KEANEKARAGAMAN MOLEKULER DURIAN BERDASARKAN FRAGMEN INTERNAL TRANSCRIBED SPACERS (ITS) DNA RIBOSOMAL MELALUI ANALISIS PCR-RFLP
skripsi disusun sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sain Biologi
Oleh Rohati Uswahdani Hikmah 4450406007
JURUSAN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS NEGERI SEMARANG 2013
i
PERNYATAAN KEASLIAN SKRIPSI
ii
PENGESAHAN
iii
ABSTRAK Hikmah, Rohati Uswahdani. 2013. Keanekaragaman Molekuler Durian Berdasarkan Fragmen Internal Transcribed Spacers (ITS) DNA Ribosomal Melalui Analisis PCR-RFLP. Skripsi, Jurusan Biologi FMIPA Universitas Negeri Semarang. Dr. Ir. Amin Retnoningsih, M.Si dan Noor Aini Habibah, S.Si, M.Si Buah durian merupakan salah satu jenis buah-buahan tropis yang mempunyai nilai ekonomis tinggi. Indonesia merupakan salah satu negara penghasil buah durian yang memiliki keanekaragaman. Salah satu daerah penghasil durian di Indonesia yaitu di Kecamatan Gunungpati, Semarang, Jawa Tengah. Buah durian memiliki bermacam-macam kultivar dengan ciri morfologi yang sulit dibedakan. Kepastian identitas kultivar durian menjadi sangat penting untuk menghindari kekeliruan khususnya dalam budidaya dengan tujuan komersial. Market atau pasar membutuhkan identitas kultivar durian yang jelas. Kepastian identitas juga sangat penting sebagai informasi mendasar dalam peningkatan efisiensi dan pengembangan pemuliaan durian. Identifikasi molekuler dipandang lebih akurat dibandingkan karakter morfologi. PCR-RFLP merupakan salah satu metode untuk menganalisis DNA menggunakan perbedaan panjang fragmen hasil pemotongan dengan enzim restriksi endonuklease. Perbedaan panjang fragmen ini dapat dilihat menggunakan elektroforesis gel agaros, sehingga dapat ditentukan sidik jari dari masing kultivar durian yang didasarkan pada masing-masing markernya. Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah 11 aksesi durian yang diambil secara acak di Kecamatan Gunungpati, Semarang. Sampel tersebut diisolasi DNA kemudian diamplifikasi menggunakan PCR. Hasil amplifikasi kemudian dipotong menggunakan enam enzim restriksi Bsp1431, AluI, Eco471, BsuRI, Ade1 dan Mph11301. Fragmen hasil pemotongan kemudian dianalisis sidik jari menggunakan gel agaros. Hasil penelitian 11 aksesi durian yang diteliti menunjukkan bahwa enzim Bsp1431 memiliki dua situs spesifik yaitu memotong pada ukuran 550bp dan 120bp. Enzim BsuR1 memiliki situs pemotongan yang spesifik pada ukuran 600bp. Sedangkan enzim Eco471 memiliki situs pemotongan yang spesifik pada ukuran 450bp. Kesimpulan dari penelitian ini yaitu didapatkan sidik jari yaitu oleh pemotongan menggunakan enzim Bsp1431 BsuR1 dan Eco471. Kata kunci: keanekaragaman molekuler durian, ITS DNA ribosomal, PCR-RFLP,
iv
KATA PENGANTAR
Puji syukur penulis panjatkan ke hadirat Allah SWT atas limpahan rahmat dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini dengan baik. Skripsi dengan judul “Keanekaragaman Molekuler Durian Berdasarkan Fragmen Internal Transcribed Spacers (ITS) DNA Ribosomal Melalui Analisis PCRRFLP” bertujuan mendapatkan sidik jari DNA durian berdasarkan fragmen Internal Transcribed Spacer (ITS) DNA ribosomal dengan teknik PCR-RFLP, untuk mengetahui keanekaragaman varietas durian di Kecamatan Gunungpati. Penyelesaian skripsi ini tidak lepas dari bantuan dan dukungan semua pihak yang terkait. Penulis mengucapkan terima kasih kepada : 1. Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (FMIPA). 2. Ketua Jurusan Biologi Universitas Negeri Semarang. 3. Dr. Ir. Amin Retnoningsih, M. Si, selaku dosen pembimbing utama dan Noor Aini Habibah, S.Si, M.Si, selaku dosen pendamping, yang telah memberikan arahan dalam pelaksanaan penelitian dan penulisan skripsi ini. 4. Ir. Tuti Widianti, M.Biomed selaku dosen penguji yang telah memberikan masukan dan saran dalam rangka perbaikan penulisan skripsi ini. 5. Ibu, Bapak dan Kakak, atas semua doa, dukungan, kesabaran dan pengertian kepada penulis. 6. Ria Ika Maharani, M.Si, Fitri Arum Sasi, S.Pd, yang telah membantu dan memberi arahan dalam melaksanakan penelitian. 7. Sriyadi, S.Pd dan Pak Nur yang telah membantu dalam proses ijin dan pengambilan sampel daun di Kecamatan Gunungpati. 8. Fidia F, S.Si, Gumilang Pramesti FA, S.Si, Mirta‟ati N, S.Si, Rahayu Muning S, S.Si, Tri Wulan DE, S.Si, Margaretha P, S.Si dan Retno Purwanti, S.Si, yang telah membantu penulis dalam menyelesaikan penelitian. 9. Lutfian Nazar, S.Si, yang selalu menemani dan menyalakan semangat penulis dalam menyelesaikan skripsi ini. 10. Semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu yang telah membantu penyusunan skripsi ini.
v
Tiada gading yang tak retak, skripsi ini masih jauh dari sempurna, oleh karena itu saran dan kritik yang membangun penulis harapkan dari pembaca sekalian. Semoga skripsi ini bermanfaat. Amin
Semarang, 2 Agustus 2013
Penulis
vi
DAFTAR ISI Halaman HALAMAN JUDUL .....................................................................................
i
PERNYATAAN KEASLIAN SKRIPSI
ii
........................................................
PENGESAHAN ............................................................................................
iii
ABSTRAK ...................................................................................................
iv
KATA PENGANTAR
v
...................................................................................
DAFTAR ISI ................................................................................................
vii
DAFTAR TABEL .........................................................................................
ix
DAFTAR GAMBAR
....................................................................................
x
.................................................................................
xi
DAFTAR LAMPIRAN BAB I
PENDAHULUAN
A. Latar Belakang ..............................................................................
1
B. Rumusan Masalah ...........................................................................
2
C. Penegasan Istilah
..........................................................................
3
D. Tujuan Penelitian
..........................................................................
3
E. Manfaat Penelitian
........................................................................
4
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
A. Tanaman durian ( Durio sp.)
........................................................
5
B. Polymerase Chain Reaction Restriction Fragmen Lenght Polimorfism (PCR- RFLP)
..........................................................
6
C. Internal Transcribed Spacer (ITS) DNA Ribosomal .....................
7
D. Enzim Restriksi Endonuklease .......................................................
8
BAB III METODE PENELITIAN A. Lokasi dan Waktu Penelitian B. Populasi Sampel
........................................................
9
.............................................................................
9
C. Rancangan Penelitian ......................................................................
10
D. Alat dan Bahan
..............................................................................
10
E. Prosedur Penelitian ..........................................................................
12
F. Metode Pengumpulan Data .............................................................
17
G. Metode Analisis Data
17
....................................................................
vii
BAB IV HASIL dan PEMBAHASAN A. Hasil
...........................................................................................
18
B. Pembahasan ................................................................................
22
BAB V
PENUTUP
A. Kesimpulan ..................................................................................
26
B. Saran
..........................................................................................
26
DAFTAR PUSTAKA ..................................................................................
27
LAMPIRAN-LAMPIRAN .........................................................................
32
viii
DAFTAR TABEL Tabel
Halaman
1.
Urutan dan ukuran basa primer ITS L dan ITS 4 ...........................
10
2.
Alat penelitian
.............................................................................
11
3.
Bahan penelitian
..........................................................................
12
ix
DAFTAR GAMBAR Gambar 1.
Halaman
Contoh elektroforegram gel agaros berdasarkan hasil analisis PCR-RFLP pada ITS DNA ribosomal pada kultivar pisang......................
8
2.
Daun durian
............................................................................................. 10
3.
Alur penelitian
4.
Elektroforegram hasil isolasi DNA durian .................................................. 18
5.
Elektroforegram hasil amplifikasi menggunakan ITS L dan ITS ................ 18
6.
Elektoforegram hasil pemotongan menggunakan enzim restriksi Alu1......... 19
7.
Elektoforegram hasil pemotongan menggunakan enzim restriksi Bsp1431 ..
......................................................................................... 13
....................................................................................................................... 19 8.
