UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN PENETAPAN KADAR FENOLIK

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN PENETAPAN KADAR FENOLIK TOTAL EKSTRAK ETANOL BUAH BUNI (Antidesma bunius (L.) Spreng) DENGAN METODE 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) DAN METODE FOLIN-CIOCALTEU SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Farmasi

Oleh: Margareta Novi Wijayanti NIM : 128114117

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2016


UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN PENETAPAN KADAR FENOLIK TOTAL EKSTRAK ETANOL BUAH BUNI (Antidesma bunius (L.) Spreng) DENGAN METODE 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) DAN METODE FOLIN-CIOCALTEU SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Farmasi

Oleh: Margareta Novi Wijayanti NIM : 128114117

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2016

i


ii


iii


HALAMAN PERSEMBAHAN I can do all this through Him who gives me strength. - Philippians 4:13-

“When you look closely to the path you have travel on, you will realise that God was always with you, directing every step you took.” -Lailah Gifty Akita“Life will always have a different plan for you. If you don’t give up, you will eventually get to your destination. But towards the end of your life, you may look back and realize that it was never really about the destination; it was the journey that counted.” -King Samuel Benson-

Kupersembahkan skripsi ini untuk : -

Tuhan Yesus yang selalu membimbing dan memudahkan dalam setiap langkahku

-

Kedua orang tua dan kakak yang selalu mendukung dan mendoakan

-

Teman – teman yang selalu memberi semangat

-

Almamaterku

iv


v


vi


PRAKATA Puji syukur penulis panjatkan kepada Tuhan atas berkat dan bimbinganNya penulis dapat menyelesaikan Skripsi yang berjudul “Uji Aktivitas Antioksidan Dan Penetapan Kadar Fenolik Total Ekstrak Etanol Buah Buni (Antidesma bunius (L.) Spreng) Dengan Metode 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) Dan Metode Folin Ciocalteu” ini dengan baik. Skripsi ini disusun untuk memenuhi salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Strata Satu Program Studi Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma. Penulis mengalami berbagai macam kesulitan dan masalah dalam proses pengerjaan Skripsi ini. Kesulitan dan masalah ini dapat diatasi penulis dengan bantuan dari segala pihak. Oleh karena itu penulis hendak mengucapkan terima kasih kepada : 1.

Aris Widayati, M.Si., Ph.D., Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma.

2.

Prof. Dr. C.J. Soegihardjo, Apt., selaku Dosen Pembimbing Utama dan Dosen Penguji Skripsi atas segala kesabaran dan masukan sehingga Skripsi ini dapat diselesaikan dengan baik.

3.

Dr. Erna Tri Wulandari, M.Si., Apt.,selaku Dosen Pembimbing Pendamping dan Dosen Penguji Skripsi atas segala kesabaran dan masukan sehingga Skripsi ini dapat diselesaikan dengan baik.

4.

Dr. Yustina Sri Hartini, M.Si., selaku Dosen Penguji Skripsi atas masukkan, kritik, dan saran kepada penulis dalam penyusunan Skripsi ini.

5.

Florentinus Dika Octa Riswanto, M.Sc selaku Dosen Penguji Skripsi atas masukkan, kritik, dan saran kepada penulis dalam penyusunan Skripsi ini.

6.

Agustina Setiawati, M.Sc., Apt., selaku Kepala Laboratorium Fakultas Farmasi yang telah memberikan izin dalam penggunaan laboratorium.

7.

Pak Wagiran selaku Laboran Laboratorium Farmakognosi - Fitokimia, Pak Suparlanselaku Laboran Laboratorium Kimia Organik, Mas Bimo selaku Laboran Laboratorium Kimia Analisis, Mas Sigit selaku Laboran Kebun

vii


Tanaman Obat atas segala bantuan dan kerja samanya selama proses penelitian. 8.

Ayah, Ibu dan Kakak yang selalu memotivasi dan mendukung penulis dalam menyelesaikan skripsi ini.

9.

Astrid Pangestuty, selaku teman seperjuangan dalam menyelesaikan Skripsi ini.

10. Grace Shelia P.P, Veronika Novaliana S.D., Monika M.W., dan Agnes Serlyta sebagai sahabat yang selalu memberikan semangat dalam penyusunan skripsi ini. 11. Bertha, Ossa, Kristi, Noven, dan Astrid sebagai sahabat yang selalu mendukung dalam penyusunan skripsi ini. 12. Teman – teman satu kelompok praktikum Meda, Berto, Desion, Rosa, Agata, Tika, dan teman – teman lain yang selalu mendukung dalam menyusun skripsi ini. 13. Kelurga besar kos Griya Kanna Putri, Cindya, Macho, Gery, Edward, Andrew, Tasya, Mala, Bertha, Nanda, David, Yosef, dan teman – teman yang selalu mendukung dan memberikan semangat. 14. Teman-teman FST B 2012, FSM C 2012 dan teman-teman Fakultas Farmasi Sanata Dharma angkatan 2012 yang selalu memberikan dukungan dan semangat dalam penyusunan Skripsi ini. 15. Semua pihak yang telah membantu dan memberikan dukungan yang tidak dapat disebutkan satu per satu. Penulis menyadari bahwa Skripsi ini masih memiliki kekurangan dalam berbagai macam hal. Untuk itu penulis mengharapkan kritik dan saran yang membangun dari segala pihak. Semoga Skripsi ini dapat berguna bagi seluruh pembaca. Yogyakarta, 19 Agustus 2016

Penulis

viii


DAFTAR ISI Halaman HALAMAN JUDUL...................................................................................

i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING .........................................

ii

HALAMAN PENGESAHAN .....................................................................

iii

HALAMAN PERSEMBAHAN .................................................................

iv

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA .....................................................

v

HALAMAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH ...............

vi

PRAKATA... ...............................................................................................

vii

DAFTAR ISI ...............................................................................................

ix

DAFTAR TABEL .......................................................................................

xiii

DAFTAR GAMBAR ..................................................................................

xiv

DAFTAR LAMPIRAN ...............................................................................

xv

INTISARI..... ...............................................................................................

xvi

ABSTRACT....... ...........................................................................................

xvii

BAB I PENGANTAR .................................................................................

1

A. Latar Belakang ................................................................................

1

B. Permasalahan...................................................................................

5

C. Keaslian Penelitian ..........................................................................

5

D. Manfaat Penelitian ..........................................................................

6

E. Tujuan Penelitian ............................................................................

7

BAB II PENELAAHAN PUSTAKA..........................................................

8

A. Tanaman Buni .................................................................................

8

1. Klasifikasi buah buni.................................................................

8

2. Nama umum ..............................................................................

8

3. Deskripsi tanaman .....................................................................

9

4. Kandungan kimia buah buni .....................................................

9

5. Aktivitas farmakologis ..............................................................

10

B. Ekstraksi ..........................................................................................

10

C. Senyawa Fenolik .............................................................................

11

ix


D. Radikal Bebas..................................................................................

13

E. Senyawa Antioksidan ......................................................................

14

F. Metode Folin-Ciocalteu ..................................................................

15

G. Metode DPPH .................................................................................

16

H. Spektrofotometri Visibel .................................................................

17

I. Landasan Teori ................................................................................

18

J. Hipotesis..........................................................................................

20

BAB III METODOLOGI PENELITIAN....................................................

21

A. Jenis dan Rancangan Penelitian ......................................................

21

B. Variabel dan Definisi Operasional ..................................................

21

1. Klasifikasi variabel ...................................................................

21

2. Definisi operasional ..................................................................

21

C. Bahan Penelitian..............................................................................

21

D. Alat Penelitian .................................................................................

23

E. Tata Cara Penelitian ........................................................................

23

1. Determinasi tanaman .................................................................

23

2. Pengambilan bahan buah buni ..................................................

23

3. Pembuatan ekstrak ....................................................................

23

4. Uji pendahuluan ........................................................................

24

a. Uji fenolik ...........................................................................

24

b. Uji aktivitas antioksidan......................................................

24

5. Skrining fitokimia ekstrak etanol 96% buah buni .....................

25

a. Pembuatan larutan uji ..........................................................

25

b. Uji saponin ..........................................................................

25

c. Uji flavonoid .......................................................................

25

d. Uji triterpenoid dan steroid .................................................

25

e. Uji minyak atsiri ..................................................................

26

f. Uji alkaloid ..........................................................................

26

g. Uji tanin dan polifenol ........................................................

26

h. Uji antosianin ......................................................................

27

i. Uji antrakuinon....................................................................

27

x


6. Penentuan kandungan fenolat total ...........................................

28

7. Penentuan aktivitas antioksidan ................................................

30

F. Analisis Data ...................................................................................

32

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ....................................................

33

A. Hasil Determinasi Tanaman ............................................................

33

B. Hasil Pengumpulan Bahan ..............................................................

33

C. Hasil Preparasi Sampel ...................................................................

34

D. Uji Pendahuluan Ekstrak Etanol Buah Buni ...................................

35

1. Uji pendahuluan keberadaan senyawa fenolik ..........................

35

2. Uji pendahuluan keberadaan senyawa antioksidan ...................

37

E. Hasil Uji Skrining Fitokimia Ekstrak Etanol 96% Buah Buni ........

38

a. Uji saponin ................................................................................

40

b. Uji flavonoid .............................................................................

40

c. Uji triterpenoid dan steroid .......................................................

41

d. Uji minyak atsiri ........................................................................

42

e. Uji alkaloid ................................................................................

42

f. Uji tanin dan polifenol ..............................................................

43

g. Uji antosianin ............................................................................

44

h. Uji antrakuinon..........................................................................

45

F. Hasil Optimasi Metode Uji Fenolik Total .......................................

45

1. Penentuan operating time..........................................................

45

2. Penentuan panjang gelombang maksimum ...............................

47

G. Penetapan Kandungan Fenolik Total ..............................................

48

H. Hasil Uji Aktivitas Antioksidan .....................................................

53

1. Penentuan Operating Time (OT)...............................................

53

2. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum ..................

55

I. Hasil Uji Aktivitas Antioksidan ......................................................

56

BAB V KESIMPULAN ..............................................................................

64

A. Kesimpulan .....................................................................................

64

B. Saran ................................................................................................

64

DAFTAR PUSTAKA .................................................................................

65

xi


LAMPIRAN ................................................................................................

72

BIOGRAFI PENULIS ................................................................................

103

DAFTAR PUSTAKA .................................................................................

65

LAMPIRAN ................................................................................................

72

BIOGRAFI PENULIS ................................................................................

103

xii


DAFTAR TABEL

Halaman Tabel I.

Hasil pengamatan uji tabung terhadap ekstrak etanol buah buni …………………………………………………....…...

Tabel II.

Hasil scanning panjang gelombang maksimumasam galat yang direaksikan dengan pereaksi Folin-Ciocalteu.......

Tabel III.

56

Hasil pengukuran aktivitas antioksidan dengan metode DPPH .....................................................................................

Tabel VII.

52

Hasil scanning panjang gelombang serapan maksimum DPPH .....................................................................................

Tabel VI.

51

Hasil penentuan jumlah fenolik total ekstrak etanol buah Buni. .......................................................................................

Tabel V.

48

Hasil pengukuran absorbansi asam galat yang telah direaksikan dengan reagen Folin-Ciocalteu pada λ 745 nm...

Tabel IV.

39

58

Hasil pengukuran aktivitas antioksidan ekstrak etanol buah buni dengan metode DPPH ...........................................

59

Tabel VIII. Hasil IC50 rutin dan ekstrak etanol buah buni ........................

60

xiii


DAFTAR GAMBAR Halaman Gambar 1.

Struktur rutin ..........................................................................

12

Gambar 2.

Struktur asam galat ................................................................

13

Gambar 3.

Struktur DPPH .......................................................................

16

Gambar 4.

Reaksi penangkapan radikal DPPH oleh antioksidan ............

17

Gambar 5.

Buah buni ...............................................................................

34

Gambar 6.

Hasil uji kualitatif senyawa fenolik pada ekstrak etanol buah buni................................................................................

Gambar 7.

Hasil uji kualitatif aktivitas antioksidan pada ekstrak etanol buah buni .....................................................................

Gambar 8.

37

38

Reaksi flavonoid pada ekstrak etanol buah buni berdasarkan uji Shinoda ........................................................

41

Mekanisme umum reaksi Liebermann-Burchard ...................

