AKTIVITAS ANTIOKSIDAN EKSTRAK BUAH DAN DAUN MENGKUDU
ANNISA MULYANINGRUM UTAMI
DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2010
ABSTRAK ANNISA MULYANINGRUM UTAMI. Aktivitas Antioksidan Ekstrak Buah dan Daun Mengkudu. Dibimbing oleh ELLY SURADIKUSUMAH dan ZULHAN ARIF. Bagian buah dan daun mengkudu (Morinda citrifolia) memiliki kemampuan sebagai antioksidan alami. Penelitian ini bertujuan menentukan aktivitas antioksidan, total fenol, dan golongan senyawa antioksidan dari fraksi ekstrak daun dan buah mengkudu. Ekstrak etil asetat buah dan daun mengkudu difraksionasi menggunakan kromatografi kolom menghasilkan 4 dan 7 fraksi berdasarkan profil kromatografi lapis tipis (KLT) yang sama. Aktivitas antioksidan dari fraksi-fraksi ekstrak ditentukan menggunakan metode 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH) dan kandungan fenol totalnya diukur menggunakan metode Folin-Cioacalteau. Fraksi 1 (IC50 38.18 ppm) dari 4 fraksi ekstrak buah dan fraksi 5 (IC50 85.86 ppm) dari 7 fraksi ekstrak daun menunjukkan aktivitas antioksidan tertinggi, tetapi lebih rendah daripada vitamin C (IC 50 3.85 ppm). Kandungan fenol total sebesar 0.40 mg ekuivalen asam galat/g serbuk buah kering dan 1.15 mg ekuivalen asam galat/g serbuk daun kering. Berdasarkan hasil uji fitokimia, diduga senyawa alkaloid dan flavonoid berperan sebagai antioksidan di dalam buah dan daun, serta senyawa selain fenol berperan sebagai antioksidan di dalam buah.
ABSTRACT ANNISA MULYANINGRUM UTAMI. Antioxidant Activity of Noni`s Fruit and Leaf Extract. Supervised by ELLY SURADIKUSUMAH and ZULHAN ARIF. Different parts of noni (Morinda citrifolia) plant including fruit and leaf exhibited antioxidant activity. This study was conducted to investigate the antioxidant activity, total phenol, and antioxidant compound group of Noni`s leaf and fruit extracts fractions. This fruit and leaf ethyl acetate extracts were fractionated by column chromatography, yielded 4 and 7 fractions based on the identical thin layer chromatography (TLC) profile. Antioxidant activities of extracts fractions were determined by radical scavenging assay using 2,2-diphenyl-1- picrylhydrazyl (DPPH) radical and the total phenolic contents were measured using Folin-Ciocalteau method. Fraction 1 (IC50 38.18 ppm) of 4 fruit extract fractions and fraction 5 (IC50 85.86 ppm) of 7 leaf extract fractions revealed the highest antioxidant activity, though lower than vitamin C (IC 50 3.85 ppm). The total phenolic contents varied from 0.40 mg of gallic acid equivalent/gram dry fruit and 1.15 mg of gallic acid equivalent/gram dry leaf. The result of phytochemical analysis confirmed the responsible antioxidant compounds present in fruit and leaf were considered as alkaloid and flavonoid. In addition, nonphenol compounds had a role as antioxidant acitivity in fruit.
AKTIVITAS ANTIOKSIDAN EKSTRAK BUAH DAN DAUN MENGKUDU
ANNISA MULYANINGRUM UTAMI
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Kimia
DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2010
Judul : Aktivitas Antioksidan Ekstrak Buah dan Daun Mengkudu Nama : Annisa Mulyaningrum Utami NIM : G44050304
Menyetujui Pembimbing I,
Pembimbing II,
Ir. Elly Suradikusumah, MS NIP 19450214 197010 2 001
Zulhan Arif, SSi
Mengetahui Ketua Departemen,
Prof. Dr. Ir. Tun Tedja Irawadi, MS NIP 19501227 197603 2 002
Tanggal Lulus :
PRAKATA Segala puji bagi Allah SWT yang telah melimpahkan segala rahmat-Nya, sehingga penulis mampu menyelesaikan karya ilmiah yang dilaksanakan sejak bulan Juni hingga Oktober 2009 di Laboratorium Kimia Analitik dan Pusat Studi Biofarmaka. Tema yang dipilih adalah antioksidan, dengan judul “Aktivitas Antioksidan Ekstrak Buah dan Daun Mengkudu” Selama penelitian sampai penulisan karya ilmiah ini, penulis mendapatkan banyak bimbingan dan dorongan dari berbagai pihak. Oleh karena itu, penulis mengucapkan terima kasih kepada Ibu Ir Elly Suradikusumah, MS. dan Bapak Zulhan Arif, SSi. selaku pembimbing penelitian ini. Ucapan terima kasih tak terhingga kepada ayah, ibu, dan adik-adik atas doa-doa, nasihat, semangat, dan bantuan materi. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada seluruh staf laboratorium Kimia Analitik (Pak Eman, Bu Nunung, Pak Dede, Pak Kosasih, Pak Ridwan) dan Pusat Studi Biofarmaka, serta teman-teman angkatan 42 yang selalu memberikan dorongan dan doa (Ida, Ufa, Malia, Siti, Rhenny, Ecep, Ois, Mbak Janti, Eem). Terima kasih atas bantuan dan semangat yang diberikan, semoga mendapat balasan pahala dari Allah SWT. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat. Bogor, Januari 2010 Annisa Mulyaningrum Utami
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Boyolali pada tanggal 29 Januari 1987 dari pasangan H. Sutarno dan Hj. Darmani. Penulis merupakan anak pertama dari lima bersaudara. Tahun 2005 penulis lulus dari SMA Bhinneka Karya 2 Boyolali dan pada tahun yang sama lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI). Penulis memilih Program Studi Kimia, Departemen Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, IPB. Selama mengikuti perkuliahan, penulis aktif mengikuti organisasi kemahasiswaan atau Himpunan Profesi Kimia/Imasika menjadi staf Departemen Keilmuan. Penulis menjadi asisten praktikum Kimia Fisik Layanan pada tahun ajaran 2007/2008; Kimia Analitik Layanan 2008/2009; Kimia Analitik 2 2008/2009; Kimia Tingkat Persiapan Bersama (TPB) 2008/2009; dan Analisis Komponen Aktif dan Uji aktivitas Diploma 2009/2010. Pada bulan Juli-Agustus 2008, penulis berkesempatan melaksanakan kegiatan praktik lapangan di PT Jakarana Tama di bagian Quality Control.
DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL ................................................................................................... viii DAFTAR GAMBAR .............................................................................................. viii DAFTAR LAMPIRAN ........................................................................................... ix PENDAHULUAN ..................................................................................................
1
TINJAUAN PUSTAKA Mengkudu .................................................................................................... Antioksidan .................................................................................................. Mekanisme Kerja Antioksidan ...................................................................... 2,2’-Difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH) ............................................................. Analisis Kuantitatif Total Fenol .................................................................... Ekstraksi dan Fraksionasi Senyawa Metabolit Sekunder ...............................
1 2 2 3 3 3
BAHAN DAN METODE Lingkup Kerja ............................................................................................ Alat dan Bahan ...........................................................................................
4 4
HASIL DAN PEMBAHASAN Kadar Air ................................................................................................... 6 Ekstrak ....................................................................................................... 6 Ekstrak Teraktif .......................................................................................... 7 Fraksi ......................................................................................................... 7 Kandungan Fitokimia ................................................................................. 8 Aktivitas Antioksidan ................................................................................. 8 Kandungan Fenol Total .............................................................................. 10 SIMPULAN DAN SARAN Simpulan ................................................................................................... 11 Saran .......................................................................................................... 11 DAFTAR PUSTAKA ............................................................................................. 11 LAMPIRAN ........................................................................................................... 13
DAFTAR TABEL Halaman 1 Uji fitokimia buah mengkudu ...............................................................................
8
2 Uji fitokimia daun mengkudu ...............................................................................
8
DAFTAR GAMBAR Halaman 1 Mengkudu ...........................................................................................................
1
2 Reaksi DPPH dan antioksidan .............................................................................
3
3 Fraksionasi dengan kromatografi kolom. ............................................................
4
4 Kromatografi lapis tipis (KLT) ............................................................................
4
5 Profil KLT bioautografi dengan larutan DPPH 1 mM dari berbagai ekstrak .........
7
6 Profil KLT eluen terbaik ......................................................................................
7
7 Profil KLT bioautografi dengan larutan DPPH 1 mM dari fraksi ekstrak etil asetat mengkudu ...............................................................................
8
8 Nilai IC50 fraksi teraktif .......................................................................................
9
9 Reaksi antara flavonoid dan DPPH ......................................................................
9
10 Reaksi antara asam askorbat dan DPPH ............................................................... 10 11 Kandungan fenol total fraksi teraktif .................................................................... 10 12 Hubungan antara IC50 dan kandungan fenol total. ................................................ 11
DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1 Diagram alir penelitian ....................................................................................... 14 2 Diagram alir uji fitokimia ................................................................................... 15 3 Penetapan kadar air buah dan daun mengkudu ................................................... 16 4 Penentuan rendemen ekstrak kasar buah dan daun mengkudu.............................. 17 5 Penentuan eluen terbaik menggunakan kromatografi lapis tipis ........................... 17 6 Hasil fraksionasi dan profil KLT hasil fraksionasi ekstrak etil asetat buah mengkudu dengan eluen heksana:etil asetat (2:1) ...............................................
18
7 Hasil fraksionasi dan profil KLT hasil fraksionasi ekstrak etil asetat daun mengkudu dengan eluen heksana:etil asetat (2:1) ...............................................
