BAB 3. ELEKTROFORESIS
3-1 TEORI UMUM ELEKTROFORESIS lstilah elektroforesis untuk pertama kalinya dikemukakan oleh Michaelis pada tahun 1909 yang digunakan untuk mendeskripsikan perpindahan tempat (migrasi) zat-zat koloidal pada suatu medan listrik. Ada juga yang menyebutnya dengan istilah ionoforesis yang artinya kurang lebih juga sama dengan elektroforesis, yaitu perindahan tempat ion-ion yang relatif kecil karena pengaruh suatu medan listrik. Meski pun istilah ionoforesis sebenarnya lebih tepat digunakan sebagai dasar pemisahan senyawa-senyawa bahan, tetapi istilah tersebut kurang populer sehingga sampai kini istilah elektroforesis lebih banyak digunakan. Prinsip dasar elektroforesis hampir sama dengan sedimentasi. Perbedaannya, pada sedimentasi perpindahan tempat didasarkan atas molar dan massa padat, sedangkan pada elektroforesis perpindahan tempat didasarkan pada muatan listrik yang dibawa oleh senyawa. Contoh jika ke dalam larutan garam (NaCl) dimasukkan dua elektroda yang berlawanan (positif dan negatif) dengan suatu perbedaan potensial, maka ion-ion yang bermuatan positif (Naj akan bergerak ke arah kutub negatif (katoda) dan ion-ion yang bermuatan negatif (Cl) akan bergerak ke arah kutub positif (anoda). Meski pun dalam larutan garam tersebut terdapat air, dan ion-ion H dan OH- yang ada juga bergerak masing-masing ke arah kutub negatif dan kutub positif, tetapi konsentrasi kedua ion tersebut sangat kecil dn konduktivitas air lebih kecil daripada konduktivitas garam sehingga gerakannya umumnya diabaikan. Molekul-molekul dapat bermuatan positif atau pun negatif misalnya protein dan turunannya atau bahkan tidak bermuatan misalnya lemak dan karbohidrat. Dalam hal ini molekul-molekul yang bermuatan juga akan bergerak ke arah kutubkutubnya. Ion-ion dan molekul-molekul bergerak ke arah kutub-kutubnya dengan kecepatan tertentu yang dapat berbeda-beda. Faktor-faktor yang mempengaruhi kecepatan gerakan ion dan molekul adalah besarnya tegangan medan listrik dan jumlah muatan yang dibawa oleh ion. Besarnya kecepatan juga dipengaruhi oleh besarnya koefisien friksional (gesekan), dan viskositas larutan. Masih ada beberapa faktor lain yang berpengaruh pada kecepatan gerak ion antara lain ukuran (berat dan besar) ion. Sering kali ukuran ion atau molekul dikaitkan dengan massanya. Jumlah muatan dan besarnya massa saling mempengaruhi
Universitas Gadjah Mada
kecepatan bergerak molekul dan dinyatakan sebagai faktor rasio jurnlah massa dengan muatan atau “c-rn ratio” atau dinarnakan pula faktor densitas muatan (charge density). Makin besar c-rn ratio suatu ion atau molekul maka akan rnakin cepat ion atau rnolekul tersebut bergerak. Itulah sebabnya ion-ion dengan perbedaan ukuran akan bergerak di dalarn medan listrik dengan kecepatan yang berbeda. Ion-ion dan juga rnolekulmolekul yang kecil tetapi mernpunyai muatan yang banyak akan bergerak lebih cepat daripada ion-ion atau molekul-molekul yang besar tetapi rnuatannya sedikit. Muatan yang dibawa oleh ion atau molekul sangat tergantung pada lingkungannya. Pada keadaan netral, ion dan molekul boleh dikatakan tidak bermuatan, tetapi pada keadaan asam, ion dan molekul akan lebih banyak bermuatan positif, oleh karena itu jika dilektroforesis akan bergerak ke arah kutub negatif. Sebaliknya pada lingkungan basis, ion dan molekul akan lebih banyak bermuatan negatif dan jika dilektroforesis akan bergerak ke arah kutub positif. Elektroforesis ion dan molekul pada keadaan netral tidak akan rnenyebabkan mobilitas apa-apa. Oleh karena itu penggunaan larutan penyangga (buffer) sangat menentukan mobilitas ion dan molekul selarna proses elektroforesis. Dengan demikian pemilihan larutan penyangga yang cocok menjadi persyaratan utama sebelurn mengerjakan elektroforesis. Juga harus