KAJIAN MOLEKULER GEN PROTEKTIF ANTIGEN Bacillus anthracis ISOLAT INDONESIA Maxs Urias Ebenhaizar Sanam
INTISARI Bacillus anthracis adalah bakteri berbentuk batang, gram-positif, dan membentuk spora. Kuman ini adalah penyebab antraks pada hewan terutama herbivora, dan manusia. Antraks tersebar di banyak negara di dunia termasuk di sejumlah provinsi di Indonesia. Virulensi B. anthracis ditentukan oleh 2 plasmid virulen yaitu pXO1 yang mengandung gen penyandi toksin antraks, dan pXO2 yang menyandi pembentukan kapsula. Gen protective antigenic (pagA) terdapat pada pXO1 dan menyandi protein antigenic (PA) yang berperan penting dalam patogenesis antraks dan bersifat imunogenik. Data tentang sekuen gen pagA isolat asal Indonesia sangat terbatas dan variasi genotipenya belum pernah diungkapkan. Penelitian ini bertujuan mengungkapkan model, genotipe, dan hubungan filogenetik sekuen gen pagAB. anthracis isolat asal Indonesia. Dua puluh tujuh isolat terkait kasus antraks di Jawa Tengah, Yogyakarta, Nusa Tenggara Timur, Nusa Tenggara Barat dan Papua diisolasi DNA-nya dengan metode lisis panas, dilanjutkan dengan reaksi PCR dan sekuensing. Sekuen yang diperoleh disejajarkan dan dibandingkan dengan sekuen rujukan B. anthracis dan sekuen strain B. cereus yang ada di GenBank. Visualisasi produk PCR multiplex mengungkapkan 2 isolat telah kehilangan salah satu plasmid pXO1 ataupun pXO2. Tiga sekuen parsial pagA dihasilkan melalui amplifikasi dan dilanjutkan sekuensing oleh 3 pasang primer berbeda untuk setiap sekuen yaitu PA8/PA5, PA 1846F/PA 2443R dan PA 5F/ PA 5R. Hasil penyejajaran sekuen dengan metode ClustalW dari MEGA5 mengungkapkan tingkat homogenitas sekuen yang tinggi, namun pada 5 isolat asal NTT dan NTB ditemukan 2 mutasi titik pada posisi nukleotida 195 dan 1799 sehingga digolongkan ke dalam genotipe 5. Sementara 19 sekuen gen pagA dari isolat lainnya tidak ditemukan mutasi titik dan digolongkan sebagai genotipe 1. Analisis filogenetik dengan metode UPGMA mengungkapkan 2 klaster yaitu klaster B. anthracis dan klaster strain B. cereus yang memiliki plasmid mirip pXO1. Dalam klaster B. anthracis, kedua kelompok genotipe tersebut menempati subklaster yang berbeda. Berdasarkan hasil yang diperoleh dapat disimpulkan bahwa di Indonesia terdapat 2 genotipe gen pagA B. anthracis yaitu genotipe 1 (79%) dan genotipe 5 (21%). Disimpulkan pula bahwa sekuen gen pagA B. anthracis dapat dibedakan secara nyata dari gen pagA strain B. cereus yang memiliki plasmid mirip pXO1 dan tergolong ke dalam genotipe 9. Kata Kunci: Bacillus anthracis, protective antigenic, pagA, genotipe, antraks, PCR
xv
MOLECULAR STUDY ON PROTECTIVE ANTIGENIC GENE of Bacillus anthracis ISOLATES FROM INDONESIA Maxs Urias Ebenhaizar Sanam
ABSTRACT Bacillus anthracis is a rod-shaped, gram-positive, spore-forming bacteria that causing anthrax in animals, especially herbivores, and in humans. Anthrax is spread in many countries around the world including a number of provinces in Indonesia. The virulence of B.anthracisis determined by two virulence plasmid namely, the pXO1 containing genes encoding anthrax toxins, and the pXO2 which encodes for the formation of bacterial capsule. Protective antigenic gene (PagA) located on pXO1 encodes for antigenic protein (PA) which is immunogenic and plays an important role in the pathogenesis of anthrax. Data on pagA gene sequences of isolates from Indonesia is very limited and the variation of their genotypes has not been disclosed. This study aims to reveal the model, genotypes, sequences and phylogenetic relationships of pagA gene of B. anthracisi solates from Indonesia. Twenty-seven anthrax-related isolates of Central Java, Yogyakarta, East Nusa Tenggara, West Nusa Tenggara and Papua were studied and their DNA was extracted by heat lysis method, followed by PCR and sequencing reactions. Aligned sequences were obtained and compared to a number of reference sequences of B. anthracis and B.cereus strain derived from GenBank. Visualization of multiplex PCR products revealed 2 isolates had lost either pXO1 or pXO2. Three primer pairs PA8 / PA5, PA1846F / PA2443R and PA5F / PA5 R respectively used to amplify and sequence partial gene of PagA. The results of sequence alignment with ClustalW method of MEGA5 software revealed a high degree of homogeneity. However five isolates from NTT and NTB were found to have two point mutations at nucleotide positions of 195 and 1799 which then be classified as genotype 5. Meanwhile, none of the rest nineteen isolates has point mutation or single nucleotide polymorphism (SNP) and therefore being grouped as pagA genotype 1. Phylogenetic analysis conducted with UPGMA methode produced 2 clusters, namely B. anthracis and B. cereus pXO1-like clusters. In B. anthracis cluster, the two groups of genotype occupy different subclusters. Based on the results obtained it can be concluded that in Indonesia there are 2 PagA genotypes of B. anthracis strains of which the dominant type is the genotype 1 (79%) and genotype 5 (21%). It was also concluded that the pagA sequences of B. anthracis is significantly distinguishable from that of B. cereus pXO1-like strains which is being classified as genotype 9. Keywords: Bacillus anthracis, protective antigenic, PagA, genotype, anthrax, PCR
xvi