19
8 Penentuan panjang gelombang maksimum larutan DPPH 0.05 mM ....... ……….. 22 9 Penentuan aktivitas antioksidan fraksi teraktif ekstrak buah mengkudu………… 23 10 Penentuan aktivitas antioksidan fraksi teraktif ekstrak daun mengkudu ............... 24 11 Penentuan aktivitas antioksidan vitamin C .......................................................... 25 12 Penentuan panjang gelombang maksimum larutan asam galat 100 ppm ............... 26 13 Penentuan kandungan fenol total dari fraksi teraktif ekstrak buah dan daun mengkudu .......................................................................................................... 27
PENDAHULUAN Antioksidan merupakan senyawa yang mampu memperlambat, menghambat, atau mencegah oksidasi lemak atau molekul lain. Berdasarkan asalnya, terdapat dua macam antioksidan, yaitu antioksidan alami dan antioksidan sintetik. Tubuh manusia tidak mempunyai cadangan antioksidan dalam jumlah berlebih, sehingga jika terdapat radikal berlebih maka tubuh membutuhkan antioksidan eksogen. Adanya kekhawatiran akan kemungkinan efek samping yang belum diketahui dari antioksidan sintetik menyebabkan antioksidan alami menjadi alternatif yang sangat dibutuhkan (Javanmardi et al. 2003). Antioksidan alami mampu melindungi tubuh terhadap kerusakan yang disebabkan spesies oksigen reaktif, mampu menghambat terjadinya penyakit degeneratif serta mampu menghambat peroksida lipid pada makanan. Meningkatnya minat untuk mendapatkan antioksidan alami terjadi beberapa tahun terakhir ini. Mengkudu (Morinda citrifolia) merupakan salah satu tanaman obat yang dapat digunakan untuk pengobatan berbagai macam penyakit di antaranya kanker, infeksi, artritis, diabetes, asma, hipertensi, dan luka (Wang et al. 2002). Zin et al. (2002) menyatakan bahwa bagian buah dan daun mengkudu memiliki kemampuan sebagai antioksidan alami. Aktivitas antioksidan memiliki hubungan yang linier positif dengan kandungan fenol di dalam ekstrak buah mengkudu (Rohman et al. 2006). Senyawaan fenol terutama asam fenolat dan flavonoid merupakan antioksidan alami di dalam buah, sayur, dan tanaman lain (Kahkonen et al. 1999). Pada penelitian ini melakukan penentuan fraksi teraktif ekstrak buah dan daun mengkudu melalui pengujian terhadap radikal bebas DPPH, kemudian menentukan kandungan fenol total, aktivitas antioksidan, dan identifikasi golongan senyawa antioksidannya melalui uji fitokimia. Penentuan aktivitas antioksidan dari fraksi ekstrak mengkudu pada penelitian ini adalah metode DPPH. Metode ini merupakan metode analisis antioksidan berdasarkan penangkapan radikal bebas dengan DPPH sebagai radikal bebasnya serta salah satu metode spektrofotometrik yang mudah dan banyak digunakan untuk penentuan aktivitas antioksidan Metode analisis senyawa metabolit sekunder dilakukan dengan pemisahan kromatografi kolom. Ekstrak difraksionasi dan diuji aktivitas antioksidannya, dan fraksi yang paling aktif dianalisis kandungan fenol totalnya de-
ngan metode Folin-Ciocalteau. Secara ringkas, penelitian ini bertujuan untuk menentukan aktivitas antioksidan dan kandungan fenol total fraksi ekstrak etil asetat buah dan daun mengkudu, serta menentukan golongan senyawa antioksidannya.
TINJAUAN PUSTAKA Mengkudu Mengkudu (Morinda citrifolia) merupakan tanaman liar yang memiliki tinggi 2–6 meter. Daunnya tebal, lebar, dan berbentuk lonjong mengkilat. Daun mengkudu yang besar memiliki lebar 15–30 cm dan panjang 20–40 cm. Buah mengkudu bervariasi ukurannya, yaitu lebar mulai dari 3 sampai 10 cm dan kadang ada yang panjang mencapai 20 cm (Gambar 1). Permukaan buah seperti terbagi dalam sel-sel poligonal (segi banyak) yang berbintik-bintik dan berkutil. Mula-mula buah berwarna hijau, menjelang masak menjadi putih kekuningan. Setelah matang, warnanya putih transparan dan lunak. Setelah lunak, daging buah mengkudu banyak mengandung air dan aromanya seperti keju busuk disebabkan adanya asam butirat yang muncul setelah buah matang (McClatchey 2002).
(a) (b) Gambar 1 Morinda citrifolia a) Buah, b) Daun. Mengkudu diklasifikasikan ke dalam kingdom Plantae, divisi Spermatophyta, subdivisi Angiospermae, kelas Dicotyledonae, ordo Gentianales, famili Rubiceae, genus Morinda, dan spesies Morinda citrifolia Roxb. Nama lain mengkudu adalah pace (Jawa Tengah dan Jawa Timur), cangkudu (Jawa Barat), sedangkan di Sumatra mengkudu diberi nama eodu, kumudee, lengkudu, bangkudu. Mengkudu dikenal di berbagai negara dengan nama yang berbeda seperti Indian mulberry (India), nono (Tahiti dan Rara tonga), polynesian bush fruit, painkiller tree (Kepulauan Karibia), lada (Guam), mengkudo (Malaysia), nhau (Asia Tenggara),
grand morinda (Vietnam), cheesefruit (Australia), kura (Fiji), dan bumbo (Afrika) (Elkins 1998). Antioksidan alami merupakan metabolit sekunder dalam tanaman. Kandungan senyawa antioksidan dari buah dan daun mengkudu di antaranya β-karoten, terpenoid, asam askorbat, alkaloid, β-sitosterol, polifenol seperti flavonoid, flavon glikosida, dan asam hidroksi fenolat (Wang et al. 2002). Hasil analisis aktivitas antioksidan ekstrak kasar etil asetat buah dan daun mengkudu dengan metode ferric thiocyanate (FTC) dan thiobarbituric acid (TBA) menunjukkan bahwa ekstrak buah dan daun mengkudu memiliki aktivitas antioksidan (Zin et al. 2002). Antioksidan Antioksidan merupakan inhibitor penting terhadap peroksidasi lemak, yaitu sebagai pelindung makanan dan pertahanan sel makhluk hidup melawan kerusakan oksidatif (Vimala & Adenan 1999). Antioksidan dalam tubuh bermanfaat untuk mencegah reaksi oksidasi yang ditimbulkan oleh radikal bebas baik berasal dari metabolisme tubuh maupun faktor eksternal lainnya. Radikal bebas adalah atom atau molekul yang tidak stabil dan sangat reaktif karena mengandung satu atau lebih elektron tidak berpasangan pada orbital terluarnya. Radikal bebas akan bereaksi dengan molekul di sekitarnya untuk memperoleh pasangan elektron supaya mencapai kestabilan atom atau molekul. Reaksi ini akan berlangsung terus menerus dalam tubuh dan bila tidak dihentikan akan menimbulkan berbagai penyakit seperti kanker, jantung, katarak, penuaan dini, serta penyakit degeneratif lainnya. Oleh karena itu tubuh memerlukan suatu substansi penting, yaitu antioksidan yang mampu menangkap radikal bebas tersebut sehingga tidak dapat menginduksi suatu penyakit (Kikuzaki & Nakatani 1993). Beberapa sumber utama antioksidan di antaranya enzim, molekul besar (albumin, seruloplasmin, feritin), molekul kecil (asam askorbat, asam urat, tokoferol, karotenoid, fenol), dan beberapa hormon seperti estrogen dan lain-lain (Prior et al. 2005). Mekanisme Kerja Antioksidan Mekanisme kerja antioksidan secara umum menghambat oksidasi substrat yang terjadi dalam tiga tahap utama, yaitu iniasi, propagasi, dan terminasi. Tahap inisiasi terjadi
pembentukan radikal substrat, yaitu turunan substrat yang bersifat tidak stabil dan sangat reaktif akibat hilangnya satu atom H. Radikal substrat akan bereaksi dengan oksigen membentuk radikal peroksi pada tahap propagasi. Radikal peroksi lebih lanjut akan menyerang substrat menghasilkan hidroperoksida dan radikal substrat baru (Javanmardi et al. 2003). Reaksi inisiasi RH Reaksi propagasi R● + O2 ROO● + RH Reaksi Terminasi ROO● + ROO● ROO● + R●
R● + H● ROO● ROOH + R● ROOR + O2 ROOR
Antioksidan mampu mendeaktivasi radikal melalui dua mekanisme utama, yaitu perpindahan atom hidrogen (PAH) dan perpindahan elektron bebas (PEB). Hasil akhir dari kedua mekanisme adalah sama tetapi kinetika dan potensial reaksinya berbeda. Reaksi PEB dan PAH mungkin terjadi secara paralel. Mekanisme yang mendominasi dalam sistem ditentukan oleh struktur dan sifat antioksidan, kelarutan dan koefisien partisi pelarut. Metode PAH mengukur kemampuan dari antioksidan dalam menstabilkan radikal bebas dengan memberikan atom hidrogennya (AH). Kapasitas pengukuran berdasarkan pada kinetikanya. Reaksi PAH tidak bergantung pada pelarut dan pH, biasanya berlangsung dengan cepat yaitu hanya beberapa detik atau menit. X● + AH
XH + A●
Metode PEB mengukur kemampuan dari antioksidan melalui proses perpindahan satu elektron untuk mereduksi berbagai senyawa seperti logam, karbonil, dan radikal (Prior et al. 2005). (1) X●+ AH -H2O (2) AH●+ − + (3) X + H3O +H2O (4) M(III) + AH
X− + AH●+ A● + H3O+ XH + H2O AH+ + M(II)
Reaksi (1), (2), (3) merupakan reaksi reduksi senyawa radikal dan karbonil, sedangkan reaksi (4) merupakan reaksi reduksi senyawa logam. Reaktivitas relatif metode ini berdasarkan pada deprotonasi dari gugus fungsional yang reaktif. Secara umum, meningkatnya kapasitas donor elektron
melalui deprotonasi menyebabkan meningkatnya pH, sehingga reaksi bergantung pada pH. Reaksi PAH umumnya lambat sehingga kapasitas antioksidannya tidak berdasarkan kinetika, tetapi pada persen penurunan produk reaksi. 2,2’-Difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH) Metode penentuan aktivitas antioksidan terdiri atas asam 2-tiobarbiturat (TBA), kemampuan mereduksi ion feri (FRAP), 2,2’Difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH), kapasitas mereduksi kupri (CUPRAC), 2,2’-Azinobis(3etil-benzotiazolin-6-asam sulfonat) (ABTS), dan kapasitas absorbansi radikal oksigen (ORAC) (Michalowska et al. 2007). Metode DPPH merupakan metode yang sering digunakan untuk penentuan aktivitas antioksidan. DPPH merupakan radikal bebas yang stabil dalam larutan berair atau metanol dan memiliki warna ungu yang ditunjukkan oleh pita absorpsi dalam pelarut metanol pada panjang gelombang sekitar 515-520 nm. DPPH bersifat peka terhadap cahaya, oksigen, dan pH. Namun, DPPH bersifat stabil dalam bentuk radikal sehingga mungkin dilakukan pengukuran aktivitas antioksidan yang cukup akurat. Metode DPPH hanya mampu mengukur aktivitas antioksidan yang mekanime kerjanya PAH. Radikal bebas DPPH dapat menangkap atom hidrogen dari komponen aktif ekstrak yang dicampurkan, kemudian bereaksi menjadi bentuk tereduksinya dan ditandai dengan berkurangnya intensitas warna ungu larutan DPPH (Gambar 2).
