VALIDASI METODE KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS (KLT)DENSITOMETRI PADA PENETAPAN KADAR KURKUMIN DALAM SEDIAAN CAIR OBAT HERBAL TERSTANDAR (OHT) KIRANTI®
SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm) Program Studi Ilmu Farmasi
Oleh : Yunita Dwi Wulansari NIM : 078114113
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2011
i
ii
iii
Learn from yesterday, live for today, hope for tomorrow. The important thing is not to stop questioning. (Albert Einstein)
As long as we do our best There's no need to regret anything As long as we keep struggling In the end... we are the winner no matter (Anonim)
Karya ini kupersembahkan untuk yang tersayang, Mama, Papa, Kakak, dan Adikku, Teman-teman, serta Almamaterku
iv
v
vi
PRAKATA Puji syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa atas berkat, kasih, penyertaan, dan karuniaNya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul Validasi Metode Kromatografi Lapis Tipis (KLT)-Densitometri pada Penetapan Kadar Kurkumin Dalam Sediaan Cair Obat Herbal Terstandar (OHT) Kiranti®. Skripsi ini disusun sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Farm). Selama perkuliahan, penelitian dan penyusunan skripsi, penulis banyak mendapat bantuan dari berbagai pihak baik berupa bimbingan, dukungan, semangat, kritik maupun saran. Oleh karena itu, pada kesempatan ini penulis ingin menyampaikan ucapan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada 1. Ipang Djunarko, M.Si, Apt selaku Dekan Fakultas Farmasi Sanata Dharma. 2. Christine Patramurti, M.Si., Apt selaku dosen pembimbing sekaligus dosen pembimbing akademik, atas bimbingan, masukan, perhatian, semangat, dan motivasi yang diberikan baik selama perkuliahan, penelitian maupun penyusunan skripsi ini. 3. Jeffry Julianus, M.Si., selaku dosen penguji atas segala arahan, masukan, kritik, dan saran yang telah diberikan kepada penulis 4. Yohanes Dwiatmaka, M.Si., selaku dosen penguji atas segala arahan, masukan, kritik, dan saran yang telah diberikan kepada penulis. 5. Prof. Dr. Sudibyo Martono, M.S., Apt. yang telah bersedia memberikan senyawa standar yang berguna dalam penelitian.
vii
6. Dr. C.J. Soegihardjo, Apt. atas pengetahuan dan diskusi yang telah diberikan kepada penulis. 7. Mas Bimo, Mas Parlan, Mas Kunto, dan Mas Wagiran atas bantuannya selama peneliti bekerja di laboratorium. 8. Segenap dosen dan karyawan atas segala ilmu dan pengalaman yang diberikan, sehingga berguna dalam penyusunan skripsi ini. 9. Eliz dan Veny, sebagai rekan kerja penulis atas segala dukungan, kebersamaan, bantuan, dan semangat yang diberikan baik selama penelitian maupun saat penyusunan naskah skripsi. 10.
Tere, Seno, Lilis, Upil, Lala, Pakdhe, K3n, Benny, dan Pace, sebagai
teman seperjuangan di Laboratorium Kimia Analisis Instrumental atas semangat dan kebersamaannya 11.
Lia, atas dukungan, semangat, bantuan, nasehat, kebersamaan, dan
pengalaman
berharga,
baik
selama
perkuliahan,
penelitian,
maupun
penyusunan skripsi. 12.
Dinar, Anin, Fifi, dan Dika, atas dukungan dan bantuan yang diberikan
kepada penulis. 13.
Yudi, Yemi, Veny, Lilis, dan Devina sebagai teman yang sering satu
kelompok atas pengetahuan dan pengalaman yang diberikan. 14.
Mas Bayu, atas ilmu dan pengalaman yang telah dibagikan sehingga
sangat membantu penulis dalam penyusunan skripsi. 15.
Teman-teman kos Pelangi yang pernah menjadi teman seperjuangan di
Yogyakarta.
viii
16.
Teman-teman BEMF 2009/2010 dan DPMF 2010/2011 atas kebersamaan
dan pengalamannya. 17.
Teman-teman KKN kel 26 XL yang telah menjadi teman yang baik selama
1 bulan di Ngaran, Bantul. 18.
Teman-teman FST 07 atas pengalaman, suka duka, kekompakan dan
kebersamaan yang pasti tak akan terlupakan. 19.
Teman-teman angkatan 2007, atas pengalaman dan kebersamaannya
selama ini. 20.
Semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu persatu oleh penulis,
terimakasih atas bantuan yang diberikan selama ini sehingga penulis bisa menyelesaikan skripsi ini. Penulis menyadari skripsi ini masih memiliki banyak kekurangan. Oleh karena itu, penulis mengharapkan kritik dan saran untuk membantu penulis dalam perkembangan selanjutnya.
Penulis
ix
DAFTAR ISI HALAMAN JUDUL ……………………………………………………......
i
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ………………………........
ii
HALAMAN PENGESAHAN .......................................................................
iii
HALAMAN PERSEMBAHAN ....................................................................
iv
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA .......................................................
v
LEMBAR PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA……………………….
vi
PRAKATA......................................................................................................
vii
DAFTAR ISI..................................................................................................
x
DAFTAR TABEL .........................................................................................
xiv
DAFTAR GAMBAR ....................................................................................
xv
DAFTAR LAMPIRAN..................................................................................
xvi
INTISARI ......................................................................................................
xvii
ABSTRACT ....................................................................................................
xviii
BAB I PENGANTAR ...................................................................................
1
A. Latar Belakang .........................................................................................
1
1. Permasalahan.......................................................................................
3
2. Keaslian penelitian ............................................................................
4
3. Manfaat penelitian ............................................................................
4
B. Tujuan Penelitian .....................................................................................
5
BAB II PENELAAHAN PUSTAKA ..........................................................
6
A. Kurkumin.................................................................................................
6
x
B. Sediaan Cair Oral.....................................................................................
9
C. Obat Herbal Terstandar...........................................................................
10
D. Kiranti.....................................................................................................
11
E. Kromatografi Lapis Tipis.......................................................................
11
1. Tinjauan umum..................................................................................
11
2. Sistem KLT.......................................................................................
15
F. Densitometri...........................................................................................
17
G. Validasi Metode.....................................................................................
19
1. Tinjauan umum..................................................................................
19
2. Parameter validasi..............................................................................
21
H. Landasan Teori........................................................................................
24
I. Hipotesis..................................................................................................
25
BAB III METODE PENELITIAN ..............................................................
26
A. Jenis Rancangan Penelitian.....................................................................
26
B. Variabel Penelitian..................................................................................
26
C. Definisi Operasional...............................................................................
27
D. Bahan Penelitian.....................................................................................
27
E. Alat Penelitian........................................................................................
27
F. Tata Cara Penelitian...............................................................................
28
1. Pembuatan pelarut (metanol pH 4)....................................................
28
2. Pembuatan fase gerak .......................................................................
28
3. Pembuatan larutan baku kurkumin ...................................................
28
4. Penetapan panjang gelombang maksimum .......................................
28
xi
5. Pembuatan kurva baku dan pengamatan nilai Rf .............................
29
6. Penentuan recovery dan Coefficient of Variation .............................
29
7. Penentuan recovery dan Coefficient of Variation dalam matriks sampel........................................................................
30
G. Analisis Hasil..........................................................................................
30
1. Selektivitas ........................................................................................
30
2. Linearitas...........................................................................................
31
3. Akurasi..............................................................................................
31
4. Presisi.................................................................................................
31
5. Range.................................................................................................
31
6. Akurasi pengukuran baku dalam matriks sampel .............................
31
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN....................................................
32
A. Pembuatan metanol pH 4........................................................................
32
B. Pembuatan Fase gerak ...........................................................................
33
C. Pembuatan Larutan Baku ......................................................................
33
D. Penetapan Panjang Gelombang Maksimum...........................................
34
E. Pengamatan Nilai Retardation Factor (Rf) dan Pembuatan Kurva Baku Kurkumin........................................................
36
F. Validasi Metode Analisis.......................................................................
41
1. Selektivitas........................................................................................
41
2. Linearitas..........................................................................................
44
3. Akurasi............................................................................................
44
4. Presisi..............................................................................................
45
xii
5. Range..............................................................................................
46
G. Penentuan Akurasi dan Presisi Baku Kurkumin pada Sampel...............
46
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN...................................................
49
A. Kesimpulan............................................................................................
49
B. Saran......................................................................................................
49
DAFTAR PUSTAKA.................................................................................
50
LAMPIRAN...............................................................................................
54
BIOGRAFI PENULIS...............................................................................
72
xiii
DAFTAR TABEL Tabel I.
Parameter analisis validasi metode…………………………..... 21
Tabel II.
Kriteria rentang recovery yang dapat diterima………………... 22
Tabel III.
Kriteria CV yang dapat diterima……………………………....
22
Tabel IV.
Data replikasi kurva baku kurkumin…………………………..
39
Tabel V.
Data replikasi kurva baku kurkumin dengan penyesuaian nilai AUC…………………………………………………………… 40
Tabel VI.
Perbandingan nilai Rf baku dan sampel, serta nilai resolusi…..
43
Tabel VII.
Data % recovery……………………………………………….
45
Tabel VIII.
Data Coefficient of Variation (CV)……………………………
45
Tabel IX.
Recovery dan CV baku kurkumin dalam matriks sampel……..
48
xiv
DAFTAR GAMBAR Gambar 1.
Struktur molekul kurkuminoid……………………………….
6
Gambar 2.
Tautomerisasi keto-enol kurkumin............................................. 7
Gambar 3.
Reaksi degradasi kurkumin…………………………………..
8
Gambar 4.
Produk fotodegradasi kurkumin...............................................
9
Gambar 5.
Logo Obat Herbal Terstandar………………………………...
10
Gambar 6.
Kiranti Sehat Datang Bulan…………………………………..
11
Gambar 7.
Gugus metilen aktif kurkumin………………………………..
32
Gambar 8.
Spektra baku kurkumin konsentrasi 50 ppm, 100 ppm, dan 175 ppm…………………………………………………….....
35
Gambar 9.
Gugus kromofor dan auksokrom kurkumin..............................
35
Gambar 10.
Baku Kukumin 100 ppm...........................................................
36
Gambar 11.
Interaksi kurkumin dengan fase gerak………………………..
37
Gambar 12.
Interaksi hidrogen kurkumin dengan fase diam………….…...
37
Gambar 13.
Hubungan antara konsentrasi dengan AUC/100 (replikasi
41
III)……………………………………………………………. Gambar 14.
Rf baku kurkumin konsentrasi 100 ppm………………………
43
Gambar 15.
Rf sampel replikasi I………………………………………….
44
Gambar 16.
Range konsentrasi kurkumin………………………………….. 46
Gambar 17.
Kromatogram sampel tanpa penambahan baku kurkumin……. 47
Gambar 18.
Kromatogram sampel dengan penambahan baku kurkumin…..
xv
47
DAFTAR LAMPIRAN Lampiran 1.
Pernyataan jaminan keaslian bahan kurkumin standar hasil sintesis……………………………………………………..… 55
Lampiran 2.
Data penimbangan bahan..…………………………………..
56
Lampiran 3.
Kromatogram seri baku kurkumin replikasi III…………...…
56
Lampiran 4.
Kromatogram validasi metode………………………………. 58
Lampiran 5.
Contoh perhitungan kadar kurkumin………………………...
63
Lampiran 6.
Persamaan kurva baku dan gambar kurva baku kurkumin…..
64
Lampiran 7.
Nilai AUC dan contoh perhitungan recovery kurkumin…….. 65
Lampiran 8.
Contoh perhitungan CV kurkumin…………………………..
Lampiran 9.
Kromatogram sampel tanpa penambahan baku kurkumin…... 66
66
Lampiran 10. Kromatogram sampel dengan penambahan baku kurkumin… 68 Lampiran 11. Contoh perhitungan resolusi…………………………………
69
Lampiran 12. Nilai AUC sampel dan sampel yang diadisi baku kurkumin... 70 Lampiran 13. Contoh perhitungan recovery baku kurkumin dalam sampel..
70
Lampiran 14. Perhitungan CV kadar baku kurkumin dalam sampel……….