42

Gambar 10. Reaksi antara flavonoid dengan FeCl3 ...................................

44

Gambar 11. Perubahan struktur antosianin pada pH yang berberda .........

45

Gambar 12. Grafik penentuan Operating Time asam galat ......................

47

Gambar 9.

Gambar 13. Reaksi asam galat dengan senyawa molybdenum dari reagen Folin-Ciocalteu ..........................................................

50

Gambar 14. Kurva baku asam galat dalam penetapan fenolik total (Replikasi 3) ..........................................................................

51

Gambar 15. Grafik penentuan Operating Time rutin ................................

55

Gambar 16. Kurva persamaan regresi linier aktivitas antioksidan rutin replikasi 3 ..............................................................................

58

Gambar 17. Kurva persamaan regresi linier aktivitas antioksidan ekstrak etanol buah buni replikasi 2 .....................................

xiv

59


DAFTAR LAMPIRAN Halaman Lampiran 1.

Surat determinasi tanaman ..................................................

Lampiran 2.

Gambar tanaman buah buni di taman Kampus III

73

Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta .............................

74

Lampiran 3.

Ekstrak etanol buah buni .....................................................

74

Lampiran 4.

Foto hasil uji saponin ..........................................................

75

Lampiran 5.

Foto hasil uji flavonoid ........................................................

75

Lampiran 6.

Foto hasil uji triterpenoid dan steroid ..................................

76

Lampiran 7.

Foto hasil uji minyak atsiri ..................................................

76

Lampiran 8.

Foto hasil uji alkaloid ..........................................................

77

Lampiran 9.

Foto hasil uji tanin dan polifenol .........................................

77

Lampiran 10. Foto hasil uji antosianin.......................................................

78

Lampiran 11. Foto hasil uji antrakuinon ....................................................

78

Lampiran 12. Perhitungan rendemen ekstrak etanol buah buni .................

79

Lampiran 13. Data penimbangan untuk penetapan kadar fenolik total .....

80

Lampiran 14. Data optimasi penetapan kandungan fenolik total...............

81

Lampiran 15. Data penetapan kandungan fenolik total .............................

85

aktivitas antioksidan Lampiran 16. Data penimbangan untuk pengujian aktivitas antioksidan ...........................................................................

89

Lampiran 17. Data perhitungan konsentrasi DPPH, larutan pembanding dan larutan uji ......................................................................

90

Lampiran 18. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan...........................

93

Lampiran 19. Uji aktivitas antioksidan menggunakan radikal DPPH .......

97

Lampiran 20. Perhitungan nilai IC50 rutin dan ekstrak etanol buah buni .............................................................................

100

Lampiran 21. Data uji statistik ...................................................................

101

xv


INTISARI Radikal bebas merupakan suatu atom atau molekul yang memiliki satu atau lebih elektron yang tidak berpasangan, sehingga relatif tidak stabil yang dapat menimbulkan berbagai macam penyakit. Antioksidan adalah senyawa yang dapat menghambat reaksi oksidasi dengan mengikat radikal bebas dan molekul yang sangat reaktif, akibatnya kerusakan sel dapat dihambat. Belakangan ini banyak penelitian yang menunjukkan bahwa antioksidan sintetik seperti butylated hydroxyanisole (BHA) dan butylated hydroxytoluene (BHT)dalam dosis besar dapat menyebabkan penyakit seperti gangguan fungsi ginjal dan hati, kanker, dan reaksi alergi. Oleh karena itu penelitian terkait bahan alam yang efektif, tidak toksik, dan memiliki aktivitas sebagai antioksidan semakin gencar dilakukan. Buah buni (Antidesma bunius(L.)Spreng) dilaporkan mempunyai kandungan senyawa fenolik yang mempunyai aktivitas antioksidan. Senyawasenyawa yang berperan sebagai antioksidan yaitu asam fenolik, antosianin dan flavonoid. Etanol dapat menyari berbagai macam senyawa fenolik seperti polifenol, flavonoid, antosianin dan tanin. Sehingga tujuan dari penelitian ini adalah untuk menetapkan kandungan fenolik total dan menguji aktivitas antioksidan ekstrak etanol buah buni. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak etanol buah buni mempunyai kandungan fenolik total sebesar 0,2794 ± 0,0048 mg GAE/g ekstrak etanol buah buni yang diukur dengan metode Folin-Ciocalteu. Sedangkan ekstrak etanol buah buni mempunyai aktivitas antioksidan dengan IC50 sebesar 2049,7099 ± 91,2742μg/mL yang diukur dengan metode DPPH.

Kata kunci : Buah Buni, (Antidesma bunius (L.) Spreng), Antioksidan, Fenolik Total, Metode DPPH, Metode Folin-Ciocalteu.

xvi


ABSTRACT A free radical is an atom or molecule having one or more unpaired electrons.It is relatively unstable which cause various diseases. Antioxidants are compounds that can inhibit oxidation reactions by binding free radicals and highly reactive molecules, resulting in inhibited of cell damage. Lately, many studies show that synthetic antioxidants such as butylated hydroxyanisole (BHA) and butylated hydroxytoluene (BHT) in large doses can cause diseases such as kidney and liver function disorders, cancer, and allergic reactions. Therefore, the research related to the natural ingredients that are effective, non-toxic, and have antioxidant activity more intensively conducted. Berry (Antidesma bunius (L.) Spreng) has been reported to have phenolic compounds. Phenolic compounds are potent sources of natural antioxidants. Compounds that act as antioxidants are phenolic acids, anthocyanins and flavonoids.Ethanol can extract wide range of phenolic compounds such as polyphenols, flavonoids, antocyanin and tanin.Therefore, the purpose of this study was to specify a total phenolic content and antioxidant activity of ethanol extract test of buni fruits. The results showed that the ethanolic extract of berry fruits obtained total phenolic content of 0.2794 ± 0.0048 mg GAE/g of ethanol extract of berry fruit as measured by the Folin-Ciocalteu method. While the berry fruit ethanol extract has antioxidant activity with IC50 2049.7099 ± 91.2742 mg/mL as measured by DPPH method. Keywords: Buni fruits, (Antidesma bunius (L.) Spreng), Antioxidants, phenolic Total, DPPH method, Folin-Ciocalteu method.

xvii


BAB I PENGANTAR A. Latar Belakang Di dalam tubuh kita setiap saat terjadi reaksi oksidasi sehingga memicu terbentuknya radikal bebas yang sangat aktif yang dapat merusak struktur dan fungsi sel. Tetapi reaktivitas radikal bebas tersebut dapat dihambat oleh sistem antioksidan yang melengkapi sistem kekebalan tubuh (Damayanthi et al., 2010). Oksidasi merupakan proses alami yang dapat terjadi ketika suatu zat berikatan dengan oksigen (Chawda, 2011). Radikal bebas merupakan suatu molekul yang kehilangan elektron terluarnya yang dengan cepat dapat bereaksi dengan atom – atom atau senyawa – senyawa di lingkungannya (Droge, 2002). Radikal bebas terbentuk melalui suatu reaksi oksidasi. Kerusakan oksidatif yang ditimbulkan karena terpapar radikal bebas dapat menyebabkan penuaan dan beragam penyakit seperti arterosklerosis, diabetes, sirosis, dan kanker (Doss dan Thangavel, 2011). Antioksidan adalah senyawa yang bertindak sebagai penangkal radikal bebas dan mencegah terjadinya kerusakan yang diakibatkan oleh senyawa radikal (Pham-Huy, 2008). Belakangan ini banyak penelitian yang menunjukkan bahwa antioksidan sintetik seperti butylated hydroxyanisole (BHA) dan butylated hydroxytoluene (BHT) berbahaya bagi kesehatan manusia. Antioksidan sintetik tersebut dalam dosis yang besar dapat menyebabkan penyakit seperti gangguan fungsi ginjal dan hati, kanker, dan reaksi alergi. Oleh karena itu penelitian terkait

1

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 2

bahan alam yang efektif, tidak toksik, dan memiliki aktivitas sebagai antioksidan semakin gencar dilakukan (Gupta dan Sharma, 2006). Salah satu jenis bahan pangan yang mempunyai aktivitas antioksidan adalah berbagai jenis buah berry. Buah buni (Antidesma bunius (L.) Spreng) merupakan jenis berry lokal.Senyawa antioksidan yang terdapat dalam buah buni antara lain antosianin, flavonoid dan asam fenolik. Buni merupakan jenis berry yang tumbuh secara liar di Australia, China, India, Indonesia, Myanmar, Filipina, Srilanka, Thailand, dan Vietnam (Orwa et al., 2009). Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Butkhup dan Samappito (2008) menunjukkan bahwa ekstrak metanol buah buni mengandung antosianin (prosianidin B1, prosianidin B2), flavonoid (katekin, epikatekin, rutin, mirisetin, resveratrol, luteolin, kuersetin, naringenin, dan kaempferol) dan asam fenolik (asam galat, asam kafeat, asam elagat, dan asam ferulat). Pada penelitian sebelumnya oleh Butkhup dan Samappito (2011) telah dilakukan uji aktivitas antioksidan buah buni dari tahap mentah (hijau muda), mentah menuju kematangan (hijau), setengah matang (merah muda), matang (merah), dan matang sempurna (ungu kehitaman). Hasil yang didapatkan yaitu buah buni dengan tahap matang sempurna berwarna ungu kehitaman berpotensi mempunyai aktivitas antioksidan yang tinggi. Senyawa yang berperan dalam aktivitas antioksidan tersebut adalah polifenol, antara lain prosianidin B2, prosianidin B1, katekin, epikatekin, rutin dan tran-resveratrol. Oleh karena itu pada penelitian kali ini buah yang dipilih adalah buah dengan kematangan sempurna berwarna ungu kehitaman yang diharapkan mempunyai aktivitas antioksidan yang tinggi.


Metode uji yang sering digunakan untuk penentuan kandungan fenolik total adalah metode Folin – Cioucalteu. Metode ini merupakan metode yang umum digunakan sebagai standar penentuan kandungan fenolik total karena merupakan metode yang cepat dan sederhana yang dinyatakan sebagai masa ekuivalen asam galat tiap mg sampel (Fu et al., 2011). Asam galat digunakan sebagai pembanding karena telah diketahui sebagai salah satu senyawa fenolik yang terdapat dalam tanaman, selain itu asam galat merupakan standar yang direkomendasikan untuk mendapatkan hasil yang reliabel karena mempunyai reaktivitas yang cukup tinggi terhadap reagen Folin-Ciocalteu (Prior et al., 2005). Prinsip metode ini adalah reaksi oksidasi senyawa fenol dalam suasana basa oleh pereaksi Folin – Ciocalteu menghasilkan kompleks berwarna biru yang memberikan serapan kuat pada panjang gelombang 760 nm. Peningkatan intensitas warna biru akan sebanding dengan jumlah senyawa fenolik yang ada dalam sampel (Blainski et al., 2013). Senyawa fenolik erat kaitannya dengan aktivitas antioksidan, tanaman yang mempunyai kandungan senyawa fenolik yang tinggi diharapkan juga mempunyai aktivitas antioksidan yang tinggi. Metode yang digunakan untuk mengukur aktivitas antioksidan salah satunya adalah DPPH. Metode uji DPPH menggunakan radikal bebas DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazil). Metode ini menggunakan kontrol positif rutin karena rutin merupakan salah satu senyawa flavonoid yang ada pada tanaman yang mempunyai aktivitas antioksidan. Nilai aktivitas antioksidan diketahui melalui nilai IC50 (Inhibitory Concentration 50)