(a) (b) Gambar 2 Reaksi DPPH dan antioksidan, (a) DPPH bentuk radikal, (b) DPPH bentuk nonradikal (Molyneux 2004). Berdasarkan reaksi tersebut, senyawa antioksidan (RH) melepas atom hidrogen menjadi radikal senyawa antioksidan (R●). DPPH yang merupakan radikal bebas direaksikan dengan senyawa antioksidan dan membentuk DPPH yang nonradikal (DPPHn) (Molyneux 2004). Pengujian keberadaan senyawa antioksidan dalam bahan dapat dilakukan menggunakan metode kromatografi lapis tipis (KLT)
bioautografi, yaitu menggabungkan KLT dan bioassay. Metode ini cepat dan melokalisasi senyawa aktif dari ekstrak. Ekstrak dipisahkan secara kromatografi menggunakan eluen terbaik, kemudian plat diuji dengan pereaksi DPPH. Warna noda yang pucat menunjukkan adanya senyawa antioksidan (Hostettman et al. 1997). Kuantitatif Total Fenol Kadar fenol total dapat ditentukan dengan pereaksi Folin-Ciocalteau. Pereaksi ini biasanya digunakan pada metode Lowry untuk menentukan konsentrasi protein. Pereaksi Folin tidak memiliki gugus fenol, tetapi bersifat sensitif untuk mengoksidasi senyawasenyawa fenol. Reaksi antara pereaksi Folin dan senyawa fenol menghasilkan senyawa kompleks warna biru, sehingga dapat diukur serapannya dengan spektrofotometer Ultraviolet-Tampak (UV-tampak) pada panjang gelombang 750 nm (Rohman et al. 2006). Ekstraksi dan Fraksionasi Senyawa Metabolit Sekunder dari Tumbuhan Ekstraksi merupakan suatu proses yang secara selektif mengambil zat terlarut yang terkandung dalam suatu campuran dengan bantuan pelarut. Metode pemisahan pada ekstraksi pelarut menggunakan prinsip kelarutan like dissolve like, yaitu pelarut polar akan melarutkan zat polar dan sebaliknya. Hal-hal yang perlu dipertimbangkan dalam pemilihan pelarut adalah selektivitas, sifat racun, dan kemudahannya untuk diuapkan (Khopkar 2002). Salah satu prosedur klasik untuk memperoleh kandungan senyawa organik dari jaringan tumbuhan ialah maserasi. Metode maserasi digunakan untuk mengekstraksi contoh yang relatif tidak tahan panas. Metode ini dilakukan hanya dengan merendam contoh dalam suatu pelarut dengan lama waktu tertentu, biasanya selama 24 jam tanpa menggunakan pemanasan. Kelebihan metode maserasi, yaitu sederhana, tidak memerlukan alatalat yang rumit, relatif murah, serta dapat menghindari kerusakan komponen senyawa yang tidak tahan panas. Kelemahannya di antaranya dari segi waktu yang lama dan penggunaan pelarut yang tidak efisien. Pemilihan pelarut untuk proses maserasi akan memberikan efektivitas yang tinggi dengan memperhatikan kelarutan senyawa bahan alam pada pelarut tersebut (Rohman et al. 2006).
Fraksionasi adalah proses pemisahan komponen dalam suatu ekstrak menjadi kelompokkelompok senyawa yang memiliki kemiripan karakteristik secara kimia (Houghton & Raman 1998). Teknik fraksionasi dapat dilakukan dengan kromatografi kolom, yaitu teknik analisis untuk menentukan jumlah komponen dalam suatu campuran senyawa, dan juga untuk memisahkan dan memurnikan komponen senyawa tertentu dari campurannya. Pemisahan kromatografi kolom ini menggunakan suatu pelarut pengelusi yang dialirkan secara kontinu melalui kolom dan komponen demi komponen dari campuran pada akhirnya keluar dari kolom kemudian dapat dikumpulkan dan difraksionasi (Gambar 3) (Rouessac & Rouessac 1994).
Gambar 3 Fraksionasi dengan kromatografi kolom (a) bahan yang dibutuhkan (C, kolom; SP, fase stasioner; MP, fase mobil; dan S, contoh); (b) contoh dimasukkan; (c) proses elusi dimulai; (d) hasil separasi diperoleh; (Rouessac & Rouessac 1994). Kromatografi lapis tipis merupakan jenis kromatografi partisi menggunakan sebuah lapis tipis silika atau alumina yang seragam pada sebuah lempeng gelas atau logam yang keras. Fase diam untuk kromatografi lapis tipis seringkali juga mengandung substansi yang dapat berpendar dalam sinar ultraviolet. Fase gerak merupakan pelarut atau campuran pelarut yang sesuai (Furniss et al. 1989). Pergerakan zat relatif terhadap garis depan pelarut dalam sistem kromatografi tertentu dapat didefinisikan sebagai nilai Rf, yaitu perbandingan jarak tempuh zat dengan jarak tempuh garis depan pelarut (Gambar 4).
(a)
(b)
Gambar 4 Kromatografi lapis tipis, (a) chamber, tempat pengembangan pelat KLT; (b) plat KLT dalam penentuan Rf (Furniss et al. 1989).
BAHAN DAN METODE Lingkup Kerja Secara garis besar metode penelitian ini dilakukan dalam dua tahap. Tahap pertama adalah ekstraksi maserasi buah dan daun mengkudu dengan metanol lalu ekstraksi caircair dengan etil asetat. Tahap kedua, yaitu melakukan fraksionasi terhadap ekstrak kasar etil asetat buah dan daun, menentukan aktivitas antioksidan dan kandungan fenol total terhadap fraksi teraktif dari ekstrak. Bagan alir penelitian dapat dilihat pada Lampiran 1. Alat dan Bahan Alat-alat yang digunakan adalah spektrofotometer UV-tampak (Shimadzu PharmaSpeck UV-1700). Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah contoh buah dan daun mengkudu dari perkebunan Pusat Studi Biofarmaka, DPPH dari Sigma, plat KLT SiO2 60 F254 dan silika gel G60 F254 dari Merck. Penentuan Kadar Air (AOAC 2006) Cawan porselin dikeringkan pada suhu 105 ºC selama 30 menit lalu didinginkan dalam eksikator dan ditimbang. Sebanyak 3 g contoh buah dan daun mengkudu masingmasingnya dimasukkan dalam cawan dan dipanaskan pada suhu 105 ºC selama 3 jam sampai diperoleh bobot konstan, kemudian didinginkan dalam eksikator dan ditimbang. Penetapan kadar air ini dilakukan berdasarkan penentuan jumlah bobot kering contoh. A B 100 % Kadar air (%) = A keterangan: A adalah bobot contoh (g) B adalah bobot bahan setelah dikeringkan (g) Ekstraksi Buah dan Daun Mengkudu (Zin et al. 2002) Serbuk buah dan daun mengkudu dibebaskan dari lemak dengan menggunakan heksana. Sebanyak 150 gram serbuk kering buah dan daun mengkudu masing-masingnya dimasukkan ke dalam labu erlemeyer, ditambah 300 mL heksana, dan direndam selama 12 jam. Residu dikeringkan pada suhu kamar selama 24 jam, selanjutnya diekstraksi dengan metanol. Residu ditambah 600 mL metanol dan direndam selama enam jam sambil sekalikali diaduk, kemudian didiamkan selama 24
jam. Maserat dipisahkan dan proses diulang 2 kali dengan jenis dan jumlah pelarut yang sama. Semua maserat dikumpulkan dan diuapkan dengan penguap putar tekanan rendah hingga diperoleh ekstrak metanol yang volumenya 1/10 volume awal. Ekstrak metanol diekstraksi cair-cair sebanyak tiga kali dengan etil asetat dengan perbandingan volume 1:1. Fraksi yang larut dalam etil asetat dikumpulkan, kemudian diuapkan dengan penguap putar tekanan rendah dan dikeringbekukan, serta dilanjutkan dengan uji berikutnya. Uji Fitokimia (Harborne 1987) Uji Flavonoid. Sebanyak 0.1 gram ekstrak etil asetat buah dan daun mengkudu ditambahkan 10 mL air panas kemudian dididihkan selama 5 menit dan disaring. Sebanyak 10 mL filtrat ditambahkan 0.5 gram serbuk Mg, 1 mL HCl pekat, dan 1 mL amil alkohol. Campuran dikocok kuat-kuat. Uji positif ditandai dengan munculnya warna merah, kuning, atau jingga pada lapisan amil alkohol. Uji Triterpenoid dan Steroid. Sebanyak 0.1 gram ekstrak etil asetat buah dan daun mengkudu dilarutkan dengan 25 mL etanol (50 ºC), disaring dan residu ditambahkan eter. Filtrat ditambahkan 3 tetes asam asetat anhidrat dan 1 tetes asam sulfat pekat secara berurutan. Larutan dikocok perlahan dan dibiarkan beberapa menit. Uji positif ditandai dengan terbentuknya warna merah atau ungu untuk triterpenoid serta hijau atau biru untuk steroid. Uji Alkaloid. Sebanyak 0.1 gram ekstrak etil asetat buah dan daun mengkudu dilarutkan dengan 10 mL kloroform dan beberapa tetes NH4OH dan disaring ke dalam tabung reaksi tertutup. Ekstrak kloroform dalam tabung reaksi dikocok dengan penambahan 10 tetes H2SO4 2 M kemudian lapisan asamnya dipindahkan ke dalam tabung reaksi yang lain. Lapisan asam ini diteteskan pada pelat tetes dan ditambahkan pereaksi Meyer, Wagner, dan Dragendorf yang akan menimbulkan endapan warna berturut-turut putih, cokelat, dan merah jingga. Uji Saponin. Sebanyak 0.1 gram ekstrak etil asetat buah dan daun mengkudu ditambahkan ke dalam 10 mL air panas dan dididihkan selama 5 menit lalu disaring. Filtrat dikocok dalam tabung reaksi tertutup selama 10 detik untuk kemudian dibiarkan 10 menit. Adanya saponin ditunjukkan dengan terbentuknya buih stabil.