71
xvi
INTISARI Kurkumin merupakan senyawa yang berasal dari bahan alamiah dari tanaman obat golongan curcuma yang bermanfaat bagi kesehatan dan banyak digunakan dalam berbagai sediaan obat tradisional. Salah satu sediaan obat tradisional yang mengandung kurkumin adalah sediaan cair obat herbal terstandar merk ‘Kiranti”. Penetapan kadar kurkumin dapat dilakukan dengan metode KLTdensitometri. Oleh karena itu perlu dilakukan validasi metode terlebih dahulu untuk mengetahui metode yang digunakan dapat memberikan hasil yang dapat dipercaya. Penelitian ini merupakan penelitian noneksperimental-deskriptif. Dalam penelitian ini kurkumin dan senyawa-senyawa lain dalam sampel dipisahkan dengan metode KLT dengan fase diam silika gel G 60 dan fase gerak kloroform : asam asetat glasial (95:5), serta dengan jarak pengembangan sejauh 10 cm. Setelah pemisahan senyawa dengan metode KLT, kemudian dilakukan analisis kuantitatif dengan densitometer. Parameter validasi yang diteliti adalah selektivitas, linearitas, akurasi, presisi, dan range. Hasil penelitian menunjukkan metode ini memiliki selektivitas dan linearitas yang baik pada konsentrasi 50-175 ppm (r=0,9999), nilai recovery dan CV berturut-turut untuk konsentrasi kurkumin 50 ppm; 100 ppm; dan 175 ppm 98,95-101,10% dan 1,7%; 98,61-101,79% dan 0,7%; 100,18-103,83% dan 0,9%. Berdasarkan hasil tersebut, maka metode KLT-densitometri ini memiliki validitas yang baik untuk menetapkan kadar kurkumin dalam sampel.
Kata kunci : Kurkumin, KLT, densitometri, validasi metode, obat herbal terstandar
xvii
ABSTRACT Curcumin is compound which comes from plant that are beneficial to health and is widely used in various traditional medicinal. One of traditional medicine which used curcumin is liquid stock of Scientific Based Herbal Medicine Kiranti®. The determination of curcumin can be done with TLCdensitometry method. For that reason, it is important to get validation method first to know the appropriate method can be used to get trustable result. This research is noneksperimental-descriptive research. In this research, curcumin and other compounds in the sample are separated using TLC method with the stationary phase silica gel G 60 and a mobile phase of chloroform: glacial acetic acid (95:5), along with range development for 10 cm. Then quantitative analysis with densitometer can be done. Validation parameter which observed were specificity, linearity, accuracy, precision, and range. The result showed that this method has good specificity and linearity in the concentration 50-175 ppm (r=0,9999), recovery and CV value consecutively for the curcumin concentration 50 ppm, 100 ppm, and 175 ppm were 98,95-101,10% and 1,7%; 98,61-101,79% and 0,7%; 100,18-103,83% and 0,9%. With this result, it can be concluded that this TLC-densitometry method has good validity for quantitative analysis of curcumin in the sample.
Keywords: Curcumin, TLC, densitometry, validity method, scientific based herbal medicine
xviii
1
BAB I PENGANTAR
A. Latar Belakang Penggunaan bahan alam, baik sebagai obat maupun tujuan lain cenderung meningkat, terlebih dengan adanya isu back to nature serta krisis berkepanjangan yang mengakibatkan turunnya daya beli masyarakat. Penggunaan obat-obatan tradisional dipercaya oleh masyarakat memiliki efek samping yang relatif kecil bila dibandingkan obat sintesis (Sari, 2006). Walaupun demikian bukan berarti tanaman obat atau obat tradisional tidak memiliki efek samping yang merugikan, bila tidak disertai dengan ketepatan dosis (Katno dan Pramono,2010). Kebijakan Badan Pengawasan Obat dan Makanan mengenai obat herbal adalah meningkatkan penjaminan keamanan obat herbal dengan mendorong perkembangan obat herbal sampai ke tingkat fitofarmaka atau setidaknya obat herbal terstandar (OHT). Perkembangan ini bertujuan untuk menjamin keamanan obat herbal sehingga obat herbal dapat dimasukkan dalam pengobatan formal. OHT adalah obat herbal yang menggunakan bahan baku yang telah terstandar dan khasiatnya telah dibuktikan dengan uji praklinis. Standarisasi bahan baku diperlukan agar dapat diperoleh bahan baku yang seragam yang akhirnya dapat menjamin efek farmakologi tanaman tersebut (Hanani, 2010). Salah satu senyawa yang berasal dari tanaman dan banyak digunakan sebagai bahan obat atau campuran obat tradisional adalah kurkumin. Kurkumin banyak terdapat pada tanaman Curcuma xanthorriza (temulawak) dan Curcuma
1
2
domesticae Val. (kunyit). Dalam tanaman Curcuma domesticae, kurkumin terdapat bersama dengan demetoksikurkumin dan bis-demetoksikurkumin, yang dikenal dengan nama kurkuminoid. Kurkumin memiliki stabilitas yang rendah, dimana kurkumin bersifat fotosensitif dan mudah terdegradasi dalam larutan. Oleh karena itu, perlu penjaminan mutu terhadap produk yang memiliki kandungan kurkumin karena dikhawatirkan kurkumin dalam produk terdegradasi selama proses distribusi dan penyimpanannya. Salah satu obat tradisional yang mengandung kurkumin sebagai komposisi terbesarnya adalah sediaan cair OHT Kiranti®. Produk ini cukup banyak digunakan oleh masyarakat. Bahan baku yang digunakan dalam produk ini adalah simplisia. Standarisasi simplisia yang dilakukan meliputi: penetapan kadar minyak atsiri, penetapan kadar air, kadar abu larut air, kadar abu yang tidak larut air, kadar abu larut asam, kadar sari larut air, kadar sari larut etanol, susut pengeringan, dan bahan organik asing (Direktorat Jenderal Pengawas Obat dan Makanan, 1995a). Standarisasi yang dilakukan belum mencakup analisis kadar zat aktif pada produk jadi. Oleh karena itu, penetapan kadar zat aktif dalam OHT Kiranti® perlu dilakukan untuk mengetahui jumlah zat aktif yang nantinya mempengaruhi khasiat dari OHT tersebut. Dalam sediaan ini selain terdapat kurkuminoid juga terdapat senyawa lain, seperti golongan minyak atsiri. Oleh karena itu digunakan metode Kromatografi Lapis Tipis (KLT)-densitometri untuk penetapan kadar kurkumin dalam sediaan tersebut. Melalui metode KLT, kurkumin dapat dipisahkan dari senyawa kurkuminoid lainnya serta senyawa lain yang terdapat dalam sampel, sehingga
3
selanjutnya dapat ditetapkan kadarnya dengan metode densitometri. KLT cocok untuk analisis obat di laboratorium farmasi, karena metodenya sederhana, cepat dalam pemisahan, sensitif, kecepatan pemisahan tinggi, dan memerlukan jumlah cuplikan yang sangat sedikit (Khopkar, 1990). Penelitian ini merupakan rangkaian dalam penelitian penetapan kadar kurkumin dengan metode KLT-Densitometri yang meliputi optimasi, validasi metode, dan aplikasinya pada sediaan OHT yang beredar di pasaran. Dalam hal ini peneliti mengambil bagian pada tahap validasi metode KLT-Densitometri untuk penetapan kadar kurkumin dalam sediaan cair OHT. Metode penetapan kadar kurkumin dalam sediaan OHT ini menggunakan sistem yang diperoleh dari hasil optimasi yang dilakukan pada rangkaian penelitian ini. Suatu metode analisis harus divalidasi ketika suatu metode menggunakan sistem baru yang belum divalidasi sebelumnya. Validasi ini bertujuan untuk memberikan jaminan bahwa metode analisis dengan sistem yang digunakan tersebut memenuhi parameter-parameter validasi yang meliputi selektivitas, linearitas, akurasi, presisi, dan range sehingga dapat memberikan hasil analisis yang valid atau dapat dipercaya. Oleh karena itu, validasi metode merupakan tahapan yang penting untuk dilakukan sebelum metode ini diaplikasikan untuk analisis kadar kurkumin dalam OHT Kiranti®. 1. Permasalahan
Berdasarkan latar belakang maka diperoleh permasalahan sebagai berikut: apakah penetapan kadar kurkumin pada sediaan cair OHT Kiranti® dengan metode
4
KLT-Densitometri memenuhi parameter-parameter validasi yaitu selektivitas, linearitas, akurasi, presisi, dan range? 2. Keaslian penelitian
Sejauh sepengetahuan penulis, penelitian validasi metode penetapan kadar kurkumin dalam sediaan cair OHT Kiranti® dengan metode KLT-densitometri belum pernah dilakukan sebelumnya. Penelitian mengenai penetapan kadar kurkumin dengan metode KLT yang pernah dilakukan yaitu, penetapan kadar baku kurkumin (E-Merck) dengan metode KLT-densitometri dengan fase diam silika gel GF 254 dan fase gerak kloroform:etanol:air suling (25:0,96:0,04) (Martono, 1996), penetapan kadar kurkuminoid secara simultan dalam sampel Curcuma menggunakan metode high performance thin layer chromatography (HPTLC) (Gupta, Gupta, and Kumar, 1999), standarisasi mutu dengan HPTLC terhadap adanya kurkuminoid dalam Curcuma longa L. (Paramasivam, Aktar, Poi, Banerjee, and Bandyopahyay, 2008). Penelitian yang dilakukan penulis, menggunakan sistem KLT dengan fase gerak kloroform : asam asetat glasial (95:5). Sejauh sepengetahuan penulis sistem KLT yang digunakan tersebut belum pernah digunakan dalam penelitian sebelumnya. 3. Manfaat penelitian
a. Manfaat metodologis. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan sumbangan ilmiah tentang penggunaan metode KLT-Densitometri pada penetapan kadar kurkumin dalam sediaan cair OHT.
5
b. Manfaat praktis. Hasil penelitian diharapkan dapat memberikan informasi mengenai selektivitas, linearitas, akurasi, presisi, dan range metode penetapan kadar kurkumin dalam sediaan cair OHT Kiranti® secara KLTDensitometri.
B. Tujuan Penelitian ini bertujuan untuk membuktikan bahwa penetapan kadar kurkumin dengan metode KLT-Densitometri memenuhi parameter-parameter validasi yaitu selektivitas, linearitas, akurasi, presisi, dan range sehingga dapat digunakan untuk penetapan kadar kurkumin dalam sediaan cair OHT Kiranti®.
6
BAB II PENELAAHAN PUSTAKA
A. Kurkumin Kurkumin merupakan senyawa yang banyak terdapat dalam tanaman kunyit (Curcuma longa L.) dan temulawak (Curcuma xanthorrhiza Roxb.) (Tonnesen, 1989; Van der Goot, 1997). Di alam kurkumin umumnya ditemukan bersama
demetoksikurkumin
dan
bis-demetoksikurkumin,
yang
dikenal
dengan
kurkuminoid (Tonnesen dan Karlsen, 1985). O
O
HO
OH
kurkumin OCH3
OCH3 O
HO
O
demetoksikurkumin
OH OCH3
O
HO
O
bis-demetoksikurkumin
OH
Gambar 1. Struktur molekul kurkuminoid (Aggarwal, Bhatt, Ichikawa, Ahn, Sethi, Sandur, Natarajan, Seeram, dan Shishodia, 2006)
6
7
Kurkumin (1,7 – bis(4’hidroksi-3 metoksifenil)-1,6 heptadien, 3, 5-dion (Jaruga, 1998; Pan, 1999) memiliki berat molekul 368,126 g/mol (Tonnesen and Karlsen, 1983). Kurkumin tergolong senyawa diarilheptanoid dengan rumus molekul C21O6H2O (Tonnesen and Karlsen, 1985). Strukturnya yang rigid dan planar (adanya sistem konjugasi) membuat afinitas kurkumin terhadap lipid bilayer menjadi besar, dan juga bertanggung jawab terhadap warna kuning yang ada (Nakayama, 1997). Panjang gelombang 425 nm diketahui sebagai panjang gelombang serapan maksimum kurkumin dimana menghasilkan sensitivitas pengukuran paling baik (Paramasivam et al., 2008). Kurkuminoid mempunyai aktivitas antiinflamasi (Kohli, Ali, Ansari, and Raheman, 2005). Kurkuminoid menghambat senyawa eicosanoid seperti prostaglandin, tromboksan dan prostasiklin dengan cara menghambat aktivitas enzim cyclooxygenase (COX). Kurkuminoid juga menghambat pembentukan senyawa leukotrien dengan menghambat aktivitas enzim lipooxygenase (LOX) (Kohli et al., 2005). Dari tiga senyawa kurkuminoid, kurkumin mempunyai aktivitas antiinflamasi yang paling kuat dibandingkan senyawa turunannya (Agnam, Samhoedi, Timmerman, Venie, Sugiyanto, and Goot, 1995). Kurkumin memiliki 2 bentuk tautomer, yaitu bentuk enol dan keto (gambar 2). Dalam larutan, kurkumin terutama berada dalam bentuk enol.
OCH3
H3CO
Bentuk keto
OCH3
H3CO
Bentuk enol
Gambar 2.Tautomerisasi keto-enol kurkumin (Stankovic, 2004).