yang merupakan konsentrasi ekuivalen yang memberikan 50% efek aktivitas antioksidan (Dehpour et al., 2009). Radikal DPPH memberikan serapan kuat pada panjang gelombang 517 nm dengan warna violet gelap. DPPH dapat memberikan serapan karena memiliki gugus kromofor dan auksokrom pada struktur kimianya dan dengan adanya delokalisasi elektron pada DPPH akan memberikan warna violet (Dehpour et al., 2009). Perubahan absorbansi akibat dari reaksi ini telah digunakan secara luas untuk menguji kemampuan beberapa molekul sebagai penangkap radikal bebas. Metode DPPH merupakan metode yang mudah, cepat, dan sensitif untuk pengujian aktivitas antioksidan senyawa tertentu atau ekstrak tumbuhan (Koleva et al., 2002). Pelarut yang sering digunakan untuk mengekstraksi senyawa fenolik antara lain metanol, etanol, aseton dan etil asetat (Taroreh et al., 2015). Etanol tergolong pelarut yang memiliki sifat polar sehingga diharapkan mampu melarutkan sebagian besar senyawa fenolik dalam buah buni yang bersifat polar. Oleh karena itu peneliti menggunakan etanol sebagai pelarut dalam pembuatan ekstrak. Penggunaan etanol sebagai pelarut juga merupakan pengembangan penelitian yang pernah dilakukan Butkhup dan Samappito 2008 dan 2011. Perbedaan kepolaran pelarut sangat mempengaruhi kemampuan pelarut untuk menarik zat aktif yang ada pada buah buni. Selain itu, adanya perbedaan tempat tumbuh tanaman ini tentu saja akan mempengaruhi kadar metabolit dari buah buni karena kadar edafik tanah setiap daerah berbeda-beda. Pada penelitian Buthkup dan Samappito 2008 dan 2011 menggunakan tanaman buni yang tumbuh


di Thailand sedangkan penelitian ini menggunakan tanaman buni yang tumbuh di Indonesia. B. Permasalahan a. Berapakah kandungan fenolik total ekstrak etanol buah buni dalam massa ekivalen asam galat yang diukur dengan metode Folin - Ciocalteu? b. Berapakah nilai aktivitas antioksidan ekstrak etanol buah buni dalam nilai IC50 yang diukur dengan metode DPPH? C. Keaslian Penelitian Penelitian menggunakan tanaman Antidesma bunius (L.)Sprengpernah dilakukan oleh : a. Butkhup dan Samappito (2008) mengenai analisis total antosianin menggunakan spectrophotometric pH differential protocol dan komponen fenolik berupa (flavonoid, prosianidin, dan asam fenolik) menggunakan metode RP-HPLC-DAD (Reverse Phase High-Performance Liquid Chromatrography-Photodiode Detector), fenolik total dengan metode Folin-Ciocalteu dan aktivitas antioksidan menggunakan metode DPPH pada ekstrak metanol 50 % buah buni. b. Butkhup dan Samappito (2011) melaporkan mengenai pengaruh perkembangan dan kematangan buah buni pada perubahan fisika kimia, aktivitas antioksidan dan akumulasi polifenol. Total fenolik diukur menggunakan metode Folin-Ciocalteu, komponen polifenol dianalisis menggunakan metode RP-HPLC-DAD (Reverse Phase High-Performance Liquid Chromatrography-Photodiode Detector), dan aktivitas antioksidan


ditetapkan menggunakan metode DPPH. Hasil yang didapatkan adalah pada ekstrak metanol 60% buah buni matang mempunyai aktivitas antioksidan yang tinggi. c. Butkhup dan Samappito (2011) melakukan penelitian mengenai penetapan total flavonoid, jumlah antosianin, total fenolik, aktivitas antibakteri dan aktivitas antioksidan menggunakan metode DPPH. Hasil yang diperoleh yaitu pada ekstrak metanol 60 % kulit buah buni mempunyai kandungan antosianin yang tinggi, sedangkan pada ektrak metanol 60 % biji buah buni mempunyai kandungan fenolik yang tinggi. Perbedaan penelitian ini dengan penelitian – penelitian sebelumnya adalah pada tempat pengambilan sampel, pelarut etanol 96 % yang digunakan, dan cara ekstraksi buah buni. D. Manfaat Penelitian 1. Manfaat teoritis. Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan tambahan pengetahuan mengenai aktivitas antioksidan yang dinyatakan dengan IC50 dalam ekstrak etanol 96 % buah buni yang diukur dengan metode DPPH, sehingga hasil penelitian dapat menjadi acuan untuk penelitian selanjutnya. 2. Manfaat praktis. Penelitian ini diharapkan dapat memberi informasi bagi masyarakat mengenai potensi buah buni sebagai salah satu sumber antioksidan alami yang dapat meningkatkan pertahanan tubuh manusia dari radikal bebas.


E. Tujuan Penelitian 1. Tujuan umum : menguji aktivitas antioksidan menggunakan metode DPPH dan menetapkan kandungan fenolik total menggunakan metode FolinCiocalteu dari ekstrak etanol buah buni. 2. Tujuan khusus a. Mengetahui nilai kandungan fenolik total pada ekstrak etanol buah buni yang dinyatakan dengan massa ekuivalen asam galat menggunakan metode Folin-Ciocalteu. b. Mengetahui nilai aktivitas antioksidan ekstrak etanol buah buni yang dinyatakan dalam nilai IC50 dengan metode DPPH.


BAB II PENELAAHAN PUSTAKA A. Tanaman Buni 1. Klasifikasi buah buni Menurut United States Departement of Agriculture (USDA), tanaman buni diklasifikasikan sebagai berikut : Kerajaan

: Plantae

Sub-kerajaan

: Tracheobionta

Superdivisi

: Spermatophyta

Divisi

: Magnoliophyta

Kelas

: Magnoliopsido

Sub-kelas

: Rosidae

Bangsa

: Euphorbiales

Suku

: Euphorbiaceae

Marga

: Antidesma L.

Jenis

: Antidesma bunius (L.) Spreng

2. Nama umum Tanaman ini dikenal dengan nama wuni di Jawa dan Sunda, burneh di Madura, bune tedong di Sulawesi, dan di Melayu dikenal dengan nama buni (Hariyana, 2013). Diluar negeri dikenal dengan nama bignai di Filipina, ma mao luang di Tailand, choi moi di Vietnam, kywe-pyisin di Birma, antidesme di Perancis dan di Inggris dikenal dengan nama Chinese laurel (Orwa et al., 2009).

8


3. Deskripsi tanaman Tanaman ini berbentuk pohon, dengan tinggi 15 – 30 m. Daun bertangkai pendek, bentuk lanset sampai eliptis dengan panjang 9 – 25 cm. Tanaman ini berumah dua; bunga di ujung dan dalam ketiak tandan, tandan jantan bentuk mulai mengecil. Bunga jantan duduk atau bertangkai pendek, bau tidak enak; kelopak berbentuk bola cawan, pendek berlekuk 3 – 4, panjang 1 – 2 mm. Benang sari 3 – 4; tonjolan penebalan dasar bunga dengan taju yang tidak sama, gundul, dan berseling dengan kelopak; putik yang rudimenter besar. Bunga betina bertangkai; kelopak bentuk cekungan, bertaju 3 – 4 pendek, panjang 1 mm, bakal buah gundul, bentuk telur – botol; kepala putik 3 – 4, pendek dan tebal, melengkung keluar. Buah eliptis lebar, hijau kemudian merah, akhirnya ungu kehitaman, gundul, bentuk telur; kepala putik 3 – 4, pendek dan tebal, melengkung keluar. Buah eliptis lebar, hijau kemudian merah, akhirnya dapat dimakan dan biji berbentuk pipih dengan rusuk yang berbentuk jala. Pohon yang tumbuh di hutan tingginya mencapai 1.300 m (Van Steenis, 1992). 4. Kandungan kimia buah buni Menurut Butkhup dan Samappito (2008) ekstrak metanol buah buni mengandung antosianin (prosianidin B1, prosianidin B2), flavonoid (katekin, epikatekin, rutin, mirisetin, resveratrol, luteolin, kuersetin, naringenin, dan kaempferol) dan asam fenolik (asam galat, asam kafeat, asam elagat, dan asam ferulat).


5. Aktivitas farmakologis Tanaman buni dapat digunakan untuk mengobati flu dan kanker (Micor, 2005). Tanaman buni juga dapat digunakan untuk mengobati kurang darah, darah kotor, hipertensi, jantung berdebar, batuk, sifilis dan kencing nanah (Haryanto, 2009). Buah yang sudah matang dapat digunakan untuk mengatasi masalah pada saluran cerna seperti disentri, diabetes, indigesti, dan konstipasi (Kassem et al., 2013). B. Ekstraksi Ekstraksi merupakan proses pemisahan bahan dari campurannya dengan menggunakan pelarut. Sedangkan ekstrak adalah sediaan yang diperoleh dengan cara ekstraksi tanaman obat dengan ukuran partikel tertentu menggunakan cairan penyari yang sesuai. Maserasi adalah metode penyarian simplisia sederhana yang dilakukan dengan menggunakan berbagai macam pelarut pada suhu kamar selama beberapa waktu (Agoes, 2009). Remaserasi adalah pengulangan penambahan pelarut setelah dilakukan penyaringan maserat pertama, dan seterusnya (Depkes RI, 2000). Pada proses ekstraksi, pelarut berdifusi kedalam sel dan selanjutnya zat aktif akan larut kedalam pelarut. Sehingga, akan dicapai kesetimbangan antara solut dan solven (Agoes, 2009). Keuntungan metode ekstraksi yaitu dapat diaplikasikan dalam sampel dengan jumlah yang sedikit, prosesnya mudah, dan alat yang digunakan sederhana (List dan Schmidt, 2000). Pelarut yang digunakan dalam proses pembuatan ekstrak adalah pelarut optimal yang dapat menyari senyawa aktif atau berkhasiat, sehingga senyawa


tersebut dapat terpisah dari bahan atau kandungan lainnya. Pelarut yang dipilih adalah pelarut yang bisa melarutkan hampir semua metabolit sekunder yang terkandung. Pelarut yang sering digunakan untuk mengekstraksi senyawa fenolik antara lain metanol, etanol, aseton dan etil asetat (Tarorehet al., 2015). C. Senyawa Fenolik Senyawa fenolik merupakan kelompok terbesar metabolit sekunder pada tanaman. Senyawa ini termasuk dalam alkohol aromatik karena gugus hidroksilnya selalu melekat pada cincin benzen. Senyawa fenolik secara umum memiliki potensi sebagai bakterisidal, antiseptik, antioksidan, dan sebagainya (Pengelly, 2006). Beberapa senyawa yang termasuk dalam kelompok fenolik adalah fenol sederhana, kumarin, tannin, saponin, dan flavonoid. Senyawa tersebut biasanya berada dalam bentuk glikosida atau ester pada tanaman (Proestos, 2006). Senyawa fenolik ini merupakan molekul yang dapat bertindak sebagai antioksidan untuk mencegah penyakit jantung, mengurangi peradangan, menurunkan kejadian kanker dan diabetes, serta mengurangi tingkat mutagenesis pada sel manusia. Perlindungan yang diperoleh dari mengonsumsi produk tanaman seperti buah-buahan, sayuran dan kacang-kacangan sebagian besar terkait dengan adanya senyawa fenolik pada tanaman tersebut (Khoddami et al., 2013). Senyawa fenolik dapat memberikan perlindungan sebagai antioksidan dikarenakan senyawa fenolik dapat bereaksi dengan reactive oxygen species (ROS) dan menghilangkan aktivitas radikalnya sehingga tidak berbahaya lagi terhadap sel tubuh manusia (Sochor, 2010).


Flavonoid merupakan senyawa fenolik yang paling umum, karena tersebar luas di jaringan tanaman, dan bersama karotenoid dan klorofil bertanggung jawab memberikan warna seperti biru, ungu, kuning, oranye dan merah pada tanaman. Flavonoid meliputi flavon, flavonol, iso-flavonol, anthocyanin, anthocyanidin, proanthocyanidin dan katekin (Khoddami et al., 2013). Flavonoid merupakan senyawa polar karena memiliki sejumlah gugus hidroksil. Umumnya flavonoid larut dalam pelarut polar seperti air, etanol, metanol, aseton, dimetilsulfoksida, dan dimetilformamida. Gula yang terikat pada flavonoid dapat membantu meningkatkan kelarutan flavonoid dalam air, sehingga dengan menggunakan campuran pelarut air dengan beberapa contoh pelarut polar lain dapat menjadi pelarut yang baik untuk flavonoid khususnya glikosida. Sebaliknya aglikon bersifat kurang polar, contohnya adalah isoflavon, flavon, dan flavonol yang termetoksilasi. Mereka akan cenderung lebih mudah larut dalam pelarut seperti eter dan kloroform (Markham, 1988). Rutin (3’,4’,5,7-tetrahidroksiflavon-3β-D-rutinosida) adalah glukosida flavonoid yang sangat umum dikenal dengan vitamin P. Dalam keseharian, rutin biasa digunakan untuk mengobati tekanan darah tinggi serta penyakit lain yang berkaitan dengan vaskuler (dos Santos, 2008).

