Panjang primer yang umum digunakan berkisar 20-30 basa (Saiki 1989).
Elektroforesis Gel Agarosa untuk Analisis Fragmen Elektroforesis merupakan pergerakan zat bermuatan listrik akibat adanya pengaruh medan listrik. Molekul DNA termasuk senyawa bermuatan negatif. Sifat ini menjadikan molekul DNA yang ditempatkan pada medan listrik akan bermigrasi menuju kutub positif. Kecepatan migrasi molekul DNA tergantung pada konsentrasi gel yang digunakan, ukuran molekul yang dianalisis, serta tegangan listrik yang diberikan. Salah satu gel yang dapat digunakan pada elektroforesis adalah gel agarosa. Agarosa digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi, dan memurnikan fragmen-fragmen DNA (Sambrook et al.1989). Mobilitas fragmen DNA pada gel elektroforesis sangat dipengaruhi oleh komposisi dan kelarutan ion buffer elektroforesis. Jika konsentrasi ion-ion sangat sedikit maka konduktifitas listrik sangat kecil dan migrasi DNA menjadi lambat. Konsentrasi ion yang berlebih akan mengakibatkan gel mencair dan DNA terdenaturasi. Selain buffer elektroforesis, teknik elektroforesis DNA juga memerlukan loading buffer. Buffer ini berfungsi meningkatkan densitas sampel sehingga fragmen tersebut berada di dasar well dan tidak menyebar. Fungsi lainnya adalah memberi warna pada fragmen DNA sehingga mempermudah pengamatan proses elektroforesis. Buffer ini dapat juga membantu pergerakan sampel ke anoda. Ukuran fragmen DNA hasil pemotongan dengan endonuklease restriksi dapat ditentukan dengan memakai penanda DNA (marker). Penanda DNA adalah fragmen DNA yang telah diketahui ukurannya (Sambrook et al.1989).
BAHAN DAN METODE Alat dan Bahan Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini adalah tabung mikro 500 µL, pipet mikro, alumunium foil, parafilm, sarung tangan, cawan petri, Erlenmeyer, gelas piala, sudip, peralatan elektroforesis, gel doc, sentrifus, ose, stirer, laminar air flow cabinet, inkubator bergoyang, autoklaf, penangas air, mesin PCR, penangas air bergoyang, dan lemari es.
Bahan-bahan yang digunakan adalah E. coli galur XL1-Blue, gen stilbena sintase, plasmid pGEM-T Easy, pCAMBIA 1303, Agrobacterium tumefacians galur AGL-0, enzim restriksi Nco1 dan Spe1, kit elusi dari Invitrogen, kit ligasi dari promega, kit isolasi plasmid dari Roche, kit elusi dari Qiagen, es batu, TBE 0.5x, EtBr, loading dye, marker 1 Kb plus, media luria bertani (LB) yang terdiri atas tripton, ekstrak kamir dan NaCl, media luria bertani agar (LA) yang terdiri atas tripton, ekstrak kamir, NaCl dan agar , KOH 10 N, HCl 5M, bufer ligasi, T4 ligase, glukosa, Ampisilin 100 mg/L, IPTG 0.1 mM, X-Gal 40 mg/L, kanamisin 100000 mg/L, rifampisin 25000 mg/L, EDTA, dNTP, primer M13 F, primer M13 R, Taq polimerase, MW, Mg2+ dan buffer.