8
Sifat kimia kurkuminoid yang menarik adalah sifat perubahan warna akibat perubahan pH lingkungan. Dalam susana asam, kurkuminoid berwarna kuning atau kuning jingga, sedangkan dalam suasana basa berwarna merah (Tonnesen and Karlsen, 1985). Stabilitas kurkumin sangat dipengaruhi oleh pH lingkungan. Dalam larutan berair dengan pH basa, kurkumin mengalami reaksi degradasi pada gugus metilen aktif pada senyawa tersebut. Degradasi ini terjadi bila kurkumin berada dalam lingkungan pH 8,5 – 10,0 dalam waktu yang relatif lama, walaupun hal ini tidak berarti bahwa dalam waktu yang relatif singkat tidak terjadi degradasi kurkumin (Tonnesen and Karlsen, 1985). Kurkumin dapat mengalami degradasi membentuk asam ferulat dan feruloilmetan. Feruloilmetan dapat terhidrolisis menghasilkan vanillin dan aseton (Stankovic, 2004).
feruloilmetan
vanilin
asam ferulat
aseton Gambar 3.Reaksi degradasi kurkumin (Stankovic, 2004).
9
Instabilitas kurkumin juga dipengaruhi oleh adanya cahaya yang menyebabkan terjadinya degradasi fotokimia senyawa tersebut (Van der Goot, 1997; Supardjan, dan Meiyanto, 2002) dan oleh sinar ultraviolet (Bermawie, Rahardjo, Wahyuno, and Ma’mun, 2005).
Gambar 4.Poduk fotodegradasi kurkumin (Tonnesen and Greenhill, 1992).
B. Sediaan Cair Oral Sediaan cair oral dapat berupa larutan, emulsi, atau suspensi. Larutan merupakan campuran homogen antara dua zat atau lebih. Emulsi adalah dua cairan yang tidak saling campur, dimana salah satu cairan terdistribusi dalam bentuk droplet di dalam cairan lainnya. Sedangkan suspensi merupakan sistem dispersi dimana partikel padat terdispersi dalam suatu pembawa (medium dispersi) (Aulton, 1988).
10
Sediaan cair oral obat tradisional memiliki beberapa persyaratan yang harus dipenuhi antara lain: keseragaman volume, angka lempeng total tidak lebih dari 10, angka kapang khamir tidak lebih dari 10, mikroba patogen negatif, aflatoksin lebih lebih dari 30 bagian per juta (bpj), bahan tambahan, wadah dan penyimpanan, penandaan (Kementerian Kesehatan RI, 1994).
C. Obat Herbal Terstandar (OHT) Merupakan sediaan obat bahan alam yang telah dibuktikan keamanan dan khasiatnya secara ilmiah dengan uji pra klinik dan bahan bakunya telah distandarisasi. OHT harus memenuhi kriteria: aman, klaim khasiat dibuktikan praklinik,dan telah dilakukan standarisasi bahan baku yang digunakan dalam produk jadi (Badan Pengawas Obat dan Makanan Republik Indonesia, 2004).
Gambar 5. Logo obat herbal terstandar (Badan Pengawas Obat dan Makanan Republik Indonesia, 2004) Bahan baku yang digunakan dalam produk jadi dapat berupa simplisia. Simplisia adalah bahan alamiah yang digunakan sebagai obat tradisional dan belum mengalami pengolahan apapun juga, kecuali dinyatakan lain merupakan bahan yang dikeringkan (Badan Pengawas Obat dan Makanan Republik Indonesia, 2005). Standarisasi simplisia meliputi: penetapan kadar minyak atsiri, penetapan kadar abu, penetapan kadar abu yang tidak larut dalam asam, penetapan kadar abu yang larut air, penetapan kadar air, penetapan susut pengeringan, penetapan kadar sari yang larut
11
dalam air, penetapan kadar sari yang larut dalam etanol, penetapan bahan organik asing, dan penetapan kadar tanin (Direktorat Jenderal Pengawas Obat dan
Makanan, 1995a).
D. Kiranti®
Kiranti Sehat Datang Bulan® merupakan OHT yang memiliki indikasi untuk mengatasi rasa nyeri, perasaan letih, bau badan tak sedap saat haid, keputihan dan membuat tubuh tetap fit sekaligus segar (Anonim, 2010).
Gambar 6. Kiranti Sehat Datang Bulan® (Anonim, 2010). Komposisi Kiranti Sehat Datang Bulan® terdiri dari: Curcumae domesticae Rhizoma (30 g), Tamarindi Pulpa (6 g), Kaempferiae Rhizoma (3 g), Arengae pinnata Fructose (3 g), Zingiberis Rhizoma (0,8 g), Paullinia cupana (0,23 g), Cinnamomi Cortex (0,1 g) dan air (hingga 150 mL) (Anonim, 2010).
E. Kromatografi Lapis Tipis 1. Tinjauan Umum Kromatografi didefinisikan sebagai prosedur pemisahan zat terlarut oleh suatu proses migrasi diferensial dinamis oleh sistem yang terdiri dari 2 fase atau
12
lebih, salah satu diantaranya bergerak secara berkesinambungan dalam arah tertentu dan didalamnya zat-zat itu menunjukkan perbedaan mobilitas disebabkan adanya perbedaan dalam adsorpsi, partisi, kelarutan, tekanan uap, ukuran molekul atau kerapatan muatan ion. Dengan demikian masing-masing zat dapat diidentifikasi atau ditetapkan dengan metode analitik (Direktorat Jenderal Pengawas Obat dan Makanan, 1995b). Teknik kromatografi umum membutuhkan zat terlarut terdistribusi di antara dua fase, satu diantaranya diam (fase diam), yang lainnya bergerak (fase gerak). Fase gerak membawa zat terlarut melalui media, hingga terpisah dari zat terlarut lainnya, yang terelusi lebih awal atau lebih akhir. Umumya zat terlarut dibawa melalui media pemisah oleh aliran pelarut berbentuk cairan atau gas yang disebut eluen. Fase diam dapat bertindak sebagai adsorben, seperti halnya adsorben alumina yang diaktifkan, silika gel, dan resin penukar ion, atau dapat bertindak melarutkan zat terlarut sehingga partisi antara fase diam dan fase gerak. Dalam proses terakhir ini suatu lapisan cairan dalam suatu penyangga yang inert berfungsi sebagai fase diam (Direktorat Jenderal Pengawas Obat dan Makanan, 1995b). Kromatografi lapis tipis (KLT) bersama-sama dengan kromatografi kertas dengan berbagai macam variasinya pada umumnya merupakan kromatografi planar. KLT dikembangkan oleh Izmailoff dan Schraiber pada tahun 1938. Pada KLT , fase
diamnya berupa lapisan yang seragam (uniform) pada permukaan bidang datar yang didukung oleh lempeng kaca, pelat alumunium, atau pelat plastik. Meskipun demikian, kromatografi planar ini dapat dikatakan sebagai bentuk terbuka dari kromatografi kolom (Rohman, 2009).
13
Kromatografi lapis tipis dalam pelaksanannya lebih mudah dan lebih murah dibandingkan kromatografi kolom. Demikian juga peralatan yang digunakan. Dalam kromatografi lapis tipis, peralatan yang digunakan lebih sederhana dan dapat dikatakan bahwa hampir semua laboratorium dapat melaksanakan setiap saat secara cepat (Rohman, 2009). Pemilihan pelarut yang digunakan untuk senyawa yang akan dianalisis dengan metode KLT, harus dapat melarutkan analit dengan sempurna, mudah menguap, viskositas rendah, serta dapat membasahi lapisan penyerap (Sherma and Fried, 1996). Deteksi bercak pemisahan pada KLT dapat dilakukan dengan cara-cara berikut: a. menyemprot lempeng KLT dengan reagen kromogenik yang akan bereaksi secara kimia dengan seluruh solut yang mengandung gugus fungsional tertentu sehingga bercak menjadi berwarna. Kadang-kadang bercak dipanaskan terlebih dahulu untuk mempercepat reaksi pembentukan warna dan intensitas warna bercak b. mengamati lempeng di bawah lampu ultraviolet dengan panjang gelombang 254 atau 366 nm untuk menampakkan solut sebagai bercak yang gelap atau bercak yang berfluoresensi terang pada dasar yang berfluoresensi c. menyemprot lempeng dengan asam sulfat pekat atau asam nitrat pekat lalu dipanaskan untuk mengoksidasi solut-solut organik yang akan nampak sebagai bercak hitam kecoklatan d. memaparkan lempeng dengan uap iodium dalam chamber tertutup
14
e. melakukan scanning pada permukaan lempeng dengan densitometer (Gandjar dan Rohman, 2007).
Pada kromatografi planar, senyawa yang berbeda dalam campuran sampel menempuh jarak yang berbeda sesuai dengan seberapa kuat mereka berinteraksi dengan fase diam dibandingkan dengan fase gerak. Semakin polar solut maka semakin tertahan kuat ke dalam adsorben polar (silika gel). Solut-solut non polar tidak mempunyai afinitas atau mempunyai sedikit afinitas terhadap adsorben polar, sementara solut-solut yang terpolarisasi memiliki afinitas yang kecil terhadap adsorben polar disebabkan adanya interaksi dipol atau interaksiinteraksi yang diinduksi oleh dipol. Solut-solut polar, terutama yang mampu membentuk ikatan hidrogen, akan terikat kuat pada adsorben karenanya butuh fase gerak yang cukup polar untuk mengelusinya. Berikut adalah urutan polaritas solut-solut organik: alkana < alkena < aromatis < eter < ester < keton dan aldehid < tiol < amin dan amida < alkohol < fenol < asam-asam organik (Gandjar dan Rohman, 2007). Retardation factor (Rf) merupakan parameter karakteristik KLT. Harga Rf didefinisikan sebagai perbandingan antara jarak senyawa dari titik awal dan jarak tepi muka pelarut dari titik awal (Roth, 1994). Angka Rf berjangka antara 0,00 sampai 1,00 dan hanya dapat ditentukan dua desimal (Stahl, 1985). Rf = (Dean, 1995) Harga Rf untuk senyawa murni dapat dibandingkan dengan harga standar. Pengukuran yang sering dipakai lainnya menggunakan pengertian Rx atau
15
Rstd yang didefinisikan sebagai perbandingan antara jarak yang digerakkan oleh senyawa yang tidak diketahui dengan jarak yang digerakkan oleh senyawa standar yang diketahui (Hardjono, 1983). Nilai Rx dapat dihitung: Rx,a (Dean, 1995). Pengekoran noda kromatogram terjadi apabila proses pemisahan yang terjadi tidak sempurna. Terlalu tingginya konsentrasi komponen yang ditentukan juga merupakan salah satu penyebab terjadinya kromatogram yang berekor. Penyebab pengekoran yang lain adalah ketidakjenuhan chamber. Ketidaktepatan pemilihan fase gerak terhadap jenis fase diam dan macam sampel yang dianalisis juga merupakan penyebab pengekoran kromatogram yang lainnya (Mulja dan Suharman, 1995). 2. Sistem KLT a. Fase diam. Fase diam yang sering digunakan dalam KLT adalah bahan penjerap (adsorben). Silika gel merupakan penjerap yang paling banyak digunakan dalam KLT. Pada umumnya ditambah dengan bahan pengikat untuk memberikan kekuatan perlekatan pada pendukungnya. Bahan pengikat yang sering digunakan adalah gipsum, dan silika gel yang diberikan tambahan senyawa, ini dikenal dengan istilah ”silika gel G”. Kadang-kadang untuk mempermudah identifikasi diatambah zat yang berfluoresensi sehingga dikenal dengan istilah silika gel GF. Bahan penjerap lain yang digunakan adalah alumina, selulosa, sefadex, poliamida, kieselguhr, dan amilum (Harborne, 1973).
16
Adanya air dari atmosfer yang diserap oleh permukaan silika gel mampu mendeaktifkan permukaan silika gel karena air akan menutup sisi aktif silika gel. Hal seperti ini dapat diatasi dengan memanaskan plat pada suhu 105ºC (Gandjar dan Rohman, 2007). b. Fase gerak. Fase gerak adalah medium angkut yang terdiri atas satu atau beberapa pelarut. Fase gerak bergerak di dalam fase diam yaitu lapisan berpori karena ada gaya kapiler. Yang digunakan adalah pelarut bertingkat mutu analitik dan bila diperlukan sistem pelarut multikomponen, maka harus berupa suatu campuran sederhana mungkin terdiri atas maksimum tiga komponen (Stahl, 1985). Pemilihan sistem pelarut untuk mencapai sistem pemisahan yang diperlukan mungkin melibatkan beberapa percobaan, tetapi pilihan pelarut cukup terbatas dengan pertimbangan interferensi respon detektor atau kerusakan yang mungkin terjadi dari fase diam (Dean, 1995). Berikut adalah beberapa petunjuk dalam memilih dan mengoptimasi fase gerak: 1) fase gerak harus mempunyai kemurnian yang sangat tinggi karena KLT merupakan teknik yang sensitif 2) daya elusi fase gerak harus diatur sedemikian rupa sehingga harga Rf solut terletak antara 0,2-0,8 untuk memaksimalkan pemisahan (Rohman, 2009).
