak dari tengah atau bagian
standar glukosa pada konsentrasi 100,
dalam molekul pati.
pada
150, 200, 250, dan 300 ppm.
Pengamatan Glukosa yang terbentuk
Pengamatan pati sisa: mengambil sampel pada setiap tabung sebanyak 1 ml dan menambahkan 0,1 ml larutan Iod
konsentrasi
0,2%
kemudian
mengocoknya sampai homogen dan menambahkan 3 ml aqudes. Mengukur absorbansi
sampel
spektrofotometer
pada
dengan panjang
gelombang 660 nm. Membuat kurva standar pati pada konsentrasi 0,015;
Pengamatan glukosa yang terbentuk dari reaksi enzimatis alpha amilase dengan cara mengambil 1 ml cairan supernatan. Enzim alpha amilase akan bekerja dengan cara bereaksi dengan molekul substrat (pati), sehingga akan menghasilkan senyawa glukosa. Enzim amilase menghidrolisis ikatan glikosidik β-1,4, sehingga amilosa terurai menjadi glukosa (Lynd, 2002).
0,020; 0,250; dan 0,030%.
Setelah itu ditambahkan 3 ml DNS dan menginkubasinya pada suhu 100oC
HASIL DAN PEMBAHASAN Molekul amilosa sebagian besar terdiri dari rantai tunggal dengan 500 sampai 20.000 ikatan α-1,4-D-glukosa. Amilosa dapat membentuk “extended shape” cenderung berakhir menjadi kumpuran
heliks.
Heliks
tunggal
selama ±5 menit. Jumlah glukosa yang dihasilkan
selama
reaksi
enzimatis
diukur dengan menggunakan pereaksi asam
dinitro
dinitrosalycilic
salisilat acid
(DNS)
atau pada
panjang gelombang 550 nm. Semakin tinggi nilai absorbansi yang dihasilkan, 77
Pengenalan Enzim Amilase (Alpha-Amylase) dan Reaksi Enzimatisnya Menghidrolisis Amilosa Pati Menjadi Glukosa semakin banyak pula gula pereduksi (glukosa)
sampel.
yang terkandung dalam 1.4 y = 0,0034x + 0,1818 R² = 0,9875
Absorbansi
1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0
50
100
150 200 250 Konsentrasi (ppm)
300
350
Grafik 1. Kurva standar glukosa
Konsentrasi glukosa
Tabel 1. Konsentrasi Glukosa yang terbentuk dari hidrolisis pati Sampel 1 Sampel 2 Waktu (Menit) Absorbansi Konsentrasi Absorbansi Konsentrasi 0 0.786 177,706 0.803 182,706 10 0.547 107,412 0.668 143,000 20 0.524 100,647 0.638 134,176 30 0.510 96,529 0.692 150,059 40 0.463 82,706 0.638 134,176 50 0.479 87,412 0.643 135,647 60 0.433 73,882 0.648 137,118 200.000 180.000 160.000 140.000 120.000 100.000 80.000 60.000 40.000 20.000 0.000
Sampel 1 Sampel 2 0
10
20
30 40 Waktu (menit)
50
60
70
Grafik 2. Kurva konsentrasi glukosa yang terbentuk dari hidrolisis pati Berdasarkan kurva standar glukosa
= 0,0034x + 0,1818, R²=0,9875 yang
diatas terlihat bahwa nilai persamaan y
berarti data tersebut termasuk teliti. 78
Ariandi (2016)
Walaupun nilai R belum mencapai 0,99,
sehingga kecepatan reaksinya pun akan
kemungkinan hal ini disebabkan oleh
menurun
faktor teknis (keakuratan/ketelitian alat)
Metode penentuan komposisi gula
dan ketidak-telitian praktikan dalam
reduksi dalam sampel menggunakan
melakukan pengukuran, seperti dalam
pereaksi asam dinitro salisilat atau 3,5-
proses
dinitrosalicylic
pemipetan
larutan
dengan
acid
(DNS).