Metode Penelitian Purifikasi Produk PCR (Stilbena Sintase) Penelitian ini dimulai dari purifikasi terhadap produk PCR yang didapatkan. Purifikasi ini menggunakan high pure plasmid isolation kit dari Invitrogen. Fragmen dipotong dari gel menggunakan pisau skalpel, kemudian ditimbang dan dilarutkan dengan buffer GS1. Penimbangan dilakukan untuk menentukan banyaknya buffer GS1 yang harus ditambahkan. Perbandingan antara sampel dan buffer GS1 adalah 1:3. Selanjutnya, campuran diinkubasi pada suhu 50 oC selama 15 menit, setiap 3 menit larutan dikocok dengan membolak-balikan tabung secara perlahan dan setelah larut campuran dikocok setiap 5 menit. Larutan kemudian ditransfer ke dalam kolom, lalu disentrifugasi dengan kecepatan 12000 rpm selama 2 menit pada suhu 25oC. Tahap selanjutnya adalah sebanyak 500 µL buffer GS1 ditambahkan ke dalam kolom dan diinkubasi selama 1 menit, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 12000 rpm selama 2 menit. Sampel yang berada di dalam kolom kemudian ditambah dengan 700 µL W9 dan diinkubasi selama 5 menit, sampel selanjutnya disentrifugasi kembali dengan kecepatan 12000 rpm selama 2 menit untuk menghilangkan sisa etanol. Setelah itu, 30 µL buffer TE yang sudah dipanaskan (65-70oC) dimasukkan ke dalam sampel, kemudian diinkubasi selama 1 menit dan disentrifugasi dengan kecepatan 12000 rpm selama 3 menit. Hasil purifikasi kemudian diuji dengan elektroforesis gel agarosa 1% sebanyak 2 µL.
Kloning Gen Stilbena Sintase (STS) ke dalam Plasmid pGEM-T Easy Kloning gen diawali dengan ligasi gen STS dengan pGEM-T Easy. Ligasi dilakukan dengan menggunakan kit dari Promega. Sebanyak 5 µL buffer ligase dicampurkan dengan 0.5 µL plasmid pGEMT Easy , 1 µL T4 Ligase dan 3.5 µL gen stilbena sintase. Kemudian campuran diinkubasi pada suhu 25 oC selama 1 jam atau pada suhu 4 oC selama satu malam. Hasil ligasi selanjutnya ditransformasikan ke E.coli XL1-Blue Transformasi gen hasil ligasi ke bakteri E.coli XL1-Blue menggunakan metode heat shock. Sebanyak 10 µL hasil ligasi dimasukkan ke dalam 200 µL sel kompeten dan dikocok perlahan sampai campuran merata. Selanjutnya, campuran diinkubasi di dalam es selama 30 menit, kemudian diinkubasi pada suhu 42 oC selama 50 detik. Tabung yang telah diinkubasi pada suhu 42 oC kemudian diinkubasi di dalam es selama 10 menit. Larutan kemudian ditambah dengan 800 µL LB glukosa dan dikocok menggunakan inkubator bergoyang dengan kecepatan 150 rpm pada suhu 37 oC selama 90 menit. Selanjutnya, larutan diambil dan disebar ke media luria bertani agar (LA) ditambah ampisilin 100 ppm, isopropil tiogalaktosida (IPTG) 0.1 mM dan X-Gal 40 mg/L. Selanjutnya dilakukan seleksi putih biru untuk membedakan sel yang mengandung plasmid rekombinan dengan sel yang tidak mengandung plasmid rekombinan.
Konfirmasi Koloni Transforman yang Membawa Fragmen Sisipan Konfirmasi koloni transforman dilakukan dengan teknik PCR koloni. PCR koloni dilakukan menggunakan mesin PCR (Biometra T-Personal). Proses ini diawali oleh pemecahan sel dengan pemanasan 96 o C selama 5 menit, kemudian suhu turun menjadi 50 oC dan berlangsung selama 90 detik, suhu naik kembali menjadi 96 oC selama 90 detik, lalu 90 detik selanjutnya pada suhu 45 oC, 1 menit pada suhu 96 oC dan 40 oC selama 1 menit. Setelah pemanasan pada proses lisis, campuran PCR (buffer, MW, dNTPs, primer universal M13 F, M13 R dan Taq polimerase) ditambahkan pada setiap sampel. Proses PCR dilanjutkan kembali dengan suhu 94 oC selama 30 detik, 55 oC selama 1 menit, dan 2 menit pada 72 o C selama 30 siklus dan selanjutnya 72 oC selama 5 menit. Hasil PCR koloni diverifikasi pada gel agarosa. Koloni terpilih
kemudian dikultur dalam medium LB cair yang mengandung ampisilin dan diinkubasi pada inkubator bergoyang suhu 37 oC dengan kecepatan 150 rpm. Selanjutnya dilakukan isolasi plasmid menggunakan High Pure Plasmid Isolation Kit (Roche) dari kultur bakteri yang tumbuh. Hasil isolasi plasmid selanjutnya diverifikasi kembali pada gel agarosa dan dilakukan sekuensing.