Gambar 1. Struktur rutin (Lopez, 2003)


Golongan senyawa fenolik lainnya antara lain, asam fenolik, kumarin, dan flavonol. Asam fenolik yang sering ditemukan antara lain asam hydroxylbenzoic, dan yang tergolong didalamnya antara lain asam galat, asam salisilat, dan asam vanillic (Vermerris dan Nicholson, 2008). Asam galat (asam 3,4,5-trihidroksibenzoat) merupakan senyawa fenolik yang bukan tergolong dalam flavonoid. Asam galat termasuk dalam golongan antioksidan alami yang sering digunakan sebagai pengawet makanan (Lopez, 2003).

Gambar 2. Struktur asam galat (Lopez, 2003) D. Radikal Bebas Radikal bebas merupakan suatu atom atau molekul yang memiliki satu atau lebih elektron yang tidak berpasangan, sehingga relatif tidak stabil. Atom atau molekul tersebut bersifat reaktif mencari pasangan elektron disekitarnya untuk menstabilkan diri atau sering disebut sebagai reactive oxygen species (ROS) (Ardhie, 2011). Sifat sangat reaktif yang dimiliki oleh radikal bebas menyebabkan radikal ini dapat bereaksi dengan protein, lipid, karbohidrat dan DNA untuk memperoleh kembali pasangan elektronnya dan menjadi stabil (Badarinath et al., 2010).


Efek berbahaya dari radikal bebas menyebabkan potensi kerusakan biologis yang disebut dengan oxidative stress dan nitrosative stress. Efek tersebut terjadi dalam sistem biologi bila ada produksi lebih dari ROS/RNS. Oxidative Stress dapat merusak jaringan lipid, protein, atau DNA seluler sehingga menghambat fungsi normal mereka. Maka oxidative stressdapat disimpulkan terlibat dalam menimbulkan sejumlah penyakit pada manusia serta dalam proses penuaan (Valko et al., 2006). E. Senyawa Antioksidan Menurut Pham-Huy (2008) antioksidan adalah senyawa yang bertindak sebagai penangkal radikal bebas dan mencegah terjadinya kerusakan yang diakibatkan oleh senyawa radikal. Radikal bebas dapat mengoksidasi asam nukleat, protein, lipid, serta DNA, sehingga menyebabkan penyakit degeneratif. Senyawa antioksidan seperti asam fenolik, polifenol, dan flavonoid dapat meredam radikal bebas peroksida, hidroperoksida atau lipid peroksil dan menghambat mekanisme oksidatif yang menimbulkan penyakit degeneratif (Prakash et al., 2001). Berdasarkan sifatnya antioksidan dibagi menjadi 2, yaitu antioksidan enzimatis dan non enzimatis. Antioksidan enzimatis merupakan sistem pertahanan terhadap kerusakan oksidatif dalam sel. Contoh antioksidan enzimatis adalah superoksida dismutase (SOD), katalase, glutation reduktase dan glutation peroksidase. Sedangkan antioksidan non-enzimatis adalah antioksidan yang mempertahankan membran sel, seperti vitamin C di fase air, vitamin E, ubiquinol


di

fase

lipid,

karotenoid

(β

karoten),

glutation,

bilirubin,

abumin,

transferin/laktoferin/serulo-plasmin, feritin, sistein, dan flavonoid (Ardhie, 2011). Berdasarkan sumbernya, antioksidan dapat digolongkan menjadi dua jenis, yaitu antioksidan alami dan antioksidan sintetis. Antioksidan sintetis adalah antioksidan yang dibuat dengan melakukan sintetis kimia seperti TBHQ, BHT, dan propil galat (Gulcin et al., 2004). Antioksidan alami terdapat pada makanan sehari – hari, seperti buah dan sayuran yang mengandung berbagai senyawa fenolik atau nitrogen dan karotenoid. Antioksidan alami dapat melindungi tubuh manusia dari radikal bebas dan menurunkan terjadinya perkembangan penyakit kronis (Sing, 2007). F. Metode Folin-Ciocalteu Metode ini didasarkan pada reduksi asam fosfotungstat dalam larutan alkali menjadi fosfotungstat biru. Absorbansi yang terbentuk akibat fosfotungstat biru sebanding dengan jumlah senyawa fenolik yang terdapat dalam sampel, sehingga dapat diketahui seberapa besar jumlah kandungan senyawa dengan gugus fenol dalam suatu sampel tanaman yang dinyatakan dengan ekuivalen asam galat (Cindrić et al., 2011). Metode

spektrofotometri

UV/VIS

banyak

menggunakan

reaksi

kolorimetrik karena mudah, cepat dan biayanya terjangkau. Metode ini mengukur konsentrasi total senyawa fenolik dalam ekstrak tumbuhan. Polifenol dalam ekstrak tumbuhan akan bereaksi dengan reagen Folin Ciocalteu sehingga membentuk kompleks berwarna biru yang dapat diukur dengan cahaya tampak spektrofotometri. Reagen Folin Ciocalteu mempunyai kelemahan, yaitu sangat


cepat terurai dalam larutan alkali, sehingga perlu untuk menggunakan reagen secara berlebih untuk mendapatkan reaksi yang lengkap. Tetapi penggunaan reagen berlebih dapat menimbulkan endapan dan kekeruhan yang tinggi, sehingga membuat analisis spektrofotometri tidak bisa dilakukan. Untuk mengatasi masalah ini, didalam reagen Folin Ciocalteu terdapat garam lithium, yang dapat mencegah kekeruhan. Reaksi ini pada umumnya memberikan data yang akurat dan spesifik pada beberapa kelompok senyawa fenolik (Blainski et al., 2013). G. Metode DPPH Metode uji ini menggunakan radikal bebas DPPH (2,2-difenil-1pikrilhidrazil). Radikal bebas DPPH dapat bereaksi dengan senyawa yang dapat mendonorkan atom hidrogen. Tujuan metode ini adalah untuk mengetahui parameter konsentrasi yang ekuivalen memberikan 50% efek aktivitas antioksidan (IC50) yaitu dengan cara menginterpretasikan data eksperimental dari metode DPPH tersebut (Dehpour et al., 2009). Metode DPPH dapat digunakan untuk sampel yang berupa padatan maupun cairan. DPPH sering digunakan untuk menguji senyawa yang berperan sebagai free radical scavengers atau donor hidrogen, mengevaluasi aktivitas antioksidannya dan mengkuatifikasi jumlah kompleks radikal antioksidan yang terbentuk (Prakash et al., 2001).

Gambar 3. Struktur DPPH (Molyneux, 2004)


Metode DPPH merupakan metode yang sederhana, cepat, sensitif, dan reprodusibel untuk pengujian aktivitas antioksidan (Savatovic et al., 2012). DPPH memberikan serapan kuat pada 517 nm dikarenakan adanya elektron yang tidak berpasangan. Ketika

elektronnya menjadi berpasangan oleh keberadaan

penangkap radikal bebas, maka absorbansinya akan menurun. Keberadaan senyawa antioksidan dapat mengubah warna larutan DPPH dari ungu menjadi kuning. Perubahan absorbansi akibat dari reaksi ini telah digunakan secara luas untuk menguji kemampuan beberapa molekul sebagai penangkap radikal bebas (Dehpour et al., 2009).

Gambar 4. Reaksi penangkapan radikal DPPH oleh antioksidan (Prakash et al., 2001) Warna DPPH yang berubah dari warna ungu menjadi kuning dikarenakan adanya penambahan antioksidan yaitu saat elektron tunggal pada DPPH berpasangan dengan hidrogen dari antioksidan. Hasil dekolorisasi oleh antioksidan setara dengan jumlah elektron yang tertangkap (Prakash et al., 2001). H. Spektofotometri Visibel Prinsip spektrofotometri UV/Visibel yaitu radiasi pada rentang panjang gelombang 200–700 nm dilewatkan melalui suatu larutan senyawa. Elektron pada ikatan dalam molekul menjadi tereksitasi sehingga berada pada keadaan energi


yang lebih tinggi dalam proses menyerap sejumlah energi yang melewati larutan tersebut (Watson, 2010). Absorpsi cahaya ultraviolet atau cahaya tampak mengakibatkan adanya transisi elektronik, yaitu perpindahan elektron dari orbital dasar yang energinya rendah menuju keadaan tereksitasi yang energinya lebih tinggi (Fessenden dan Fessenden, 1982). Hal - hal yang perlu diperhatikan dalam analisis spektrofotometri antara lain waktu operasional dan panjang gelombang maksimum. Waktu operasional ditentukan dengan mengukur hubungan antara waktu pengukuran dengan absorbansi larutan. Tujuan dari waktu operasional untuk mengetahui waktu pengukuran yang stabil. Pada awal terjadi reaksi absorbansi akan terus meningkat hingga pada waktu tertentu absorbansi yang dihasilkan stabil. Terdapat kemungkinan senyawa mengalami kerusakan atau terurai sehingga menyebabkan intensitas warna dan absorbansinya menurun seiring bertambahnya waktu. Oleh karena hal tersebut perlu dilakukan pengukuran pada saat waktu operasional yang tepat (Gandjar dan Rohman, 2007). Panjang gelombang yang digunakan dalam pengukuran adalah panjang gelombang yang memiliki absorbansi maksimal. Pada panjang gelombang maksimal kepekaan yang dihasilkan tinggi. Oleh karena itu perubahan absorbansi untuk setiap satuan konsentrasi adalah yang paling besar (Gandjar dan Rohman, 2007). I. Landasan Teori Radikal bebas merupakan suatu atom atau molekul yang memiliki satu atau lebih elektron yang tidak berpasangan, sehingga relatif tidak stabil.


Antioksidan seperti asam fenolik, polifenol, dan flavonoid merupakan senyawa pemberi elektron yang dapat memerangi aktivitas oksidan dalam tubuh yang dapat mencegah timbulnya penyakit degeneratif. Buah buni merupakan sumber antioksidan yang memiliki kandungan senyawa fenolik, flavonoid dan antosianin yang tinggi. Ekstrak metanol buah buni mengandung antosianin (prosianidin B1, prosianidin B2), flavonoid (katekin, epikatekin, rutin, mirisetin, resveratrol, luteolin, kuersetin, naringenin, dan kaempferol) dan asam fenolik (asam galat, asam kafeat, asam elagat, dan asam ferulat) yang tinggi. Maserasi dipilih karena metodenya tidak menggunakan panas dan tidak merusak kandungan senyawa dalam buah buni. Etanol 96 % dipilih sebagai pelarut karena bersifat polar sehingga diharapkan senyawa – senyawa flavonoid dan fenolik yang bersifat polar dapat tersari ke dalam etanol. Etanol dapat menyari berbagai macam senyawa fenolik seperti polifenol, flavonoid, antosianindan tanin. Metode yang sering digunakan untuk mengukur aktivitas antioksidan adalah metode DPPH. Metode ini menggunakan rutin sebagai kontrol positif karena rutin merupakan salah satu senyawa flavonoid dalam tanaman yang telah diketahu mempunyai aktivitas antioksidan. Tujuan metode ini adalah untuk mengetahui parameter konsentrasi yang ekuivalen memberikan 50% efek aktivitas antioksidan (IC50), yaitu dengan cara menginterpretasikan data eksperimental dari metode DPPH tersebut. Aktivitas antioksidan juga berhubungan dengan kadar fenolik totalnya, kadar fenolik total dapat ditentukan dengan metode Folin-Ciocalteu. Metode


Folin-Ciocalteu didasarkan pada reduksi asam fosfotungstat dalam larutan alkali menjadi fosfotungstat biru. Kandungan fenolik total dinyatakan dengan ekuivalen asam galat sebagai pembanding karena asam galat merupakan salah satu senyawa asam fenolik yang banyak terdapat dalam tanamanyang mempunyai aktivitas antioksidan. J. Hipotesis 1. Ekstrak etanol buah buni memiliki kandungan senyawa fenolik yang dapat diukur dengan metode Folin-Cioucalteu dan dinyatakan dengan ekuivalen asam galat. 2. Ekstrak etanol buah buni memiliki aktivitas antioksidan yang dapat diukur dengan metode DPPH dan dinyatakan dalam nilai IC50.