Elektoforegram hasil pemotongan menggunakan enzim restriksi BsuR1 .... 20
9.
Elektoforegram hasil pemotongan menggunakan enzim restriksi Eco471 .... .........................................................................................................................20
10. Elektoforegram hasil pemotongan menggunakan enzim restriksi Ade1 ........................................................................................................................ 21 11. Elektoforegram hasil pemotongan menggunakan enzim restriksi Mph11301 .........................................................................................................................21
x
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran
Halaman
1
Alat penelitian…….………………………………………….
32
2
Dokumentasi penelitian………………………………………
34
3
Lembar pengajuan tema skripsi…………………...……….....
35
4
Surat penetapan dosen pembimbing.........................................
36
5
Surat ijin penelitian di laboratorium Biologi Molekuler……..
37
xi
BAB I PENDAHULUAN A. Latar Belakang Buah durian merupakan salah satu jenis buah-buahan tropis yang mempunyai nilai ekonomis tinggi. Indonesia merupakan salah satu negara penghasil buah durian yang memiliki keanekaragaman. Salah satu daerah penghasil durian di Indonesia yaitu Kecamatan Gunungpati, Semarang, Jawa Tengah. Buah durian memiliki bermacam-macam kultivar dengan ciri morfologi yang sulit dibedakan. Kepastian identitas kultivar durian menjadi sangat penting untuk menghindari kekeliruan khususnya dalam budidaya dengan tujuan komersial. Market atau pasar membutuhkan identitas kultivar durian yang jelas. Kepastian identitas juga sangat penting sebagai informasi mendasar dalam peningkatan efisiensi dan pengembangan pemuliaan durian. .
Salah satu cara mempelajari keanekaragaman genetika adalah
berdasarkan karakter morfologi. Pada penelitian Novayandi (2004) menyebutkan bahwa ada ketidaksesuaian karakter morfologi dengan penanda molekuler (isozim) pada analisis genetik tanaman durian. Hal ini menunjukkan bahwa mempelajari keanekaragaman genetika menggunakan penanda morfologi hasilnya kurang tepat karena sangat dipengaruhi oleh lingkungan, dan interaksi antara genetik dan lingkungan (Pandin 2010, Sobir et al. 2005). Karakter molekuler dengan teknik PCR merupakan cara yang tepat untuk menentukan identitas suatu organisme. Identifikasi molekuler dipandang lebih akurat dibandingkan karakter morfologi (Guzwo-Krzeminska et al. 2001, Vicente et al. 2005). Salah satu karakter molekuler yang dapat digunakan sebagai karakter pengenal adalah daerah Internal Transcribed Spacer (ITS) DNA ribosom. Pemilihan DNA ribosom untuk tujuan identifikasi suatu organisme didasarkan pada: (1) sifat homolog pada berbagai organisme yang berbeda, (2) terdapat banyak di dalam sel, (3) sekuennya cukup panjang sehingga memungkinkan dilakukannya uji statistik untuk melihat perbedaannya satu sama lain.
1
2
Variasi DNA ribosom dapat diamati melalui pemotongan oleh enzim endonuklease tertentu (restriction enzyme). Enzim ini akan memotong situs tertentu yang dikenali. Proses ini menyebabkan terbentuknya fragmen-fragmen DNA yang berbeda ukurannya dari satu organisme ke organisme lain. Polimorfisme ini selanjutnya digunakan sebagai penciri (sidik jari suatu organisme). Pemanfaatan penanda DNA dapat dibagi menjadi 2 tipe yaitu : berdasarkan hibridisasi DNA-DNA yang dipotong dengan enzim restriksi, seperti AFLP dan RFLP, serta amplifikasi DNA seperti RAPD dan Simple Sequence Repeat (SSR) (Yunus 2004). Dalam hal ini penggunaan teknik PCRRFLP secara mengesankan berhasil mengungkap keanekaragaman genetika berbagai organisme (Vekemans et al. 1998, Krokene et al. 2004, Bertea et al. 2006) Metode PCR-RFLP mengamplifikasi DNA pada daerah ITS DNA Ribosomal dengan enzim restriksi pada situs pemotongannya yang kemudian dianalisis menggunakan elektroforesis.
B. Rumusan Masalah Dari 20 jenis Durio yang ditemukan di Indonesia, 18 jenis di antaranya terdapat di Kalimantan, tujuh jenis di Sumatera, satu jenis terdapat di Jawa, Bali, Sulawesi, serta Maluku. Salah satu dari sembilan jenis kerabat Durio yang dapat dimakan (edible fruit) yaitu Durio zibethinus.
D.zibethinus merupakan buah
favorit di Indonesia khususnya di kawasan Indonesia bagian barat (Uji 2005). Di Jawa, banyak kultivar yang sangat sulit dibedakan menurut morfologinya. Penggunaan teknologi molekuler, dapat membedakan kultivar durian, salah satunya yaitu dengan teknik PCR-RFLP. PCR-RFLP merupakan salah satu metode untuk menganalisis DNA menggunakan perbedaan panjang fragmen hasil pemotongan dengan enzim restriksi
endonuklease.
Perbedaan
panjang fragmen
ini
dapat
dilihat
menggunakan elektroforesis gel agaros, sehingga dapat ditentukan sidik jari dari masing kultivar durian yang didasarkan pada masing-masing markernya. Berdasarkan uraian diatas, permasalahan yang akan dikaji dalam penelitian ini adalah untuk mengetahui keanekaragaman kultivar durian pada ITS DNA
3
Ribosomal dengan menggunakan metode PCR-RFLP berdasarkan sidik jari DNA durian yang diperoleh setelah menganalisis variasi fragmen Internal Transcribed Spacer (ITS) DNA ribosomal.
C. Penegasan Istilah 1.
Keanekaragaman genetik Keanekaragaman genetik adalah perbedaan di dalam jenis (Abercrombie et al 1991). Kajian penelitian ini adalah perbedaan ukuran fragmen ITS DNA ribosomal yang dipotong dengan enzim restriksi.
2.
Internal Transcribed Spacer (ITS) DNA Ribosomal Internal Transcribed Spacer (ITS) DNA Ribosomal adalah bagian DNA yang mengkode sub unit RNA pada 18S, 58S dan 26S, terorganisasi dalam kelompok multigen yang terbentuk karena ulangan 250 sampai lebih dari 20.000 unit gen per genom (Roger dan Bendich 1987).
3.
PCR-RFLP Polimerase Chain Reaction- Restriction Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP) merupakan suatu metode analisis keanekaragaman genetika dengan cara memotong fragmen DNA menggunakan enzim restriksi endonuklease.
Amplifikasi
DNA
dengan
cara
memotong
DNA
menggunakan enzim restriksi endonuklease. Pada penelitian ini akan digunakan penanda ITS DNA Ribosomal dengan 2 primer yaitu : ITS L „TCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTG‟
dan
ITS
4
„TCCTCCGCTTATTGATATGC‟.
D. Tujuan Penelitian Tujuan penelitian ini adalah mengetahui keanekaragaman kultivar durian Kecamatan Gunungpati pada ITS DNA Ribosomal dengan menggunakan metode PCR-RFLP berdasarkan sidik jari DNA durian yang diperoleh setelah menganalisis variasi fragmen Internal Transcribed Spacer (ITS) DNA ribosomal.
4
E. Manfaat Penelitian Hasil
penelitian
ini
diharapkan
dapat
memberikan
informasi
keanekaragaman dan sidik jari sehingga dapat digunakan untuk memastikan kebenaran kultivar jenis durian (true to type).
BAB II TINJAUAN PUSTAKA A. Tanaman durian ( Durio sp ) Indonesia merupakan salah satu dari delapan pusat keanekaragaman genetika tanaman di dunia khususnya untuk buah-buahan tropis seperti durian, bacang (mangga) dan rambutan (Sastrapradja dan Rifai 1989). Tanaman durian yang dapat dimakan (edible fruit) ada sembilan jenis yaitu Durio dulcis (lahong), D. excelsus (apun), D. grandiflorus (sukang), D. graveolens (tuwala), D. kutejensis (lai), D. lowianus (teruntung), D. oxleyanus (kerantungan), D. testudinarum (sekura) dan D. zibethinus (durian) (Uji 2005). Salah satu dari empat jenis diantaranya yang telah dibudidayakan adalah Durio zibethinus. Tanaman durian termasuk famili Bombaceae sebangsa pohon kapukkapukan. Klasifikasi tanaman durian adalah sebagai berikut. Kingdom: Plantae Divisi: Magnoliophyta Kelas: Magnoliopsida Ordo: Malvales Famili: Bombacaceae Genus: Durio Spesies: Durio zibethinus Murr (Van Steenis 1992) Durio
zibethinus
(durian)
di
Indonesia
memiliki
kultivar
yang
beranekaragam, tercatat 38 kultivar dan enam diantaranya, yaitu varietas Petruk, Vera, Bubur, Kopek/Kempis, Kendi dan Kerikil terdapat di Jawa Tengah. Keenam jenis durian tersebut memiliki aroma harum dan tajam. Rasa buah manis dan warna daging buahnya putih, hingga kuning keemasan. Durian petruk, vera, bubur, dan kopek memiliki daging buah yang tebal dan berbiji kecil. Tekstur daging buahnya berbeda-beda. Durian petruk memiliki tekstur berserat halus, durian bubur bertekstur lembek seperti bubur, begitu juga dengan durian kerikil, sedangkan durian vera dan durian kendi bertekstur kering.