diperhatikan pada pemilihan larutan penyangga ialah jangan sampai larutan penyangga tersebut dapat mengadakan reaksi dengan komponen-komponen yang akan dipisahkan. Sebagai contoh larutan penyangga borat kurang balk untuk digunakan memisahkan komponen-komponen karbohidrat karena borat dapat membentuk senyawa komplek dengan karbohidrat. Seperti telah disinggung bahwa besarnya konduktivitas akan mempengaruhi mobilitas ion dan molekul. Di dalam hal pemilihan larutan penyangga untuk elektroforesis, konsentrasi yang tinggi konduktivitasnya juga tinggi. Secara umum jika molaritas larutan penyangga tinggi akan menghasilkan pemisahan yang balk, yaitu pita-pita yang sempit, tetapi memerlukan waktu lebth lama danpada memakai larutan penyangga dengan molaritas rendah. Di dalam praktek sering digunakan molaritas larutan penyangga antara 0,05-0, 10M. Faktor yang juga berpengaruh pada kecepatan gerak ion dan molekul adalah besarnya voltase dan aliran listrik atau besarnya tegangan medan listrik yang digunakan untuk elektroforesis. Makin tinggi voltase dan aliran listrik maka akan
Universitas Gadjah Mada
makin cepat terjadinya mobilitas. Meski pun demikian voltase dan aliran listrik yang tinggi dapat menyebabkan timbulnya panas. 3-2 METODA PADA ELEKTROFORESIS
Metoda pada elektroforesis dapat digolongan berdasarkan beberapa hal, yaitu atas dasar media yang digunakan, sistem, konsentrasi media padat, arah pemisahan, dan penggunaannya.
Penggolongan Atas Dasar Media Yang Digunakan Atas dasar media yang digunakan, secara umum elektroforesis digolongan dalam dua metoda, yaitu elektroforesis yang menggunakan media cair (larutan; moving boundary electrophoresis), elektroforesis yang menggunakan media padat, dan elektroforesis yang menggunakan media semi padat. Kedua metoda yang terakhir dikatagorikan sebagai elektroforesis zona. Elektroforesis pada media larutan.- Pada metoda ini hanya digunakan larutan sebagai media pemisahan komponen tanpa menggunakan media penyangga padat. Larutan yang sering digunakan adalah larutan penyangga yang ditempatkan pada tabung berbentuk huruf U. Elektroda-elektrodanya, yaitu kutub positif dan kutub negatif, dimasukkan pada masing-masing mulut tabung sementara contoh (sampel) ditempatkan pada dasar tabung. Jika aliran listrik dihidupkan melalui elektroda positif maka molekul-molekul akan bergerak menuju kutubnya masing-masing. Molekul yang bermuatan postif akan bergerak ke arah katoda dan gerakan mi dinamakan descending boundary. Molekul yang bermuatan negatif akan bergerak ke arah anoda dan gerakan mi dinamakan ascending boundary. Dalam hal ini mobilitas molekul dipengaruhi oleh besarnya densitas massa dan pH larutan penyangga yang digunakan. Moteda ini merupakan metoda yang paling sederhana, tetapi tidak populer oleh karena sulit untuk mengambil hasilnya. Dengan demikian metoda ini lebih sesuai untuk keperluan analisis daripada untuk keperluan preparatif (produksi). Elektroforesis pada media padat. - Metoda ini menghasilkan pemisahan yang lebih balk serta lebih reproduktif daripada elektroforesis yang menggunakan media cair. Media yang dapat digunakan untuk keperluan ini adalah kertas saring seperti yang banyak digunakan pada kromatografi kertas, lapis tipis selulosa asetat, atau lapis tipis yang sering digunakan pada kromatografi lapis tipis. Dasar
Universitas Gadjah Mada