BAB III METODOLOGI PENELITIAN A. Jenis dan Rancangan Penelitian Penelitian ini termasuk jenis penelitian eksperimental murni dengan rancangan acak sederhana. B. Variabel dan Definisi Operasional 1. Klasifikasi variabel a. Variabel utama 1) Variabel bebas : konsentrasi ekstrak etanol buah buni 2) Variabel tergantung : aktivitas antioksidan dan kandungan fenolik total ekstrak etanol buah buni. b. Variabel pengacau 1) Variabel pengacau terkendali : waktu pemanenan, umur tanaman yang dipanen, dan metode ekstraksi. 2) Variabel pengacau tak terkendali : kondisi cuaca dan lingkungan pada tempat tumbuh tanaman. 2. Definisi operasional a. Ekstrak etanol buah buni adalah ekstrak kental yang diperoleh dari maserasi buah buni yang masih segar selama 24 jam dengan etanol 96% dan diremaserasi sebanyak dua kali selama 24 jam dengan pelarut yang sama lalu diuapkan menggunakan vacuum rotary evaporator hingga diperoleh pengurangan berat ekstrak yang tetap sebesar 0,01.


b. Metode DPPH adalah salah satu metode pengujian aktivitas antioksidan menggunakan radikal bebas DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl). Prinsip metode ini adalah penangkapan radikal bebas yang menyebabkan elektron bebas menjadi berpasangan dan mengakibatkan pemudaran warna ungu. c. Persen inhibitory concentration (%IC) adalah persen yang menyatakan kemampuan ekstrak etanol buah buni dalam menghambat radikal bebas dalam hal ini DPPH. d. Inhibitory concentration 50 (IC50) adalah konsentrasi ekstrak etanol buah buni yang dapat menghambat 50 % radikal bebas (DPPH). C. Bahan Penelitian Bahan yang digunakan adalah buah buni yang diambil dari taman Kampus III Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Aquadest dan etanol 96 % diperoleh dari CV. General Labora. Natrium karbonat p.a diperoleh dari laboratorium Universitas Gadjah Mada Yogyakarta. Bahan kimia kualitas pro analitik Sigma Chem. Co., USA berupa rutin, asam galat, reagen Folin-Ciocalteu, DPPH (2,2diphenyl-1-picrylhdrazyl). Reagen Mayer LP, Dragendroff LP, serbuk magnesium P, gelatin 1%, dan bahan kimia pro analitik E. Merck berupa metanol, asam asetat glasial, asam klorida 37%, kloroform, natrium hidroksida, besi (III) klorida, KOH, hidrogen peroksida, asam sulfat, benzena, ammonia yang diperoleh dari Laboratorium Farmakognosi-Fitokimia Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.


D. Alat Penelitian Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah : spektrofotometer UVVis (Shimadzu), vacuum rotary evaporator (buchi rotavapor), maserator/orbital shaker, corong Buchner, pompa vaccum, waterbath (Labo-tech, Haraeus), neraca analitik (Scaltec SBC 22, BP 160p), oven, vortex (Junke & Kunkel), micropipet 50 – 200 μl, micropipet 200 – 1000 μl, dan alat – alat gelas (Pyrex-Germany dan Iwaki). E. Tata Cara Penelitian 1. Determinasi tanaman Buah buni yang diteliti dideterminasi menurut pustaka acuan. Determinasi dilakukan di Laboratorium Kebun Tanaman Obat, Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta. Proses determinasi dilakukan dengan menggunakan bagian tanaman buni seperti daun, buah, dan bunga. 2. Pengambilan bahan buah buni Buah buni diperoleh dari taman Kampus III Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta. Cara pemanenan buah buni yang digunakan pada penelitian ini yaitu, diambil buah yang berwarna ungu kehitaman berbentuk bulat telur dengan permukaan kulit licin halus dan buah tidak jatuh ke tanah. Pemanenan buah buni dilakukan bulan Februari 2015 pada pagi hari pukul 09.00 WIB. 3. Pembuatan ekstrak Sebanyak 1000 g buah buni segar dicuci beberapa kali menggunakan air mengalir dan diangin-anginkan, kemudian direndam dengan etanol 96% setinggi kurang lebih dua sentimeter dari tinggi buah buni dan didiamkan dalam tempat


gelap selama 5 bulan, kemudian dilakukan maserasi selama 24 jam dengan etanol 96% dan diremaserasi sebanyak dua kali selama 24 jam dengan pelarut yang sama. Hasil maserasi dan remaserasi disaring kemudian filtrat yang diperoleh dipekatkan menggunakan vaccum rotary evaporator pada suhu 600C sehingga diperoleh ekstrak kental etanol buah buni. Hasil penguapan dari rotary evaporator diuapkan kembali di waterbath untuk menghilangkan seluruh pelarut yang masih terdapat di dalam ekstrak. Ekstrak kental ditimbang dan dihitung rendemen ekstrak kemudian disimpan dalam desikator. 4. Uji pendahuluan a. Uji fenolik Sebanyak 0,5 mL larutan uji dengan konsentrasi 11 mg/mL dan larutan pembanding asam galat dengan konsentrasi 150,0 µg/mL masing – masing dimasukkan ke dalam tabung reaksi, kemudian ditambah dengan 2,5 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan akuades dengan perbandingan 1:10 v/v dalam tabung reaksi. Campuran didiamkan selama 10 menit, lalu ditambah dengan 7,5 mL larutan natrium karbonat 1 M. Warna larutan diamati secara visual dengan mata. b. Uji aktivitas antioksidan Sebanyak 1,0 mL larutan DPPH dimasukkan ke dalam masing – masing tiga tabung reaksi, kemudian ke dalam masing – masing tabung reaksi ditambahkan 1,0 mL metanol p.a., larutan pembanding rutin 25 µg/mL, dan larutan uji 11 mg/mL. Campuran tersebut ditambah dengan 3 mL metanol p.a.,


lalu divortex selama 30 detik. Selama 30 menit, warna larutan tersebut diamati secara visual dengan mata. 5. Skrining fitokimia ekstrak etanol 96% buah buni a. Pembuatan larutan uji Pembuatan larutan uji untuk uji fitokimia dilakukan dengan cara melarutkan sebanyak 500 mg ekstrak etanol 96% buah buni dilarutkan dengan 50 mL etanol 96%, kemudian didapat larutan uji yang digunakan untuk skrining fitokimia. b. Uji saponin Sebanyak 0,05 g sampel dilarutkan dalam 10 mL akuades, kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Dikocok vertikal selama 30 detik kemudian dibiarkan selama 30 detik, diamati perubahan yang terjadi. Apabila terbentuk busa yang tetap maka identifikasi menunjukkan adanya saponin (Marliana et al., 2005). c. Uji flavonoid Sebanyak 3 mL larutan dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Kemudian ditambahkan serbuk Mg dan 5 tetes HCl pekat. Jika menghasilkan warna kuning, oranye, dan merah menandakan adanya flavonoid (Nafisah et al., 2014). d. Uji triterpenoid dan steroid Larutan uji sebanyak 2 mL diuapkan dalam cawan porselen. Residu dilarutkan dengan 0,5 mL kloroform, setelah itu ditambahkan dengan asam asetat anhidrat sebanyak 0,5 mL. Selanjutnya ditambahkan 2 mL asam sulfat


pekat melalui dinding tabung. Adanya triterpenoid ditandai dengan terbentuknya cincin kecoklatan atau violet pada perbatasan larutan, sedangkan adanya steroid ditandai dengan terbentuknya cincin biru kehijauan (Hayati dan Halimah, 2010). e. Uji minyak atsiri Larutan uji dipipet sebanyak 1 mL kemudian diuapkan diatas cawan porselen hingga diperoleh residu. Hasil positif minyak atsiri ditandai dengan bau khas yang dihasilkan oleh residu tersebut (Padmasari et al., 2013). f. Uji alkaloid Sebanyak 2 mL larutan uji diuapkan diatas cawan porselen. Residu yang terbentuk dilarutkan dengan 5 mL HCl 2 N. Larutan yang dihasilkan dibagi ke dalam 3 tabung reaksi. Tabung pertama berfungsi sebagai blanko yang ditambahkan dengan HCl, tabung kedua ditambahkan 3 tetes pereaksi Dragendorff dan tabung ketiga ditambahkan 3 tetes pereaksi Mayer. Hasil positif adanya alkaloid ditandai dengan terbentuknya endapan jingga pada tabung kedua dan endapan kuning pada tabung ketiga (Puspitasari et al., 2013). g. Uji tanin dan polifenol Sebanyak 3 mL larutan ekstrak uji dibagi ke dalam 3 bagian yaitu tabung A, tabung B, dan tabung C. Tabung A digunakan sebagai blanko, tabung B direaksikan dengan larutan besi (III) klorida 10%, warna biru tua atau hitam kehijauan menunjukkan adanya tannin dan polifenol, sedangkan pada tabung C hanya ditambahkan gelatin 1%. Apabila terbentuk endapan


pada tabung C maka larutan ekstrak positif mengandung tannin (Marliana et al., 2005). h. Uji antosianin Sebanyak 10 mL larutan uji ditambahkan HCl 2 M kemudian dipanaskan 1000C selama 5 menit. Hasil positif bila timbul warna merah. Juga ditambahkan NaOH 2M tetes demi tetes sambil diamati perubahan warna yang terjadi. Hasil positif bila timbul warna hijau biru yang memudar perlahan – lahan (Putri dan Gunawan, 2015). i. Uji antrakuinon Uji Brontrager dilakukan dengan cara mengambil 0,05 gekstrak dan dilarutkan dengan 10 mL akuades kemudian disaring, filtrat diekstrak dengan 5 mL benzena. Hasil ekstrak dibagi menjadi 2 bagian, A dan B. Filtrat A digunakan sebagai blanko dan filtrat B ditambahkan 5 mL amonia kemudian dikocok, bila terdapat warna merah berarti hasil positif (Marliana et al., 2005). Uji Brontrager termodifikasi dilakukan dengan melarutkan 0,05 g sampel dengan 10 mL 0,5 N KOH dan 1 mL larutan hidrogen peroksida. Kemudian dipanaskan pada waterbath selama 10 menit, didinginkan dan disaring. Pada filtratnya ditambahkan asam asetat bertetes – tetes sampai pada kertas lakmus menunjukkan asam. Selanjutnya diekstrak dengan 5 mL benzena. Hasil ekstrak dibagi menjadi 2 bagian, A dan B. Larutan A digunakan sebagai blanko, sedangkan larutan B dibuat basa dengan 2 – 5 mL larutan amonia. Perubahan warna pada lapisan basa diamati. Warna merah atau merah muda menunjukkan adanya antrakuinon


6. Penentuan kandungan fenolat total a. Pembuatan larutan asam galat Asam galat ditimbang sebanyak 25 mg, kemudian dimasukkan ke dalam gelas Beker dan dilarutkan dengan aquades : metanol p.a (1:1). Larutan dimasukkan ke dalam labu takar 50 mL, tambahkan akuades : metanol p.a (1:1) sampai batas tanda. Larutan tersebut diambil sebanyak 0,5; 0,75 ; 1 ; 1,25 dan 1,5 mL, masukkan ke dalam labu takar 10 mL dan tambahkan aquades : metanol p.a (1:1) sampai batas tanda, sehingga diperoleh konsentrasi larutan baku asam galat sebesar 50; 75; 100; 125; dan 150 μg / mL. b. Pembuatan larutan uji untuk penentuan kandungan fenolik total Ekstrak etanol buah buni ditimbang sebanyak 250 mg, larutkan menggunakan metanol p.a dalam gelas beker. Kemudian masukkan ke dalam labu takar 10 mL dan ditambahkan metanol p.a hingga batas tanda. Larutan intermediet dibuat dengan mengambil 3,6 mL dari larutan stok, masukkan ke dalam labu takar 10 mL dan ditambahkan metanol p.a hingga batas tanda. Sejumlah 2,5 mL larutan intermediet diambil, masukkan ke dalam labu takar 10 mL dan ditambahkan metanol p.a hingga batas tanda. Konsentrasi larutan uji sebesar 4500,0 μg / mL. c. Penentuan operating time Larutan asam galat dengan konsentrasi 50; 100; dan 150 μg/mL diambil sebanyak 0,5 mL. Reagen Folin-Ciocalteu ditambahkan sebanyak


2,0 mL pada masing – masing larutan. Selanjutnya, ditambahkan dengan 4,0 mL natrium karbonat 1 M. Baca absorbansi larutan setiap 5 menit dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 760 nm selama 60 menit. d. Penentuan panjang gelombang maksimum Larutan asam galat dengan konsentrasi 50; 100; dan 150 μg/mL diambil sebanyak 0,5 mL. Reagen Folin-Ciocalteu ditambahkan sebanyak 2 mL pada masing – masing larutan. Selanjutnya, ditambahkan dengan 4,0 mL natrium karbonat 1 M. Diamkan selama operating time yang telah didapat, kemudian dilakukan scanning panjang gelombang maksimum dengan spektrofotometer visibel dengan panjang gelombang 600-800 nm. e. Pembuatan kurva baku asam galat Larutan asam galat dengan konsentrasi 50; 75; 100; 125; dan 150 μg/mL diambil sebanyak 0,5 mL. Reagen Folin-Ciocalteu ditambahkan sebanyak 2 mL.Selanjutnya, ditambahkan dengan 4,0 mL natrium karbonat 1 M, diamkan selama operating time yang telah didapat. Baca absorbansinya pada panjang gelombang maksimum yang telah diperoleh. Lakukan replikasi sebanyak 3 kali. f. Estimasi kandungan fenolik total larutan uji Larutan uji dengan konsentrasi 4500,0 μg/mL diambil sebanyak 0,5 mL. Reagen Folin-Ciocalteu ditambahkan sebanyak 2mL. Selanjutnya, ditambahkan dengan 4,0 mL natrium karbonat 1 M, diamkan selama operating time yang telah didapat. Baca absorbansinya pada panjang gelombang maksimum yang telah diperoleh.