Uji Tanin. Sebanyak 0.1 gram ekstrak etil asetat buah dan daun mengkudu ditambahkan ke dalam 10 mL air panas dan dididihkan selama 5 menit lalu disaring. Filtrat ditambahkan 10 mL FeCl3 1%. Uji positif ditandai munculnya warna hijau kehitaman. Bagan alir uji fitokimia dapat dilihat pada Lampiran 2. Pemilihan Eluen Terbaik Pelarut atau fase gerak yang akan digunakan untuk fraksionasi ekstrak buah dan daun mengkudu dipilih pelarut terbaik yang dihasilkan dari kromatografi lapis tipis, yaitu heksana:etil asetat 1:1, heksana:etil asetat 2:1, etil asetat:toluena 1:1, metanol:kloroform 1:9 etil asetat:diklorometana 7:3. Noda hasil elusi oleh berbagai pelarut dilihat di bawah sinar lampu ultraviolet pada panjang gelombang 254 dan 366 nm. Fraksionasi dengan Kromatografi Kolom (Rouessac & Rouessac 1994) Fraksionasi dilakukan dengan pengemasan kolom sebanyak 30 g silika gel untuk pemisahan 1.5 gram ekstrak dengan diameter 2 cm dan tinggi kolom 30 cm. Pengemasan kolom menggunakan silika gel 15-20 kali jumlah ekstrak dan perbandingan tinggi adsorben dan diameter kolom 8:1. Ekstrak etil asetat buah dan daun mengkudu dilarutkan dalam eluen terbaik, kemudian dipisahkan komponenkomponennya dengan kolom kromatografi dengan elusi gradien (peningkatan kepolaran). Eluat ditampung setiap 5 mL dalam tabung reaksi yang telah diberi nomor kemudian diuji dengan KLT. Noda pemisahan dideteksi di bawah lampu UV 254 nm dan 366 nm. Eluat yang memiliki Rf dan pola KLT yang sama digabungkan sebagai satu fraksi dan diuji aktivitas antioksidan dengan KLT bioautografi sehingga diperoleh fraksi teraktif. Penentuan Aktivitas Antioksidan (Hanani 2005) Sebanyak 10 mg ekstrak dilarutkan dengan metanol dalam labu takar 10 mL, maka didapatkan konsentrasi 1000 ppm. Kemudian ekstrak 1000 ppm diencerkan dengan menambahkan metanol sehingga diperoleh ekstrak dengan konsentrasi 10, 30, 50, 70, 90 ppm. Masing-masing konsentrasi larutan contoh dipipet 0.2 mL ke dalam vial, kemudian ditambahkan 3.8 mL larutan DPPH 50 µM. Campuran dihomogenkan dan dibiarkan selama 30 menit di tempat gelap. Serapan diukur dengan spektrofotometer UV-tampak pada panjang gelombang 515 nm. Sebagai pemban-
ding digunakan asam askorbat (konsentrasi 2, 3, 4, 5, 6 ppm) dengan perlakuan yang sama dengan contoh uji. Nilai IC50 fraksi dan asam askorbat dihitung dengan menggunakan rumus persamaan regresi. Persentase inhibisi
=K
( S1
S0 )
100
K
K : absorbansi kontrol negatif/blanko DPPH S1 : absorbansi contoh dengan penambahan DPPH S0 : absorbansi contoh tanpa penambahan DPPH Penentuan Kandungan Fenol Total (Chun et al. 2003) Kandungan fenol total fraksi ekstrak etil asetat ditentukan menggunakan metode FolinCiocalteau. Sebanyak dua mg ekstrak dilarutkan dengan tiga mL metanol, maka didapatkan konsentrasi ekstrak 2 mg/3 mL pelarut. Sebanyak 200 μL larutan asam galat berbagai konsentrasi (50, 75, 100, 125, 150 ppm) dan larutan contoh (2 mg/3 mL) masing-masing dimasukkan ke dalam labu takar 10 mL dan ditambahkan 3 mL akuabides. Pereaksi Folin-Ciocalteu sebanyak 400 μL ditambahkan ke dalam campuran lalu dihomogenkan. Setelah lima menit, 4 mL larutan Na2CO3 7% ditambahkan ke dalam campuran lalu dihomogenkan. Campuran ditambahkan akuabides hingga tepat 10 mL. Selanjutnya campuran didiamkan selama 90 menit, kemudian diukur absorbansinya dengan spektofotometer UV-tampak pada panjang gelombang maksimum (750 nm). Kandungan fenol total fraksi ekstrak etil asetat dinyatakan sebagai mg ekuivalen asam galat/g bobot contoh kering.
HASIL DAN PEMBAHASAN Kadar Air Serbuk buah dan daun mengkudu yang diperoleh dari kebun Pusat Studi Biofarmaka ditentukan kadar airnya. Penentuan kadar air ini bertujuan menentukan jumlah air suatu contoh sehingga dapat diketahui cara penyimpanan yang terbaik agar tidak terjadi kerusakan contoh. Kadar air buah dan daun mengkudu yang diperoleh sebesar 13.27% dan 12.52% (Lampiran 3). Nilai yang diperoleh >10% menunjukkan contoh tidak baik jika disimpan dalam jangka waktu lama sehingga contoh yang telah diekstraksi dan dipekatkan harus segera dianalisis dengan memperhatikan
faktor koreksi. Serbuk contoh dikeringkan terlebih dahulu sebelum diekstraksi. Pengeringan bertujuan agar contoh tidak mudah rusak sehingga dapat disimpan dalam jangka waktu yang lama karena dengan mengurangi kadar air, kerusakan contoh oleh mikroba dapat dihindari. Kadar air pada contoh tidak selalu sama karena dipengaruhi oleh kelembaban, perlakuan terhadap contoh, dan besarnya penguapan. Kandungan air dihilangkan dengan pemanasan pada suhu 105 ºC. Menurut Harjadi (1993), air yang terikat secara fisik dapat dihilangkan dengan pemanasan pada suhu 100-105 ºC. Ekstrak Sebelum serbuk contoh buah dan daun mengkudu diekstraksi, komponen lemak atau nonpolar dari contoh dihilangkan terlebih dahulu menggunakan pelarut yang bersifat nonpolar seperti heksana. Komponen nonpolar yang terdapat dalam contoh dapat mengganggu proses analisis. Lemak dapat menghambat penguapan pelarut pada saat ingin memperoleh ekstrak pekat. Selain itu, lemak dikhawatirkan juga dapat terjerap dalam fase diam pada saat analisis menggunakan kromatografi (Kramer 1985). Pelarut ekstraksi komponen aktif mengkudu yang digunakan adalah metanol. Metanol merupakan pelarut yang dapat melarutkan hampir semua senyawa organik yang ada pada contoh, baik senyawa polar maupun semi polar. Metanol mudah menguap sehingga mudah dibebaskan dari ekstrak, dan metanol lebih ekonomis dibandingkan dengan pelarut organik yang lain. Ekstrak metanol yang diperoleh kemudian diekstraksi cair-cair dengan etil asetat. Menurut Zin et al. (2002), ekstrak kasar etil asetat buah dan daun mengkudu memiliki aktivitas antioksidan tinggi. Heinicke (1985) menyatakan bahwa senyawa antioksidan yang berperan besar di dalam ekstrak etil asetat adalah alkaloid yang terdapat di dalam buah dan daun mengkudu. Metode ekstraksi yang digunakan adalah maserasi karena cara ini merupakan metode yang mudah dilakukan dan menggunakan alatalat sederhana, yaitu cukup dengan merendam contoh dalam pelarut. Rendemen ekstrak etil asetat buah dan daun mengkudu, yaitu 2.24% dan 2.95% (Lampiran 4). Rendemen ekstrak yang diperoleh tidak berbeda jauh dengan hasil penelitian Jayaraman et al. (2008), yang menunjukkan bahwa rendemen ekstrak etil asetat buah mengkudu sebesar 1.90%. Rende-
men ekstrak etil asetat daun mengkudu sedikit lebih besar karena mungkin senyawa kimia yang memiliki sifat kepolaran sama dengan etil asetat di dalam daun mengkudu jumlahnya sedikit lebih besar daripada di dalam buahnya. Ekstrak Teraktif Pengujian potensi bahan sebagai penangkap radikal bebas dan antioksidan dilakukan menggunakan KLT bioautografi karena mudah, cepat, dan hanya membutuhkan jumlah contoh yang sedikit. Bahan yang diujikan antara lain ekstrak etil asetat (EA), ekstrak metanol (EM), dan estrak metanol hasil ekstraksi cair-cair dengan etil asetat (EMP) dari buah dan daun mengkudu. Penentuan ekstrak teraktif melalui KLT bioautografi, yaitu berdasarkan penampakan warna noda ekstrak dengan cara menyemprotkan larutan DPPH 1 mM dalam metanol (Hanani 2005) pada beberapa ekstrak mengkudu yang sudah ditotolkan pada pelat kromatografi lapis tipis dengan fase diam silika gel. a
b
c
d
ekstrak etil asetat buah dan daun mengkudu memiliki aktivitas antioksidan yang tinggi. Fraksi Pelarut atau fase gerak yang akan digunakan untuk fraksionasi ekstrak buah dan daun mengkudu dipilih pelarut terbaik yang dihasilkan dari kromatografi lapis tipis (Lampiran 5). Noda hasil elusi oleh berbagai pelarut dilihat di bawah sinar lampu ultraviolet pada panjang gelombang 254 dan 366 nm. Pelarut yang akan dijadikan sebagai penyusun fase gerak adalah pelarut yang menghasilkan jumlah noda terbanyak dan memiliki pemisahan yang baik. Fraksionasi dilakukan terhadap ekstrak etil asetat buah dan daun mengkudu. Fraksionasi menggunakan eluen terbaik dengan perbandingan heksana:etil asetat (2:1) (Gambar 6). Pemisahan dilakukan dengan elusi gradien (peningkatan kepolaran), hal ini bertujuan agar peningkatan polaritas sistem eluen menyebabkan semua komponen akan terbawa lebih cepat (Harvey 2000).