17
F. Densitometri Densitometri merupakan metode analisis instrumental yang mendasarkan pada interaksi radiasi elektromagnetik dengan analit yang merupakan bercak pada plat KLT. Densitometri lebih dititikberatkan untuk analisis kuantitatif analit-analit dengan kadar kecil, yang mana diperlukan pemisahan terlebih dahulu dengan KLT (Rohman, 2009). KLT-densitometri merupakan salah satu dari metode analisa kuantitatif. Penetapan kadar suatu senyawa dengan metode ini dilakukan dengan mengukur kerapatan bercak senyawa yang dipisahkan dengan cara KLT. Pada umumnya pengukuran kerapatan bercak tersebut dibandingkan dengan kerapatan bercak senyawa standar yang dielusi bersama-sama (Hardjono, 1985). Metode densitometri mempunyai cara kerja yang sederhana dan cepat. Pada metode densitometri diperlukan adsorbens dan fase gerak yang murni. Untuk memperoleh hasil yang baik umumnya digunakan adsorbens siap pakai yang telah mengalami pra pencucian (Gritter, 1991). Alat densitometri mempunyai sumber sinar yang bergerak di atas bercak pemisahan pada lempeng kromatografi yang akan ditetapkan kadar komponennya. Lempeng digerakkan menyusuri berkas sinar yang berasal dari sumber sinar tersebut. Bercak yang kecil dan intensif akan menghasilkan suatu puncak kurva absorbsi yang sempit dan tajam, sebaliknya bercak yang lebar akan menghasilkan puncak kurva absorbsi yang melebar dan tumpul (Sudjadi, 1988).
18
Teknik pengukuran dapat didasarkan atas pengukuran intensitas sinar yang diserap (absorbansi), intensitas sinar yang dipantulkan (reflaktansi) atau intensitas sinar yang difluoresensikan (fluoresensi) (Mintarsih, 1990). Pada beberapa alat TLC scanner sudah dilengkapi alat pemroses data atau mikro komputer, sehingga integrasi luas puncak atau tinggi puncak tersebut dapat
langsung
direkam
atau
dicatat
sebagai
data
sekaligus
dengan
kromatogramnya dan dapat pula direkam dan dicatat langsung sebagai kadarnya, melalui teknik pemrogaman tertentu. Penelusuran bercak dapat dilakukan secara horizontal maupun vertikal (scanning horizontal atau scanning vertical). Penelusuran bercak secara horisontal dapat dilakukan satu persatu, atau apabila satu pelat bercak yang diperoleh segaris semua maka dapat dilakukan penelusuran untuk semua bercak sekaligus. Sedangkan cara penelusuran vertikal, hanya dapat dilakukan satu per satu. Pada penelusuran bercak horisontal dengan penelusuran beberapa bercak sekaligus hanya dapat dilakukan apabila bercak-bercak tesrsebut benar-benar berada dalam satu baris. Cara ini akan mengalami kesulitan jika bercak yang sangat dekat dengan bercak yang akan ditetapkan, karena ada kemungkinan bercak yang tidak diinginkan ikut tertetapkan (Mintarsih, 1990). Penelusuran bercak akan mendapatkan hasil yang baik apabila dilakukan pada panjang gelombang maksimum, karena perubahan konsentrasi pada bercak sedikit saja sudah terdeteksi. Pengukuran dilakukan dengan menelusuri bercak yang akan ditetapkan kadarnya pada kisaran panjang gelombang zat tersebut (Mintarsih, 1990).
19
Pelat yang digunakan untuk KLT pada densitometri sebaiknya digunakan pelat buatan pabrik, karena pada pelat buatan sendiri fase diamnya kurang rata, sehingga akan mempengaruhi hasil penelusuran dengan densitometri, yaitu berupa puncak yang lebar dan kasar. Puncak yang lebar disebabkan kurang kompaknya fase diam, puncak yang kasar disebabkan permukaan pelat kurang rata (Mintarsih, 1990). Ada dua cara penetapan dengan alat densitometer. Pertama, setiap kali penetapan ditotolkan sediaan baku dari senyawa yang bersangkutan dan dielusi bersama dalam satu lempeng, kemudian Area Under Curve (AUC) sampel dibandingkan dengan AUC zat baku. Yang kedua, dengan membuat kurva hubungan antara jumlah zat baku dengan AUC. Kurva baku diperoleh dengan membuat totolan zat baku pada pelat KLT dengan bermacam-macam konsentrasi (minimal tiga macam konsentrasi). Bercak yang diperoleh dicari AUC dengan densitometer. Dari kurva baku diperoleh persamaan : y = bx + a, dimana x adalah banyaknya zat yang ditotolkan dan y adalah AUC (Supardjan, 1987).
G. Validasi Metode 1. Tinjauan Umum
Validasi metode menurut United States Pharmacopeia (USP) dilakukan untuk menjamin bahwa metode analisis bersifat akurat, spesifik, dan reprodusibel pada kisaran analit yang akan dianalisis. Secara singkat validasi merupakan aksi konfirmasi bahwa metode analisis yang akan digunakan sesuai dengan tujuan yang diinginkan (Rohman, 2009).
20
Suatu metode analisis harus divalidasi untuk melakukan verifikasi bahwa parameter-parameter kinerjanya cukup mampu untuk mengatasi problem analisis, karenanya suatu metode harus divalidasi, ketika: a. metode baru dikembangkan untuk mengatasi problem analisis tertentu b. metode yang sudah baku direvisi untuk menyesuaikan perkembangan, atau karena munculnya suatu problem yang mengarahkan bahwa metode tersebut harus direvisi c. penjaminan mutu yang mengindikasikan bahwa metode baku telah berubah seiring dengan berjalannya waktu d. metode baku digunakan di laboratorium yang berbeda, dikerjakan oleh analis yang berbeda, atau dikerjakan dengan alat yang berbeda e. untuk mendemonstrasikan kesetaraan antar 2 metode, seperti antara metode baru dan metode baku (Swartz dan Krull, 1997). Tujuan utama validasi metode adalah untuk menghasilkan hasil analisis yang paling baik. Untuk memperoleh hasil tersebut, semua variabel yang terkait dengan metode analisis harus dipertimbangkan seperti prosedur pengambilan sampel, tahap penyiapan sampel, jenis penyerap yang digunakan pada kromatografi, fase gerak, dan sistem deteksinya. Banyaknya parameter yang harus divalidasi tergantung pada tujuan analisis (Adamovics, 1997). Menurut The United States Pharmacopeia 30th tahun 2007, metode analisis dapat dibedakan menjadi 4 kategori, yaitu: a. Kategori I. Mencakup prosedur analisis kuantitatif, untuk menetapkan kadar komponen utama bahan obat atau zat aktif dalam sediaan farmasi.
21
b. Kategori II. Mencakup prosedur analisis kualitatif dan kuantitatif yang digunakan untuk menganalisis impurities dalam sediaan farmasi. c. Kategori III. Mencakup prosedur analisis yang digunakan untuk menentukan karakteristik penampilan suatu sediaan farmasi, misalnya disolusi dan pelepasan obat. d. Kategori IV (tes identifikasi) Tabel I. Parameter analisis validasi metode (United States Pharmacopeial Convention, 2007)
2. Parameter Validasi
a. Akurasi. Akurasi atau kecermatan metode analisis adalah kedekatan hasil analisis yang diperoleh dengan menggunakan metode tersebut dengan nilai yang sebenarnya. Penentuan kecermatan metode analisis biasanya dinyatakan dengan persen perolehan kembali terhadap sampel yang kadarnya telah diketahui dengan pasti (Mulja dan Suharman, 1995).
22
Tabel II. Kriteria rentang recovery yang dapat diterima (United States Pharmacopeial Convention, 2007) Analit pada matriks sampel (%) Rentang recovery yang diperoleh(%) 98-102 100 98-102 >10 97-103 >1 95-105 >0,1 90-107 0,01 90-107 0,001 80-110 0,0001 (1 ppm) 80-110 0,00001 (100 ppb) 60-115 0,000001 (10 ppb) 40-120 0,00000001 (1 ppb)
b. Presisi. Presisi suatu metode analisis merupakan sejumlah pencaran hasil yang diperoleh dari analisis berulang kali pada suatu sampel homogen. Presisi umumnya dinyatakan dalam coefficient of variation (CV) atau koefisien variasi (KV) (Mulja dan Hanwar, 2003). Tabel III. Kriteria CV yang dapat diterima (United States Pharmacopeial Convention, 2007) Kadar analit CV(%) 2,5 ≥1% 5 > 0,1 16 1 ppm 32 1 ppb
c. Linearitas. Linearitas merupakan kemampuan suatu metode untuk memperoleh hasil-hasil uji yang secara langsung proporsional dengan konsentrasi analit pada kisaran yang diberikan. Linearitas suatu metode merupakan ukuran seberapa baik kurva kalibrasi yang menghubungkan antara respon (y) dengan konsentrasi (x) (Rohman, 2009). Persyaratan data linearitas yang bisa diterima jika memenuhi nilai koefisien korelasi (r) > 0,999 (Yuwono and Indrayanto, 2005).
23
d. Batas Deteksi (Limit of Detection atau LOD). Batas deteksi didefinisikan sebagai konsentrasi analit terendah dalam sampel yang masih dapat dideteksi, meskipun tidak selalu dapat dikuantifikasi. LOD merupakan batas uji yang secara spesifik menyatakan apakah analit di atas atau di bawah nilai tertentu. Sebagai contoh, batas deteksi merupakan banyaknya sampel yang menunjukkan respon (S) 3 kali terhadap derau (N) atau LOD = 3 S/N (Swartz and Krull, 1997). e. Batas Kuantifikasi (Limit of Quantification atau LOQ). Batas kuantifikasi didefinisikan sebagai konsentrasi analit terendah dalam sampel yang dapat ditentukan dengan presisi dan akurasi yang dapat diterima pada kondisi operasional metode yang digunakan (Rohman, 2009). Batas kuantifikasi didefinisikan sebagai konsentrasi analit terendah dalam sampel yang dapat ditentukan dengan presisi dan akurasi yang dapat diterima pada kondisi operasional metode yang digunakan. Kadang-kadang rasio signal to noise 10:1 digunakan untuk menentukan LOQ (Rohman, 2009). f. Selektivitas (Spesifisitas). Selektivitas atau spesifisitas merupakan kemampuan suatu metode yang hanya mengukur zat tertentu saja secara cernat dan seksama dengan adanya kompoenen lain yang mungkin ada dalam matriks sampel. Selektivitas seringkali dapat dinyatakan sebagai derajat penyimpangan metode terhadap sampel yang mengandung bahan yang ditambahkan berupa cemaran, produk degradasi, senyawa sejenis, dan senyawa asing lain, kemudian dibandingkan dengan hasil analisis sampel yang tidak mengandung bahan yang ditambahkan tersebut (Harmita, 2004).
24
Selektivitas pada metode kromatografi ditunjukkan melalui nilai resolusi (Harmita, 2004). Dalam teknik pemisahan, daya pisah (resolusi) antara analit yang dituju dengan pengganggu lainnya harus > 1,5 (Swartz and Krull, 1997). g. Range (kisaran). Menurut ICH, kisaran suatu prosedur analisis adalah interval antara konsentrasi (jumlah) analit pada level atas dan pada level bawah dalam suatu sampel, yang mana dapat ditunjukkan bahwa prosedur analisis mempunyai level akurasi, presisi, dan linearitas yang sesuai.
F. Landasan Teori Kurkumin banyak terdapat dalam tanaman Curcuma longa dan Curcuma xanthorrhiźa.
Kurkumin
di
alam
biasanya
terdapat
bersama
bis-
demetoksikurkumin dan demetoksikurkumin, yang dikenal dengan nama kurkuminoid. Kurkumin merupakan salah satu senyawa yang terkandung dalam banyak obat tradisional. Salah satu kategori obat tradisional adalah obat herbal terstandar, dimana obat tradisional ini telah melalui standarisasi bahan baku dan uji praklinis. Metode KLT dapat memisahkan beberapa campuran senyawa karena adanya perbedaan interaksi antara senyawa-senyawa tersebut dengan fase diam dan fase gerak yang digunakan. Bercak analit hasil pemisahan KLT dapat dianalisis kuantitatif dengan metode densitometri. Suatu metode dapat digunakan dalam penetapan kadar apabila metode tersebut telah divalidasi. Parameter validasi meliputi selektivitas, akurasi, presisi,
25
linearitas, dan range. Metode dikatakan valid apabila memenuhi persyaratan parameter validasi.