7. Penentuan aktivitas antioksidan a. Pembuatan larutan DPPH Sejumlah DPPH ditimbang sebanyak 5 mg dan dilarutkan dengan metanol p.a. di dalam labu ukur 50 mL sehingga diperoleh larutan stok dengan konsentrasi 100

. Diambil sebanyak 5 mL larutan stok

DPPH kemudian ditambahkan metanol p.a sampai 25,0 mL. Larutan ditutup dengan alumunium foil dan harus selalu dibuat baru. b. Pembuatan larutan stok rutin Sejumlah 5 mg rutin dilarutkan dalam metanol p.a sampai 50,0 mL. c. Pembuatan larutan standar rutin Kemudian diambil sebanyak 3,0 ; 4,0 ; 5,0; 6,0; dan 7,0 mL larutan stok, lalu ditambahkan metanol p.a sampai 10,0 mL, sehingga diperoleh konsentrasi larutan standar rutin sebesar 30; 40; 50; 60; dan 70 µg/mL. d. Pembuatan larutan uji Sejumlah 250,0 mg ekstrak etanol buah buni ditimbang kemudian ditambahkan metanol p.a sampai 10,0 mL. Dari larutan tersebut diambil sebanyak 2,0 mL untuk ditambahkan dengan metanol p.a sampai 10,0 mL, menjadi larutan intermediet. Kemudian diambil 0,6; 1,0; 1,4; 1,8; dan 2,2 mL sehingga diperoleh konsentrasi larutan uji sebesar 600; 1000; 1400; 1800; 2200 µg/mL.


e. Pembuatan larutan kontrol Larutan yang digunakan adalah 0,2 mL metanol p.a dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan 3,8 mL DPPH, divortex selama 30 detik. Didiamkan selama 30 menit (Reaction Time). f. Penentuan operating time (OT) Digunakan 3 konsentrasi rutin (5, 15, 25 µg/mL). Sebanyak 3,8 mL larutan DPPH dimasukkan ke dalam tabung reaksi tertutup kemudian ditambah dengan 0,2 mL larutan standar rutin. Campuran larutan tadi kemudian divortex selama 30 detik. Larutan dibaca absorbansinya dengan spektrofotometer visible pada panjang gelombang maksimal 517 nm setiap 5 menit selama 60 menit sampai diketahui terjadi penurunan absorbansi secara nyata. g. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum Larutan DPPH yang telah dibuat dengan konsentrasi 20, 30, 40 µg/mL ditentukan spektrum serapannya menggunakan spektrofotometer UV pada panjang gelombang 400 nm hingga 700 nm. Dan ditentukan panjang gelombang optimumnya. h. Penentuan aktivitas antioksidan Dari masing – masing larutan uji dipipet 0,2 mL dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Ditambahkan 3,8 mL DPPH 20 µg/mL, divortex selama 30 detik, kemudian didiamkan selama 30 menit (Operating Time) dan diukur serapannya pada panjang gelombang 516 nm. Dilakukan


pengujian yang sama untuk pembanding rutin. Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali. i. Estimasi aktivitas antioksidan Hasil dari prosedur, dihitung nilai %IC dan IC50 untuk rutin dan ekstrak etanol buah buni. F. Analisis Data Kandungan fenolik total ekstrak etanol buah buni dinyatakan sebagai mg ekivalen asam galat (GAE) per g ekstrak etanol buah buni. Nilai absorbansi larutan uji yang telah didapatkan dimasukkan ke dalam persamaan kurva persamaan regresi linear asam galat, sehingga diperoleh nilai ekivalensi larutanuji terhadap asam galat. Kandungan fenolik total diperoleh berdasarkan rumus : Konsentrasi ekstrak etanol buah buni x

Aktivitas penghambatan radikal bebas DPPH (%IC) dihitung dengan menggunakan rumus :

x 100 %

%IC=

Setelah didapatkan presentase inhibisi dari masing – masing konsentrasi, kemudian ditentukan persamaan y = a + bx dengan perhitungan secara regresi linear dimana x adalah konsentrasi (µg/mL) dan y adalah presentase inhibisi (%). Aktivitas antioksidan dinyatakan dengan Inhibition Concentration 50 % (IC50) yaitu konsentrasi sampel yang dapat menghambat radikal.


BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN A. Hasil Determinasi Tanaman Determinasi tanaman dilakukan di Laboratorium Kebun Tanaman Obat, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma yang diidentifikasi menurut acuan Flora untuk Sekolah di Indonesia (1992). Determinasi tumbuhan ini bertujuan untuk memastikan bahwa tanaman yang digunakan benar Antidesma bunius (L.) Spreng. Bagian tanaman yang digunakan untuk determinasi adalah daun, batang, bunga dan buah. Determinasi dilakukan sampai kategori spesies, hasil determinasi menunjukkan bahwa buah buni yang digunakan dalam penelitian ini memiliki nama ilmiah Antidesma bunius (L.) Spreng (Lampiran 1) dengan warna kulit buah ketika masih muda hijau, ketika hampir matang berwarna merah, dan ketika matang berwarna ungu kehitaman dengan permukaan kulit yang licin dan halus. B. Hasil Pengumpulan Bahan Buah buni yang digunakan pada penelitian ini berasal dari taman Kampus III Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta tepatnya di depan laboratorium Farmasetika Dasar. Bahan berupa buah buni hanya berasal dari satu pohon di satu tempat, hal tersebut bertujuan agar tidak terjadi variasi kandungan senyawa pada tanaman yang dapat disebabkan oleh adanya perbedaan kondisi tanah, lingkungan, dan unsur hara dari tempat tanaman berasal (Rahardjo et al., 2006).


Gambar 5. Buah buni (Dokumentasi pribadi, 2015). Buah buni yang digunakan berwarna ungu kehitaman karena diharapkan mengandung sejumlah senyawa kimia fenolik dengan jumlah maksimal. Pemanenan dilakukan di pagi hari agar metabolit sekunder yang terkandung dalam buah buni belum mengalami fotosintesis sehingga kadar metabolit sekundernya tidak berkurang karena menurut Pallipane dan Rolle (2008) pemanenan paling baik dilakukan pada kondisi tersejuk, yaitu pagi hari atau malam hari ketika aktivitas fisiologi tanaman rendah. C. Hasil Preparasi Sampel Sampel yang digunakan dalam preparasi sampel berupa buah buni yang masih segar. Menurut Markham (1988), alasan digunakan buah buni yang masih segar adalah untuk menjaga kestabilan senyawa flavonoid dalam sampel, karena bahan tumbuhan yang telah dikeringkan mempunyai kecenderungan adanya perubahan susunan senyawa flavonoid berupa glikosida menjadi aglikonnya yang disebabkan karena pengaruh fungi dan aglikon yang peka menjadi teroksidasi. Perendaman dilakukan selama 5 bulan, menurut Cooper-Driver dan Balick (1978), senyawa fenolik masih dapat terdeteksi didalam etanol 95 % yang


digunakan untuk merendam bahan segar selama 1 bulan. Metode ekstraksi yang dipilih adalah maserasi dengan bantuan shaker. Maserasi dipilih karena menurut Williamson et al., (1996) maserasi tidak menggunakan pemanasan sehingga tidak terjadi dekomposisi senyawa kimia yang terkandung didalamnya. Dekomposisi senyawa kimia terjadi karena oksidasi senyawa fenolik, sehingga dapat menyebabkan penurunan senyawa fenolik (Dai dan Mumper 2010). Pada penelitian ini etanol dipilih karena merupakan pelarut polar, sehingga diharapkan dapat menarik senyawa yang bersifat polar. Dasar pemilihan pelarut yang lain yaitu, kemudahan penggunaan, efisiensi, selektivitas dan penerapan yang luas (Dai dan Mumper, 2010). Menurut Schirmer (1990), etanol memiliki indeks polaritas 5,2, sehingga dapat menarik senyawa senyawa fenolik yang cenderung polar, seperti teori like dissolve like menurut Wagner (2013), dimana senyawa yang bersifat polar cenderung akan menarik senyawa yang bersifat polar juga, dan sebaliknya. Selain itu kelebihan dari etanol adalah tidak berbahaya bagi lingkungan, dan dapat mencegah pertumbuhan kapang pada konsentrasi lebih dari 20%. Hasil ekstrak kental yang didapat memiliki bobot 138,41 gram dari 1000 gram buah segar yang digunakan. Dari hasil perhitungan rendemen yang diperoleh adalah 13,841 %. D. Uji Pendahuluan Ekstrak Etanol Buah Buni 1. Uji pendahuluan keberadaan senyawa fenolik Uji pendahuluan senyawa fenolik bertujuan untuk mengetahui keberadaan senyawa fenolik pada ekstrak etanol buah buni. Uji kualitatif ini menggunakan reagen Folin-Ciocalteu yang terdiri dari asam fosfomolibdat dan asam


fosfotungstad (Nunes, et al., 2012). Prinsip uji kualitatif ini adalah reaksi oksidasi-reduksi dalam suasana basa menggunakan reagen Folin-ciocalteu dan natrium karbonat. Senyawa fenolik akan berubah menjadi ion fenolat dalam suasana basa. Ion fenolat yang terbentuk akan mereduksi asam fosfomolibdatfosfotungstat dalam reagen Folin-Ciocalteu selama proses oksidasi fenol menjadi senyawa kompleks molybdenum-tungsten berwarna biru (Haciet al., 2009). Perubahan menjadi warna biru inilah yang digunakan sebagai indikator keberadaan senyawa fenolik dalam sampel. Uji pendahuluan senyawa fenolik menggunakan kontrol positif dan kontrol negatif. Kontrol positif yang digunakan yaitu reagen Folin-Ciocalteu yang direaksikan dengan asam galat dan natrium karbonat untuk menunjukkan warna larutan jika hasilnya positif (Gambar 6). Kontrol negatif yang digunakan yaitu reagen Folin-Ciocalteu, metanol : air (1:1) dan natrium karbonat untuk menunjukkan jika hasilnya negatif.