pemisahannya tidak berbeda dengan elektroforesis pada media cair, yaitu tergantung pada densitas muatan dan lingkungannya. Metoda ini kini banyak sekali digunakan untuk keperluan analisis atau untuk keperluan produksi (preparatif). Elektroforesis pada kertas merupakan metoda elektroforesis yang paling sederhana. Kelemahan metoda mi ialah adanya sifat adsorpsi kertas saring sehingga beberapa komponen yang dielektoforesiskan sering tidak muncul meski pun sebenarnya terjadi juga pemisahan. Kelemahan pada elektroforesis kertas dapat diatasi dengan menggunakan lapis tipis misalnya selulosa asetat yang dilapiskan pada lembaran aluminium atau kaca. Sifat adsorpsi selulosa asetat sifat rendah sehingga setelah visualisasi dengan pengecatan akan menjadi lebih baik daripada menggunakan kertas saring. Demikian pula dengan resolusi yang dihasilkan lebih tegas dan pemisahannya berlangsung cepat. Metoda ini banyak digunakan untuk pemisahan protein dalam bentuk serum. Lapis tipis yang banyak digunakan pada kromatografi lapis tipis juga dapat digunakan untuk keperluan elektroforesis. Penggunaan lapis tipis ini mempunyai banyak keuntungan, antara lain sederhana, cepat dan menghasilkan resolusi yang baik, sensitif, dan dapat memanipulasi media penyangga dengan berbagai variasi. Meski pun demikian terdapat pula kelemahannya, yaltu selama proses elektroforesis akan timbul panas yang dapat menyebabkan pengeringan pada lapis tipis. Elektroforesis dapat menggunakan media semi padat. Sebagai bahan semi padat umumnya berupa jeli (gel) seperti misalnya jeli tepung, jeli agar, dan jell poliakrilamida. Salah satu sebab jeli dapat digunakan untuk memisahkan komponen-komponen oleh karena jeli mempunyai struktur jaringan tiga demensi yang poreous. Molekul-molekul yang mempunyai ukuran kecil akan mudah melalui lubang pori-pori, sedangkan molekul-molekul yang besar akan tertahan. Besarnya pori-pori jeli dapat diatur dengan mengatur besarnya konsentrasi bahan yang digunakan untuk membuat jeli. Pada metoda ini mobilitas molekul juga tergantung pada densitas muatannya. Keuntungan elektroforesis dengan media jeli tepung adalah karena media ini dapat digunakan untuk memisahkan dalam jumlah banyak. Akan tetapi kelemahannya adalah komponen-komponen yang sudah terpisahkan sering kaii tercemar oleh konstituen karbohidrat yang berasal dan tepung. Keuntungan lainnya, metoda ini sederhana dan mudah dikerjakan, resolusinya berupa pita-
Universitas Gadjah Mada
pita sederhana terutama jika protein yang dipisahkan. Untuk keperluan preparatif, metoda mi kurang baik. Untuk keperluan elektroforesis dengan jeli agar, hasilnya lebih baik daripada menggunakan kertas tetapi tidak sebaik jika menggunakan jeli tepung atau poliakrialimida. Jeli agar juga mempunyai tegangan mekanik yang baik, poriporinya besar sehingga dapat digunakan untuk memisahkan komponenkomponen lipoprotein, protein membran, dan asam nukleat yang ukuran molekulnya besar. Secara kimiawi, agar adalah suatu polisakharida yang diperoleh dan ganggang. Ada dua macam agar, yaitu agarosa umumnya bersifat netral dan agaropektin yang mempunyai gugus-gugus bermuatan negatif yang dapat menyebabkan gerakan elektroendosmotik pada kebanyakan larutan penyangga alkali dan kadang-kadang dapat menyerap protein. Agarosa dapat dibuat dan agar dengan mengendapkan agaropektin yang ada dengan setil pirisidium klorida. Media semi padat yang paling banyak dan populer digunakan adalah jeli akrilamida karena kelebihan-kelebihannya yang tak tertandingi. Kelebihankelebihan yang dimaksud antara lain: a.
Resolusi yang dihasilkan sangat baik
b.
Sangat sesuai untuk memisahkan komponen-komponen yang mempunyai interval berat molekul besar
c.
Jika digunakan larutan penyangga, maka jeli akrilamida dapat digunakan untuk pemisahan komponen pada keadaan asam, netral, atau pun basis.
d.
Jeli poliakrilamida bersifat tembus cahaya sehingga mudah dilakukan pemotretan hasil, fotokopi atau pengukuran dengan spektrofotometri/ densitometri atau radiografimetri
e.
Mudah
memanipulasi
polaritasnya
dengan
mengatur
konsentrasi
poliakrilamida. f.
Jeli poliakrilamida tidak larut pada kebanyakan pelarut.
g.
Metoda ini masih termasuk sederhana untuk dikerjakan.