5
6
Durian memiliki bermacam manfaat selain dikonsumsi sebagai buah segar dan makanan olahan. Manfaat lainnya, yaitu tanaman pohonnya sebagai pencegah erosi di lahan-lahan yang miring, batang pohon durian sering dimanfaatkan untuk bahan bangunan atau perabotan rumah tangga karena kayunya cenderung lurus seperti kayu sengon, bijinya memiliki kandungan pati cukup tinggi dan berpotensi sebagai alternatif pengganti makanan (dapat dibuat bubur yang dicampur daging buahnya), kulit dipakai sebagai bahan abu gosok yang bagus (Bappenas 2000). Analisis keanekaragaman durian secara molekuler telah banyak dilakukan antara lain menggunakan marka mikrosatelit, RAPD dan menggunakan metode PCR-RFLP. Analisis keanekaragaman genetik durian berdasarkan penanda RAPD dengan amplifikasi menggunakan 6 primer polimorfik OPA-01, OPA-02, OPA-07, OPA-16, OPA-18, dan OPA-19 telah menghasilkan pola pita yang menunjukkan keragaman antar varietas, yaitu pada lima varietas durian cenderung memisah, durian sukun, sunan, monthong dan petruk merupakan satu kelompok yang memisah dari durian kani (Ruwaida 2009). Keanekaragaman genetik pada 10 varietas durian oleh Nafsi (2007) menggunakan penanda mikrosatelit lokus DZgccg01, lokus DZcag01, dan lokus DZg01 menghasilkan analisis kekerabatan menjadi dua kelompok besar yaitu kelompok A terdiri atas durian aden, hepe, petruk, sunan, sitokong, matahari, dan monthong, serta kelompok B terdiri dari durian ajimah, D24 dan chanee.
B. Polymerase Chain Reaction Restriction Fragment Lenght Polimorfism (PCR- RFLP) Banyak metode yang dapat digunakan untuk melakukan analisis DNA, salah satunya yaitu amplifikasi dengan Polimerase Chain Reaction- Restriction Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP). Teknik ini adalah salah satu teknik penandaan DNA yang didasarkan pada perbedaan sisi pemotongan (situs restriksi). Enzim restriksi endonuklease yang dapat mendigesti DNA akan memotong DNA pada sisi-sisi restriksi tertentu menjadi fragmen-fragmen yang kemudian dengan analisis elektroforesis gel
dapat ditentukan analisis yang
diinginkan sesuai dengan markernya masing-masing.
7
Metode PCR-RFLP yang memanfaatkan amplifikasi dengan primer spesifik atau universal yang diikuti dengan pemotongan menggunakan enzim restriksi
endonuklease
dan
dilanjutkan
dengan
analisis
menggunakan
elektroforesis telah banyak digunakan untuk penentuan filogeni tanaman. Pemanfaatan PCR-RFLP dalam identifikasi dan penentuan filogeni pada tanaman telah banyak dilakukan, antara lain pada Fungi (Nakamura et al 1997), Phaseolus (Xavier et al 1997) dan pisang (Ekasari 2011). Santoso et al (2005) mempelajari variasi genetik 11 aksesi dari 10 spesies durian dengan metode PCR-RFLP menggunakan delapan jenis enzim restriksi pada daerah ndhC-trnV dan rbcL. Pada daerah ndhC-trnV menunjukkan variasi polimorfisme yang lebih tinggi dibandingkan dari daerah rbcL yaitu aksesi dikelompokkan menjadi lima kelompok yang berbeda, sedangkan pada daerah rbcL, hanya dikelompokkan ke dalam tiga kelompok. PCR-RFLP pada daerah IGS-rDNA dan ndhC-trnV di DNA durian dari 71 klon yang dibudidayakan ditemukan telah menghasilkan pita monomorfik, menunjukkan bahwa, perubahan tidak terjadi pada pola urutan di kedua daerah (Santoso 2004).
C. Internal Transcribed Spacer (ITS) DNA Ribosomal DNA ribosomal adalah DNA yang mengkode RNA Ribosomal, terdiri atas pengulangan tandem dari segmen unit, operon, yang terdiri dari NTS, ETS, 18S, ITS1 5.85, ITS2 dan 28S. Daerah ITS merupakan daerah non fungsional pada gen DNA Ribosomal. Pada tanaman dikotil dan lumut panjang ITS2 didistribusikan antara 100bp dan 700bp, sedangkan pada monokotil, gymnospermae dan pakis antara 100bp dan 480 bp. Metode ini terbukti dapat membedakan genom pada beberapa kultivar pisang. Gambar 1 menunjukkan hasil analisis elektroforesis gel dari PCR-RFLP dengan penanda ITS-DNA Ribosomal pada tanaman pisang.
8
Gambar 1 Contoh hasil analisis elektroforesis gel dari PCR-RFLP dengan penanda ITS-DNA Ribosomal pada pisang (Nwakanma et al 2003) Gambar 1 merupakan produk PCR-RFLP pisang dengan menggunakan 2 primer ITS didapatkan DNA dengan panjang fragmen 600-700 bp. DNA ini kemudian dipotong dengan menggunakan enzim endonuklese RsaI sehingga terjadi pemotongan pada pita-pita DNA dengan ukuran fragmen yang spesifik untuk masing-masing genom yaitu 530 bp untuk genom pisang A, 350 bp da 180 bp untuk genom B. Berdasarkan hasil pemotongan tersebut dapat dibaca pita-pita DNA dan ditentukan genom dari masing-masing kultivar pisang yang dianalisis. Gen RNA ribosomal pada tanaman tingkat tinggi terbentuk dalam unit yang panjang berulang pasangan. Masing-masing unit yang berulang terdiri atas sebuah daerah transkripsi yang meliputi daerah 18S, 5,8S, dan 28S pada RNA ribosomal yang terdiri atas bagian kecil Internal Transcribed Spacer (ITS 1 dan ITS 2) dan bagain besar eksternal nontranscribed Intergenic Spacer (IGS) (Maras 2008).
D. Enzim Restriksi Endonuklease Enzim restriksi yang digunakan dalam penelitian RFLP adalah enzim restriksi tipe II. Ciri utama enzim ini adalah setiap enzim mengenal urutan basa spesifik pada pita DNA yang akan dipotong (Fatchiyah et al 2011). Enzim restriksi akan memotong pita DNA menjadi serangkaian fragmen dalam kondisi konsentrasi garam, pH, dan suhu yang sesuai dengan karakter enzim. Jumlah
9
dan ukuran fragmen tergantung pada konsentrasi dan letak situs restriksi enzim dalam DNA. Sampai saat ini, hampir 250 enzim restriksi yang spesifik telah ditemukan (Roberts dan Macelis 2001). Penelitian ini menggunakan empat jenis enzim, Alu1, Bsp1431, BsuR1, dan Eco471. Enzim Alu1 sering digunakan pada peneltian menggunakan teknik PCR-RFLP (Rodriguez et al. 1997, Init et al. 2007, Tiwari dan Takhotia 1991). Alu1 mengenali situs pemotongan pada basa AG↓CT, memotong dengan maksimal pada suhu 37°C dalam buffer Tango (Thermo Scientific) selama 1 sampai 16 jam. Inaktivasi enzim ini yaitu pada suhu 65 °C selama 20 menit. Suhu penyimpanan yang ideal adalah pada -20°C. Enzim Bsp1431 diisolasi dari bakteri Bacillus species RFL143. Enzim Bsp1431 mengenali situs pemotongan pada basa ↓GATC. Enzim aktif memotong dengan maksimal pada suhu 37°C dalam buffer Bsp1431 (Thermo Scientific). Inaktivasi enzim pada suhu 65°C selama 20 menit. Enzim BsuR1 diisolasi dari bakteri Bacillus subtilis R. Enzim ini mengenali situs pemotongan pada basa GG↓CC. Inkubasi enzim BsuR1 pada suhu 37°C pada buffer R (Thermo Scientific). Inkubasi selama 1-16 jam . Inaktivasi enzim dapat dilakukan dengan pemanasan pada suhu 65°C selama 20 menit. Enzim Eco471 diisolasi dari bakteri Escherichia coli yang membawa klon gen eco471R dari E.coli RFL47. Enzim Eco471 mengenali situs pemotongan pada basa G↓G(A/T)CC. Enzim akan aktif maksimal memotong dalam buffer R pada suhu 37°C. Inaktivasi enzim pada suhu 65°C selama 20 menit. Enzim Ade1 diisolasi dari bakteri Alcaligenes denitrificans. Enzim ini mengenali situs pemotongan pada basa CACNNN↓GTG. Inkubasi enzim Ade1 optimal pada suhu 37°C pada buffer G (Thermo Scientific) selama 1-16 jam. Inaktivasi enzim dapat dilakukan pada suhu 65°C selama 20 menit. Enzim Mph11031 diisolasi dari bakteri Moraxella phenylpyruvica RFL1103. enzim Mph11031 aktif pada suhu 37°C. Inkubasi optimal pada buffer R (Thermo Scientific) selama 1-16 jam. Inaktivasi enzim dapat dilakukan dengan pemanasan pada suhu 65°C selama 20 menit.