G. Hipotesis Metode KLT-densitometri pada penetapan kadar kurkumin dalam sampel OHT Kiranti® memenuhi parameter-parameter validasi, yaitu selektivitas, linearitas, akurasi, presisi, dan range yang baik.
26
BAB III METODE PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian Penelitian yang dilakukan bersifat noneksperimental deskriptif karena tidak terdapat manipulasi dan perlakuan terhadap subjek uji.
B. Variabel Penelitian 1. Variabel bebas adalah sistem KLT yang telah dioptimasi, yaitu jenis dan komposisi fase gerak. 2. Variabel tergantung adalah parameter validasi yaitu selektivitas, linearitas akurasi, presisi, dan range. 3. Variabel pengacau terkendali adalah: a. pelarut, untuk mengatasinya digunakan pelarut pro analisis yang memiliki kemurnian tinggi. b. pH pelarut, untuk mengatasinya dilakukan pengaturan pH pelarut, yaitu pada pH 4. c. cahaya, untuk mengatasinya pengerjaan dilakukan di ruangan dengan intensitas cahaya yang terbatas serta dengan penggunaan alumunium foil.
26
27
C. Definisi Operasional 1. Sistem KLT yang digunakan dalam penelitian adalah fase diam berupa silika gel G 60 dan fase gerak berupa campuran kloroform dan asam asetat glasial (95:5). 2. Kadar kurkumin dinyatakan dalam satuan part per million (ppm). 3. Parameter validasi yang digunakan adalah selektivitas, linearitas, akurasi, presisi, dan range.
D. Bahan Penelitian Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah baku kurkumin (hasil sintesis Prof. Dr. Sudibyo Martono, M.S., Apt. yang telah dikonformasi strukturnya dengan metode spektroskopi H-NMR dan Mass Spectra, serta memiliki titik lebur 181,2-182,40C), metanol p.a. EMSURE® ACS, ISO, Reag. Ph. Eur (E. Merck), kloroform p.a. EMSURE® ACS, ISO, Reag. Ph. Eur (E. Merck), asam asetat glasial EMPARTA® ACS (E. Merck), plat KLT silika gel G 60 (E. Merck), dan sediaan cair OHT Kiranti®.
E. Alat Penelitian Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah seperangkat alat densitometer (Camag TLC Scanner 3 CAT. No. 027.6485 SER. No.160602), indikator pH, penyaring Millipore, mikropipet Scorex, neraca, neraca analitik (Scaltec SBC 22 max 60/210 g; min 0,001 g; d=0,01/0,1mg; e=1mg), ultrasonikator (Retsch tipe T460 no V935922013 Ey), vaccum (Gaast model
28
DOA-P104-BN), dan alat-alat gelas yang umum digunakan dalam analisis (Pyrex).
F. Tata Cara Penelitian 1. Pembuatan pelarut (metanol pH 4)
Dibuat campuran metanol dan asam asetat glasial dengan perbandingan 9:1. 2. Pembuatan fase gerak
Fase gerak yang digunakan dalam penelitian menggunakan campuran kloroform : asam asetat glasial (95:5). Fase gerak dibuat dalam labu ukur 100 mL kemudian digojog. 3. Pembuatan larutan baku kurkumin
a. Pembuatan larutan stok kurkumin 1000 ppm. Sejumlah lebih kurang 10,0 mg baku kurkumin ditimbang seksama kemudian dilarutkan dalam metanol pH 4 hingga volume tepat 10,0 mL. b. Pembuatan seri larutan baku. Sebanyak 0,250 mL; 0,375 mL; 0,500 mL; 0,625 mL; 0,750 mL; dan 0,875 mL larutan stok kurkumin diambil dan dimasukkan ke dalam labu ukur 5 ml kemudian diencerkan dengan metanol pH 4 hingga tanda, sehingga didapatkan konsentrasi 50 ppm, 75 ppm, 100 ppm, 125 ppm, 150 ppm, dan 175 ppm. 4. Penetapan panjang gelombang maksimum
Seri larutan baku konsentrasi 50 ppm, 100 ppm, dan 175 ppm masingmasing ditotolkan dengan volume penotolan 3 µL pada plat KLT dengan fase
29
diam silika gel G 60 dan setelah kering dikembangkan dalam bejana kromatografi yang telah dijenuhi dengan fase gerak. Setelah mencapai jarak rambat 10 cm, plat dikeluarkan dari bejana dan dikeringkan. Plat hasil pengembangan kemudian secepatnya discanning panjang gelombang serapan maksimumnya dengan densitometer. 5. Pembuatan kurva baku dan pengamatan nilai Retardation Factor (Rf)
kurkumin Seri larutan baku konsentrasi 50 ppm, 75 ppm, 100 ppm, 125 ppm, 150 ppm, dan 175 ppm masing-masing ditotolkan dengan volume penotolan 3 µL pada plat KLT dengan fase diam silika gel G 60 dan setelah kering dikembangkan dalam bejana kromatografi yang telah dijenuhi dengan fase gerak. Setelah mencapai jarak rambat 10 cm, plat dikeluarkan dari bejana dan dikeringkan. Plat hasil pengembangan kemudian secepatnya diukur AUC dan tinggi peaknya dengan densitometer. Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali dan pilih persamaan kurva baku yang paling baik. Selain itu dilihat pula nilai Rf dari masing-masing seri baku kurkumin. 6. Penentuan recovery dan Coefficient of Variations (CV) baku
Seri larutan baku konsentrasi 50 ppm, 100 ppm, dan 175 ppm diberi perlakuan seperti pada poin F.5. Replikasi dilakukan sebanyak 5 kali. Selanjutnya dihitung kadar terukur dengan menggunakan persamaan kurva baku yang telah dibuat pada poin F.5. Berdasarkan data ini dapat ditentukan recovery dan CVnya.
30
7. Penentuan recovery dan Coefficient of Variations (CV) baku dalam
matriks sampel a. Pembuatan larutan sampel (LS). Sejumlah lebih kurang 15,0 mL sampel ditambah metanol pH 4 hingga volume 25,0 mL. Larutan sampel kemudian didegasing selama 15 menit dan disaring dengan kertas saring. Larutan hasil penyaringan ditambah metanol pH 4 hingga volume 25,0 mL. b. Pembuatan larutan sampel dengan penambahan baku kurkumin (LSK). Sejumlah 0,125 mL larutan sampel kurkumin dimasukkan dalam labu takar 5 mL, kemudian ditambahkan 4,5 mL LS dan ditambahkan metanol pH 4 hingga tanda. Replikasi dilakukan sebanyak 5 kali. c. Pengembangan dan pengukuran. LS dan LSK diberi perlakuan seperti pada poin F.5. Setelah itu dihitung kadar baku kurkumin dalam sampel menggunakan persamaan kurva baku yang telah dibuat pada poin F.5. Kadar baku kurkumin dalam sampel adalah selisih kadar LSK dengan kadar LS. Selanjutnya dihitung recovery dan CVnya.
G. Analisis Hasil 1. Selektivitas Selektivitas ditentukan dengan membandingkan nilai Rf baku dan Rf sampel. Selain itu selektivitas juga ditunjukkan dengan nilai resolusi ≥ 1,5. Resolusi dapat dihitung dengan cara berikut: Resolusi (Rs)
31
2. Linearitas Linearitas dilihat dari harga r (koefisien korelasi) hasil pengukuran seri baku kurkumin. Suatu metode dapat dikatakan memiliki linearitas yang baik jika r > 0,999. 3. Akurasi Akurasi metode analisis dinyatakan dengan recovery yang dapat dihitung dengan cara berikut:
4. Presisi Presisi metode analisis dinyatakan dengan CV (koefisien variasi) yang dapat dihitung dengan cara berikut:
5. Range Range merupakan interval konsentrasi analit yang memenuhi persyaratan linearitas, akurasi, dan presisi. 6. Akurasi pengukuran baku dalam matriks sampel Nilai recovery baku kurkumin dalam matriks sampel dapat dihitung dengan rumus berikut: Recovery =
32
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Pembuatan Metanol pH 4 Kurkumin merupakan senyawa yang tidak stabil dalam pH basa, karena dapat terdegradasi pada gugus metilen aktifnya, sehingga terbentuk asam ferulat dan feruloilmetan. Apabila kurkumin terdegradasi, maka kadar yang diperoleh akan berkurang sehingga tidak dapat merepresentasikan kadar kurkumin yang sebenarnya.
Gambar 7. Gugus metilen aktif kurkumin = gugus metilen aktif
Oleh karena itu, untuk menjaga stabilitas kurkumin selama pengerjaan, maka digunakan metanol pH 4 sebagai pelarut. pH pelarut yang digunakan ini, diperoleh berdasarkan hasil optimasi yang dilakukan pada rangkaian penelitian ini. Metanol sendiri memiliki pH 5, sehingga untuk menurunkan pHnya hingga 4, dilakukan penambahan asam asetat glasial sebanyak 1 bagian pada setiap 9 bagian metanol.
32
33
B. Pembuatan Fase Gerak Pembuatan fase gerak pada penelitian ini menggunakan fase gerak yang diperoleh dari hasil optimasi yang dilakukan pada rangkaian penelitian ini, yaitu kloroform : asam asetat glasial (95:5). Pembuatan fase gerak dengan jenis dan komposisi tersebut bertujuan agar didapatkan polaritas fase gerak yang sesuai sehingga dapat memisahkan kurkumin dengan senyawa lain dalam sampel secara optimal. Selain itu, pemilihan asam asetat glasial sebagai salah satu komposisi fase gerak, juga bertujuan untuk memberikan suasana asam untuk menjaga stabilitas kurkumin. Sistem kromatografi pada penelitian ini merupakan kromatografi fase normal, karena fase gerak pada penelitian ini bersifat non polar, sedangkan fase geraknya, yaitu silika gel bersifat polar.
C. Pembuatan Larutan Baku Larutan baku kurkumin dibuat dengan melarutkan baku kurkumin menggunakan pelarut metanol pH 4. Penelitian ini menggunakan 6 seri konsentrasi baku kurkumin, yaitu 50 ppm, 75 ppm, 100 ppm, 125 ppm, 150 ppm, dan 175 ppm. Pemilihan seri konsentrasi ini disesuaikan dengan melihat respon detektor terhadap sinyal (peak) yang dihasilkan, apabila sinyal yang dihasilkan pada konsentrasi tertentu terlalu kecil, maka sinyal tersebut dapat terganggu oleh noise yang dihasilkan alat, maka pemilihan konsentrasi harus melihat rasio konsentrasi analit terhadap sinyal (respon detektor). Selain itu pemilihan seri konsentrasi ini juga bertujuan agar respon analit yang terdapat dalam sampel dapat masuk ke dalam respon seri larutan baku. Dengan demikian persamaan
34
kurva baku yang diperoleh dapat digunakan untuk penetapan kadar analit dalam sampel.
D. Penetapan Panjang Gelombang Maksimum Kurkumin Penetapan panjang gelombang maksimum kurkumin dilakukan agar didapatkan panjang gelombang dimana kurkumin memberikan respon yang maksimum, sehingga sensitivitas pengukurannya tinggi, serta memberikan hasil yang reprodusibel pada pengulangan pengukuran. Oleh karena itu, dengan pengukuran
pada
panjang
gelombang
maksimum,
diharapkan
maksimum
dilakukan
dapat
meminimalkan kesalahan pada pengukuran. Penetapan
panjang
gelombang
dengan
menggunakan 3 seri konsentrasi, yaitu konsentrasi 50 ppm, 100 ppm, dan 175 ppm. Penggunaan 3 seri konsentrasi ini bertujuan untuk melihat apakah pada konsentrasi yang dianggap mewakili seluruh konsentrasi pada seri baku ini dihasilkan spektrum serapan maksimum yang sama. Scanning panjang gelombang maksimum kurkumin dilakukan pada panjang gelombang 400-500 nm, karena panjang gelombang maksimum teoritis kurkumin adalah 425 nm. Dari hasil scanning dengan densitometer, diperoleh panjang gelombang maksimum (λ maks) ketiga seri konsentrasi pada 425 nm.
35
175 ppm
100 ppm
50 ppm
Gambar 8. Spektra baku kurkumin konsentrasi 50ppm, 100 ppm, dan 175 ppm (λ maks=425 nm)
Kurkumin memiliki gugus kromofor yang panjang serta auksokrom, sehingga dapat memberikan serapan pada panjang gelombang visibel.