Jeli poliakrilamida terbentuk oleh karena proses polimerisasi antara dua komponen
monomer,
bisakrilamida
yaitu
akrilamida
(CH2=CHCONH2)
(CH2=CHCONHCH2NHCOCH=CH2)
yang
dan sering
metilenadisebut
akrilamida. Derajad polimerisasinya sangat tergantung pada terjadinya ikatan silang antara dua komponen tersebut. Pori-pori yang dihasilkan oleh jeli poliakrilamida dipengaruhi oleh konsentrasi akrilamida dan bisakrilamida, yang
Universitas Gadjah Mada
menentukan sifat fisik jeli yang meliputi elstisitas, tegangan mekanis, viskositas, dan densitasnya. Polimerisasi terjadi karena adanya komponen-komponen radikal
bebas
misalnya
ion-ion
persulfat
atau
ion-ion
riboflavin
yang
terdekomposisi oleh cahaya. Jeli akrilamida sangat populer digunakan untuk memisahkan komponen protein, peptida, atau enzim. Penggolongan Atas Dasar Konsentrasi Media Yang Digunakan Suatu material (sampel) yang akan dipisahkan dengan elektroforesis umumnya terdiri atas komponen-komponen atau molekul-molekul yang ukurannya berbedabeda. Dengan menggunakan elektroforesis jeli, molekul-molekul yang lebih kecil atau yang ukurannya sesuai dengan pori-pori jeli saja yang dapat melaluinya. Kelemahan
penggunaan
jeli
dengan
konsentrasi
tertentu
tidak
dapat
menghasilkan pemisahan yang sempurna karena molekul-molekul yang tertahan atau yang lobs poripori belum tentu mempunyai ukuran yang sama. Dengan menggunakan konsentrasi jeli
yang
dibuat bertingkat
dapat mengatasi
kelemahan tersebut. Umumnya konsentrasi awalnya adalah rendah sedangkan konsentrasi akhirnya tinggi. Dengan demikian molekulmolekul yang besar akan tertahan lebih dahuk, sedangkan molekulmolekul yang lebih kecil akan tertahan kemudian. Masing-masing molekul akan berhenti bergerak pada tempat-tempat pada saat poripori jeli sudah tidak memungkinkan untuk dilaluinya karena ukuran molekul lebih besar daripada lubang porinya. Dengan demikian jeli bertindak semacam penyaring bertingkat, dan pemisahan molekulmolekul akan menjadi lebih sempurna. Elektroforesis berlangsung sampai sistem mencapai keseimbangan dan semua molekul berhenti bergerak. Hasil yang diperoleh merupakan pita-pita yang tipis. Perlu ditekankan bahwa mobilitas molekul-molekul lebih banyak disebabkan oleh karena ukurannya. Molekul yang kecil dengan muatan sedikit dapat bergerak mendahului molekul yang besar meski pun muatannya banyak. Metoda ini baik digunakan untuk memisahkan protein asli (native, bukan turunan) dan dalam hal ini penambahan SDS (sodium dodecyl sulphate) boleh ditiadakan. Penggolongan Atas Dasar Sistem Elekttroforesis
Sistem kontinyu dan diskontinyu.- Larutan penyangga adalah suatu yang sangat penting pada elektroforesis jeli, baik untuk membuat jelinya sendiri mau
Universitas Gadjah Mada
pun untuk preparasi sampel atau untuk membuat medan listrik. Jika semua larutan penyangga yang digunakan mempunyai pH yang sama dan tidak mengalami
perubahan
selama
elektroforesis,
metoda
ini
dinamakan
elektroforesis sistem kontinyu. Sebaliknya jika larutan penyangga yang digunakan untuk membuat jeli dan medan histrik berbeda dengan larutan penyangga yang digunakan untuk preparasi sampel, maka elektroforesis demikian dinamakan elektroforesis sistem diskontinyu. Preparasi elektroforesis kontinyu dalam praktek tidak menimbulkan kesulitan, tetapi pada elktroforesis diskontinyu diperlukan tambahan jeli (stacking gel) yang diletakkan di atas jeli pemisah. Pada umumnya pada elektroforesis diskontinyu yang berbeda bukan hanya pH larutan penyangga saja tetapi juga komposisi bahan penyangga yang digunakan juga berbeda. Kelebihan elektroforesis sistem diskontinyu adalah jumlah sampel yang diaplikasikan dapat lebih banyak dengan hasil resolusi tetap baik. Sistem desosiasi dan nondesosiasi. - Molekul-molekul tertentu mempunyai struktur yang komplek yang mengandung berbagai ikatan. Contohnya protein mengandung ikatan-ikatan hidrogen, disulfida, hidrofobik, ikatan ionik, dan sebagainya. Sering kali untuk memperoleh hasil pemisahan yang balk, ikatanikatan tersebut perlu diputus. Elektroforesisi yang dikerjakan dengan memutuskan ikatan-ikatan tersebut dinamakan elektroforesis sistem desosiasi, dan sebaliknya jika ikatan-ikatan tersebut
tidak
diputuskan
maka
dinamakan
elektroforesis
nondesosiasi.