e f
Gambar 5 Profil KLT bioautografi dengan larutan DPPH 1 mM dari (a) EA buah, (b) EA daun, (c) EMP buah, (d) EMP daun, (e) EM buah, (f) EM daun. Larutan DPPH menghasilkan warna ungu pada pelat KLT. Komponen aktif bereaksi dengan DPPH sehingga DPPH menjadi bentuk tereduksinya dan ditandai dengan berkurangnya intensitas warna ungu dari larutan DPPH pada noda ekstrak. Ekstrak teraktif dilihat pada noda-noda ekstrak yang memiliki intensitas warna ungu yang rendah atau terlihat paling pudar. Hasil pewarnaan noda ekstrak dengan DPPH menunjukkan bahwa ekstrak teraktif adalah ekstrak etil aseatat (EA) buah dan daun mengkudu (Gambar 5). Hal ini didukung oleh pernyataan Zin et al. (2002) bahwa ekstrak metanol tidak memiliki aktivitas antioksidan, sedangkan
(a) (b) Gambar 6 Profil KLT eluen terbaik heksana:etil asetat (2:1) ekstrak etil asetat buah (a) dan daun mengkudu (b). (Kondisi KLT: plat KLT SiO2 60 F254, visualisasi noda: UV 254 nm dan 366 nm). Elusi diawali dengan pelarut heksana, kemudian campuran kedua pelarut dan diakhiri dengan pelarut etil asetat. Hasil pemisahan ekstrak ditampung sebanyak 5 ml dalam tiap tabung reaksi. Pemisahan ekstrak buah mengkudu tersebut diperoleh 88 tabung reaksi, sedangkan ekstrak daun menghasilkan 117 tabung reaksi. Hasil pemisahan dimonitor dengan kromatografi lapis tipis (KLT). Fase gerak yang digunakan dalam KLT adalah eluen terbaik heksana:etil asetat (2:1). Pemisahan dengan KLT dan kolom didasarkan pada interaksi antara fase gerak, fase diam, dan analat.
Pergerakan suatu senyawa pada bidang adsorben tergantung pada kepolaran antara eluen dengan senyawa tersebut. Fraksionasi ini menggunakan adsorben silika gel. Sifat dari silika gel adalah polar sehingga silika gel akan mengikat senyawa yang bersifat polar juga, sedangkan hubungannya dengan eluen, yaitu senyawa yang polar akan cepat bergerak jika menggunakan pelarut yang polar begitu juga sebaliknya (Harvey 2000). Senyawa yang kurang polar akan keluar terlebih dahulu dari kolom dengan eluen heksana dan dilanjutkan dengan senyawa semi polar dengan campuran kedua eluen, dan terakhir senyawa polar dengan eluen etil asetat. Noda yang terbentuk dapat dideteksi dengan sinar UV pada panjang gelombang 254 nm dan 366 nm. Pada panjang gelombang ini adanya senyawa yang berpendar jika disinari dengan sinar ultraviolet sehingga noda akan terlihat. Eluat dalam tabung reaksi yang memiliki pola dan Rf yang sama dijadikan satu fraksi. Fraksionasi buah mengkudu menghasilkan 4 fraksi, sedangkan daun mengkudu menghasilkan 7 fraksi (Lampiran 6 dan Lampiran 7). Fraksi-fraksi yang diperoleh selanjutnya diuji aktivitas antioksidannya secara bioautografi. Penentuan fraksi teraktif melalui KLT bioautografi menghasilkan fraksi teraktif ekstrak buah dan daun mengkudu adalah fraksi 1 dan fraksi 5 (Gambar 7).
(a) (b) Gambar 7 Profil KLT bioautografi dengan larutan DPPH 1 mM dari fraksi ekstrak etil asetat (a) buah mengkudu (F1–F4), (b) daun mengkudu (F1–F7). Kandungan Fitokimia Analisis fitokimia adalah salah satu cara untuk mengetahui kandungan metabolit sekunder pada suatu tanaman. Analisis fitokimia dilakukan dua kali, yaitu terhadap ekstrak kasar dan fraksi teraktif buah dan daun mengkudu.
Berdasarkan hasil uji fitokimia terhadap ekstrak dan fraksi 1 ekstrak buah mengkudu (Tabel 1), menunjukkan bahwa ekstrak buah mengkudu mengandung flavonoid, alkaloid, saponin, tanin, kuinon, dan triterpenoid. Fraksi 1 ekstrak buah mengkudu mengandung flavonoid, alkaloid, saponin, dan triterpenoid. Tabel 1 Uji fitokimia buah mengkudu Senyawa Ekstrak Fraksi teraktif Alkaloid + + Meyer – + Wagner + + Dragendorf + + Flavonoid + + Saponin + + Tanin + – Kuinon + – Triterpenoid + + Steroid – – Keterangan: (-): tidak terdeteksi; (+): terdeteksi Tabel 2 Uji fitokimia daun mengkudu Senyawa Ekstrak Fraksi teraktif Alkaloid + + Meyer + + Wagner + + Dragendorf + + Flavonoid + + Saponin – – Tanin – – Kuinon – – Triterpenoid – – Steroid + – Keterangan: (-): tidak terdeteksi; (+): terdeteksi Hasil uji fitokimia terhadap ekstrak dan fraksi teraktif daun mengkudu (Tabel 2), menunjukkan bahwa ekstrak daun mengkudu mengandung flavonoid, alkaloid, dan steroid. Fraksi 5 ekstrak daun mengkudu mengandung flavonoid dan alkaloid. Hasil uji negatif pada analisis fitokimia dapat disebabkan oleh rusaknya senyawa ekstrak atau memang kandungan fitokimia yang terdapat dalam contoh sangat kecil. Hasil positif analisis fitokimia menunjukkan bahwa kemungkinan golongan senyawa yang aktif sebagai antioksidan pada buah dan daun mengkudu adalah golongan senyawa flavonoid, alkaloid, dan terpenoid. Aktivitas Antioksidan Penentuan aktivitas antioksidan dari fraksi teraktif mengkudu didasarkan pada penang-
kapan radikal bebas DPPH dan aktivitasnya ditentukan menggunakan metode spektroskopi. Radikal bebas DPPH memiliki warna ungu yang ditunjukkan oleh pita absorpsi dalam pelarut metanol pada panjang gelombang maksimum 515 nm (Lampiran 8). Larutan DPPH diukur serapan cahayanya dan dihitung aktivitas antioksidannya dengan menghitung persentase inhibisi, yaitu banyaknya aktivitas senyawa antioksidan yang dapat menangkap radikal bebas DPPH. Parameter yang juga digunakan untuk pengukuran aktivitas antioksidan dari mengkudu adalah IC50, yaitu bilangan yang menunjukkan konsentrasi ekstrak yang mampu menghambat aktivitas DPPH sebesar 50%. Penentuan nilai IC50 menggunakan persamaan kurva hubungan antara %inhibisi sebagai sumbu y dan konsentrasi fraksi antioksidan sebagai sumbu x. Nilai IC50 dihitung dengan cara memasukkan nilai 50% ke dalam persamaan kurva sebagai sumbu y kemudian dihitung nilai x sebagai konsentrasi IC50. Perhitungan IC50 bertujuan menentukan besarnya konsentrasi senyawa antioksidan yang diperlukan untuk dapat menghambat setengah aktivitas radikal bebas. Semakin kecil nilai IC50 menunjukkan semakin tinggi aktivitas antioksidannya (Molyneux 2004). Radikal bebas diharapkan dapat ditangkap oleh senyawa antioksidan hanya dengan konsentrasi yang kecil. Berdasarkan pengujian aktivitas antioksidan, nilai IC50 untuk fraksi teraktif buah mengkudu sebesar 38.18 ppm (Lampiran 9) dan nilai IC50 untuk fraksi teraktif daun mengkudu sebesar 85.86 ppm (Lampiran 10).
Gambar 8 Nilai IC50 dari fraksi teraktif buah, daun mengkudu, dan vitamin C. Gambar 8 menunjukkan bahwa nilai IC50 fraksi ekstrak buah mengkudu lebih kecil daripada fraksi ekstrak daun, yang berarti fraksi ekstrak buah mengkudu memiliki aktivitas antioksidan lebih besar daripada fraksi ekstrak daun mengkudu. Hal ini berbeda dengan pernyataan Zin et al. (2002) bahwa aktivitas antioksidan ekstrak daun mengkudu lebih besar daripada ekstrak buahnya. Perbedaan hasil diduga disebabkan
contoh yang dianalisis berbeda umur, asal dan tempat tumbuh. Perbedaan ini menyebabkan kandungan metabolit sekunder di dalam contoh berbeda sehingga aktivitas antioksidannya juga berbeda. Senyawa antioksidan seperti alkaloid, flavonoid, asam fenol, alkohol, gula atau glikosida di dalam buah mengkudu diduga lebih banyak daripada di dalam daunnya, sehingga menghasilkan aktivitas antioksidan fraksi ekstrak buah yang lebih besar. Selain itu, kandungan triterpenoid dan saponin yang ditemukan di dalam fraksi ekstrak buah mengkudu tidak ditemukan di dalam fraksi ekstrak daun sehingga diduga senyawa selain fenol ini berperan besar sebagai antioksidan.