Gambar 9. Gugus kromofor dan auksokrom pada kurkumin = kromofor = auksokrom
36
E. Pengamatan nilai Retardation Factor (Rf) dan Pembuatan Kurva Baku Kurkumin Pengamatan nilai Rf merupakan parameter analisis kualitatif yang nantinya digunakan untuk mengetahui ada tidaknya analit dalam sampel. Pengamatan nilai Rf menggunakan konsentrasi tengah seri larutan baku kurkumin, yaitu 100 ppm. Dari hasil pengamatan, diperoleh nilai Rf baku kurkumin 0,52.
Gambar 10. Baku kurkumin 100 ppm (nilai Rf=0,52)
Nilai Rf kurkumin dari sistem KLT ini dipengaruhi oleh interaksi kurkumin dengan fase gerak maupun fase diamnya. Interaksi kurkumin dengan fase diam dan fase gerak dapat dilihat pada gambar 11 dan 12.
37
Cl
Interaksi dipol-dipol
H H3C
C
C
O
O
Cl
Cl
H Interaksi hidrogen
O
O Cl
Cl
Cl C
H H
Cl
Cl
Interaksi dipol-dipol
H
C
H
C
Cl
H
C
OCH3
Cl OH
Cl Cl
Cl
Cl
Cl
H
OCH3
C
Cl
Cl
Interaksi dipol-dipol
Cl
Gambar 11. Interaksi kurkumin dengan fase gerak
O
O
O
O H
H
OCH3
OCH3
O
H
O
Si
O
Si
O Si
OH O
O O
Si
Si
OH O
O O
Si
Si
OH O
O O
Si
Si
O
O O
Cl
Cl
Interaksi
Cl dipol-dipol HO
C
Si
O
H
O
H
Si
O
Si
OH
O O
H
Si
O O
Gambar 12. Interaksi hidrogen kurkumin dengan fase diam
Si
OH
38
Pada gambar 11 dan 12 dapat dilihat bahwa interaksi kurkumin dengan fase geraknya lebih dominan. Adanya interaksi hidrogen dan interaksi dipol-dipol antara asam asetat glasial dengan kurkumin serta interaksi dipol-dipol kloroform dengan kurkumin akan menyebabkan lepasnya interaksi hidrogen antara kurkumin dengan permukaan silika gel. Hal ini akan menyebabkan kurkumin dapat terelusi oleh fase gerak dan mencapai jarak rambat tertentu. Interaksi yang sesuai antara kurkumin dengan fase diam dan fase gerak akan menghasilkan nilai Rf yang baik, yaitu antara 0,2-0,8. Selain dari analisis interaksi senyawa terhadap fase diam dan fase geraknya. Nilai Rf suatu senyawa juga dapat dijelaskan dari polaritas senyawa tersebut dan kesesuaiaannya terhadap polaritas dari fase gerak yang digunakan. Fase gerak yang digunakan yaitu campuran antara kloroform dan asam asetat glasial (95:5) dengan indeks polaritas campuran 4,205. Dari hasil percobaan indeks polaritas ini memiliki kesesuaian polaritas dengan kurkumin, sehingga kurkumin dapat terelusi oleh fase gerak dan mencapai jarak rambat tertentu. Pembuatan kurva baku kurkumin dilakukan 3 replikasi. Hal ini bertujuan untuk mendapatkan nilai koefisien korelasi yang paling baik. Koefisien korelasi menunjukkan korelasi hubungan antara konsentrasi dengan respon pengukuran, baik itu Area Under Curve (AUC) atau tinggi peak. Respon yang menunjukkan nilai korelasi yang paling baik terhadap konsentrasi akan digunakan dalam pembuatan persamaan kurva baku. Hasil pengukuran respon dari tiap kadar baku kurkumin pada tiga replikasi dapat dilihat pada tabel IV.
39
Seri baku (ppm) 51,5 77,25 103 128,75 154,5 180,25 A B r
Tabel IV. Data replikasi kurva baku kurkumin Baku kurkumin Replikasi I Replikasi II Replikasi III Tinggi Seri Tinggi Seri AUC AUC AUC peak baku peak baku (ppm) (ppm) 7009,9 183 49,5 6528,6 145,5 50 6600 9403,3 252,1 74,25 8785,8 211,9 75 8864,1 11159,2 272,2 99 11108,2 253 100 11298,6 13535,4 341,5 123,75 13577,8 330,9 125 13455,5 15461,5 355,8 148,5 15698 358,6 150 15774,6 18444 449,5 173,25 17818,8 449,5 175 18201,1
149,6 216,9 257,7 336,9 364,6 397,7
2509,47 81 86,2372 0,9976
60,587 6 2,0146 0,9886
88,7867
A
1,900 0,9821
B r
2011,226 7 91,9564 0,9997
57,061 9 2,0190 0,9890
A B r
1965,00 57 92,4502 0,9999
Tinggi peak
Pada tabel IV dapat dilihat bahwa hubungan antara kadar dengan AUC menunjukkan korelasi yang lebih baik dibandingkan hubungan antara kadar dengan tinggi peak. Korelasi yang baik ini dilihat dari nilai r yang paling mendekati 1. Oleh karena itu, respon pengukuran yang akan digunakan adalah AUC. Rata-rata sudut yang dibentuk dari hasil pembuatan kurva baku adalah 89,340C. Sudut ini hampir berdempet dengan sumbu y, sehingga dari segi sensitivitas kurva baku ini kurang layak ditampilkan. Oleh karena itu, diperlukan penyesuaian pada nilai AUC agar diperoleh sudut kemiringan yang mendekati 450. Faktor koreksi yang digunakan untuk penyesuaian nilai AUC adalah 100. Nilai ini selanjutnya akan digunakan sebagai faktor koreksi AUC untuk setiap perhitungan. Hasil penyesuaian nilai AUC ini dapat dilihat pada tabel V.
40
Tabel V. Data replikasi kurva baku kurkumin dengan penyesuaian nilai AUC
Replikasi I Seri baku AUC/100 (ppm) 51,5 70,099 77,25 94,033 103 111,592 128,75 135,354 154,5 154,615 180,25 184,44
Baku kurkumin Replikasi II Seri baku AUC/100 (ppm) 49,5 65,286 74,25 87,858 99 111,082 123,75 135,778 148,5 156,98 173,25 178,188
Replikasi III Seri baku AUC/100 (ppm) 50 66 75 88,641 100 112,986 125 134,555 150 157,746 175 182,011
A B r
A B r
A B r
25,0948 0,8624 0,9976
20,1123 0,9196 0,9997
19,6500 0,9245 0,9999
Kurva baku yang digunakan adalah kurva baku yang memiliki linearitas yang baik. Linearitas menyatakan adanya hubungan respon pengukuran yang secara langsung proporsional terhadap konsentrasi (jumlah) analit. Suatu kurva baku memiliki linearitas yang baik apabila memiliki nilai r > 0,999 (Yuwono and Indrayanto, 2005). Pada tabel V di atas dapat dilihat bahwa kurva baku replikasi II dan III telah memenuhi persyaratan linearitas yang baik, namun yang dipilih untuk digunakan pada perhitungan kadar selanjutnya adalah kurva baku replikasi III, karena memiliki nilai r yang lebih mendekati 1. Kurva hubungan konsentrasi kurkumin dengan AUC dapat dilihat pada gambar 13. Dengan demikian persamaan kurva baku yang digunakan adalah y = 0,9245x + 19,6500, dengan r = 0,9999.
41
Gambar 13. Hubungan antara konsentrasi kurkumin dengan AUC/100 (replikasi III)
F. Validasi Metode Analisis Validasi metode analisis dilakukan untuk membuktikan bahwa metode analisis yang digunakan memenuhi persyaratan validitas sehingga memberikan hasil analisis yang dapat dipercaya. Validasi dilakukan dengan 3 seri konsentrasi sebanyak 5 replikasi. Konsentrasi yang digunakan merupakan konsentrasi rendah, sedang, dan tinggi dari konsentrasi seri baku, yaitu 50 ppm, 100 ppm, dan 175 ppm. Pemilihan ketiga seri konsentrasi ini adalah untuk mewakili setiap konsentrasi dari seri baku, yaitu 50 ppm sampai 175 ppm. Parameter yang digunakan dalam penentuan validitas metode ini adalah selektivitas, linearitas, akurasi, presisi, dan range. 1. Selektivitas Selektivitas metode menggambarkan kemampuan suatu metode untuk mengukur respon analit dalam sampel secara akurat diantara semua komponen yang terdapat dalam matriks sampel. Metode yang memenuhi persyaratan selektivitas, maka metode tersebut hanya mengukur kadar analit. Pengambilan
42
analit dari matriks sampel, dilakukan dengan mengekstraksi sampel dengan metanol pH 4. Ekstraksi dilakukan dengan menggunakan ultrasonikator. Gelombang ultrasonik yang dihasilkan akan memberikan energi atau getaran yang akan mendorong kurkumin keluar dari serbuk simplisia yang tersuspensi dalam sampel, kemudian adanya metanol akan dapat menarik dan melarutkan kurkumin. Hal ini disebabkan karena kurkumin memiliki kelarutan yang baik dalam metanol. Namun banyak senyawa-senyawa dalam sampel yang juga memiliki kelarutan yang baik dalam metanol, sehingga dapat ikut terekstraksi bersama kurkumin, seperti demetoksikurkumin dan bis-demetoksikurkumin, serta minyak atsiri. Oleh karena itu, selektivitas yang baik dari metode diperlukan untuk mengukur analit secara akurat tanpa terganggu oleh senyawa-senyawa lain yang terdapat dalam sampel. Penentuan selektivitas dari metode KLT-Densitometri ini dapat dilihat dengan membandingkan nilai Rf baku dan Rf analit dalam sampel. Nilai Rf merupakan parameter analisis kualitatif suatu senyawa dalam campuran pada metode KLT, sehingga dapat digunakan sebagai parameter selektivitas. Parameter lain dari selektivitas adalah resolusi, dimana suatu metode dikatakan memiliki selektivitas yang baik apabila memiliki nilai resolusi > 1,5 (Swartz and Krull, 1997). Perbandingan nilai Rf antara baku dan analit dalam sampel serta nilai resolusi dapat dilihat pada tabel VI.
43
Tabel VI. Perbandingan nilai Rf baku dan sampel, serta nilai resolusi
Konsentrasi seri larutan baku kurkumin (ppm) 50 75 100 125 150 175 Rata-rata
Rf baku 0,53 0,53 0,52 0,53 0,53 0,54 0,53
Replikasi sampel
Rf sampel
Resolusi
1 2 3 4 5
0,50 0,50 0,50 0,51 0,54
2,4 2,25 2,4 2,53 2,57
0,51
2,43
Pada tabel VI dapat dilihat bahwa Rf baku dan analit dalam sampel menunjukkan nilai yang identik, dimana nilai Rf rata-rata dari baku adalah 0,53 dan Rf rata-rata dari analit dalam sampel adalah 0,51. Dari gambar 14 dan 15 dapat dilihat nilai Rf yang identik antara baku dan sampel. Sedangkan untuk nilai resolusi, pada gambar 15 dapat dilihat bahwa pada kromatogram sampel terdapat 3 peak dan nilai rata-rata resolusi antara peak nomor 3 dengan peak terdekat (peak nomor 2) adalah 2,43. Berdasarkan nilai Rf dan resolusi yang diperoleh tersebut, maka metode KLT-Densitometri ini dikatakan memenuhi parameter selektivitas dalam menetapkan kadar kurkumin.
Gambar 14. Rf baku kurkumin konsentrasi 100 ppm = 0,52
44
Gambar 15. Rf sampel replikasi 1 = 0,50
2. Linearitas Linearitas suatu metode ditunjukkan oleh nilai koefisien korelasi (r) dari kurva baku, dimana nilai r ini menunjukkan korelasi hubungan antara konsentrasi dengan respon pengukuran, dalam hal ini AUC. Suatu metode dikatakan memiliki linearitas yang baik apabila nilai r > 0,999 (Yuwono and indrayanto, 2005). Berdasarkan data yang diperoleh dari hasil pembuatan kurva baku diperoleh nilai r untuk replikasi II = 0,9997 dan replikasi III = 0,9999. Nilai r yang kurva baku repliasi II dan III tersebut memenuhi persyaratan, sehingga dapat dikatakan metode KLT-densitometri ini memiliki linearitas yang baik dalam menetapkan kadar kurkumin. 3. Akurasi Akurasi metode dalam suatu penelitian dinyatakan dengan nilai recovery. Recovery merupakan persen perolehan kembali kadar terukur terhadap kadar sebenarnya. Suatu metode dikatakan memiliki akurasi yang baik apabila nilai % recoverynya antara 98-102% (Harmita, 2004).