Pemutusan ikatan dapat dilakukan dengan menggunakan kebanyakan deterjen, misalnya sosium dodesil sulfat (SDS), urea, senyawa tiol, merkaptoetanol, dll. Sodium dodesil sulfat berperan memecah ikatan nonkovalen, urea dan tiol berfungsi sebagai denaturan protein, dan merkaptoetanol memutus ikatan disulfida. Isoelectric
focusing.-
Elektroforesis
zona
dengan
densitas
bertingkat
dimaksudkan untuk memisahkan molekul-molekul berdasarkan ukurannya. Isoelectric focusing dimaksudkan untuk memisahkan molekul-molekul (terutama protein) berdasarkan titik isoelektriknya. Metoda ini sering disebut sebagai electrofocusing saja. Seperti telah dibahas sebelumnya, mobilitas molekul-molekul tergantung pada jumlah muatan yang dibawa. Jika muatannya banyak maka mobilitasnya cepat. Mobilitas menjadi nol (berhenti) jika molekul tidak mempunyai muatan. Protein
Universitas Gadjah Mada
adalah suatu senyawa organik yang bersifat amfolit, artinya mengandung gugusgugus yang bermuatan positif dan bermuatan negatif. Muatan yang menentukan sifat amfolit protein sangat tergantung pada lingkungannya, yaitu pH. Protein akan bermuatan positif jika pH lingkungannya rendah dan akan bermuatan negatif jika pH lingkungannya tinggi. Pada pH tertentu protein tidak bermuatan dan ini dinamakan titik isoelektrik. Pada titik isoelektrik semua amfolit tidak akan bergerak pada medan listrik. Jika protein dielektroforesiskan dengan metoda ini maka molekul protein akan bergerak menuju titik isoelektriknya dan sesudah mencapai tempat tersebut akan berhenti, sementara protein-protein lainnya tetap akan bergerak menuju titik isoelektriknya masing-masing. Pemisahan protein berdasarkan titik isoelektriknya hanya mungkin dikerjakan jika media yang digunakan mempunyai pH bertingkat. Untuk membuat tingkatan pH dengan dua campuran larutan penyangga sangat sulit, karena meski pun hal
ini
memungkinkan tetapi pada saat elektroforesis berlangsung ion-ion larutan penyangga juga akan bergerak, sehingga akan merusak sifat larutan penyangga tersebut. Sementara itu gerakan molekul-molekul lebih lambat daripada kecepatan kerusakan larutan penyangga itu sendiri. Untuk mengatasi hal tersebut digunakan poliamfolit yang pada umumnya merupakan campuran polimer aminoalifatik dengan asam karboksilat atau asam sulfonat. Dalam perdagangan, poliamfolit banyak diberi nama sebagai ampholin, pharmalyte, dan bilyte. Sistem dua demenst- Operasi elektroforesis biasanya dilakukan hanya searah (satu demensi). Elektroforesis dua demensi, adalah pemisahan molekul-molekul berdasarkan mobilitas dua arah. Prinsip kerjanya seperti pada kromatografi kertas atau lapis tipis dua arah. Elektroforesis konveksi, merupakan kombinasi antara elektroforesis dengan difusi panas. Mobilitas molekul terjadi dua arah, yaitu arah horizontal mengikuti proses elektroforesis dan arah vertikal mengikuti tingkatan panas. 3-3 APLIKASI ELEKTROFORESIS LAINNYA Teknik-teknik elektroforesis lainnya antara lain: a.
Imonoelektroforesis, ialah teknik elektroforesis yang digunakan untuk mendeterminasi konsentrasi antigen.
Universitas Gadjah Mada
b.
Isatochophoresis, ialah teknik elektroforesis yang dimaksudkan untuk memisahkan molekul-molekul hanya berdasarkan jumlah muatannya dan bukan berdasarkan ukuran molekul.
c.
Elektrodentasi.