Gambar 9 Reaksi antara senyawa flavonoid dan DPPH (Williams et al.1995). Reaksi yang terjadi antara senyawa antioksidan (contoh flavonoid) dan DPPH (Gambar 9) meliputi pemberian atom hidrogen dari senyawa flavonoid untuk mereduksi radikal DPPH. Selanjutnya radikal aril dari flavonoid mengalami resonansi dan memberikan atom hidrogennya kembali kepada radikal DPPH. Pembentukan kompleks antara antioksidan dan DPPH bergantung pada kestabilan dan potensial reaksi dari struktur molekulnya. Berdasarkan mekanisme tersebut, maka dapat dikatakan bahwa senyawa antioksidan mempunyai sifat yang relatif stabil dalam bentuk radikalnya (Williams et al. 1995). Sifat ini yang menyebabkan golongan senyawa flavonoid, terpenoid, dan alkaloid diduga senyawa yang berpotensi sebagai antioksidan.
Penelitian ini menggunakan asam askorbat atau vitamin C sebagai kontrol positif antioksidan. Molekul asam askorbat atau vitamin C mereduksi dua radikal DPPH (2Z●) melalui pelepasan dua atom hidrogennya, sehingga membentuk DPPH nonradikal (Gambar 10) (Blouis 1958). Senyawa ini mampu memberikan atom hidrogennya kepada radikal bebas sehingga aktivitasnya dapat diukur menggunakan metode DPPH. Senyawa ini merupakan salah satu antioksidan sekunder dan memiliki cara kerja yang sama dengan vitamin E, yaitu menangkap radikal bebas dan mencegah terjadinya reaksi berantai (Praptiwi et al. 2006). Lampiran 11 menunjukkan bahwa nilai IC50 asam askorbat sebesar 3.85 ppm. Hal ini menunjukkan bahwa fraksi ekstrak dan vitamin C mempunyai aktivitas antioksidan yang kuat karena mempunyai IC50 kurang dari 200 ppm (Blouis 1958).
Gambar 10 Reaksi antara asam askorbat dan DPPH (Blouis 1958). Reaksi antara DPPH dan senyawa antioksidan menghasilkan dehidrogenasi pada molekul antioksidan, sedangkan DPPH berubah menjadi DPPHn dengan n menunjukkan jumlah atom H yang diterima oleh DPPH dari antioksidan. DPPH berwarna violet dan DPPHn tak berwarna sehingga memungkinkan pengukuran dengan spektrofotometri dari penurunan intensitas warna DPPH. Absorbansi yang rendah menunjukkan kapasitas penangkapan radikal DPPH yang lebih tinggi. Kandungan Fenol Total Penentuan kadar senyawa fenolat total menggunakan asam galat sebagai larutan standar. Serapan maksimum asam galat diperoleh pada panjang gelombang 750 nm (Lampiran 12). Kurva kalibrasi larutan standar asam galat dibuat terlebih dahulu dengan konsentrasi 50; 75; 100; 125; 150 mg/L, sebelum kadar fenol total diperiksa. Pembuatan kurva kalibrasi berguna untuk membantu menentukan kadar fenol dalam contoh melalui persamaan regresi dari kurva kalibrasi. Pemeriksaan larutan standar asam galat menghasilkan kurva kalibrasi dengan persamaan regresi y = 0,002x - 0,069 dan harga koefesien korelasi (r) yaitu 0,9849.
Nilai r yang mendekati 1 membuktikan bahwa persamaan regresi tersebut adalah linier. Konsentrasi larutan contoh dapat ditentukan dengan menggunakan kurva kalibrasi dengan cara mengukur absorbansi contoh kemudian kadar fenolat total dalam mengkudu dihitung dengan menggunakan persamaan regresi linear.
Gambar 11 Kandungan fenol total dalam fraksi teraktif ekstrak etil asetat buah dan daun mengkudu. Menurut Pratt & Hudson (1992), senyawa fenol ditemukan di semua bagian tanaman seperti buah, akar, bunga, batang, dan daun. Gambar 8 menunjukkan bahwa fraksi 1 dari ekstrak buah mengkudu mengandung 0.40 mg ekuivalen asam galat /g bobot contoh kering, sedangkan fraksi 5 ekstrak daun mengkudu adalah 1.15 mg ekuivalen asam galat /g bobot contoh kering (Lampiran 13). Hal ini menunjukkan bahwa kandungan fenol total dari buah mengkudu lebih kecil daripada daunnya, sehingga hasil menunjukkan bahwa tidak ada hubungan yang linier positif antara aktivitas antioksidan ekstrak buah dan daun megkudu dengan kandungan fenol totalnya (Gambar 12). Hal ini tidak sesuai dengan Rohman et al. (2006) yang menyatakan bahwa terdapat hubungan yang linier positif antara aktivitas antioksidan dengan kandungan fenol total ekstrak buah mengkudu. Gambar 12 menunjukkan bahwa kandungan sejumlah senyawa fenol bukan satu faktor utama aktivitas antioksidan, dan senyawa selain fenol berperan penting terhadap aktivitas antioksidan (Zin et al. 2004). Selain itu, tidak semua senyawa fenol memiliki aktivitas antioksidan yang sama, beberapa ada yang kuat dan lainnya lemah. Senyawa fenol ini bekerja secara antagonis atau sinergis saat bercampur dengan sesama senyawa fenol atau senyawa selain fenol (Lien et al. 1999). Berdasarkan hasil uji fitokimia, diduga senyawa alkaloid dan flavonoid dalam fraksi ekstrak buah dan daun berperan sebagai antioksidan. Fraksi teraktif ekstrak buah
mengkudu mengandung senyawa selain fenol seperti triterpenoid dan saponin yang juga berperan sebagai antioksidan. Hal ini diduaskorbat, senyawa karotenoid dan minyak atsiri di dalamnya juga berperan sebagai antioksidan (Javanmardi et al. 2003). Daun
[AOAC] The Association of Analytical Chemist. 2006. Methods of Analysis. Ed Washington DC: Association of Analytical Chemist.
Official Official ke-18. Official
Blouis MS. 1958. Antioxidant Determinations By The Use Of a Stable Free Radical. Nature 181: 1199-1200. Chun OK, Kim DO, Lee CY. 2003. Superoxide Radical Scavenging Activ-ity of The Major Polyphenols in Fresh Plums. Journal of Agricultural and Food Chemistry 51: 8067-8072.
Buah
Gambar 12 Hubungan antara aktivitas antioksidan (IC50) dan kandungan fenol total (mg ekuivalen asam galat/g contoh kering).
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Pemisahan ekstrak etil asetat buah dan daun mengkudu menghasilkan 4 dan 7 fraksi. Fraksi teraktif dari ekstrak buah dan daun mengkudu memberikan nilai IC50 38.18 ppm dan 85.86 ppm. Kandungan fenol total dalam fraksi teraktif dari ekstrak buah dan daun mengkudu, yaitu 0.40 mg ekuivalen asam galat/g bobot contoh kering dan 1.15 mg ekuivalen asam galat/g bobot contoh kering. Berdasarkan hasil uji fitokimia, senyawa alkaloid dan flavonoid berperan sebagai antioksidan di dalam buah dan daun mengkudu, serta senyawa selain fenol berperan besar sebagai antioksidan di dalam buah mengkudu. Saran Penelitian lebih lanjut perlu dilakukan untuk menguji hasil secara in vivo dan untuk mengidentifikasi senyawa yang berperan sebagai antioksidan.
DAFTAR PUSTAKA Abbott IA. 1992. La`au Hawai Traditional Uses of Plants. Hawai: Bishop Musesum Press.
Elkins R. 1998. Hawaiian noni (Morinda citrifolia) Prize Herb of Hawaii and the South Pacific. Utah: Woodland Publishing. Furniss BS, Hannaford AJ, Smith PWG, Tatchell AR, Vogel AI. 1989. Vogel’s Textbook of Practical Organic Chemistry 4th. New York: Wiley. Harjadi W. 1993. Ilmu Kimia Analitik Dasar. Jakarta: Gramedia. Hanani E, Abdul M, Ryany S. 2005. Identifikasi Senyawa Antioksidan dalam Spons Callyspongia sp dari Kepulauan Seribu. Majalah Farmasi Indonesia 2: 127 – 133. Harborne JB. 1987. Metode Fitokimia. K Padmawinata & I Sudiro, penerjemah. Bandung: Institut Teknologi Bandung. Terjemahan dari: Phytochemical Methods. Harvey D. 2000. Modern Analytical Chemistry. Washington DC: McGraw-Hill. Heinicke RM. 1985. The pharmacologically active ingredient of Noni. Bulletin of the National Tropical Botanical Garden 165. Hostettmann K, Terreaux C, Marston A, Potterat O. Strategy for the Biological and Chemical Evaluation of Plant Extracts. 1997. Journal of Planar Chromatography 10: 251-257. Houghton J, Raman A. 1998. Laboratory handbook for the Fractionation of Natural Extract. London: Chapman & Hall.