BAB III METODE PENELITIAN A. Lokasi dan waktu penelitian Penelitian dilakukan di Laboratorium Genetika dan Biologi Molekuler Jurusan Biologi FMIPA Universitas Negeri Semarang pada bulan April 2011 – Oktober 2012.
B. Subjek Penelitian 1.
Sampel penelitian Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah 25 aksesi durian (Durio zibethinus) yang terdapat di Kecamatan Gunungpati, Semarang. Jenis organ yang digunakan berupa daun durian yang tidak terlalu muda dan tidak terlalu tua (Gambar 2).
Gambar 2 Daun Durian 2.
Primer yang digunakan dalam proses PCR. Pada penelitian ini digunakan dua macam primer yaitu ITS L dan ITS 4 (Nwakanma et al. 2003). Urutan dan ukuran basa primer dapat dilihat pada Tabel 1. Tabel 1 Urutan basa dan ukuran primer ITS L dan ITS 4 Nama Primer
Urutan Basa
Jumlah Basa
ITS L
5‟ TCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTG 3‟
23
ITS 4
5‟ TCCTCCGCTTATTGATATGC 3‟
20
10
11
3.
Enzim restriksi yang digunakan dalam proses pemotongan. Enzim restriksi yang digunakan yaitu Alu1, Bsp1431, BsuR1, Eco471, Ade1 dan Mph11301, diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam.
C. Rancangan penelitian Parameter pengamatan Pengamatan akan dilakukan dengan mengamati dan menganalisa pita DNA spesifik yang terbentuk dari hasil pemotongan enzim restriksi pada gel hasil elektroforesis. Berdasarkan fragmen DNA tersebut dapat ditentukan sidik jari dari aksesi durian.
D. Alat dan bahan Alat dan bahan yang digunakan dalam penelitian ini disajikan dalam Tabel 2 dan Tabel 3. Tabel 2 Alat penelitian Uraian Pengambilan kuncup daun Penyimpanan dalam perjalanan Penyimpanan sebelum isolasi DNA Isolasi dan purifikasi DNA
Alat Gunting yang tajam dan bersih Plastik klip bersih, kertas label Freezer, alumunium foil Freezer, Mortar dan pestle, sentrifus, kotak penyimpan sampel, rak ependorf, ependorf, vortex, micropipet, tip pipet, water bath, gunting dan pinset, sarung tangan. Amplifikasi DNA dan pemotongan Mesin thermal cycle, ependorf, dengan enzim mikropipet, tip pipet, sentrifus, rak ependorf, sarung tangan. Elektroforesis Elektroforesis horizontal, sisir, power supply, microwave, Gel documentation, mikropipet, tip pipet, alat timbang.
12
Tabel 3 Bahan penelitian Uraian Isolasi dan purifikasi DNA
Bahan Sampel (daun durian), Illustra Nucleon Phytopure Genomic DNA Extraction Kits (Reagen 1, Reagen 2, Phytopure Resin), kloroform, βmerkaptoetanol, isopropanol 100%, etanol 70%, RNAse, buffer TE (Tris, EDTA) Amplifikasi dengan mesin PCR dan DNA sampel, primer, buffer PCR, taq pemotongan dengan enzim restriksi polimerase, dNTP, ddH2O, enzim Alu1, Bsp1431, BsuR1, Eco471, Ade1 dan Mph11301. Elektroforesis 1X buffer TAE, ethidium bromida (EtBr), gel agaros , loading dye, DNA marker.
13
E. Prosedur penelitian Tahap-tahap yang digunakan dalam penelitian ini disajikan dalam Gambar 3. Pengambilan daun tanaman durian
Isolasi dan purifikasi DNA
Elektroforesis gel agaros 0,8% untuk melihat hasil isolasi DNA
Amplifikasi ITS menggunakan PCR
Elektroforesis gel agaros 1% untuk melihat hasil PCR
Pemotongan dengan enzim restriksi
Elektroforesis gel agaros 2% untuk melihat hasil pemotongan dengan enzim restriksi
Analisis Keanekaragaman Genetik Gambar 3 Alur penelitian PCR-RFLP 1. Pengambilan sampel tanaman Sampel yang diambil berasal dari daun yang masih muda untuk mendapatkan DNA dalam jumlah yang banyak. Sampel daun dipotong dengan gunting yang tajam dan dibungkus menggunakan alumunium foil
14
disimpan dalam plastik klip yang bersih, dan kemudian diberi label nomor aksesi. 2. Isolasi dan purifikasi DNA genom DNA diisolasi menggunakan Kit Isolasi DNA (Nucleon Phytopure, USA) dengan prosedur kerja mengikuti protokol dari Nucleon Phytopure yang telah dimodifikasi sesuai dengan hasil optimasi. Sampel yang digunakan adalah daun dari tanaman durian. Sampel daun dipisahkan dari tulang daunnya kemudian ditimbang seberat 0,2 gram. Daun dipotong kecil-kecil kemudian dibungkus menggunakan aluminium foil dan dimasukkan ke dalam frezeer selama kurang lebih 24 jam supaya mudah digerus dan menjaga DNA di dalamnya tidak rusak. Daun digerus menggunakan mortar dan pestel untuk memisahkan sel-sel daun sehingga memperluas permukaan sel ketika bereaksi dengan reagen Phytopure. Reagen 1 ditambahkan ke dalam sampel sebanyak 800 μl, sedikit demi sedikit sambil digerus. Reagen 1 berfungsi untuk melisiskan dinding sel dan membran sel. Sampel dipindahkan ke dalam tube berukuran 1,5 ml kemudian ditambahkan RNAse sebanyak 20 μl dan β-merkaptoetanol sebanyak 30 μl, tube dikocok perlahan menggunakan tangan selanjutnya diinkubasi di dalam inkubator suhu 37°C selama satu jam untuk membantu proses pengikatan RNA. Selanjutnya ke dalam sampel ditambah Reagen 2 sebanyak 150 μl yang berfungsi untuk melisiskan membran inti dan plasma serta organel lainnya sehingga DNA terpisah dari bagian sel lain. Sampel diinkubasi pada suhu 65°C selama 30 menit di waterbath. Kemudian sampel diinkubasi di dalam lemari pendingin selama 20 menit untuk menghentikan aktivitas enzim yang telah bekerja saat proses pelisisan dinding sel pada inkubasi di dalam waterbath. Perlakuan kejutan suhu (heat shock) ini bertujuan untuk memutuskan ikatan antara DNA dengan protein yang mengemasnya. Selanjutnya ke dalam sampel dimasukkan 500 μl kloroform dingin yang berfungsi untuk mengangkat supernatan karena memiliki massa jenis yang lebih tinggi daripada komplek supernatan. Phytopure Resin kemudian ditambahkan sebanyak
15
100 μl untuk mengikat polisakarida yang masih tersisa dan membentuk lapisan semisolid yang memisahkan antara bagian yang mengandung DNA dengan debris sel. Sampel disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit sehingga terbentuk tiga lapisan yaitu, lapisan paling atas adalah supernatan, lapisan kedua adalah debris sel dan lapisan paling bawah adalah kloroform. Supernatan yang terbentuk di bagian paling atas dipindahkan ke tube 1,5 ml baru dan ditambah isopropanol 100% dingin dengan perbandingan volume isopropanol:supernatan adalah 1:1, kemudian dikocok dengan tangan secara perlahan-lahan. Kemudian sampel disentrifugasi kembali dengan kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit dan terbentuk pelet DNA yang berwarna putih, sedangkan supernatan dibuang. Pelet DNA kemudian dicuci menggunakan ethanol 70%, pencucian dilakukan dengan cara menambahkan ethanol 70% sebanyak 100 μl kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 5 menit. Pencucian dilakukan sebanyak tiga kali, kemudian sisasisa ethanol dibuang dan pellet DNA dikeringanginkan dan setelah kering ditambah buffer TE sebanyak 50 μl dan disimpan di dalam freezer. 3. Elektroforesis Gel Agaros Hasil isolasi DNA dilihat menggunakan elektroforesis gel agaros 0,8%. Gel agaros dibuat dengan cara, agaros sebanyak 0,4 gr dilarutkan dalam 50 ml TAE 1X, selanjutnya dipanaskan dalam microwave selama 3 menit. EtBr sebanyak 2 μl ditambahkan dalam larutan agaros dalam kondisi suhu hangat. Larutan agaros dituangkan dalam cetakan yang telah dilengkapi dengan sisir dan didiamkan sampai gel mengeras. Elektroforesis dilakukan menggunakan buffer TAE 1X, loading dye sebanyak 2 μl dicampurkan dengan 4 μl sampel DNA durian menggunakan micropipet kemudian dimasukkan ke dalam sumur gel dengan hati-hati. Elektroforesis dijalankan pada 100 volt selama 30 menit. Setelah elektroforesis selesai, gel dimasukkan ke dalam UV