DNS
menggunakan pipet mikro yang tidak
merupakan senyawa aromatis yang akan
teliti.
bereaksi dengan gula reduksi maupun
Berdasarkan data absorbansi glukosa
komponen pereduksi lainnya untuk
yang terbentuk yang dihasilkan dari
membentuk
hidrolisis pati oleh enzim alpha-amilase,
acid, suatu senyawa yang mampu
data terlihat bahwa semakin lama waktu
menyerap
pemanasan
gelombang elektromagnetik pada 540
kinerja
enzim
amilase,
3-amino-5-nitrosalicylic
dengan
nm.
yang berarti kadar glukosanya semakin
pereduksi yang terdapat dalam sampel,
menurun (fluktuatif). Berdasarkan teori
maka
seharusnya semakin lama enzim bekerja
molekul 3-amino-5-nitrosalicylic acid
pada suhu tinggi yang optimal (enzim
yang terbentuk dan mengakibatkan
termofilik),
maka
reaksi
enzim
serapan
berlangsung
lebih
cepat.
Setiap
1986)
peningkatan
suhu
1
semakin
semakin
komponen
banyak
tinggi
pula
(Sazciet.al.
dapat
Reaksi dengan DNS yang terjadi
meningkatkan rata-rata reaksi lebih 10%
merupakan reaksi redoks pada gugus
sampai mencapai suhu optimal, setelah
aldehid gula dan teroksidasi menjadi
itu enzim menjadi tidak aktif (Illanes,
gugus karboksil. Sementara itu DNS
2008 dalam Heryanto, 2012). Selain itu,
sebagai
karena enzim merupakan protein, maka
membentuk
kemungkinan
dapat
nitrosalicylic acid. Reaksi ini berjalan
proses
dalam suasana basa. Bila terdapat gula
denaturasi, apabila hal tersebut terjadi,
reduksi pada sampel, maka larutan DNS
maka bagian sisi aktif enzim akan
yang awalnya berwarna kuning akan
terganggu
bereaksi dengan gula reduksi sehingga
menyebabkan
kenaikan
C
akan
banyak
radiasi
semakin menurun nilai absorbansinya,
o
Semakin
kuat
suhu
terjadinya
dan
menyebabkan
oksidator
akan
3-amino
tereduksi dan
5-
konsentrasi enzim menjadi berkurang
79
Pengenalan Enzim Amilase (Alpha-Amylase) dan Reaksi Enzimatisnya Menghidrolisis Amilosa Pati Menjadi Glukosa menimbulkan warna jingga kemerahan
I153-).
(Sastrohamidjojo, 2005)
dapatmengikat sekitar dua atom iodium
Setiap lingkaran helix amilosa
dan warna biru dihasilkan karena
Pengamatan Pati Sisa
adanya interaksi donor-akseptor antara Amilosa patiberbentuk helix tunggal memiliki
bentuk
siklodekstrin
mirip
dengan
dengan memiliki
permukaan bagian dalam yang relatif hidrofobik
yang
dapat
berikatan
molekul dengan air, yang relatif mudah hilang
akan
hidrofobik
digantikan
atau
molekul
oleh
lipid
aromatik
(Aiyer, 2005).
air dan polyiodides yang kekurangan elektron (Ophardt, 2003). Pengujian pati dengan melakukan penambahan Iodium-reagen KI pada larutan pati. Jika amilosa pati terdapat dalam larutan, maka akan menghasilkan warna biru-hitam. Jika amilosa pati tidak hadir, maka warna akan tetap oranye atau kuning. Untuk Amilopektin
Karakteristik ini dapat mengikatkan rantai amilosa dengan molekul Iodium (misalnya, polyiodides, rantai I3- dan I5dan membentuk struktur seperti I93-dan
pati, selulosa, ataupun disakarida seperti sukrosa yang terdapat dalam larutan tidak akan memberikan efek warna.