Jayaraman SK, Manoharan MS, Illanchezian S. 2008. Antibacterial, Antifungal and Tumor cell suppression potential of Morinda citrifolia fruit extracts. International Journal of Integrative Biology 1: 44-49. Javanmardi J, Stushnoff C, Locke E, Vivan-co JM. 2003. Antioxidant Activity and Total Phenolic Content of Iranian Ocimum Accessions. Journal of Agricultural and Food Chemistry 83: 547-550. Kahkonen MP, Hopia AI, Vuorela HJ, Rauha JP, Pihlaja K, Kujala TS, Heinonen M. 1999. Antioxidant activity of extracts containing phenolic compounds. Journal of Agricultural and Food Chemistry 47: 3954-3962. Khopkar. 2002. Konsep Dasar Kimia Analitik. Saptorahardjo, penerjemah. Jakarta: UI Press. Terjemahan dari: Basic Concept of Analitical Chemistry. Kikuzaki H, Nakatani N. 1993. Antioxidant effects of some ginger constituents. Journal of Food Science 58: 1407–1410. Kramer RE. 1985. Antioxidants in Clove. Journal of the American Oil Chemist`s Society 62: 111-113. Lien EJ, Ren S, Bui HH, Wang R. 1999. Quantitative structure activity relation-ship analysis of phenolic antioxidants. Free Radical Biology and Medicine 26: 285– 294. McClatchey W. 2002. From Polynesian healers to health food stores: changing perspectives of Morinda citrifolia (Rubiaceae). Integrative Cancer Therapies 1: 110-120. Michalowska AG, Korczak J, Hes M. 2007. Purification process influence on green tea extracs polyphenol content and antioxidant activity. Acta Scientiarum Polonorum Technology Aliment 6: 41-48. Molyneux P. 2004. The use of the stable free radical diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) for estimating antioxidant activity. Jounal of Science Technology 26: 211-219. Praptiwi, Dewi P, Harapini M. 2006. Nilai Peroksida dan Aktivitas Anti Radikal
Bebas Diphenil Picrylhidrazil Hydrate (DPPH) Ekstrak Metanol Knema laurina. Majalah Farmasi Indonesia 17: 32-36. Pratt DE dan Hudson BJF. 1990. Natural Antioxidants Not Exploited Commercially. Elsevier Applied Science 1: 239243. Prior RL, Wu X, Schaich K. 2005. Standardized methods for the determination of antioxidant capacity and phenolics in foods and dietary supplements Journal of Agricultural and Food Chemistry 55: 2698 A-J. Rohman A, Riyanto S, Utari D. 2006. Aktivitas antioksidan, kandungan fenolik total dan kandungan flavonoid total ekstrak etil asetat buah mengkudu serta fraksi-fraksinya. Majalah Farmasi Indonesia 17: 136-142. Rouessac F, Rouessac A. 1994. Chemical Analysis Modern Instrumentation Methods and Techniques 2nd. New York: Wiley. Vimala S, Adenan MI. 1999. Malaysian tropical forest medicinal plants: a source of natural antioxidants. Journal of Tropical Forest Products 5: 32–38. Wang MY, West BJ, Jensen CJ, Nowicki D, Su C, Palu AK, Anderson G. 2002. Morinda Citrifolia (noni): A literature review and recent advances in noni research. Acta Pharmacologica Sinica 23: 1127-1141. Williams B, Cuvelier WME, Berset C. 1995. Use of a Free Radical Method to Evaluate Antioxidant Activity. Lebens-mittelwissenschaft und Technology 28: 25-30. Zin M, Abdul H, Osman. 2002. Antioxidative Activity of Extracts from Mengkudu (Morinda citrifolia) Root, Fruit, and Leaf. Food Chemistry 78: 227-231. Zin M, Abdul H, Osman A, Saari N. 2004. Antioxidative activities of chromatographic fractions obtained from root, fruit and leaf of Mengkudu (Morinda citrifolia L). Food Chemistry 08: 048.
LAMPIRAN
Lampiran 1 Diagram alir penelitian
Simplisia sampel (buah, daun mengkudu) Penghilangan lemak dengan heksana
Residu sampel bebas lemak Maserasi dengan Metanol
Ekstrak Metanol Ekstraksi cair-cair dengan etil asetat
Ekstrak Etil asetat Uji Fitokimia Penentuan Eluen Terbaik dengan KLT
Eluen terbaik
Fraksionasi dengan kromatografi kolom
Fraksi teraktif
Uji Fitokimia
Penentuan Kandungan Fenolik Total
Analisis kuantitatif Aktivitas Antioksidan
Lampiran 2 Uji Fitokimia a) Uji Alkaloid 0.1 gram sampel ekstrak dengan 10 mL kloroform dan beberapa tetes amonia saring 10 tetes H2SO4 lapisan asam +pereaksi Dragendorf
Meyer
Wagner
endapan jingga
endapan putih
endapan coklat
b) Uji saponin, flavonoid, dan tanin 0.1 gram sampel dilarutkan dalam 10 mL air panas didihkan selama 5 menit saring
kocok
Busa 10 menit
+ 0.5 mg Mg + 10 mL FeCl3 1% +1 mL HCl pekat + 1 mL amil alkohol Merah/kuning/ jingga (flavonoid)
Biru tua (tanin)
saponin c) Steroid/triterpenoid 0.1 gram sampel dilarutkan dalam 25 mL etanol panas uapkan pelarut residu dilarutkan dalam eter ekstrak eter + 3 tetes anhidrida asam asetat dan 1 tetes H2SO4 pekat
merah/ungu (triterpenoid)
hijau/biru (steroid)
Lampiran 3 Penentuan kadar air buah dan daun mengkudu a) Kadar air buah mengkudu Ulangan 1 2 3 Rerata
Bobot cawan Bobot sampel kosong (g) (g) 1.9672 3.0202 1.8780 3.0109 1.9915 3.019
Bobot cawan+sampel kering (g) 4.5870 4.4906 4.6081
Kadar Air (% b/b) 13.26 13.23 13.33 13.27
b) Kadar air daun mengkudu Ulangan 1 2 3 Rerata
Bobot cawan kosong (g) 1.9263 1.9855 2.0331
Bobot sampel (g) 3.0278 3.0210 3.0417
Bobot cawan+sampel kering (g) 4.569 4.6369 4.6913
Kadar Air (% b/b) 12.72 12.23 12.61 12.52
Contoh perhitungan ulangan 1 buah mengkudu: Kadar
air
Bobot sampel
((Bobot cawan
sampel kering)
Bobot sampel 3.020 2
(4.5870
1.9672) gram
3.0202 gram 13.25 %
100%
Bobot cawan kosong)
100%
Lampiran 4 Penentuan rendemen ekstrak kasar buah dan daun mengkudu Ekstrak Buah Etil asetat Daun Etil asetat
Bobot ekstrak (g) 2.9632 3.939
Bobot sampel (g) 150.0061 150.2231
Faktor koreksi 1.1327 1.1252
Rendeman (% b/b) 2.24 2.95
Contoh perhitungan ekstrak buah etil asetat: Faktor koreksi
100
kadar air
100
100 13 . 2705
100
= 1.1327 Re ndemen
Bobot Ekstrak
xfkx 100 %
Bobot sampel
2 . 9632 g
x1 . 1327 x100 %
150 . 0061 g
= 2.24%
Lampiran 5 Penentuan eluen terbaik menggunakan kromatografi lapis tipis Pelarut
Ekstrak etil asetat
Heksana:etil asetat 2:1
buah daun
Heksana:etil asetat 1:1
buah daun
Metanol:kloroform 1:9
buah daun
Etil asetat:dikorometana 7:3
buah daun
Etil asetat:toluena 1:1
buah daun
Nilai Rf (1) 0.1125, (2) 0.1688, (3) 0.2250, (4) 0. 3875, (5) 0.5813 (1) 0.1511, (2) 0.4250, (3) 0.5750 (4) 0.7688, (5) 0.7875, (6) 0.9819 (1) 0.2901, (2) 0.4074, (3) 0.5494 (1) 0.3703, (2) 0.5123, (3) 0.6296 (4) 0.7407, (5) 0.8765 (1) 0.5125, (2) 0.6500, (3) 0.7188 (4) 0.7688 (1) 0.5625, (2) 0.6375, (3) 0.7188 (4) 0.7625, (5) 0.8750 (1) 0.6173, (2) 0.7777 (1) 0.2592, (2) 0.6605, (3) 0.7777 (4) 0.8395, (5) 0.9136 (1) 0.4500, (2) 0.6375 (1) 0.1375, (2) 0.4375, (3) 0.6188 (4) 0.8563, (5) 0.9125
Lampiran 6 Hasil fraksionasi dan profil KLT hasil fraksionasi ekstrak etil asetat buah mengkudu dengan eluen heksana:etil asetat (2:1)
F1 Tabung ke1−20 21 29 30 33 35 40 41 42 43
61
62
Jarak spot dari garis awal (cm) − 6.6 6.6 3.7 1.7 3.8 1.6 3.7 1.5 3.7 1.5 3.7 1.8 3.7 1.6 1.8 1.4 1 1.8 1.4 0.8 1.7 1.3 0.8
F2 Jarak tempuh eluen dari garis awal (cm) − 7.9 7.9 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8
F3
Rf − 0.84 0.84 0.46 0.21 0.48 0.20 0.46 0.19 0.46 0.19 0.46 0.23 0.46 0.20 0.23 0.18 0.13 0.23 0.18 0.10 0.21 0.17 0.10
F4 Fraksi ke-
Bobot (gram)
Rendemen (% b/b)
− 1
− 0.2931
− 19.54
2
0.0384
2.56
3
0.0439
2.93
Lanjutan lampiran 6 Hasil fraksionasi ekstrak etil asetat buah mengkudu Tabung ke63 65 70 75 80 85 88
Jarak spot dari garis awal (cm) 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.3
