Sede central | Mendoza | Argentina San Martín 430 – Ciudad – Mendoza – Argentina Tel.: 54 261 521 6604 – 521 6605 – 521 6773 Fax: 54 261 5216606
Carbamato de Etilo en vinos. Su determinación y exigencias internacionales Instituto Nacional de Vitivinicultura
CARBAMATO DE ETILO
Nombres Etiluretano Etilcarbamato Uretano (CE) Fórmula molecular C3H7NO2 NO2 Masa molecular 89 89,,09 g/mol Apariencia sólido incoloro Número CAS [51 51--79 79--6]
¿Qué es el Carbamato de Etilo? ¿ El carbamato de etilo se forma normalmente durante el proceso de fermentación aparece naturalmente fermentación, nat ralmente en algunos alg nos alimentos como el pan, bebidas fermentadas y licores destilados. destilados. Es una sustancia considerada por el Organización Mundial de la Salud como agente g cancerígeno g y genotóxico. g Se han establecido límites de concentración del carbamato de etilo en b bid alcohólicas. bebidas l hóli Canadá, EEUU y la UE han establecido límites legales.
¿Qué es el Carbamato de Etilo? ¿ Índice DL50 en el conejo de 2 g/Kg. En ratones ha demostrado capacidad de inducir la aparición de tumores pulmonares pulmonares. Dosis diaria estimada para el hombre “sin efectos” 0.3 ppb/kg de peso corporal Los problemas de salud: Depende de factores como la ingesta, la susceptibilidad del individuo y la toxicidad intrínseca.
¿Cómo se forma el carbamato de etilo? El carbamato de etilo, es el producto de la reacción de urea con etanol. Las levaduras liberan urea al medio, producto de su propio metabolismo. La urea y el etanol reaccionan en el medio, formando carbamato de etilo una reacción que depende de la temperatura. etilo, temperatura Los niveles de carbamato de etilo, aunque pueden ser bajos inmediatamente después de la fermentación, aumentan en el tiempo y con la temperatura.
¿Cómo se forma el carbamato de etilo? Etanol
Uretano
Urea
¿Cómo se forma el carbamato de etilo? El envejecimiento de vinos, sobre todo en los tintos, a partir de la etanólisis de la urea procedente del metabolismo nitrogenado de levaduras y/o de compuestos derivados de bacterias lácticas. La presencia de azúcares residuales. La tendencia de no practicar la filtración en tintos de calidad. calidad
Principio Se basa en la extracción del CE por solvente y posterior análisis mediante cromatografía gaseosa con detector selectivo de masas (GCMS). El contenido desconocido de CE en la muestra de vino se pico cromatográfico g calcula sobre la base de la altura del p (o de área), utilizando la metodología del estándar externo.
Materiales y Reactivos Solventes y reactivos de trabajo Dicloro metano (CH2Cl2) “grado HPLC” (Cas Nº 7575-0909-2) Carbamato de etilo (CE) (Cas Nº 5151-79 79--6) ceto a (C3H6O) (C3 6O) “grado g ado HPLC” C (Cas Nº 6 67-6 6764--1)) 64 Acetona
Soluciones de referencia y materiales Solución de Carbamato de etilo de 0,1 mg/ml disuelto en acetona. Sulfato de sodio anhidro (Cas Nº 77577757-8282-6) Frasco para extracción de 500 ml de capacidad del tipo Schott Schott. Frasco para extracción de 250 ml de capacidad del tipo Schott. Agitador magnético. Equipo de concentración al vacío. .
Técnicas de extracción •Columna con Resina Celite AK4 •Cartuchos de extracción de tierra de diatomeas Varian Chem de 5 ml •Frasco tipo Schott. •Agitador magnético é
Cromatógrafo Gaseoso con Detector Selectivo de Masa con inyector automático
Condiciones cromatográficas operativas
Columna: DBDB-Wax de 60 m y 320 um. Carrier Helio: 1ml/min Split: 1/50 Temperatura del Inyector: 180 ºC Temperatura de la línea de transferencia: 200 ºC Temperatura de la fuente de iones: 220 ºC
Scan m/z 50 a 100 SIR masa 62 Dwell 0,1 y masa 74 con Dwell 0,1 Solvent delay de 10 minutos. Tiempo p de retención p promedio del Carbamato de etilo: 40,30 minutos. Condiciones de temperatura del horno Programa de temperatura: 40° 40° - 1 min – 10 10°°/min – 60 60°° 2 °/min – 150 ° - 0 min – 10 °/min – 220 220°° - 5 min Tiempo de corrida 60 min
Análisis CG/SM Verificación absoluta. fragmentos iónicos 89 amu (M. ion molecular). 62 amu (M(M-C2H3.)+ y abundancia relativa 100%,: ((89.09 ((89.09--(24+3)) 74 amu (M(M-CH3.)+ y 13% de abundancia relativa : ((89.09 ((89.09--(12+3)) 44 amu (M (M--OC2H5.)+ OC2H5 )+ y 90% de abundancia; ((89 ((89.09 ((89.0909-(16+24+5))
½ m v2
Energía Cinética del ion e V = ½ m v2 F Fuerza centrífuga t íf
m v2 /r
HeV
Fuerza magnética centrípeta HeV = m v2 /r
Operando m/e = H2 r2 / 2 V Entonces m/e , depende solamente de r, porque B (H) y E (V) son constante.
Las muestras analizadas, li d mostraron también bié los l mismos i picos que los estándares con los m/z antes definidos. También coincidieron los tiempos de retención obtenidos entre el estándar y el CE presente en las muestras analizadas.
Dicloro metano 1
Vino sin carbamato de etilo 1
Vino con carbamato de etilo 15 ppb 1
Corrida cromatográfica en Scan
VALIDACIÓN Repetibilidad El método fue desarrollado para una repetibilidad en los límites de 15 µg/l a 45 µg/l en vinos vinos. Se analizaron por duplicado muestras de vinos adicionadas con distintas concentraciones de CE. Los resultados obtenidos para la repetibilidad fueron los siguientes: Desviación estándar de repetibilidad Sr = 0,84 µg/l Repetibilidad r = 2,4 µg/l
VALIDACIÓN Linealidad Para el cálculo de la linealidad se realizaron 21 mediciones de las áreas de pico de 3 concentraciones distintas de CE en vinos, i siendo i d estas, t 15 µg/l, /l 30 µg/l, /l 45 µg/l, /l con llas cuales l se calculó, la pendiente y el coeficiente de correlación..
C onc entrac ión µg /l C urva de reg res ión ajus ió j tada d 3500 3000 Altura
2500 2000 y = 71.602x R 2 = 0.996 0 996
1500 1000 500 0 0
10
20
30
Concentración µ g/l
40
50
C onc entrac ión µg ión µg /l G /l G ráfic o o de los de los res iduales 150
R es iiduos
100 50 0 ‐50
0
10
20
30
‐100 C onc e ntra c ión µ g /l
40
50
Límite de Detección
El límite de Detección para este método fue calculado utilizando el procedimiento gráfico derivado del ruido de fondo del registro cromatográfico en diferentes vinos blancos y tintos. Límite de detección: 15 µg/l.
Sede central | Mendoza | Argentina San Martín 430 – Ciudad – Mendoza – Argentina Tel.: 54 261 521 6604 – 521 6605 – 521 6773 Fax: 54 261 5216606