0.3
Absorbansi
0.25 0.2 y = 8.6x + 0.021 R² = 0.9908
0.15 0.1 0.05 0 0
0.005
0.01
0.015 0.02 Konsentrasi (%)
0.025
0.03
0.035
Grafik 3. Kurva standar pati Berdasarkan data yang didapatkan,
dan nilai absorbansinya sangat rendah
nilai kurva standar pati R2=0,9908, nilai
mendekati nol, hal ini berarti hampir semua
tersebut termasuk teliti, dengan nilai
pati yang terkandung dalam larutan telah
persamaan y=8.6x + 0.021.Berdasarkan
terhidrolisis oleh enzim alpha amilase
data, semua larutan sampel berwana kuning
menjadi glukosa. Hal ini kemungkinan
80
Ariandi (2016)
disebabkan setelah sampel didinginkan,
kemungkinan hampir semua pati yang
enzim
terkandung dalam larutan telah terhidrolisis
alpha amilase
tetap bekerja
menghidrolisis pati, seharusnya setelah
oleh enzim alpha amilase menjadi glukosa.
sampel diangkat dari suhu panas, sampel
Saran
untuk
penelitian
langsung ditambahkan dengan larutan Iod
melakukan
untuk menghentikan reaksi enzimatis dari
amylase meliputi pH, suhu, konsentrasi
alpha amilase.
enzim, lama inkubasi enzim (perlakuan
karakterisasi
berikutnya
enzim
alpha
Apabila terdapat amilosa pati dalam
panas), dan penambahan inhibitor yang
larutan sampel, maka akan berpengaruh
berpengaruh terhadap aktivitas enzim alpha
dalam pembentukan warna biru tua, hal ini
amylase.
disebabkan oleh adanya molekul iodium yang terikat dalam kumparan helix amilosa pati.
DAFTAR PUSTAKA Aiyer,
Iodine dalam reagen KI sangat tidak larut dalam air, sehingga reagen iodium dibuat dengan melarutkan iodium dalam
Prasanna
V.
2005.
Review:
Amylases and Their Applications. African Journal of Biotechnology Vol. 4 (13), pp. 1525-1529.
larutan kalium iodida. Hal ini membuat larutan ion kompleks triiodida linier. Ion
Heryanto, Tri E. 2012. Penentuan Aktivitas
ion triiodida terikat ke dalam kumparan
Amilase
helix dari pati menyebabkan
subtilis Isolat Gunung Darajat Garut,
intensitas
Kasar
Termofil
Bacillus
warna biru-hitam (Zhizhuanget.al, 2006).
Jawa Barat. Universitas Pendidikan
KESIMPULAN
Indonesia. Repository. upi.ac.id.
Glukosa tereduksi yang dihasilkan dari hidrolisis pati oleh enzim alpha-amilase terlihat bahwa semakin lama waktu kinerja enzim amilase, semakin menurun nilai absorbansinya
yang
berarti
kadar
glukosanya semakin menurun (fluktuatif), Pengukuran pati sisa menunjukkan semua larutan sampel berwana kuning dan nilai absorbansinya mendekati
sangat nol),
rendah
hal
ini
(hampir berarti
Lynd L.R. Weimer PJ. Van Zyl WH. Pretorius IS. 2002. Microbial Amylase utilization:
fundamentals
and
biotechnology. Microbiol Mol Biol Rev 2002;66:506–77.
Ophardt, Charles E. 2003. Carbohydrate MiniTopics;
Starch-Iodine.
Virtual
Chembook. Elmhurst College..
81
Pengenalan Enzim Amilase (Alpha-Amylase) dan Reaksi Enzimatisnya Menghidrolisis Amilosa Pati Menjadi Glukosa Sastrohamidjojo, Hardjono. 2005. Kimia Organic,
Sterokimia,
Lemak,
dan
Protein. Yogyakarta :Gadjah Mada University Press.
Sazci A. Radforda A. & Erenler K. 1986. Detection of Cellulolytic Fungi by Using Congo red as an Indicator: a Comparative
Study
Dinitrosalicyclic Method.
Journal
with
Acid of
The
Reagent Applied
Bacteriology 61. 559-562.
Wang, Nam Sun. 2009. Experiment no. 5: Starch
Hydrolysis
Department
of
by
Amylase.
Chemical
&
Biomolecular Engineering. University of Maryland
Zhizhuang X, Reginald S, Adrian T. 2006. A Quantitative Starch–Iodine Method for Measuring Alpha-Amylase And Glucoamylase Activities. Analytical biochemistry Volume 351, Issue 1, 1 April 2006, Pages 146–148.
82