Jarak tempuh eluen dari garis awal (cm) 8 8 8 8 8 8 8
Rf
Fraksi ke-
Bobot (gram)
Rendemen (% b/b)
4
0.021
3.16
0.15 0.15 0.15 0.15 0.15 0.15 0.16
Lampiran 7 Hasil fraksionasi dan profil KLT hasil fraksionasi ekstrak etil asetat daun mengkudu dengan eluen heksana:etil asetat (2:1)
F1 Tabung ke1 5 7 15 20 25 28 29 31 32 33 34 35 36
Jarak spot dari garis awal (cm) 7.8 7.8 7.8 7.8 7.8 7.8 7.6 6.6 6.6 6.9 6.9 6.9 6.8 6.8
F2
F3
Jarak tempuh eluen dari garis awal (cm) 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8.1 8.1 8.1 8 8
F4
Rf 0.98 0.98 0.98 0.98 0.98 0.98 0.95 0.83 0.83 0.85 0.85 0.85 0.85 0.85
F5
F6
F7
Fraksi ke-
Bobot (gram)
Rendemen (% b/b)
1
0.0993
6.62
2
0.0252
1.68
Lanjutan lampiran 7 Hasil fraksionasi ekstrak etil asetat daun mengkudu Tabung ke37
39
40
50
51
54
55
57
59
61
Jarak spot dari garis awal (cm) 6.90 6.50 6.00 6.90 6.50 5.90 6.70 6.10 5.50 6.60 5.90 4.90 6.60 5.90 4.90 6.60 5.90 4.90 5.9 4.9 3.90 2.70 5.90 4.90 3.80 2.70 5.90 5.00 3.90 2.70 5.90 4.90 3.90 2.70
Jarak tempuh eluen dari garis awal (cm) 8.1 8.1 8.1 8.1 8.1 8.1 7.9 7.9 7.9 7.9 7.9 7.9 7.9 7.9 7.9 7.9 7.9 7.9 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8
Rf 0.85 0.80 0.74 0.85 0.80 0.73 0.85 0.77 0.70 0.84 0.75 0.62 0.84 0.75 0.62 0.84 0.75 0.62 0.74 0.61 0.49 0.34 0.74 0.61 0.48 0.34 0.74 0.63 0.49 0.34 0.74 0.61 0.49 0.34
Fraksi ke-
Bobot (gram)
Rendemen (% b/b)
3
0.2705
18.03
4
0.1469
9.79
Lanjutan lampiran 7 Hasil fraksionasi ekstrak etil asetat daun mengkudu Jarak spot dari garis awal (cm) 62 3.80 2.80 69 3.80 2.80 86 3.80 2.80 94 3.90 2.80 101 3.90 2.60 102 3.80 3.00 2.00 108 3.80 3.10 2.00 110 3.80 2.90 1.90 111 3.80 2.90 1.50 0.30 114 3.80 3.00 1.40 0.50 115−117 − Tabung ke-
Jarak tempuh eluen dari garis awal (cm) 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 −
Rf 0.48 0.35 0.48 0.35 0.48 0.35 0.49 0.35 0.49 0.33 0.48 0.38 0.25 0.48 0.39 0.25 0.48 0.36 0.24 0.48 0.36 0.19 0.04 0.48 0.38 0.18 0.06 −
Contoh perhitungan: Rf
= = =
Jarak spot dari garis awal Jarak tempuh eluen dari garis awal 7.8 8 0.98
Fraksi ke-
Bobot (gram)
Rendemen (% b/b)
5
0.5673
37.82
6
0.1913
12.75
7
0.1626
10.84
−
−
−
Lampiran 8 Penentuan panjang gelombang maksimum larutan DPPH 0.05 mM Panjang Gelombang (nm) 500 501 502 503 504 505 506 507 508 509 510 511 512 513 514
Absorbansi 0.455 0.460 0.464 0.468 0.472 0.476 0.479 0.482 0.485 0.487 0.489 0.491 0.492 0.493 0.494
Panjang Gelombang (nm) 515 516 517 518 519 520 521 522 523 524 525 526 527 528 529
Absorbansi 0.494 0.494 0.493 0.492 0.491 0.489 0.487 0.484 0.482 0.479 0.475 0.471 0.467 0.463 0.458
λ maksimum= 515 nm
Panjang gelombang (nm)
Lampiran 9 Penentuan aktivitas antioksidan fraksi teraktif ekstrak buah mengkudu dengan metode DPPH Kons (ppm)
Ulangan – 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2
Blanko 10 30 50 70 90
Absorbansi smpl+dpph tanpa dpph 0.463 – 0.279 0.006 0.296 0.015 0.264 0.016 0.296 0.046 0.265 0.066 0.302 0.092 0.267 0.097 0.297 0.108 0.265 0.120 0.301 0.139
%Inhibisi – 41.04 39.31 46.44 46.00 57.05 54.64 63.28 59.18 68.68 65.01
Rerata %Inhibisi
IC50 (ppm)
– 40.18 46.22 56.85
38.18
61.23 60.85
Konsentrasi ekstrak (ppm) Contoh Perhitungan: % Inhibisi =
A blanko
A sampel
DPPH
A sampel tan pa DPPH
x100 %
A blanko
=
0 , 463
0 , 279
0 , 006
x100 %
0 , 463
= 41.04% Perhitungan IC50 : y = 0.341x + 36.98 50 = 0.341x + 36.98 13.02 = 0.341x x = 38.18 Jadi, IC50 untuk fraksi aktif ekstrak etil asetat buah mengkudu = 38.18 ppm
Lampiran 10 Penentuan aktivitas antioksidan fraksi teraktif ekstrak daun mengkudu dengan metode DPPH Kons (ppm) Blanko 10 30 50 70 90 100 150 200 250 300
Ulangan – 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2
Absorbansi smpl+dpph tanpa dpph 0.463 – 0.278 0.000 0.304 0.014 0.267 0.003 0.29 0.015 0.27 0.012 0.287 0.016 0.255 0.018 0.269 0.023 0.254 0.030 0.265 0.040 0.259 0.045 0.276 0.055 0.259 0.075 0.293 0.102 0.246 0.097 0.288 0.132 0.231 0.115 0.271 0.150 0.216 0.130 0.286 0.189
Konsentrasi ekstrak (ppm)
%Inhibisi – 39.96 38.44 42.98 40.6 44.28 41.47 48.81 46.87 51.62 51.4 53.78 52.27 60.26 58.75 67.82 66.31 74.95 73.87 81.43 79.05
Rerata IC50 %Inhibisi (ppm) – 39.2 41.79 42.88 47.84 51.41 53.03 59.51 67.07 74.41 80.24
85.86
Contoh Perhitungan: A blanko
% Inhibisi =
A sampel
DPPH
A sampel
tan pa DPPH
x100 %
A blanko
=
0 , 463
0 , 278
0 , 000
x100 %
0 , 463
= 39.96% Perhitungan IC50 : y = 0.145x + 37.55 50 = 0.145x + 37.55 12.45 = 0.145x x = 85.86 Jadi, IC50 untuk fraksi aktif ekstrak etil asetat daun mengkudu = 85.86 ppm Lampiran 11 Penentuan aktivitas antioksidan vitamin C dengan metode DPPH Konsentrasi (ppm) Blanko 2
3
4
5
6
Ulangan Absorbansi – 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
0.463 0.352 0.350 0.355 0.275 0.272 0.276 0.229 0.225 0.227 0.162 0.160 0.163 0.098 0.086 0.105
% Inhibisi – 23.97 24.41 23.33 40.60 41.25 40.39 50.54 51.40 50.97 65.01 65.44 64.79 78.83 81.43 77.32
Konsentrasi (ppm)
Rerata %Inhibisi
IC50 (ppm)
– 23.90
40.75
50.97
65.08
79.19
3.85
Contoh Perhitungan: % Inhibisi =
A blanko
A sampel
A blanko
=
0 , 463
0 ,352
x100 %
0 , 463
= 23.97% Perhitungan IC50 : y = 13.49x - 1.986 50 = 13.49x - 1.986 51.986 = 13.49x x = 3.85 Jadi, IC50 untuk vitamin C = 3.85 ppm Lampiran 12 Penentuan panjang gelombang maksimum larutan standar fenol asam galat 100 ppm Panjang gelombang (nm) 724 726 728 730 732 734 736 738 740 742 744 746 748 750 752 754 756
Absorbansi 0.207 0.207 0.208 0.209 0.21 0.21 0.211 0.211 0.212 0.212 0.213 0.213 0.214 0.214 0.213 0.213 0.213
Panjang gelombang (nm) 758 760 762 764 766 768 770 772 774 776 778 780 782 784 786 788 790
Absorbansi 0.213 0.213 0.212 0.212 0.212 0.212 0.212 0.211 0.211 0.211 0.211 0.211 0.21 0.21 0.209 0.208 0.207
λ maksimum= 750 nm
Panjang gelombang (nm)
Lampiran 13 Penentuan kandungan fenol total fraksi teraktif ekstrak buah dan daun mengkudu
Larutan Asam galat 50 ppm Asam galat 75 ppm Asam galat 100 ppm Asam galat 125 ppm Asam galat 150 ppm Daun 2 mg/3 ml Buah 2 mg/3 ml
Absorbansi terkoreksi ul 1 0.047 0.164 0.221 0.264 0.348 0.122 0.085
ul 2 0.047 0.164 0.188 0.26 0.328 0.115 0.102
ul 3 0.039 0.073 0.156 0.223 0.314 0.105 0.086
Rerata Absorbansi 0.0443 0.1577 0.1883 0.2490 0.3300 0.1140 0.0910
Konsentrasi asam galat (ppm) Contoh perhitungan: Perhitungan kadar fenol total fraksi 5 etil asetat daun mengkudu: y = 0.002x - 0.069 0.1140 = 0.002x - 0.069 x = 69.09 ppm
Kadar Fenol (mg ekuivalen asam galat/g sampel kering) – – – – – 1.15 0.40
Kandungan fenol total = kadar fenol x konsentrasi fraksi x rendemen fraksi x rendemen ekstrak =
69 . 09 mg fenol 1000 mL
3 mL
x
x
2 mg fraksi kering
37 . 82 g fraksi kering
x
100 g ekstrak kering
2 . 93 g ekstrak kering 100 g sampel kering
= 1.15 mg/g sampel kering Jadi, kandungan fenol total fraksi 5 etil asetat daun mengkudu adalah 1.15 mg ekuivalen asam galat/g berat sampel kering. Perhitungan kadar fenol total fraksi 1 etil asetat buah mengkudu: y = 0.002x - 0.069 0.0910 = 0.002x - 0.069 x = 60.41 ppm Kandungan fenol total = 60 . 41 mg fenol 1000 mL
x
3 mL 2 mg fraksi kering
x
19 . 54 g fraksi kering 100 g ekstrak kering
x
2 . 24 g ekstrak kering 100 g sampel kering
= 0.40 mg/g sampel kering Jadi, kandungan fenol total fraksi 1 etil asetat buah mengkudu adalah 0.40 mg ekuivalen asam galat/g berat sampel kering.