Gambar 6. Hasil uji kualitatif senyawa fenolik pada ekstrak etanol buah buni [A = kontrol positif (asam galat + reagen Folin-Cioucalteu + natrium karbonat)] ; B = sampel [larutan uji ekstrak etanol buah buni + reagen Folin-Ciocalteu + natrium karbonat] ; C = kontrol negatif [air : metanol (1:1) + reagen FolinCiocalteu + natrium karbonat]


Hasil dari uji kualitatif ekstrak etanol buah buni (Gambar 6) menunjukkan perubahan warna menjadi biru, sama seperti kontrol positif. Hal ini berarti dalam ekstrak etanol buah buni mengandung senyawa – senyawa fenolik. Warna yang dihasilkan oleh sampel yang direaksikan dengan pereaksi Folin dan natrium karbonat tidak sepekat pada kontrol positif karena kandungan fenolik dalam sampel rendah. Semakin tinggi kandungan fenolik dalam sampel maka intensitas warna biru juga semakin meningkat. Asam galat digunakan sebagai senyawa pembanding karena merupakan salah satu asam fenolik yang banyak terdapat dalam tanaman, dan sering digunakan untuk mendeterminasi kandungan fenol dalam tanaman melalui uji Folin-Ciocalteu (Fiuza et al., 2004) 2. Uji pendahuluan keberadaan senyawa antioksidan Tujuan dilakukannya uji pendahuluan antioksidan pada ekstrak etanol buah buni adalah untuk mengetahui aktivitas antioksidan secara kualitatif. Prinsip uji ini adalah reaksi antara ekstrak etanol buah buni dengan DPPH (2,2-difenil-1pikirihidrazil). Senyawa antioksidan yang terdapat dalam ekstrak etanol buah buni akan bereaksi dengan radikal bebas DPPH. Senyawa antioksidan akan mengikat elektron bebas dari senyawa radikal. Keberadaan senyawa antioksidan inilah yang dapat mengubah warna larutan DPPH dari warna ungu menjadi kuning (Dehpour et al., 2009). Uji pendahuluan aktivitas antioksidan menggunakan kontrol positif dan kontrol negatif. Kontrol positif yang digunakan adalah DPPH yang direaksikan dengan rutin. Rutin digunakan sebagai senyawa pembanding karena merupakan jenis flavonoid yang paling sering dijumpai pada pemeriksaan flavonoid yang


banyak terdapat dalam tumbuhan dan tersebar luas dalam pigmen tanaman. Rutin juga telah terbukti mempunyai aktivitas antioksidan terhadap radikal bebas (Mu’awwanah dan Ulfah, 2015). Kontrol negatif yang digunakan adalah DPPH.

Gambar 7. Hasil uji kualitatif aktivitas antioksidan pada ekstrak etanol buah buni [A = kontrol negatif (larutan DPPH) ; B = kontrol positif (larutan DPPH + rutin) ; C = sampel (larutan DPPH + larutan uji ekstrak etanol buah buni) Hasil dari uji kualitatif ekstrak etanol buah buni (Gambar 7) menunjukkan perubahan warna menjadi ungu menjadi kuning, sama seperti kontrol positif. Hal ini berarti dalam ekstrak etanol buah buni mengandung senyawa – senyawa yang mempunyai aktivitas antioksidan. E. Hasil Uji Skrining Fitokimia Ekstrak Etanol 96% Buah Buni Tujuan utama skrining fitokimia adalah untuk mengidentifikasi senyawa bioaktif atau senyawa yang mempunyai aktivitas yang menguntungkan, yaitu sebagai antioksidan. Skrining fitokimia ini menggunakan uji tabung yaitu dengan mereaksikan bahan tanaman dengan larutan atau pereaksi tertentu menggunakan tabung reaksi, sehingga diperoleh hasil yang mengarah ke kandungan senyawa aktif dari bahan tanaman tersebut.


No 1. 2. 3. 4.

5.

6. 7.

8.

Tabel I. Hasil pengamatan uji tabung terhadap ekstrak etanol buah buni Uji Tabung Pereaksi Hasil Keterangan Tidak terbentuk Uji saponin Akuades buih Uji flavonoid Mg dan HCl + Merah Terbentuk cincin Uji triterpenoid Liebermanncoklat, positif + dan steroid Burchard mengandung triterpenoid Uji minyak atsiri + Berbau khas Tidak terdapat endapan berwarna Dragendroff coklat muda sampai kuning Uji alkaloid Tidak terdapat Mayer endapan berwarna putih Hijau kehitaman, Gelatin 1% + Uji tannin dan ada endapan polifenol FeCl3 + Hijau kehitaman HCl + Hijau Uji antosianin NaOH + Merah Tidak berwarna Brontrager merah Uji antrakuinon Brontrager Tidak berwarna termodifikasi merah

Keterangan : - = negatif ; + = positif Uji tabung meliputi uji alkaloid, antrakuinon, saponin, flavonoid, triterpenoid dan steroid, antosianin, minyak atsiri, tanin dan polifenol. Salah satu indikator terjadinya reaksi pada uji tabung adalah perubahan warna. Berdasarkan hasil penelitian diduga bahwa ekstrak etanol buah buni mengandung minyak atsiri, tanin dan polifenol, flavonoid, antosianin, fenolik, dan triterpenoid sebagaimana dalam tabel I.


a. Uji saponin Uji saponin dilakukan dengan menggojog kuat ekstrak dengan akuades selama 30 detik hingga terbentuk buih setinggi 10 cm. Buih yang terbentuk ini akan tahan dalam jangka waktu yang lama, tidak akan hilang selama 30 detik. Saponin pada umumnya berada dalam bentuk glikosida, sehingga mempunyai kemampuan membentuk buih dalam air (Marliana et al., 2005). Saponin merupakan senyawa aktif permukaan yang dapat menimbulkan busa jika dikocok dengan air. Hal ini karena saponin memiliki gugus polar dan non polar yang akan membentuk misel. Apabila misel terbentuk maka gugus polar akan menghadap keluar yang akan berikatan dengan air dan gugus non polar akan menghadap kedalam menjauhi air yang tampak seperti busa (Padmasari et al., 2013), akibatnya terjadi penurunan tegangan permukaan air yang dapat menimbulkan buih. Hasil penelitian sesuai dengan penelitian sebelumnya yang dilakukan oleh Rakasiwi dan Soegihardjo (2014), yaitu ekstrak etanol buah buni tidak mengandung saponin karena tidak terbentuk buih pada saat pengocokan. b. Uji flavonoid Untuk mengetahui kandungan flavonoid pada ekstrak uji digunakan uji Shinoda test, yaitu menggunakan larutan HCl pekat dan serbuk Mg yang menghasilkan warna kuning, oranye, atau merah jika dinyatakan positif. Mg(s) + 2HCl(l) MgCl2(aq) + H2(g) MgCl2(aq) + 6ArOH(s) [Mg(OAr)6]-4(aq) + 6H+ + 2ClGambar 8. Reaksi flavonoid pada ekstrak etanol buah buni berdasarkan uji Shinoda(Nafisah et al., 2014)


Menurut Rakasiwi dan Soegihardjo (2014), ekstrak etanol buah buni mengandung senyawa flavonoid. Hasil penelitian yang dilakukan sesuai dengan penelitian sebelumnya yaitu timbul warna merah pada ekstrak etanol buah buni yang direaksikan dengan HCl dan Mg, hal ini menunjukkan bahwa ekstrak positif mengandung flavonoid. c. Uji triterpenoid dan steroid Pada pengujian steroid dan triterpenoid, analisis senyawa didasarkan pada kemampuan senyawa tersebut membentuk warna dengan H2SO4 pekat dalam pelarut asam asetat anhidrat (Sangi et al., 2008). Pereaksi Lieberman-Burchard yang terdiri dari campuran asam asetat anhidrat, asam sulfat pekat dan kloroform. Hasil positif ditunjukkan dengan adanya cincin coklat atau violet untuk triterpenoid, sedangkan untuk hasil positif steroid ditunjukkan dengan adanya cincin biru kehijauan.

Gambar 9. Mekanisme umum reaksi Liebermann-Burchard (Nafisah, et al., 2014).


Menurut Rakasiwi dan Soegihardjo (2014), ekstrak etanol buah buni mengandung senyawa triterpenoid. Hasil penelitian sesuai dengan penelitian sebelumnya yaitu ekstrak etanol buah buni positif mengandung triterpenoid ditandai dengan terbentuknya cicin berwarna coklat. d. Uji minyak atsiri Minyak atsiri dapat dihasilkan dari berbagai tanaman (Kardinan, 2005). Telah diketahui bahwa bunga, buah batang, dan akar rempah – rempah mengandung bahan yang mudah menguap serta berbau khas yang dikenal dengan minyak atsiri (Fachriyah dan Sumardi, 2007). Minyak atsiri didefinisikan sebagai sebagai campuran kimiawi yang terdapat pada berbagai tumbuhan dan mempunyai sifat mudah menguap. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak etanol buah buni mengandung minyak atsiri karena menimbulkan bau khas setelah larutan ekstrak uji diuapkan. Hasil positif ini diperkuat dengan penelitian sebelumnya yang dilakukan oleh Rakasiwi dan Soegihardjo (2014) bahwa ekstrak etanol buah buni mengandung senyawa triterpenoid, sedangkan triterpenoid merupakan komponen penyusun minyak atsiri. e. Uji alkaloid Pada uji ini larutan ekstrak uji yang telah diuapkan kemudian ditambahkan asam klorida. Penambahan asam klorida bertujuan untuk mengubah alkaloid yang bersifat basa menjadi garam alkaloid, agar bisa larut dalam air. Alkaloid merupakan senyawa yang mengandung atom N dan sebagian besar bersifat basa. Tujuan dari pemanasan adalah mempercepat pembentukan garam alkaloid. Setelah dingin, larutan kemudian dimasukkan kedalam 2 tabung reaksi dan


direaksikan dengan pereaksi Dragendroff dan Mayer masing – masing sebanyak 3 tetes. Reaksi positif jika terbentuk endapan berwarna coklat muda sampai kuning pada penambahan Dragendroff dan endapan berwarna putih pada penambahan Mayer (Marliana et al., 2005). Menurut Rakasiwi dan Soegihardjo (2014), ekstrak etanol buah buni tidak mengandung alkaloid. Hasil penelitian yang didapatkan sesuai dengan penelitian sebelumnya yaitu negatif dengan ditandai tidak adanya endapan dari kedua tabung sampel. f. Uji tanin dan polifenol Pada uji tanin diperoleh hasil positif yaitu berwarna hijau dan terbentuk endapan, adanya tanin akan mengendapkan protein pada gelatin. Tanin akan bereaksi dengan gelatin membentuk kopolimer mantap yang tidak larut dalam air (Marliana et al., 2005). Uji tanin juga dilakukan dengan menggunakan pereaksi besi (III) klorida untuk menentukan apakah sampel mengandung gugus polifenol atau tidak. Salah satu senyawa polifenol adalah tanin. Adanya gugus fenol ditunjukkan dengan perubahan warna sampel menjadi hijau kehitaman atau biru tua setelah penambahan besi (III) klorida. Terjadinya pembentukan warna ini karena terbentuknya senyawa kompleks antara logam Fe dan tanin. FeCl3(aq) + 6ArOH(s) 6H+ + 3Cl- + [Fe(OAr)6]3-(aq) Gambar 10. Reaksi antara flavonoid dengan FeCl3 (Nafisah et al., 2014). Menurut Rakasiwi dan Soegihardjo (2014), ekstrak etanol buah buni mengandung senyawa tanin. Hasil positif ditunjukkan pada penelitian ini adalah adanya perubahan warna ekstrak menjadi hijau kehitaman, hal ini sesuai dengan


penelitian sebelumnya bahwa ekstrak etanol buah buni mengandung senyawa tanin yang tergolong sebagai tanin kondensasi (Sangi et al., 2008). g. Uji antosianin Salah satu faktor yang mempengaruhi warna dari antosianin adalah perubahan pH. Sifat asam akan menyebabkan warna antosinin menjadi merah, sedangkan sifat basa menyebabkan antosianin menjadi biru. Dalam penelitian ini digunakan asam kuat (HCl) dan basa kuat (NaOH). Penambahan asam kuat akan mengubah pH antosinin menjadi lebih asam, sedangkan penambahan basa akan mengubah pH antosinin menjadi basa (Putri et al., 2015). Menurut Maulida dan Guntarti (2015), pada pH asam antosianin akan berada pada bentuk ion flavilium yang berwarna merah dan berganti warna biruhijau pada keadaan basa. Warna biru-hijau disebabkan karena antosianin banyak berada dalam bentuk ion anhidro basa.