Semula
metoda
ini
dinamakan
elektrodialisis
yang
dimaksudkan untuk memurnikan koloida. Prinsipnya adalah jika larutan koloidal dialiri arus listrik, maka akan terjadi pemisahan menjadi dua bagian satu diantaranya koloida. Dua lapisan yang dapat terpisah dapat dibedakan dari warnanya atau dan refraksi indeknya. Cara ini banyak digunakan untuk memurnikan hemoglobin dan serum albumin. 3-4 PERALATAN ELEKTROFORESIS
Elektroforesis kertas dan lapis tipis.- Peralatannya adalah sebuah tangki yang mempunyai tiga bagian. Kedua bagian di tepi diisi dengan larutan penyangga sedangkan bagian tengahnya diisi dengan air untuk menjaga kelembaban. Satu lembar kertas saring diletakkan pada dudukan yang terdapat di dalam tangki tersebut. Tepi yang satu dimasukkan ke dalam salah satu larutan penyangga dan tepi lain yang berlawanan dimasukkan ke dalam larutan penyangga yang lain. Ke dalam masing-masing larutan penyangga dimasukkan anoda dan katoda. Sampel dimuatkan pada tengah kertas berupa garis memanjang atau noda. Alat kemudian ditutup untuk menghindari penguapan larutan penyangga, dan arus listrik dialirkan. Pemisahan akan terjadi, molekul yang bermuatan positif akan bergerak ke arah katoda dan molekul yang bermuatan negatif akan bergerak ke arah anoda, sedangkan molekul yang bermuatan netral tidak akan bergerak atau tetap tinggal di tengah-tengah kertas. Molekul yang bermuatan banyak akan bergerak lebih cepat daripada yang bermuatan sedikit. Hasil elektroforesis dapat diketahui dengan visualisasi yang dapat dikerjakan dengan pengecatan atau dengan metoda lainnya (penyinaran, pemanasan, dll).
Universitas Gadjah Mada
Peralatan elektroforesis kertas atau lapis tipis Elektroforesis dengan media jeli. - Ada dua macam peralatan yang dapat digunakan untuk melakukan elektroforesis dengan media semipadat. Yang pertama berbentuk tabung yang ujung-ujungnya terbuka. Kedalam tabung di masukkan jeli sedangkan masing-masing ujung tabung dihubungkan dengan larutan penyangga yang diberi katoda dan anoda. Tipe yang kedua dengan menggunakan dua pelat yang di antaranya dimasukkan jeli sehingga jeli berbentuk lembaran (slab). Dua tepi yang berlawanan (biasanya tepi atas dan tepi bawah) dihubungkan dengan larutan penyangga yang diberi katoda dan anoda.
A
B
C
D
Peralatan elektroforesis dengan media jeli. A dan C masing-masing elektroforesis tabung dan lembaran (slab) sistem kontinyu. B dan D masing-masing elektroforesis tabung dan lembaran (slab) sistem diskontinyu
Universitas Gadjah Mada
3-5 OPERASIONAL ELEKTROFORESIS DENGAN MEDIA SEMI PADAT
Persiapan Larutan Penyangga Larutan penyangga terutama digunakan untuk membuat medan listrik. Larutan penyangga untuk membuat medan listrik lebih populer dinamakan sebagai larutan penyangga reservoir. Larutan penyangga yang digunakan dalam elektroforesis kertas atau lapis tipis tergantung pada komponen yang akan dipisahkan. Untuk pemisahan molekulmolekul protein dapat digunakan berbagai larutan penyangga, antara lain larutan penyangga barbiton pH 8,6, larutan penyangga Na-tetraborat pH 8,6, larutan penyangga Na-fosfat pH pH 7,4 atau pH 6,0, larutan penyangga asam format pH 1,9, larutan penyangga ftalat pH 4,0, larutan penyangga borat pH 10,0, larutan penyangga Na-karbonat pH 11,5, dan larutan penyangga piridin asetat, pH3,5— pH6,5. Pada elektroforesis jeli, larutan penyangga selain digunakan untuk membuat medan listrik juga untuk membuat jelinya sendiri. Tergantung pada sistem elektroforesis yang digunakan, larutan penyangga untuk peparasi jeli dan untuk membuat medan listrik dapat sama atau dapat berbeda baik pHnya mau pun komposisi bahannya. Pemiihan larutan penyangga pada elektroforesis dengan media jeli harus dilakukan dengan cermat sesuai dengan komponen yang akan dipisahkan. Selain tergantung pada jeli yang digunakan juga harus diperhatikan komponen yang akan dipisahkan. Berbagai larutan penyangga yang digunakan pada elektroforesis dengan media jeli untuk pemisahan protein: a.