16
transiluminator untuk mengetahui pita DNA hasil isolasi kemudian diambil foto sebagai dokumentasi. 4. Amplifikasi ITS dengan mesin PCR Campuran (master mix) sebanyak 12,5 μl yang terdiri atas 10 ng DNA template, 0,5 µl masing-masing primer ITS L dan ITS 4, kemudian ditambah masing-masing 200 μM dNTP mix, buffer 1X dan enzim taq polymerase, kemudian campuran dimasukkan ke dalam tabung PCR 0,2 ml. Tabung yang berisi campuran larutan 12,5 μl dimasukkan ke dalam Thermal Cycler Chain Reaction dengan kondisi suhu denaturasi awal 95 o
C selama 1 menit, denaturasi akhir pada 95 oC selama 1 menit,
dilanjutkan annealing pada suhu 45 oC selama 30 detik, ekstensi selama 1 menit pada suhu 72 oC. Inkubasi terakhir dilakukan pada suhu 72 oC selama 7 menit. Keberhasilan PCR diuji melalui elektoforesis dengan gel agaros 1%. Gel agaros 1% dibuat dengan cara mencampur 0,3 gram agaros dan ditambahkan 30 ml buffer TAE 1X, selanjutnya dipanaskan dalam microwave selama 3 menit. EtBr sebanyak 2 μl ditambahkan dalam larutan agaros dalam kondisi suhu hangat. Larutan agaros dituangkan dalam cetakan yang telah dilengkapi dengan sisir dan didiamkan sampai gel mengeras. Proses elektroforesis untuk melihat hasil amplifikasi DNA target sama dengan elektroforesis untuk melihat hasil isolasi DNA. 5. Pemotongan Produk PCR dengan Enzim Restriksi Setelah amplifikasi
fragmen DNA target berhasil selanjutnya
dilakukan analisis dengan teknik RFLP. Hasil amplifikasi dipotong menggunakan enam jenis enzim restriksi yaitu Alu1, Bsp1431, BsuR1, Eco471, Ade1 dan Mph11301. Pemotongan dilakukan dengan cara mencampurkan 5 μl DNA (produk PCR) dengan 2 μl buffer enzim, 2 μl enzim dan 9 μl ddH2O. Mix menggunakan vortex kemudian di sentrifus sebentar dan diinkubasi di dalam suhu 37
o
C selama 72 jam. Pemotongan dilakukan
menggunakan 7 enzim yang dilakukan secara terpisah.
17
6. Elektroforesis Gel Agaros Kualitas hasil pemotongan enzim dilihat menggunakan gel agaros 2%. Gel agaros 2% dibuat dengan cara mencampur 0,5 gram agaros dan ditambahkan 25 ml buffer TAE 1X, selanjutnya dipanaskan dalam microwave selama 3 menit. EtBr sebanyak 2 μl ditambahkan dalam larutan agaros dalam kondisi suhu hangat. Larutan agaros dituangkan dalam cetakan yang telah dilengkapi dengan sisir dan didiamkan sampai gel mengeras. Elektroforesis dilakukan menggunakan buffer TAE 1X, loading dye sebanyak 2 μl dicampurkan dengan 4 μl sampel DNA durian menggunakan micropipet kemudian dimasukkan ke dalam sumur gel dengan hati-hati. Elektroforesis dijalankan pada 100 volt selama 30 menit. Setelah elektroforesis selesai, gel dimasukkan ke dalam UV transiluminator untuk mengetahui pita DNA hasil isolasi kemudian diambil foto sebagai dokumentasi.
F. Metode pengumpulan data Data diambil dari hasil elektroforesis daerah ITS DNA ribosomal durian dan elektroforesis fragmen ITS DNA ribosomal yang telah dipotong menggunakan empat jenis enzim restriksi yaitu Alu1, Bsp1431, BsuR1, dan Eco471 kemudian divisualisai pada gel documentation.
G. Metode analisis data Pita yang muncul pada gel agaros 2% pada setiap aksesi ditentukan ukuran relatifnya berdasarkan DNA marker 100bp. Perbedaan ukuran fragmen DNA hasil pemotongan enzim endonuklease merupakan sidik jari DNA setiap aksesi Durian.
BAB IV HASIL dan PEMBAHASAN A. Hasil Penelitian Isolasi 25 aksesi durian dari Kecamatan Gunungpati, 11 aksesi menunjukkan hasil DNA genom yang bagus. Isolasi DNA menggunakan Kit Nucleon Phytopure. dengan optimasi yang diperlukan. Optimasi yang dilakukan dengan 1) perbandingan menggunakan daun segar, 2) penambahan jumlah jaringan daun yang akan diekstrak, 3) penambahan β-merkaptoetanol dan RNAase. Optimasi isolasi DNA dengan perbandingan menggunakan daun segar dan yang disimpan dalam freezer memiliki kualitas DNA yang sama (Gambar 4)
Gambar 4 Elektroforegram hasil isolasi DNA durian menggunakan Kit Isolasi Nucleon Phytopure. Keterangan: x,xb=sampel isolasi menggunakan daun segar; 1-20=sampel menggunakan daun yang disimpan dalam freezer. DNA genom hasil isolasi diamplifikasi menggunakan ITS L dan ITS 4. Hasil amplifikasi tersebut dielektroforesis menggunakan gel agaros 1 % (Gambar 5).
800bp
800bp
500bp 100bp
Gambar 5 Elektroforegram Amplifikasi Menggunakan ITS L dan ITS 4 Keterangan: M (DNA marker 100bp), x,xb,1-dst (aksesi durian) Elektroforegram berdasarkan marker 100bp menunjukkan hasil amplifikasi daerah ITS DNA ribosomal berukuran 800bp. ITS DNA ribosomal
18
19
hasil amplifikasi selanjutnya dipotong menggunakan enam restriksi. Enzim restriksi yang digunakan yaitu Alu1, Bsp1431, BsuR1, Eco471, Ade1 dan Mph11301. Elektroforegram
hasil
pemotongan oleh
enzim
restriksi
AluI
ditunjukkan pada Gambar 6. Pemotongan pita ITS DNA ribosomal oleh enzim AluI menghasilkan pita-pita potongan dengan ukuran 600bp dan 150bp, hasil pemotongan yang sama juga terjadi pada aksesi yang lain.
600bp
500bp
150bp 100bp
Gambar 6 Elektroforegram hasil pemotongan menggunakan enzim restriksi Alu1. Keterangan: M (DNA marker 100bp), x,xb,1-dst (aksesi durian) Elektroforegram hasil pemotongan menggunakan enzim Bsp1431 ditunjukkan pada Gambar 7. 600bp
500bp 400bp
500bp 400bp
300bp 200bp
100bp
170bp
Gambar 7 Elektrogoregram hasil pemotongan menggunakan enzim Bsp1431. Keterangan: M (DNA marker 100bp), x,xb,1-dst (aksesi durian) Pada elektroforegram (Gambar 7) ditunjukkan hasil pemotongan enzim Bsp 1431 yang telah diinkubasi selama 24 jam. Pada aksesi nomor x memotong pada ukuran 600bp, 400bp, 200bp, 170bp dan 130bp. Pada aksesi nomor xb memiliki ukuran 550bp, 400bp dan 170bp. Aksesi nomor 1 memiliki ukuran 500bp, 400bp, 300bp dan 200bp. Sedangkan aksesi nomor 3 memiliki ukuran 500bp, 400bp dan 300bp. Pada aksesi nomor 5 dan 7 memiliki ukuran 500bp, 400bp dan 200bp. Tiga aksesi yaitu nomor 12, 15 dan
20
17 memiliki ukuran 500bp, 400bp dan 300bp. Dua aksesi selanjutnya yaitu nomor 18 dan 20 memiliki ukuran 500bp, 400bp, 200bp, dan 170bp. Elektroforegram hasil pemotongan menggunakan enzim BsuRI ditunjukkan pada Gambar 8. Hasil pemotongan menggunakan enzim BsuR1 beberapa aksesi nampak hanya smear yaitu pada aksesi nomor x, xb dan 3. Aksesi nomor 1 memiliki ukuran pita 700bp, 600bp dan 450bp. Aksesi nomor 5 memotong pada ukuran 450bp. Aksesi nomor 7 memiliki ukuran pita DNA 700bp dan 450bp. Aksesi nomor 12, 15 dan 17 memiliki ukuran pita DNA yaitu 700bp, 650bp, 550bp dan 450bp. Aksesi nomor 18 memiliki ukuran 650bp, 550bp, dan 450bp. Aksesi nomor 20 memiliki ukuran 450bp. 800bp
700bp
600bp
650bp 450 bp
450bp 100bp
Gambar 8 Elektroforegram hasil pemotongan menggunakan enzim BsuR1. Keterangan: M (DNA marker 100bp), x,xb,1-dst (aksesi durian) Elektroforegram hasil pemotongan menggunakan enzim Eco471 ditunjukkan pada Gambar 9.
