TEKNIK MOLEKULER (ELEKTROFORESIS DAN SDS PAGE)

Keahlian dalam teknik molekular secara umum meliputi: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.

Ekstraksi DNA PCR RFLP RAPD DOT BLOT Kloning PAGE dll

Pengantar Elektroforesis

ASEP AWALUDIN PRIHANTO

FPIK UB

Apakah Elektroforesis? Metode pemisahan molekul (DNA, RNA, protein) melalui medium tertentu berdasarkan ukuran dan muatan listriknya

Struktur dan Penyusun Protein  PROTEIN – asam amino polimer  STRUCTURE of Amino Acids  Asam amino mempunyai (-COOH) & amina group (-NH2 ) serta rantai samping

04_05_Hydrophobic.jpg

04_29_Disulfide bonds.jpg

GEL PADA ELEKTROFORESIS

• Agarose Gel (DNA dan RNA) • Polyacrylamide Gel (Protein)

SDS-PAGE

(SDS-Polyacrylamide gel electrophoresis)

 Memisahkan protein berdasarkan ukuran  Sample harus dipanaskan selama 5 menit ‘sample

buffer‘ yang berisi:

SDS (CH3-(CH2)10-CH2OSO3- Na+),  Glukosa atau Glycerol  Ionizable tracking dye (i.e., bromophenol blue) 

SDS-PAGE  Muatan listrik protein

akan dirubah menjadi muatan negatif dengan bantuan SDS

SDS digunakan untuk merubah konformasi protein

Polyacrylamide

liquid solid

Acrylamide Gel Elektroforesis % acrylamide (w/v)

Kisaran efektif

Dengan BIS 1:20

pemisahan - bp

3.5

1 000 - 2 000

5.0

80 - 500

8.0

60 - 400

12.0

40 - 200

15.0

25 - 150

20.0

6 - 100

Migrasi Dye pada % Polyacrylamide Gel yang berbeda % Polyacrylamide gel

Bromophenol blue

Xylene cyanol (41)

5

35

130

6

26

106

8

19

76

10

12

55

12

8

28

Kisaran ukuran (Kd)

36-205 24-205 14-205 14-66* 14-45*

% Acrylamide

5% 7.5% 10% 12.5% 15%

SDS Gel

Stacking Gel

4 % acrylamide

Resolving Gel

12% acrylamide

Gradien Gel

5%

25%

Protein Gel Protein Standard

216 kDa 132 kDa 78 kDa 45.7 kDa 32.5 kDa

Resolving gel only

18.4 kDa

Protein diukur dalam kiloDalton 1 amu = 1 Dalton 1,000 unit massa atom= 1 kiloDalton (kDa)

Lanes: 1Molecular Weight Markers 2Supernatant 3Pellet 4Resin 5Fraction 2 6Fraction 1

Calculating Protein Size

3 6 9

216 kDa 132 kDa 78 kDa

18 22

45.7 kDa 32.5 kDa

30

18.4 kDa

30

18.4 kDa

100 80

45.7 kDa 32.5 kDa

60

18 22

40

216 kDa 132 kDa 78 kDa

20

3 6 9

Protein size

120

Calculating Protein Size

Penggunaan kurfa standar untuk penentuan berat molekul protein

10

20

30

mm from top of gel

Bekerja dalam Lab

Prinsip dasar pengerjaan 1. Tempatkan gel pada peralatan chamber

2. Masukkan sampel dalam well/sumuran.

3. Run gel

Detail Pengerjaan

Menimbang agarose.

 Campur

agarose 50- 100 ml aquades.

Panaskan agarose

Pasang gel dan juga sisir nya

Tuangkan gel pada chamber

 Masukkan DNA/Protetin kedalam setiap

sumuran .

Agarose Gel Elektroforesis  Perlahan tambahkan

buffer. Pastikan semua gel terendam dalam buffer.  Sebagai alternatif bisa memasukkan sampel setelah buffer dimasukkan (jangan lupa basic dye)

Sambungkan kedalam listrik dengan voltase rendah

Agarose Gel Elektroforesis  Pasang dalam

chamber dan nyalakan saklar listriknya

Agarose Gel Electrophoresis  umumnya akan selesai

dengan waktu satu jam.

lampu UV jangan lupa untuk membuat stainingnya dari EtBr.

Sebelum

Sesudah

FMBIO® II Fluorescence Imaging System

 Sumur 1, 3, 5, 7 adalah

marker

 Sumur 2, 4, 6 and 8

adalah sample

Agarose vs SDS-PAGE

• Untuk asam nukleat seperti DNA dan RNA. • Memisahkan berdasarkan muatan listrik, ukuran dan bentuk • Gel dibuat dari agar yang berasal dari rumput laut

• Untuk protein dengan ukuran yang berbeda SIZE. • Memisahkan berdasarkan ukuran • Gel dibuat dari bubuk Polyacrylamide

Semoga bermanfaat