Elektroforesis dengan media jeli tepung antara lain larutan penyangga fosfat pH 7,4, larutan penyangga antrium asetat pH 5,5, larutan penyangga antrium asetat pH 5,5, larutan penyangga tris-EDTA pH 8,6, larutan penyangga asam borat NaOH pH 8,5, larutan penyangga asam format NaOH pH 3,1, dan larutan penyangga tris-asam sitrat pH 8,6.
b.
Elektroforesis dengan media jeli agar antara lain larutan penyangga asam asetat 0, 1M pH 4,0, larutan penyangga asetat-EDTA 0, 1M pH 4,5, larutan penyangga barbiton-asetat D, 1 M pH 8,6, larutan penyangga barbitonkalsium laktat pH 8,6, larutan penyangga tris-EDTA borat pH 9,0, dan larutan penyangga glisin 0,1M pH 9,0.
c.
Elektroforesis dengan media jeli poliakrilamida antara lain larutan penyangga tris pH 6,8, 7,5, 8,06, 8,15, 8,4, larutan penyangga fosfat pH 2,15 7,2 atau
Universitas Gadjah Mada
12,43, larutan penyangga citrat pH 3,06 atau pH 4,76, larutan penyangga asetat pH 5,23 atau pH 5,40, dan larutan penyangga format pH 3,75. Persiapan Jeli Jeli tepung umumnya dipreparasi dan tepung kentang. Meski pun demikian berbagai tepung yang lain seperti tepung kasava (ketela pohung) dan tepung ketela rambat juga sering digunakan. Tepung dicampur dengan larutan penyangga yang akan digunakan pada konsentrasi tertentu. Setelah terjadi suspensi yang homogen kemudian tepung dipanaskan sampai terjadi jeli. Larutan jeli yang masih dalam keadaan panas kemudian dimasukkan ke dalam tabung atau kompartemen pelat yang akan digunakan untuk elektroforesis dan ditunggu sampai memadat dan dingin (biasanya memerukan waktu 2-3 jam). Jika tidak segera digunakan sebaiknya disimpan dahulu pada yang dingin bersuhu rendah (± 2°C) selama semalam. Media agar dipreparasi dengan cara mencampur agar dengan larutan penyangga kemudian dipanaskan sampai teijadi jeli yang transparan. Jumlah agar yang digunakan tergantung konsentrasi yang dikehendaki. Dapat ditambahkan zat penghambat bakteri jika diperlukan seperti natrium azida (0,1%) atau mertiolat (0,01%). Jeli agar hangat (±50°C) kemudian dituangkan ke dalam tabung atau kompartemen pelat yang akan digunakan untuk elektroforesis dan ditunggu sampai memadat dan dingin. Sebelum digunakan sebaiknya disimpan dahulu pada suhu rendah (4°C) selama 24 jam. Elektroforesis dengan media poliakrilamida pada umumnya dilakukan dengan berbagai sistem tergantung pada penggunaannya. Oleh karena itu preparasi jeli poliakrilamida sedikit lebih komplek. Komposisi bahan yang digunakan untuk membuat jeli yang dipersiapkan untuk elektroforesis sistem kontinyu, diskontinyu, desosiasi atau nondesosiasi masing-masing berbeda. Berikut disampaikan beberapa resepnya.
Universitas Gadjah Mada
Tabel 4. Resep untuk membuat jeli poliakrilamida untuk elektroforesis system kontinyu nondesosiasi
Tabel 5. Resep untuk membuat jell poliakrilamida untuk elektroforesis sistem diskontinyu nondesosiasi
Tabel 6. Resep untuk membuat jell poliakrilamida untuk elektroforesis sistem kontinyu desosiasi
Universitas Gadjah Mada
Tabel 7. Resep untuk membuat jeli poliakrilamida untuk elektroforesis sistem diskontinyu desosiasi
Aplikasi Sampel Sampel protein dan turunannya.- Protein murni pada umumnya mudah dilarutkan dalam larutan penyangga, tetapi yang terpenting protein harus dalam keadaan denaturasi sempurna dan tereduksi ikatan disulfidanya. Supaya protein dalam kondisi seperti itu, maka larutan protein dapat dipanaskan dan ke dalamnya
ditambahkan
merkaptoetanol,
denaturan
guanidin
seperti
hidrokiorida,
dll.