800bp 500bp 100bp
600bp 500bp
Gambar 9 Elektroforegram hasil pemotongan menggunakan enzim Eco471. Keterangan: M (DNA marker 100bp), x,xb,1-dst (aksesi durian) Pada elektroforegram menunjukkan hasil pemotongan oleh enzim Eco471 yaitu setelah diinkubasi selama 24 jam menunjukkan ukuran pita DNA bervariasi pada beberapa aksesi. Aksesi nomor x, xb dan 1 memiliki ukuran pita 800bp. Aksesi nomor 3 dan 5 tidak menunjukkan adanya DNA. Aksesi nomor 7 memiliki ukuran pita DNA 800bp, 600bp dan 450bp. Aksesi
21
nomor 12, 15 dan 17 memiliki ukuran pita DNA yaitu 800bp dan 600bp. Aksesi nomor 18 dan 20 memiliki ukuran 800bp, dan smear pada ukuran 600bp dan 500bp. Elektroforegram hasil pemotongan menggunakan enzim restriksi Ade1 ditunjukkan pada Gambar 10. 800bp 500bp 100bp Gambar 10 Elektroforegram hasil pemotongan menggunakan enzim restriksi Ade1. Keterangan: M (DNA marker 100bp), x,xb,1-dst (aksesi durian) Panjang pita DNA hasil PCR yaitu 800bp. Pemotongan menggunakan enzim AdeI dilakukan melalui inkubasi selama 24 jam tidak menunjukkan adanya pemotongan, hasil elektroforegram menunjukkan ukuran pita DNA 800bp. Elektroforegram
hasil
pemotongan
menggunakan
enzim
Mph11301 ditunjukkan pada Gambar 11.
800bp 500bp 100bp
Gambar 11. Elektroforegram hasil pemotongan menggunakan enzim.Mph11301 Keterangan: M (DNA marker 100bp), x,xb,1-dst (aksesi durian) Hasil elektroforegram menunjukkan bahwa tidak terjadi pemotongan pada pita DNA. Ukuran pita setelah diinkubasi selama 36 jam adalah 800bp.
22
B. Pembahasan DNA hasil isolasi untuk dapat diamplifikasi harus memiliki kualitas yang bagus, yaitu tidak smear, tidak terpotong-potong dan tidak mengandung zat lain. Pita DNA yang baik ditunjukkan dalam elektroforegram yaitu pita yang kompak dan tidak smear, smear merupakan DNA yang terpotong-potong dan berukuran kecil. Isolasi 25 aksesi durian dengan menggunakan beberapa metode isolasi yaitu metode Dixit (1998), metode Rath (1998), metode Dharma (2005), metode Doyle&Doyle (1990), metode Porebski (1997) dan metode OrozcoCastillo (1994). Hasil beberapa metode tersebut menghasilkan pelet yang berwarna cokelat dan tidak larut dalam buffer Tris-EDTA (TE) atau berlendir. Hasil elektroforesis menunjukkan kualitas pita DNA masih terdapat smear dan tidak memberikan hasil yang baik untuk dilakukan PCR . Sebelas aksesi yang berhasil diisolasi menggunakan Kit Isolasi DNA Nucleon Phytopure dengan melalui berbagai optimasi isolasi yaitu 1) perbandingan menggunakan daun segar, 2) penambahan jumlah jaringan daun yang akan diekstrak, 3) penambahan β-merkaptoetanol dan RNAase (Anonim 2007). Kesulitan dalam mengisolasi DNA durian yaitu karena ada banyaknya lendir yang dihasilkan dan adanya warna kecoklatan pada pelet hasil isolasi DNA. Lendir dihasilkan terutama pada daun durian yang muda dan DNA hasil isolasi sedikit. Hasil penelitian Small et al. (2004) menunjukkan bahwa pada tanaman tertentu daun dewasa lebih cocok untuk ekstraksi DNA. Warna kecoklatan pada pelet DNA durian juga terjadi pada pelet hasil isolasi DNA daun mulberi. Adanya warna kecoklatan pada pelet DNA daun mulberi menyebabkan DNA sulit diisolasi, untuk mengatasinya Anuradha et al. (2013) menambahkah polyviny pirrolidone (PVP), l L-ascorbic acid, diethyldithocarbamic acid (DIECA), sodium metabisulfite dan sodium dodecyl sulphate pada buffer isolasi CTAB. DIECA adalah phenoloxidase inhibitor dan membantu mengurangi warna kecoklatan akibat oksidasi polifenol quinon. Penambahan asam L-askorbat mencegah oksidasi senyawa fenolik dan adsorpsi dengan molekul DNA. PVP juga memiliki fungsi yang
23
sama, membentuk kompleks senyawa dengan ikatan hidrogen dengan fenolik senyawa dan co-presipitat bersama dengan sel sehingga mencegah polifenol dari berinteraksi dengan DNA. Penelitian Suman et al. (1999) menyebutkan bahwa tingkat βmercaptoethanol yang tinggi berhasil menghilangkan polifenol. Oleh karena itu, konsentrasi β-merkaptoetanol yang tinggi merupakan protokol yang baik untuk menghasilkan DNA berkualitas bagus dari spesies tanaman yang mengandung polifenol. Sedangkan, konsentrasi NaCl yang tinggi dapat digunakan untuk menghapus kadar polisakarida selama ekstraksi DNA. Hameed et al. (2004) pada penelitiannya juga melaporkan bahwa kualitas DNA hasil isolasi gandum menjadi bagus setelah meningkatkan kadar NaCl dan β-merkaptoetanol dalam buffer isolasi. Kemurnian DNA gandum hasil isolasi sangat baik yaitu pada rasio A260/A280 dan A260/A230 adalah 1,79-1,94 dan > 2 yang menunjukkan bahwa DNA bebas dari protein dan polifenol seta senyawa polisakarida. Optimasi isolasi DNA durian dilakukan dengan menggunakan beberapa cara yaitu optimasi penambahan atau pengurangan jumlah jaringan yang akan diisolasi, penambahan β-merkaptoetanol, dan penambahan RNAse selama proses isolasi dan purifikasi DNA. Menurut Moyo et al (2008) optimasi jumlah jaringan tanaman per satuan volume buffer ekstraksi adalah salah satu satu faktor yang paling kritis dalam prosedur isolasi DNA tanaman. Sedangkan β-Merkaptoetanol berfungsi untuk mencegah terjadinya oksidasi senyawa polifenol (Kawata et al 2003). Daun durian merupakan jaringan aktif fotosintesis yang mengandung senyawa polifenol, ketika proses penggerusan, senyawa ini berinteraksi secara ireversibel dengan protein dan asam nukleat sehingga membentuk lendir (gelatinous matrix) (Michiels et al. 2003). Lendir ini yang menghambat proses PCR, jika tidak dihilangkan. PCR
merupakan
suatu
proses
sintesis
enzimatik
untuk
mengamplifikasi DNA secara in vitro. Proses amplifikasi oleh PCR dipengaruhi oleh berbagai parameter yaitu antara lain (1) kualitas dan konsentrasi DNA template, (2) desain dan konsentrasi primer, (3) konsentrasi
24