45
Tabel VII. Data % recovery
Kadar kurkumin 50 ppm 100 ppm 175 ppm
Replikasi I 101,10 101,64 101,99
Replikasi II 100,11 100,77 100,18
Recovery (%) Replikasi III Replikasi IV 99,00 100,75 101,79 100,10 102,72 103,83
Replikasi V 98,95 98,61 100,96
Berdasarkan hasil yang diperoleh, nilai recovery yang masuk pada rentang 98-102% adalah konsentrasi level rendah hingga sedang. Pada level konsentrasi tinggi (175 ppm), metode ini memiliki nilai recovery antara 100,18103,83%, nilai recovery yang diperoleh tidak memenuhi persyaratan akurasi yang baik yaitu 98-102% (Harmita, 2004). Oleh karena itu, metode ini dikatakan memiliki akurasi yang baik pada kadar 50 ppm dan 100 ppm, sehingga dapat digunakan untuk menetapkan kadar kurkumin pada level tersebut. 4. Presisi Presisi merupakan parameter yang menggambarkan kedekatan hasil pengukuran satu dengan lainnya dalam kondisi analisis yang sama. Presisi dinyatakan dengan nilai Coefficient of Variation (CV) atau Relative Standar Deviation (RSD). Kriteria presisi yang baik yaitu nilai CV ≤ 2% (Harmita, 2004). Tabel VIII. Data Coefficient of Variation (CV)
Kadar kurkumin 50 ppm 100 ppm 175 ppm
(ppm) 50,2883 100,5458 179,4245
SD 0,8552 0,7125 1,5902
CV (%) 1,7 0,7 0,9
Dari hasil perhitungan data yang diperoleh, nilai CV pada konsentrasi 50 ppm, 100 ppm, dan 175 ppm kurang dari 2 %. Oleh karena itu, metode penetapan kadar kurkumin ini dikatakan memiliki presisi yang baik, sehingga penetapan
46
kadar kurkumin pada level konsentrasi tersebut menggunakan metode ini akan memberikan kedekatan hasil pengukuran. 5. Range Range merupakan interval antara konsentrasi analit pada level bawah dan level atas dalam suatu sampel, yang masih memenuhi parameter linearitas, akurasi, dan presisi.
Linearitas dan presisi
akurasi
Gambar 16. Range konsentrasi kurkumin
Pada gambar 16 dapat dilihat bahwa range konsentrasi metode ini adalah 50-100 ppm. Range ini menunjukkan area analisis yang memenuhi parameter linearitas, akurasi, dan presisi.
G. Penentuan Akurasi dan Presisi Baku Kurkumin dalam Sampel Penentuan akurasi dan presisi baku kurkumin dalam sampel dilakukan dengan menambahkan baku kurkumin ke dalam matriks sampel. Namun sebelum melihat akurasi dan presisi baku kurkumin dalam sampel, adisi baku kurkumin pada sampel juga dilakukan untuk memastikan bahwa peak dengan nilai Rf yang identik terhadap baku kurkumin memang merupakan peak senyawa kurkumin.
47
Hal ini dapat diketahui dengan melihat apakah terjadi penambahan luas area pada peak yang dimaksud ketika dilakukan penambahan baku ke dalam sampel. Apabila luas area pada peak tersebut bertambah ketika baku kurkumin ditambahkan maka dapat dipastikan bahwa peak tersebut merupakan peak kurkumin. Berikut adalah gambar peak dari sampel tanpa penambahan baku dan sampel yang ditambah baku:
Gambar 17. Kromatogram sampel tanpa penambahan baku kurkumin
Gambar 18. Kromatogram sampel dengan penambahan baku kurkumin
Berdasarkan hasil yang diperoleh, terjadi penambahan luas area pada peak yang memiliki nilai Rf identik terhadap baku kurkumin. Dengan demikian dapat disimpulkan bahwa peak tersebut merupakan kurkumin.
48
Setelah dapat dipastikan bahwa peak dengan nilai Rf yang identik tersebut merupakan kurkumin, maka dilakukan penentuan akurasi dan presisi baku kurkumin dalam sampel. Hal ini dilakukan untuk mengetahui apakah metode ini masih dapat mengukur respon baku kurkumin dalam matriks sampel secara akurat dan seksama. Akurasi dan presisi baku yang ditambahkan dapat dilihat pada tabel IX. Tabel IX. Recovery dan CV baku kurkumin dalam matriks sampel
Replikasi I II III IV V
Recovery (%) 101,28 99,47 101,83 96,99 103,55
CV (%)
2,5
Kadar baku yang ditambahkan pada sampel adalah 25 ppm, maka menurut USP, nilai recovery yang dapat diterima yaitu 90-107% dan nilai CV≤16%. Oleh karena itu, dari tabel IX dapat disimpulkan bahwa metode KLTDensitometri ini dapat mengukur analit dalam matriks sampel secara akurat dan seksama.
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN
A. Kesimpulan Metode KLT-densitometri dengan instrumen Camag TLC Scanner 3 CAT. No. 027.6485 SER. No.160602, fase diam silika gel G 60, fase gerak kloroform:asam asetat glasial (95:5), volume penotolan 3,0 μL, dan jarak pengembangan 10 cm memiliki selektivitas dan linearitas yang baik akurasi yang baik pada konsentrasi 50-100 ppm, presisi yang baik pada konsentrasi 50-175 ppm, serta range antara 50-100 ppm. Berdasarkan hasil tersebut, maka metode KLT-densitometri ini memiliki validitas yang baik untuk menetapkan kadar kurkumin dalam sampel OHT Kiranti®.
B. Saran Perlu dilakukan penetapan kadar kurkumin pada sampel OHT Kiranti® menggunakan metode ini.
49
50
DAFTAR PUSTAKA Adamovics, 1997, Chromatographic Analysis of Pharmaceuticals,2nd Edition, Marcel Dekker, New York. Aggarwal, B., Bhatt, D., Ichikawa, H., Ahn, K.S., Sethi, G., Sandur, S.K., Natarajan, C., Seeram, N., and, Shishodia, S., 2006, Curcumin-Biological and medicinal Properties, 299-300, http://www.indsaff.com/ 10%20Curcumin%20biological.pdf , diakses tanggal 25 Oktober 2010. Agnam, N., Samhoedi, H., Timmerman, H., Venie, U. A., Sugiyanto, Goot, H., 1995, The Relationship Between Structure And Inhibition Of Lipoxygenase Activity of Curcumin Derivatives In International Symposium On Curcumin Pharmacochemistry ISCP, Yogyakarta. Anonim, 2010, Kiranti Sehat Datang Bulan, http://diarykiranti.com/kirantifunfact-sdb/, diakses tanggal 25 Oktober 2010. Aulton, 1988, Pharmaceutics: The Science of Dossage Form Design, edisi II, Churchill Livingstone, New York, pp. 310,335. Badan Pengawas Obat dan Makanan Republik Indonesia, 2004, Keputusan Kepala Badan Pengawas Obat dan Makanan Republik Indonesia No. HK 00.05.4.2411 tentang Ketentuan Pokok Pengelompokkan dan Penandaan Obat Bahan Alam indonesia, Badan Pengawas Obat dan Makanan Republik Indonesia, Jakarta. Badan Pengawas Obat dan Makanan Republik Indonesia, 2005, Pedoman Cara Pembuatan Obat tradisional yang Baik, Badan Pengawas Obat dan Makanan Republik Indonesia, Jakarta. Bermawie, N., Rahardjo, M., Wahyuno, D., Ma’mun, 2005, Status Teknologi Dan Panen Tanaman Kunyit Dan Temulawak Sebagai Penghasil Kurkumin, 85, 96, Balai Penelitian Tanaman Obat dan Aromatik, Bogor. Dean, J., 1995, Analytical Chemistry Handbook,Mc Graw-Hill Inc., USA, pp.4.98, 4.113. Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan RI, 1995a, Materia Medika Indonesia, edisi VI, Departemen Kesehatan RI, Jakarta, pp.148-152. Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan RI, 1995b, Farmakope Indonesia, edisi IV, Departemen Kesehatan RI, Jakarta, pp.735-737.
51
Drakeiron, 2008, Info Pentagamavunon-0, diakses tanggal 25 Oktober 2010.
http://drakeiron.wordpress.com,
Gritter, J.R., Bobbit, J.M., dan Scharting, A.E., 1991, Pengantar Kromatografi, diterjemahkan oleh Kosasih Pamawinata, Edisi II, Penerbit ITB, Bandung. Gandjar, G.I., dan Rohman, A, 2007, Kimia Farmasi Analisis, Pustaka Pelajar, Yogyakarta, pp.362-363. Gupta, A. P., Gupta, M. M., and Kumar, S., 1999, Simultaneous determination of curcuminoids in curcuma samples using high performance thin layer chromatography, http://203.190.147.121/bitstream/123456789/80/1/J Journal_Liquid_Chromatography_Related_Technologies_22_1561.pdf, diakses tanggal 15 Februari 2010. Hanani, E., 2010, Standarisasi Simplisia dan Ekstrak Daun Handeuleum (Graptophyllum Pictum), Laporan Penelitian, Universitas Indonesia, Jakarta. Harborne, 1973, Phtochemical methods, diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata dan Iwang Soediro, Terbitan II, hal.10-11, Institut Teknologi Bandung, Bandung. Hardjono, 1983, Kromatografi, Laboratorium Analisa Kimia Fisika Pusat, UGM, Yogyakarta, pp.32-34. Harmita, 2004, Petunjuk Pelaksanaan Validasi Metode dan Perhitungannya, Departemen Farmasi FMIPA UI, Depok, pp.5-25.
Cara
Katno, dan Pramono, 2010, Tingkat Manfaat dan Keamanan Tanaman Obat dan Obat Tradisional, Laporan Penelitian, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta. Kementerian Kesehatan RI, 1994, Keputusan Menteri Kesehatan Nomor:661/MENKES/VII/1994, Departemen Kesehatan RI, Jakarta.
RI
Khopkar, 1990, Concepts of Analytical Chemistry, diterjemahkan oleh Sapto Raharjo, Universitas Indonesia Press, Jakarta. Kohli, K., Ali, J., Ansari, M. J., and Raheman, Z., 2005, Curcumin : A Natural Anti- inflammatory Agent, 141 -142, In Indian Journal of Pharmacology, Jamie Hamdard University, New Delhi. Martono, S., 1996, Penentuan kadar kurkumin secara kromatografi lapis tipisdensitometri, Buletin ISFI Yogyakarta, 2 (4), 11-21.
52
Mintarsih, 1990, Penetapan Kadar Alkaloid Kininda dalam Akar, Batang, dan Daun Chinchona Succirubra Pavon et Klotzsch dari Daerah Kaliurang Secara Spektrodensitometri (TLC-Scanner),Skripsi, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta. Mulja, H.M. dan Suharman, 1995, Analisis Instrumental, Airlangga University Press, Surabaya, pp.102. Mulja, H.M dan Hanwar, 2003, Pinsip Cara Berlaboratorium yang Baik (Good Laboratory Practice),Majalah Farmasi Airlangga, Vol.III, No.2, 71-76. Nakayama, T., 1997, Affinities of Dietary Phenolic Antioxidants for Lipid Bilayers, in Shahidi, F., Ho, Chi-Tang. (Eds.), Phytochemicals and Phytopharmaceutical, 355-356, AOCS Press, USA. Paramasivam, M., Aktar, W., Poi, R., Banerjee, H., Bandyopahyay, A., 2008, Occurrence of curcuminoids in Curcuma longa: A quality standardization by HPTLC, http://www.banglajol.info/index.php/BJP/article/, diakses tanggal 15 Februari 2010 Rohman, 2009, Kromatografi Untuk Analisis Obat, Graha Ilmu, Yogyakarta, pp.45, 47, 53, 217. Roth, H.J., 1994, Pharmaceutical Analysis, diterjemahkan oleh Sarjono Kisman, Slamet Ibrahim, Cetakan 2, Gajah Mada University Press, Yogyakarta. Sari, L.O., 2006, Pemanfaatan Obat Tradisional dengan Pertimbangan Manfaat dan Keamanannya, Majalah Ilmu Kefarmasian, Vol.III, No.1, 1-7. Sherma, J., and, Fried B., 1996, Handbook of Thin Layer Chromatography, 2nd Edition, Marcel Dekker, Inc., pp.20. Stahl, 1985, Drugs Analysis by Chromatography and Microscopy, diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata, Institut Teknologi Bandung, Bandung. Stankovic, I., 2004, Curcumin: Chemical and Technical Assestment, ftp://ftp.fao.org/es/esn/jecfa/cta/CTA_61_Curcumin.pdf, diakses tanggal 15 Februari 2010. Sudjadi, 1988, Metode Pemisahan, cetakan pertama, Penerbit Kanisius, Yogyakarta, pp.167-175. Supardjan, A. M., Meiyanto, E., 2002, Efek Antiproliferatif Pentagamavunon – 0 Terhadap Beberapa Sel Kanker, Laporan Penelitian, Lembaga Penelitian Universitas Gajah Mada, Yogyakarta.