urea,
sodium
Proses
dodesil
pemanasan
sulfat, protein
mempunyai keuntungan lain ialah jika protein merupakan enzim, maka pemanasan akan menghentikan aktivitasnya. Konsentrasi protein dibuat antara 0,05- 1 ,Omg/ ml, sedangkan jumlahnya pada imumnya berkisar antara 20200µ1. Sampel nonprotein. - Preparasi sampel nukleotida atau turunannya dan karbohidrat cukup dengan dilarutkan dalam larutan penyangga yang sesuai. Yang terpenting adalah pada waktu ekstraksi komponen tersebut harus diyakini dalam keadaan murni. Operasi Elektroforesis Besarnya kekuatan tegangan dan arus listrik dapat divariasi sesuai dengan kebutuhan. Makin tinggi tegangan listrik dan arus listrik, makin cepat proses elektroforesis, tetapi akan timbul panas. Dengan tegangan listrik 100V dan arus
Universitas Gadjah Mada
listrik 3mA elektroforesis pada media agar memerlukan waktu kurang Iebih 6 jam untuk memisahkan komponen protein. Elektroforesis pada media tepung umumnya dioperasikan pada 100 V dengan arus listrik 5mA dan memerlukan waktu 17-19 jam untuk memisahkan protein atau dengan 220V 5mA dengan waktu 7-9 jam. Elektroforesis pada media poliakrilamida memerlukan kekuatan tegangan listrik 200 V dan arus listrik 30mA untuk memisahkan komponen protein selama 6 jam. Meski pun demikian, kondisi operasi elektroforesis dapat divariasi sesuai dengan kebutuhan. Akan tetapi perlu diingat bahwa makin tinggi kekuatan tegangan dan arus listrik dapat menimbulkan timbulnya panas yang dapat berakibat pada penguapan larutan penyangga, kerusakan jeli, perubahan sifat komponen, dan lain sebagainya. Sebaliknya penggunaan tegangan dan arus listrik yang rendah, meski pun hasilnya dapat baik tetapi mobilitas komponen yang memisah akan sangat lambat sehingga elektroforesis menjadi lama. Visualisasi Hasil Setelah elektroforesis dilakukan selesai, hasilnya harus divisualisasi untuk mengetahui resolusinya. Visualisasi umumnya dikerjakan dengan pengecatan. Berbagai macam cat yang banyak digunakan misalnya bromofenol biru, naftalena hitam 12B, sudan hitam B, coomassie biru R250, reagen asam schiff periodat, reagen ninhidrin, dan lain sebagainya tergantung pada jenis komponen yang dipisahkan. Jeli direndam dalam larutan cat selama beberapa waktu sehingga cat akan bereaksi dengan komponen memberikan warna yang dapat diamati. Kelebihan cat dihilangkan dengan pencucian dengan larutan tertentu, misalnya asam asetat, sampai jeli yang tidak mengandung komponen (latar belakang) menjadi terang (transparan). Identifikasi dan Interpretasi Untuk mengetahui jenis komponen yang ada perlu dicocokan dengan standar yang dielektroforesiskan dengan cara yang sama. Masing-masing, komponen dan standar, dihitung faktor retardasinya dan jika keduanya mempunyai nilai yang sama, maka jenis komponen yang memisah dapat diketahui. Hasil akhir elektroforesis akan lebih akurat jika identifikasi dilakukan juga dengan menggunakan teknik densitometri. Prinsipnya mirip dengan peneraan dengan menggunakan spektrofotometer. Peneraan dilakukan dengan proses “scanning”.
Universitas Gadjah Mada
Teknik lainnya yang dapat digunakan adalah dengan penggunaan metoda otoradiografimetri. 3-6 LATIHAN PEMAHAMAN MATERI 1.
Terangkan dengan jelas prinsip kerja elektroforesis!
2.
Pada proses hidrolisis protein akan dihasilkan peptida-peptida yang mempunyai polaritas berbeda-beda. Diskusikan peptida yang mana akan memisah terlebih dahulu dan yang terakhir!
3.
Berikan alasan dengan penjelasan mengapa pemilihan larutan penyangga menjadi penting pada elektroforesis!
4.
andaikata anda diminta memilih metoda elektroforesis untuk memisahkan protein yang terdapat pada daging ikan, metoda mana yang anda gunakan ?
5.
Rancang suatu elektroforesis untuk memisahkan jenis-jenis enzim yang ada dalam sel bakteri!
6.
Komponen-komponen karbohidrat dan lipida dalam keadaan “native” pada umumnya tidak bermuatan. Bagaimana penjelasan yang anda berikan untuk melakukan pemisahan dengan elektroforesis komponen-komponen tersebut!
Universitas Gadjah Mada