ion magnesium, (4) konsentrasi empat deoksinukleotida (dNTP), (5) buffer PCR, (6) konsentrasi Taq polimerase, (7) Siklus PCR, (8) Penggunaan teknik hotstart. Namun, tidak ada satu protokol PCR yang optimal untuk semua genom. Oleh karena itu, masing-masing PCR memerlukan optimasi khusus, terutama optimasi template dan primer yang akan digunakan (Grunenwald 2003). Hal tersebut juga disebutkan oleh Aris (2011) yaitu bahwa keberhasilan amplifikasi lebih didasarkan kepada kesesuaian primer serta efisiensi dan optimasi proses PCR. Primer yang tidak spesifik dapat menyebabkan teramplifikasinya daerah lain dalam genom yang tidak dijadikan sasaran atau tidak ada daerah genom yang teramplifikasi. Optimasi PCR diperlukan untuk menghasilkan karakter yang diinginkan, yaitu optimasi suhu annealing DNA dalam mesin PCR. Optimasi suhu annealing menjadi bagian yang paling penting dalam proses amplifikasi (Roux 2003). Suhu annealing yang terlalu rendah dan terlalu tinggi menyebabkan primer tidak dapat melekat pada tempat yang spesifik sehingga hasil amplifikasi DNA target tidak didapatkan (Ekasari 2011), pada amplifikasi DNA pisang suhu annealing yang optimal yaitu suhu 48°C. Pada penelitian ini optimasi suhu annealing dilakukan dengan menggunakan dua cara yaitu pada suhu 48°C (Ekasari 2011) dan gradient suhu yaitu pada suhu 38°C, 39°C, 41°C, 42°C, 43°C, 44°C, 45°C, dan 46°C. Hasil amplifikasi terbaik yaitu pada suhu annealing 45°C. Penelitian ini mengamplifikasi daerah ITS DNA ribosomal pada sebelas aksesi durian. Daerah ITS dapat diamplifikasi pada seluruh tanaman hijau menggunakan pasangan primer yang sama (Baldwin et al. 1995), daerah ITS dari DNA hasil ekstraksi dapat digunakan untuk mengidentifikasi species. Pada kerabat durian (Bombaceae) yaitu pohon baobab (Adansonia sp) daerah ITS pada tanaman yang dianalisis memiliki panjang 787bp. Sekuen individu memiliki panjang antara 771-772bp (Baum et al 1998). Filogeni ITS menunjukkan bahwa Adansonia digitata dan Adansonia kilima secara genetic sama yaitu menunjukkan tetraploidy yang berevolusi (Pettigrew et al 2012). Penelitian ini menggunakan empat jenis enzim restriksi yang memotong daerah ITS, yaitu Alu1, Bsp1431, BsuR1, Eco471, Ade1 dan
25
Mph11301. Empat enzim menunjukkan hasil pemotongan, sedangkan dua enzim tidak. Keempat enzim tersebut adalah Alu1, Bsp1431, BsuR1, dan Eco471. Enzim Alu1 memotong DNA menjadi dua fragmen pada seluruh aksesi yaitu dengan ukuran 600bp dan 150bp. Hal ini menunjukkan bahwa enzim Alu1 tidak memiliki situs yang spesifik pada daerah ITS aksesi durian yang diteliti. Pemotongan oleh enzim Bsp1431 memiliki 7 variasi ukuran pada kesebelas aksesi durian yang diteliti. Enzim Bsp1431 memiliki situs pemotongan yang spesifik pada ukuran 550bp dan 120bp. Ukuran pita 550bp yaitu hanya pada aksesi nomor xb dan ukuran pita 120bp hanya ada pada aksesi nomor x. Hal ini menunjukkan bahwa enzim Bsp1431 memiliki situs pemotongan spesifik pada ukuran 550bp dan 120bp. Enzim BsuR1 memiliki 6 variasi ukuran pemotongan. Ukuran yang spesifik yaitu hanya pada aksesi nomor 1 dengan ukuran pita DNA 600bp, sedangkan pemotongan oleh enzim Eco471 terdapat tiga variasi ukuran pemotongan. Ukuran yang spesifik terdapat pada aksesi nomor 7 dengan ukuran pita DNA 450bp. Inkubasi menggunakan enzim Ade1 dan Mph11031 menunjukkan tidak terjadi pemotongan, hal ini menunjukkan bahwa enzim tersebut tidak memiliki situs pemotongan yang pada daerah ITS DNA Ribosomal kesebelas aksesi durian.
BAB V PENUTUP A. Kesimpulan Hasil penelitian 25 aksesi durian menunjukkan bahwa DNA genom 11 aksesi durian berhasil diamplifikasi menggunakan primer ITS L dan ITS 4. Pemotongan menggunakan enzim Bsp1431 memiliki dua ukuran fragmen spesifik yaitu 550bp dan 120bp. Enzim BsuR1 memiliki situs pemotongan yang spesifik pada ukuran 600bp. Sedangkan enzim Eco471 memiliki situs pemotongan yang spesifik pada ukuran 450bp. Pada penelitian ini telah didapatkan sidik jari yaitu oleh pemotongan menggunakan enzim Bsp1431 BsuR1 dan Eco471.
B. Saran Untuk memperkuat adanya analisis sidik jari DNA lebih lanjut, sebaiknya menggunakan lebih banyak aksesi durian dan enzim restriksi.
26
DAFTAR PUSTAKA Anonim. 2007. Illustra Nucleon Phytopure Genomic DNA Ekstraction Kits Product Booklet. Buckinghamshire. Online at http://www.gelifesciences.com [diakses tanggal 3 Desember 2012] Anuradha HJ, K Vijayan, CV Nair & A Manjula. 2013. A Novel and Efficient Protocol for the Isolation of Genomic DNA from Mulberry (Morus L.). Emirates Journal Food Agriculture 25 (2): 124-131 Arercrombie M.M. 1993. Kamus Lengkap Biologi. Sutarmi, S dan Sugiri, N. (penerjemah). Jakarta : Erlangga. Aris M. 2011. Identifikasi, Patogenisitas Bakteri dan Pemanfaatan gen 16s-rrna untuk deteksi penyakit Ice-ice pada Budidaya Rumput Laut (Kappaphycus alvarezii). (Disertasi). Bogor: Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor. Baldwin BG, Sanderson MJ, Porter JM, Wojciechowski MF, Campbell CS, & Donoghue MJ (1995) The ITS Region of Nuclear Ribosomal DNA: A Valuable Source of Evidence on Angiosperm Phylogeny. Annals of the Missouri Botanical Garden 82: 247–277. Baum DA, RL Small and JF Wendel. 1998. Biogeography and Floral Evolution of Baobabs (Adansonia, Bombacaceae) as Inferred from Multiple Data Sets. Systematic Biology 47(2): 181-207. Bappenas. 2000. Durian (Bombaceae sp.). Jakarta. On line at http://www.warintek.ristek.go.id/pertanian/durian.pdf [diakses tanggal 10 Januari 2010]. Bertea CM, P Luciano, S Bossi, F Leoni, C Baiocchi, C Medana, CMM Azzolin, G Temporale, MA Lombardozzi & ME Maffei. 2006. PCR and PCRRFLP of the 5S-rRNA-NTS Region and Salvanorin A Analyses for the Rapid and Unequivocal Determination of Salvia divinorum.Phytochemistry 67: 371-378. Chiang YC, MD Chen, GH Lai, HJ Chen, J Chao, WT Chang, MK Lin, YS Chang, YM Chou, MS Lee & MS Lee. 2011. Rapid Identification of the Medicinal Plant Taraxacum formosanum and Distinguishing of This Plant from its Adulterants by Ribosomal DNA Internal Transcribed Spacer (ITS) Based DNA Barcode. African Journal of Biotechnology 10(24): 4838-4843. Dharma B, E Sudarmonowati, M Rahman dan ND Abbas. 2005. Metode Baru dalam Isolasi DNA Durian dan Kerabatnya (Durio spp.) dalam Analisis RAPD dengan Modifikasi Terhadap Prosedur CTAB. Dalam: Prosiding Seminar Nasional dan Kongres Biologi XIII. Perhimpunan Biologi Indonesia Cabang Yogyakarta dan Panitia Lustrum X Fakultas Biologi Universitas Gajah Mada. Yogyakarta, 16-17 September 2005. Hlm 5660.