Sekuensing Fragmen Terklon Pengurutan basa (sekuensing) fragmen gen terklon dilakukan di Lembaga Molekuler Eijkman Jakarta menggunakan primer universal M13 F dan M13 R. Hasil sekuen fragen selanjutnya dianalisis dengan program bioinformatika.
Isolasi DNA Plasmid Prosedur yang digunakan mengikuti prosedur High Pure Plasmid Isolation Kit dari Roche. Isolasi DNA plasmid dilakukan terhadap koloni yang berdasarkan hasil PCR koloni diketahui mengandung plasmid terinsersi fragmen yang diinginkan. Koloni tersebut dikulturkan dalam media luria bertani (LB) yang mengandung ampisilin kemudian diinkubasi selama 16 jam pada suhu 37 oC dengan pengocokan 150 rpm . DNA plasmid yang diperoleh dielektroforesis dengan gel agarosa 1% untuk melihat kemurniannya. Sebanyak 3-4 mL kultur sel Escherichia coli diransfer ke dalam tabung mikro dan disentrifugasi dengan kecepatan 8000 rpm pada suhu 25 oC selama 2 menit. Pellet yang dihasilkan kemudian diresuspensikan dengan suspension buffer 250 µL dan ditambahkan lysis buffer selanjutnya diaduk 6-8 kali. Campuran kemudian diinkubasi selama 5 menit pada suhu ruang dan ditambah dengan 350 µL binding buffer dan diaduk 3-4 kali, campuran diinkubasi kembali didalam es selam 5 menit. Selanjutnya, campuran disentrifugasi dengan kecepatan 13000 rpm selama 10 menit pada suhu 25 oC, supernatan kemudian ditransfer ke kolom dan disentrifugasi kembali dengan kecepatan 13000 rpm selama 1 menit pada suhu 25 oC. Cairan di bawah kolom dibuang dan ditambah dengan 500 µL wash buffer 1. Selanjutnya, larutan disentrifugasi dengan kecepatan 13000 rpm selama 1 menit pada suhu 25 oC, cairan di bawah kolom dibuang dan ditambah dengan wash buffer 2. Larutan kemudian disentrifugasi dengan kecepatan
13000 rpm selama 1 menit pada suhu 25 oC, cairan di bawah kolom dibuang selanjutnya disentrifugasi kembali. Sebanyak 30 µL elution buffer selanjutnya ditambahkan ke dalam kolom dan disentrifugasi dengan kecepatan 13000 rpm selama 1 menit pada suhu 25 o C, hasil purifikasi kemudian diuji dengan elektroforesis gel agarosa 1%.
Pemotongan pGEM-T Easy dan Pemurnian Gen Stilbena Sintase Plasmid pGEM-T Easy yang mengandung gen stilbena sintase dipotong menggunakan enzim restriksi Spe1 dan Nco1. Sebanyak 49 µL DNA plasmid rekombinan dicampur dengan 7 µL dH2O, 7 µL buffer 2 SpeI, 7 µL enzim SpeI dan 7 µL enzim NcoI . Campuran diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37 oC dan kemudian dielektroforesis menggunakan gel agarosa 0.6%. Setelah elektroforesis selesai, gel diletakkan pada gel doc. Selanjutnya fragmen yang berukuran 1500 bp dipotong menggunakan skalpel untuk dipurifikasi.