53
Swartz and Krull, 1997, Chromatographic Analysis of Pharmaceuticals, 2nd Edition, Marcel Dekker, USA. Tonnesen, H. H., 1989, Studies On Curcumin And Curcuminoids, Catalytic Effect Of Demethoxy And Bis-demethoxycurcumin On The Peroxydation Of Linoleic Acid By 15- Lipoxygenase, Internal Journal Pharmacy, Vol. XV, 51, 179-181 Tonnesen, H. H. and Greenhill, J. V., 1992, Studies on curcumin andcurcuminoids.. Curcumin as a reducing agent and as a radical scavenger, Int. J. Pharm., XXII87 Tonnesen, H. H., and Karlsen, 1983, Curcuminoid and It’s Compounds, Journal Chromatography, Vol. 4, 259 -376. Tonnesen, H.H., and Karlsen, 1985, Studies On Curcumin and Curcuminoids Alkaline Degradation of Curcuming Z.Lebens, Unters, Forsch, 180 : 132134. United States Pharmacopeial Convention, 2007, The United States Pharmacopeia, 30thedition, United States Pharmacopeial Convenction Inc., New York. Van der Goot, H., 2002, The Chemistry and Qualitative Structure – Activity Relationships Of Curcumin In Recent Development In Curcumin Pharmacochemistry, Procedings of The International Symposium on Curcumin Pharmacochemistry, 1995, Edited By Suwijyo Pramono, Aditya Media, Yogyakarta. Yuwono, M. and Indrayanto, G., 2005, Validation of Chromatographic Methods of Analysis, Profile of Drug Substances, Excipients, and Related Methodology, Elseiver Inc., 32, 243-259.
54
LAMPIRAN
55
Lampiran 1. Pernyataan Jaminan Keaslian Bahan Kurkumin Standar Hasil Sintesis
56
Lampiran 2. Data Penimbangan Bahan 1. Baku Kurkumin Kurkumin (g) Berat kertas Berat kertas + zat Berat kertas + zat Berat kertas + sisa Berat zat
Replikasi I 13,966 13,976 13,9764 13,9661 0,0103
Replikasi II 15,001 15,011 15,0112 15,0013 0,0099
Replikasi III 14,785 14,795 14,7952 14,7852 0,0100
2. Validasi Metode Kurkumin Kurkumin (g) Berat kertas Berat kertas + zat Berat kertas + zat Berat kertas + sisa Berat zat
I 14,675
II 14,253
Replikasi III 13,728
IV 14,852
V 15,227
14,685
14,263
13,738
14,862
15,237
14,6853
14,2633
13,7386
14,8622
15,2374
14,6753
14,2531
13,7287
14,8523
15,2371
0,0100
0,0102
0,0099
0,0099
0,0103
3. Validasi Metode Kurkumin dalam Matriks Sampel Kurkumin (g) Berat kertas 15,752 Berat kertas + zat 15,762 Berat kertas + zat 15,7623 Berat kertas + sisa 15,7524 Berat zat 0,0099
Lampiran 3. Kromatogram seri baku kurkumin replikasi III 1. Seri 1 (50 ppm)
57
2. Seri 2 (75 ppm)
3. Seri 3 (100 ppm)
4. Seri 4 (125 ppm)
58
5. Seri 5 (150 ppm)
6. Seri 6 (175 ppm)
Lampiran 4. Kromatogram validasi metode 1. Konsentrasi rendah (50 ppm) Replikasi I
59
Replikasi II
Replikasi III
Replikasi IV
60
Replikasi V
2. Konsentrasi sedang (100 ppm) Replikasi I
Replikasi II
61
Replikasi III
Replikasi IV
Replikasi V
62
3. Konsentrasi tinggi (175 ppm) Replikasi I
Replikasi II
Replikasi III
63
Replikasi IV
Replikasi V
Lampiran 5. Contoh perhitungan kadar kurkumin 1. Skema pembuatan Timbang lebih kurang seksama 10,0 mg kurkumin ↓ Larutkan dengan metanol pH 4 ad hingga 10,0 ml ↓ Pipet 0,25 ml; 0,375 ml; 0,5 ml; 0,625 ml; 0,75 ml; dan 0,875 ml ↓ Encerkan dengan metanol pH 4 ad hingga 5,0 ml 2. Perhitungan seri kadar kurkumin Bobot kurkumin hasil penimbangan = 0,0103 g = 10,3 mg Kadar stok kurkumin = 10,3 mg / 10 ml = 1030 mg / 1000 ml = 1030 ppm
64
Kadar seri larutan baku kurkumin : C1.V1 = C2.V2 1030 ppm x 0,25 ml = C2 x 5 ml C2 = 51,5 ppm Baku kurkumin Replikasi II
Replikasi I Seri baku (ppm) 51,5 77,25 103 128,75 154,5 180,25 A B r
AUC
Tinggi peak
7009,9 9403,3 11159,2 13535,4 15461,5 18444
183 252,1 272,2 341,5 355,8 449,5
2509,47 81 86,2372 0,9976
88,786 7 1,900 0,9821
Seri baku (ppm) 49,5 74,25 99 123,75 148,5 173,25 A B r
Replikasi III
AUC
Tinggi peak
6528,6 8785,8 11108,2 13577,8 15698 17818,8
145,5 211,9 253 330,9 358,6 449,5
2011,22 67 91,9564 0,9997
57,061 9 2,0190 0,9890
Seri baku (ppm) 50 75 100 125 150 175 A B r
AUC
Tinggi peak
6600 8864,1 11298,6 13455,5 15774,6 18201,1
149,6 216,9 257,7 336,9 364,6 397,7
1965,00 57 92,4502 0,9999
60,587 6 2,0146 0,9886
Dilakukan penyesuaian nilai AUC agar nilai tan α mendekati 1 Baku kurkumin Replikasi I Replikasi II Replikasi III Seri baku Seri baku Seri baku AUC/100 AUC/100 AUC/100 (ppm) (ppm) (ppm) 51,5 70,099 49,5 65,286 50 66 77,25 94,033 74,25 87,858 75 88,641 103 111,592 99 111,082 100 112,986 128,75 135,354 123,75 135,778 125 134,555 154,5 154,615 148,5 156,98 150 157,746 180,25 184,44 173,25 178,188 175 182,011 A B r
25,0948 0,8624 0,9976
A B r
20,1123 0,9196 0,9997
A B r
19,6500 0,9245 0,9999
Lampiran 6. Persamaan kurva baku dan gambar kurva baku kurkumin 1. Persamaan kurva baku yang digunakan adalah replikasi 3, yaitu : y=0,9245x+19,6500
65
2. Gambar kurva baku kurkumin
Lampiran 7. Nilai AUC dan contoh perhitungan recovery kurkumin 1. AUC kurkumin Kadar AUC/100 kurkumin Replikasi I Replikasi II Replikasi III Replikasi IV Replikasi V 50 ppm 66,386 66,85 64,956 65,752 66,761 100 ppm 112,693 118,79 112,817 112,087 113,547 175 ppm 184,658 184,968 184,713 185,956 187,885 2. Contoh perhitungan recovery Replikasi I Perhitungan kadar teoritis - Bobot kurkumin hasil penimbangan = 0,0100 g = 10 mg - Kadar stok kurkumin = 10 mg/10 ml = 1000 mg/1000ml = 1000 ppm C1.V1=C2.V2 Kadar rendah → 1000 ppm x 0,25 ml = C2 x 5 ml C2 = 50 ppm Kadar sedang → 1000 ppm x 0,5 ml = C2 x 5 ml C2 = 100 ppm Kadar tinggi → 1000 ppm x 0,875 ml = C2 x 5 ml C2 = 175 ppm Perhitungan kadar terukur y = 0,9245x+19,6500 y = AUC / 100
66
Kadar rendah → 66,386 = 0,9245x + 19,6500 x = 50,5527 ppm Kadar sedang → 112,693 = 0,9245x + 19,6500 x = 100,6414 ppm Kadar tinggi → 184,658 = 0,9245x + 19,6500 x = 178,4835 ppm Perhitungan recovery Recovery Kadar rendah → Kadar sedang → Kadar tinggi → Kadar kurkumin 50 ppm 100 ppm 175 ppm
Replikasi I 101,10 101,64 101,99
= 101,10% = 101,64% = 101,99%
Replikasi II 100,11 100,77 100,18
Recovery (%) Replikasi III 99,00 101,79 102,72
Replikasi IV 100,75 100,10 103,83
Lampiran 8. Contoh perhitungan CV kurkumin Kadar kurkumin CV (%) (ppm) SD 50 ppm 50,2883 0,8552 1,7 100 ppm 100,5458 0,7125 0,7 175 ppm 179,4245 1,5902 0,9 Lampiran 9. Kromatogram sampel tanpa penambahan baku 1. Replikasi I
Replikasi V 98,95 98,61 100,96
67
2. Replikasi II
3. Replikasi III
4. Replikasi IV
68
5. Replikasi V
Lampiran 10. Kromatogram sampel dengan penambahan baku 1. Replikasi I
2. Replikasi II
69
3. Replikasi III
4. Replikasi IV
5. Replikasi V
70
Lampiran 11. Contoh perhitungan resolusi
Diketahui: Rf kurkumin = 0,50 Rf peak terdekat = 0,32 Perhitungan: Resolusi (Rs) = = 2,4 (replikasi I) Replikasi II→ 2,25 Replikasi III→ 2,4 Replikasi IV→ 2,53 Replikasi V→ 2,57
Lampiran 12. Nilai AUC sampel dan sampel yang diadisi baku kurkumin AUC/100 Replikasi Sampel Adisi I 69,88 93,055 II 68,795 91,556 III 70,058 93,358 IV 69,983 92,175 V 68,567 92,261 Lampiran 13. Contoh perhitungan recoverybaku kurkumin dalam sampel Perhitungan kadar teoritis Bobot kurkumin = 0,0099 g = 9,9 mg Kadar stok kurkumin = 9,9 mg/10 ml = 990 mg/1000 ml = 990 ppm C1.V1 = C2.V2 990.0,125=C2.5
71
C2= 24,75 ppm Replikasi I Perhitungan kadar baku + sampel terukur y = 0,9245x + 19,65 93,055 = 0,9245x +19,65 x = 79,3997 ppm Perhitungan kadar sampel terukur y = 0,9245x + 19,65 69,88 = 0,9245x +19,65 x = 54,3321 ppm Perhitungan kadar baku terukur Kadar terukur baku = kadar (baku + sampel) terukur - kadar sampel terukur = 79,3997 – 54,3321 = 25,0676 ppm Perhitungan recovery kadar baku terukur Recovery = = = 102,34 % Lampiran 14. Tabel perhitungan CV kadar baku kurkumin dalam sampel Replikasi SD CV (%) (ppm) (ppm) I 25,0676 II 24,6197 2,5 III 25,2028 24,9047 0,6189 IV 24,0043 V 25,629
72
BIOGRAFI PENULIS
Penulis skripsi yang berjudul Validasi Metode Kromatografi Lapis Tipis (KLT)-Densitometri pada Penetapan Kadar Kurkumin dalam Sediaan Cair Obat Herbal Terstandar (OHT) Kiranti® ini bernama lengkap Yunita Dwi Wulansari. Penulis dilahirkan di Surakarta pada tanggal 10 Juni 1989 sebagai anak kedua dari tiga bersaudara, dari pasangan Heru Handoyo dan Ika Yanti. Penulis telah menyelesaikan pendidikannya di SD Marsudirini Surakarta pada tahun 2001, di SMP Pangudi Luhur Bintang Laut Surakarta pada tahun 2004, dan di SMA Negeri 3 Surakarta pada tahun 2007. Penulis kemudian melanjutkan pendidikannya di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta pada tahun 2007. Selama menempuh pendidikan di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma penulis aktif dalam berbagai kegiatan dan organisasi, antara lain panitia pelepasan wisudawan/wisudawati 2008 (konseptor), panitia inisiasi Fakultas Farmasi TITRASI 2008 (pendamping kelompok), panitia inisiasi Fakultas Farmasi TITRASI 2009 (Steering Comitte), Badan Eksekutif Mahasiswa Fakultas (BEMF) Farmasi 2009/2010 (divisi organisasi), dan Dewan Perwakilan Mahasiswa Fakultas 2010/2011 (wakil ketua). Di bidang akademik, penulis pernah menjadi asisten dosen praktikum Spektroskopi, asisten dosen praktikum Kromatografi, dan asisten dosen praktikum Kimia analisis. Selain itu, pada tahun 2009 penulis juga pernah mengikuti Program Kreativitas Mahasiswa (PKM), yang berjudul Sediaan Celup Kulit Ari Kacang Tanah sebagai Minuman Kesehatan bagi Penderita Demam Berdarah Dengue, dimana program ini diselenggarakan oleh DIKTI.