27
28
Dixit A. 1998. A Simple and Rapid Procedure for Isolation of Amaranthus DNA Suitable for Fingerprint Analysis. Plant Molecular Biology Reporter (16):1-8 Doyle JJ & JL Doyle. 1990. A Rapid Total DNA Preparation Procedure for Fresh Plant Tissue. Focus 12:13-15. Ekasari TWD. 2011. Analisis Keanekaragaman Genetika Kultivar Pisang Menggunakan Penanda PCR-RFLP pada Internal Transcribed Spacer (ITS) DNA Ribosomal. (Skripsi). Semarang: Universitas Negeri Semarang. Fatchiyah, Estri Laras A, Sri Widyarti, & Sri Rahayu. 2011. Biologi Molekular Prinsip Dasar Analis. Jakarta: Penerbit Erlangga. Guzow-Krzeminska B, Gorniak M, Wegrzyn G. 2001. Molecular determination Keys : Construction of Keys for Species Identification Based on Restriction Fragment Length Polymorphism. Inter Arch Biosic 1:10571067. Grunenwald H. Optimization of Polymerase Chain Reactions. Di Dalam: JMS Bartlett and D Stirling (Eds). 2003. Methods in Molecular Biology: PCR Protocol second edition. Totowa: Humana press. 89-99. Hameed A, SA Malik, N Iqbal, R Arshad & S Farooq. 2004. A Rapid (100 min) Method for Isolating High Yield and Quality DNA from Leaves, Roots and Coleoptile of Wheat (Triticum aestivum L.) Suitable for Apoptotic and Other Molecular Studies. International Journal Of Agriculture & Biology 6(2):383–387 Init I, Al Foead, MY Fong, H Yamazaki, M Rohela, HS Yong, dan JW Mak. 2007. Restriction Enzyme Digestion Analysis of PCR-Amplified DNA of Blastocystis hominis Isolates. Southeast Asian Jl Trop Med Public Health 36 (6): 991-997. Kawata M, Y Matsumura, T Oikawa, M Kimizu, F Fukumoto & S Kuroda . 2003. Analysis of DNA Extraction Buffer Components from Plant Tissue by Polymerase Chain Reaction. Analytical Biochemistry 318:314–317. Krokene P, I Barnes, Brenda DW & Michael JW. 2004. A PCR-RFLP Based Diagnostic Technique to Rapidly Identify Seiridium Species Causing Cypress Canker. Mycologia 96(6): 1352-1354. Maras M. 2008. An ITS DNA Sequence-Based Phylogenic Study of Some Heracleum L. (Umbelliferae) Species From Turkey‟s Partial Flora. Turkish Journal of Biochemistry 33 (4) ; 163–168. Michiels A, WV den Ende, M Tucker, LV Riet & AV Laere. 2003. Extraction of High-Quality Genomic DNA from Latex-Containing Plants. Analytical Biochemistry 315:85–89.
29
Muladno. 2002. Teknologi Rekayasa Genetika. Bogor: Pustaka Wirausaha Muda. Moyo M, SO Amoo, MW Bairu, JF Finnie, JV Staden. 2008. Optimising DNA Isolation for Medicinal Plants. South African Journal of Botany 74:771– 775. Nafsi NI. 2007. Analisis keanekaragaman varietas durian (Durio zibethinus Murr) dengan marka mikrosatelit. (Skripsi). Bandung: Institut Teknologi Bandung. Nakamura H, Kaneko S & Yamaoka Y. 1998. PCR-SSCP Analysis of the Ribosomal DNA ITS Region of the Willow Rust Fungi in Japan. Ann. Phytopathol. Soc. Jpn. 64:102-109. Novayandi A. 2004. Analisis Keanekaragaman Durian Lokal Serang Berdasarkan Penanda Morfologi, Isozim, dan Gabungan MorfologiIsozim. (Tesis). Bogor: Institut Pertanian Bogor. Nwakanma DC, M Pillay, BE Okoli & A Tenkuano. 2003. PCR-RFLP of the Ribosomal DNA Internal Transcribed Spacer (ITS) Provie Markers for the A and B Genomes in Musa L. Theorical and Applied Genetics (DEU) (1):154-159. Orozco-Castillo C, Chalmers KJ, Waugh R, Powell W. 1994. Detection of genetic diversity and selective gene introgression in coffee using RAPD markers. Theor Appl Genet 87:934–940 Pandin DS. 2010. penanda DNA untuk Pemuliaan Tanaman Kelapa (Cocos nucifera L). Perspektif 9(1): 21-35 Pettigrew JD, Karen LB, Adhil B, Eunice G, Ngalla J, Jean M, Emily W & Claudia EV. 2012. Morphology, ploidy and molecular phylogenetics reveal a new diploid species from Africa in the baobab genus Adansonia (Malvaceae: Bombacoideae). Taxon 61 (6): 1240–1250 Porebski S, LG Bailey, & BR Baum. 1997. Modification of a CTAB DNA Extraction Protocol for Plants Containing High Polysaccharide and Polyphenol Components. Plant Molecular Biology Reporter 15 (1):8-15 Rao NK. 2004. Plant Genetic Resources : Advencing Conservation and Use Through Biotechnology. African Journal of Biotechnology 3 (2):136145. Rath P, G Rajaseger, CJ Gooh & PP Kumar. 1998 .Philogenetic Analysis Of Dipterocarps Using Random Amplified Polymorphic DNA Markers. Annals of Botany 82:61-65 Roux KH. 2009. Optimization and Troubleshooting in PCR. Cold Spring Harbour Laboratory Press 4(4): 1-6
30
Roberts, R. J., and Macelis, D. 2001. REBASE-restriction enzymes and methylases. Nucl. Acids Res. 29:268–269. Ruwaida IP, E Yuniastuti & Supriyadi. 2009. Analisis Keragaman Tanaman Durian Sukun (Durio zibethinus) Berdasarkan Penanda RAPD. Bioteknologi 6 (2):96-105. Santoso PJ. 2004. Morphological and molecular assesment of durian germplasm in Malaysia. (Tesis). Malaysia: Universiti Putra Malaysia. Santoso PJ, Ghizan BS, Norihan MS & Suhaimi N.2005. Phylogenetic Relationships Amongst 10 Durio Species Based on PCR-RFLP Analysis of Two Chloroplast Genes. Indonesian Journal of Agricultural Science 6(1): 20-27 Sastrapradja SD & MA Rifai. 1989. Mengenal sumber pangan nabati dan sumber plasma nutfahnya. Bogor: Komisi Pelestarian Plasma Nutfah Nasional dan Puslitbang Bioteknologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia. Small RL, RC Cronn & JF Wendel. 2004. The use of nuclear genes for phylogeny reconstruction in plants. Australian Systematic Botany. 17:145-170 Sobir, Dwi Guntoro, & Ima Septimayani. 2005. Analisis Keragaman Genetik Enam Belas Aksesi Blewah (Cucumis melo L.) dengan Metode Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD). Gakuryoku 11(2): 177-180 Steenis VCGGJ. 1992. Flora. Jakarta: Pt. Prodnya Paramita Suman PSK, KS Ajit, MP Darokar & K Sushil. 1999. Rapid Isolation of DNA from Dry and Fresh Samples of Plants Producing Large Amounts of Secondary Metabolites and Essential Oils. Plant Molecular Biology Reporter 17: 1–7 Tiwari PK & SC Lakhotia. 1991. Restriction Enzyme Digestion of Heterochromatin in Drosophila nasuta. J.Biosci. 16(4): 187-197. Uji T, M Siregar, Sunaryo & G Somaatmadja. 1998. Buah-buahan Bengkulu. Bogor: Pusat Penelitian dan Pengembangan Biologi LIPI. Uji T. 2005. Keanekaragaman Jenis dan Sumber Plasma Nutfah Durio (Durio spp.) di Indonesia. Buletin Plasma Nutfah 11 (1) : 28 – 33. Vekemas X, H Oliver, B Bruno, F Bourlaye & B Jean-pierre. 1997. Use of PCRRFLP on Chloroplast DNA to Investigate Phylogenetic Relationships In The Genus Phseolus. Biotechnol, Agron. Soc, Environ. (2) : 128-134. Vicente MC, FA Guzman, J Engels & VR Rao. 2005. Genetic Characterization and its use in Decision Making for the Conservation of Corp Germaplasm. The Role Biotechnology 121-128.
31
Yunus, M. 2004. Marka Molekuler untuk Perbaikan Tanaman. Lokakarya Teknik Dasar Molekuler untuk Pemuliaan Tanaman : Bogor 19-23 Juli.
32
Lampiran 1. Alat Penelitian Beberapa alat yang digunakan dalam penelitian disajikan dalam tabel berikut : No
Nama Alat
1
Neraca Ohaus®
2
Microwave (SHARP)
3
Electrophoresis tools
4
Gel documentation alpha innotech USA
Gambar
33
5
Microcentrifuge (Hettich Zentrifugen®)
6
PCR Bio-rad C-1000 Thermal Cycler
7
Freezer (Modena)
8
Mikropipet dan tip, microtube 1,5 ml dan rak microtube
34
Lampiran 2. Dokumentasi penelitian Tahapan Penelitian PCR-RFLP DNA Ribosomal Durian No. Keterangan Gambar 1. Pengambilan daun tanaman durian
2.
Isolasi dan purifikasi DNA
3.
Elektroforesis gel agaros 0,8% untuk melihat hasil isolasi DNA
4.
Amplifikasi menggunakan PCR
ITS
35
5.
Elektroforesis gel agaros 1% untuk melihat hasil PCR
6.
Pemotongan dengan enzim restriksi
7.
Elektroforesis gel agaros 2% untuk melihat hasil pemotongan dengan enzim restriksi
8.
Analisis Keanekaragaman Genetik
36
37
38