Kloning Gen Stilbena Sintase dengan Vektor Ekspresi pCAMBIA 1303 Sebelum diligasi dengan gen stilbena sintase, plasmid pCAMBIA 1303 dipotong terlebih dahulu dengan enzim restriksi Spe1 dan Nco1. Pemotongan ini dilakukan pada suhu 37 oC selama 1 jam. Ligasi dilakukan menggunakan T4 ligase dan buffer ligase dari Promega. Sebanyak 5 µL gen stilbena sintase yang telah dipurifikasi dicampur dengan buffer ligase sebanyak 10 µL, 3 µL plasmid pCAMBIA 1303 dan 2 µL T4 ligase di dalam tabung mikro 500 µL . Selanjutnya, tabung ditutup dengan parafilm, diaduk menggunakan alat spin kira-kira 1 menit, kemudian diinkubasi pada suhu 4 oC selama 16 jam. Transformasi gen stilbena sintase ke dalam bakteri E.coli XL1-Blue menggunakan metode heat shock. Sebanyak 10 µL hasil ligasi dimasukkan ke dalam 200 µL sel kompeten dan dikocok perlahan sampai campuran merata. Selanjutnya, campuran diinkubasi di dalam es selama 30 menit, kemudian diinkubasi pada suhu 42 oC selama 50 detik. Campuran kemudian diinkubasi di dalam es selama 10 menit, ditambah dengan 800 µL LB glukosa dan dikocok menggunakan inkubator bergoyang dengan kecepatan 150 rpm pada suhu 37 oC selama 90 menit. Selanjutnya, campuran disebar ke media LA dengan penambahan
kanamisin 25 mg/L kemudian diinkubasi selama 1 malam. Seleksi DNA Rekombinan Setelah diinkubasi semalam, koloni yang terbentuk diambil dengan tusuk gigi dan diberi nomor kemudian dimasukkan ke dalam media LA untuk dibuat duplikatnya dan juga koloni tersebut dikulturkan dalam media LB yang mengandung kanamisin 25 mg/L. Selanjutnya dikocok pada kecepatan 150 rpm selama 1 malam. Hasil kultur selanjutnya diisolasi menggunakan kit dari Qiagen dan ditransformasikan ke dalam Agrobacterium setelah dilakukan analisis restriksi menggunakan enzim Spe1 dan Nco1. Transformasi pCAMBIA 1303-Stilbena Sintase ke dalam Agrobacterium tumefaciens Transformasi pCAMBIA 1303stilbena sintase ke dalam Agrobacterium tumefaciens menggunakan metode heat shock. Sebanyak 10 µL DNA plasmid ditambahkan ke dalam 500 µL sel kompeten Agrobacterium strain AGL-0. Kemudian diinkubasi didalam es selama 15 menit. Selanjutnya, campuran diinkubasi selama 5 menit di nitrogen cair lalu 5 menit pada suhu 37 oC. Campuran kemudian ditambah dengan 1 mL YEP dan diinkubasi selama 3 jam pada suhu 28 oC. Selanjutnya, campuran disentrifugasi 3 menit dengan kecepatan 6000 rpm pada suhu 25 o C. Supernatan dibuang dan 200 µL dicampur dengan pellet. Campuran kemudian disebar ke media LA yang mengandung rifampisin 50 mg/L dan kanamisin 25 mg/L lalu diinkubasi pada suhu 28 oC selama 2 malam dalam keadaan gelap sambil dikocok dengan kecepatan 150 rpm. Seleksi DNA Rekombinan Setelah DNA rekombinan pCAMBIA 1303-stilbena sintase ditransformasikan ke Agrobacterium tumefaciens diinkubasi 2 malam, koloni yang terbentuk diambil dengan tusuk gigi. Kemudian koloni tersebut diberi nomor. Selanjutnya, koloni dimasukkan ke dalam media LA untuk dibuat duplikatnya dan juga koloni tersebut dikulturkan dalam media LB yang mengandung kanamisin 25 mg/L dan rifampisin 50 mg/L. Selanjutnya koloni dalam media LB diinkubasi pada suhu 28 oC sambil dikocok pada kecepatan 150 rpm selama 2 malam kemudian dilakukan isolasi plasmid.