Gambar 11. Perubahan struktur antosianin pada pH yang berbeda (Maulida dan Guntarti 2015). Saat larutan sampel ditambahkan dengan HCl terjadi perubahan warna menjadi merah, dan ketika larutan sampel ditambahkan NaOH terjadi perubahan warna menjadi biru sehingga dapat disimpulkan bahwa sampel mengandung antosianin.


h. Uji antrakuinon Uji Brontrager dan uji Brontrager termodifikasi bisa mendeteksi adanya antrakuinon, antrakuinon akan memberikan karakteristik warna merah, violet, hijau atau ungu dengan basa (Marliana et al., 2005). Uji Brontrager bisa mendeteksi senyawa antrakuinon, namun uji ini akan menunjukkan negatif untuk glikosida antrakuinon yang sangat stabil atau turunan tereduksi dari tipe antranol. Oleh karena itu uji Brontrager dimodifikasi dengan melakukan uji Brontrager sebelumnya untuk menghidrolisis dan mengoksidasi senyawa antrakuinon. Tidak terjadinya perubahan warna pada uji Brontrager menunjukkan tidak adanya antrakuinon pada ekstrak antrakuinon karena antrakuinon yang terdapat dalam ekstrak kemungkinan sangat stabil atau turunan tereduksi dari tipe antranol sehingga menyebabkan hasil negatif. F. Hasil Optimasi Metode Uji Fenolik Total 1. Penentuan operating time Penentuan operating time bertujuan untuk mendapatkan waktu dimana reaksi antara sampel dan pereaksi berada pada kondisi optimum. Reaksi yang optimum ditunjukkan dengan nilai absorbansi yang relatif stabil. Pada awal reaksi, absorbansi senyawa yang berwarna akan terus meningkat hingga pada waktu tertentu akan diperoleh absorbansi yang stabil. Tetapi, semakin lama waktu pengukuran, ada kemungkinan senyawa berwarna tersebut akan mengalami kerusakan

sehingga

menyebabkan

intensitas

warnanya

menurun

dan

absorbansinya juga menurun (Gandjar dan Rohman, 2007). Penentuan OT dilakukan menggunakan asam galat sebagai senyawa pembanding. Asam galat digunakan sebagai standar karena asam galat adalah


salah satu senyawa fenolik dan memiliki aktivitas antioksidan (Fiuza et al., 2004). Penentuan OT ini dilakukan dengan mereaksikan senyawa baku asam galat dan reagen Folin-Ciocalteu. Hasil reaksi antara senyawa fenolik dengan pereaksi Folin-Ciocalteu akan membentuk kompleks berwarna biru sehingga warna larutan menjadi biru yang selanjutnya diukur dengan spektrofotometer visibel. Reaksi dianggap optimal apabila absorbansi dari tiap selang waktu yang diukur telah stabil. Absorbansi yang stabil terlihat dari makin kecilnya selisih absorbansi antar selang waktu. Pengukuran OT dilakukan selama satu jam dengan waktu pengamatan setiap 5 menit sekali. Penentuan OT dilakukan pada 3 konsentrasi yang berbeda. Setiap konsentrasi memberikan nilai absorbansi yang berbeda pada panjang gelombang maksimum teoritis, sehingga ketiga konsentrasi tersebut akan mempresentasikan OT pada masing – masing konsentrasinya. Konsentrasi yang digunakan yaitu 50 μg/mL, 100 μg/mL, dan 150 μg/mL. Operating time dilakukan menggunakan panjang gelombang teoritis. Panjang gelombang teoritis yang digunakan untuk menentukan operating time dari reaksi penentuan fenolik total adalah 760 nm (Blainski et al., 2013).


Absorbansi

47

0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0

50 µg/mL 100 µg/mL 150 µg/mL

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 Waktu (menit)

Gambar 12. Grafik penentuan operating time asam galat Dari grafik (Gambar 12) terlihat pada menit ke 30 nilai absorbansi yang didapat telah stabil, berarti reaksi sudah berjalan sempurna. Sehingga dapat disimpulkan OT untuk pengukuran asam galat adalah 30 menit. 2. Penentuan panjang gelombang maksimum Penentuan panjang gelombang maksimum dilakukan untuk mendapatkan panjang gelombang serapan maksimum dari hasil reaksi antara asam galat dengan reagen Folin-Cioucalteu yang akan digunakan untuk pengukuran absorbansi pengujian kandungan fenolik total sampel. Pembacaan panjang gelombang dilakukan dengan mereaksikan asam galat dan pereaksi Folin-Ciocalteu dan didiamkan selama 30 menit. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum sangat penting dalam sensitifitas suatu analisis dengan menggunakan spektrofotometer. Hal ini dikarenakan pada panjang gelombang maksimum kepekaannya tinggi, sehingga perubahan absorbansi untuk setiap satuan konsentrasi adalah yang paling besar (Gandjar dan Rohman, 2007).


Penentuan panjang gelombang

maksimum

dilakukan pada

3

konsentrasi yang berbeda, yaitu konsentrasi tinggi, tengah, dan rendah. Setiap konsentrasi akan memberikan nilai absorbansi yang berbeda pada panjang gelombang maksimum, sehingga ketiga konsentrasi larutan asam galat, yaitu yaitu 50 μg/mL, 100 μg/mL, dan 150 μg/mL. Penggunaan

tiga

konsentrasi

tersebut

diharapkan

akan

mempresentasikan panjang gelombang maksimum pada masing – masing konsentrasinya. Scanning panjang gelombang maksimum dilakukan pada rentang panjang gelombang 600 nm – 800 nm, dimana menurut Blainskiet al. (2013) panjang gelombang serapan maksimum untuk pereaksi Folin-Ciocalteu yang direaksikan dengan senyawa fenolik adalah 760 nm. Tabel II. Hasil scanning panjang gelombang serapan maksimum asam galat yang direaksikan dengan pereaksi Folin-Ciocalteu Konsentrasi larutan asam galat 50 100 150 µg/mL

λ maksimum hasil scanning (nm) 750 746 740

λ maksimum yang digunakan 745

Dari hasil scanning pada tiga seri konsentrasi asam galat pada tabel, didapatkan rata – rata panjang gelombang maksimum sebesar 745 nm. Panjang gelombang tersebut yang digunakan untuk pengukuran absorbansi kurva baku asam galat dan pengujian kandungan fenolik total sampel. G. Penetapan Kandungan Fenolik Total Potensi senyawa fenolik sebagai antioksidan disebabkan oleh keberadaan gugus hidroksil dalam senyawa fenol. Gugus hidroksil berfungsi


sebagai penyumbang atom hidrogen ketika bereaksi dengan senyawa radikal melalui mekanisme transfer elektron sehingga proses oksidasi dapat terhambat. Menurut Haci et al., (2009), prinsip reaksi pada metode Folin Ciocalteu adalah ion fenolat akan mereduksi asam fosfomolibdat-fosfotungstat dalam reagen Folin-Ciocalteu dalam suasana basa selama proses oksidasi fenol menjadi senyawa kompleks molybdenum-tungsten berwarna biru.Ion fenolat dibentuk melalui disosiasi proton dalam suasana basa yang didapatkan dari suatu senyawa alkali. Senyawa alkali yang digunakan adalah natrium karbonat. Semakin besar konsentrasi senyawa fenolik maka ion fenolat yang terbentuk pun semakin banyak, sehingga semakin banyak ion fenolat yang mereduksi fosfomolibdat dan fosfotungstat yang menyebabkan warna biru yang terbentuk semakin pekat, hal ini menyebabkan absorbansi yang terukur pun akan semakin besar. Kandungan fenolik total dalam ekstrak etanol buah buni yang diperoleh ditetapkan sebagai massa ekivalen asam galat. Asam galat digunakan sebagai sebagai senyawa pembanding karena asam galat merupakan asam heteropoli yang mempunyai 3 gugus hidroksi fenolat. Gugus hidroksi fenolat tersebut yang akan dioksidasi oleh reagen Folin-Ciocalteu dalam suasana basa. Reagen Folin-Ciocalteu akan mengoksidasi asam galat pada gugus hidroksi fenolatnya membentuk kompleks molybdenum-tungsten yang memiliki warna biru (Alfian dan Susanti, 2012). Pada saat reaksi berlangsung terjadi reduksi ion molybdenum (Mo6+) menjadi Mo5+ yang menyebabkan perubahan warna larutan kuning menjadi biru (Prior, 2005).


Gambar 13. Reaksi asam galat dengan senyawa molybdenum dari reagen Folin-Ciocalteu (Nunes, et al., 2012) Pembuatan kurva baku ini dilakukan sebanyak tiga kali replikasi. Kurva baku ini menghasilkan suatu persamaan regresi linier yang digunakan dalam menentukan jumlah kandungan fenolik total dalam sampel. Tidak semua persamaan regresi linier digunakan dalam menentukan kandungan fenolik total. Menurut Gandjar dan Rohman (2007) persamaan regresi dengan linieritas terbaik yaitu jika nilai r mendekati 1. Persamaan regresi linear terbaik akan digunakan untuk menentukan kandungan fenolik total. Tabel III menunjukkan hasil pengukuran absorbansi kurva baku asam galat.


Tabel III. Hasil pengukuran absorbansi asam galat yang telah direaksikan dengan reagen Folin-Ciocalteu pada λ 745 nm Replikasi

Konsentrasi (µg/mL) 50 75 100 125 150 50 75 100 125 150 50 75 100 125 150

1

2

3

Absorbansi

Persamaan regresi linear

0,268 0.344 0,498 0,622 0,749 0,239 0,369 0,475 0,585 0,724 0,232 0,360 0,482 0,587 0,717

y = 0,0050x + 0,0002 r = 0,9961

y = 0,0047x + 0,0040 r = 0,9989

y = 0,0048x – 0,0032 r = 0,9995

0,8 0,7 Absorbansi

0,6 0,5

y = 0.0048x - 0.0032 r = 0.9995

0,4 0,3 0,2 0,1 0 0

50

100 150 Konsentrasi μg/mL

200

Gambar 14. Kuva baku asam galat dalam penetapan fenolik total (Replikasi 3)

Persamaan yang digunakan dalam menentukan kandungan fenolik total adalah persamaan regresi dari replikasi ketiga, yaitu y = 0,0048x - 0,0032 dengan linieritas sebesar 0,9995. Nilai linieritas menunjukkan korelasi antara


konsentrasi dan absorbansi yang dihasilkan. Semakin baik nilai linieritas (nilai R sama dengan 1 atau mendekati 1) maka korelasi juga semakin baik. Tabel IV. Hasil penentuan jumlah fenolik total ekstrak etanol buah buni Kandungan Rata – rata Absorbansi fenolik total ± SD (mg % CV (mg GAE/g) GAE/g) Replikasi 1 0,681 0,2849 0,2794 ± Replikasi 2 0,661 0,2769 1,7180% 0,0048 Replikasi 3 0,660 0,2764 Tabel IV menunjukkan hasil pengukuran sampel uji untuk penentuan kandungan fenolik total. Absorbansi sampel yang diperoleh kemudian dimasukkan ke dalam persamaan regresi linier yang telah didapatkan. Hasil perhitungan menunjukkan bahwa ekstrak etanol buah buni memiliki nilai kandungan fenolik total rata – rata sebesar 0,2794 ± 0,0048 mg ekivalen asam galat gram ekstrak etanol buah buni. Penelitian yang dilakukan oleh Butkhup dan Samappito (2011), menunjukkan bahwa kadar fenolik total ekstrak metanol buah buni yang diperoleh adalah sebesar 8,66 ± 1,14 mg ekivalen asam galat/gram, sedangkan hasil kadar senyawa fenolik pada penelitian ini tergolong rendah. Hal ini karena jenis pelarut yang digunakan dan cara ekstraksi yang berbeda. Jenis pelarut yang digunakan dalam penelitian ini adalah etanol 96 %, etanol mempunyai sifat polar tetapi tidak lebih polar dibandingkan dengan metanol. Menurut Boeing et al. (2014) solvasi etanol dalam melarutkan senyawa fenolik yang berefek antioksidan lebih rendah daripada metanol karena etanol mempunyai rantai C yang lebih panjang daripada metanol, sehingga senyawa senyawa fenolik yang bersifat polar akan lebih terlarut pada metanol.


Menurut Sari et al. (2013), lama waktu ekstraksi dapat mempengaruhi kandungan senyawa fenolik yang ada dalam suatu tanaman. Waktu perendaman buah buni yang terlalu lama dalam penelitian ini, dapat meningkatkan peluang untuk terjadinya oksidasi senyawa fenolik sehingga kandungan total fenolik yang terekstrak turun, dan kadar fenolik yang diperoleh kecil. Hal ini juga dibuktikan pada penelitian yang dilakukan oleh Cooper-Driver dan Balick (1978) bahwa bahan yang direndam dengan etanol selama 1 bulan masih mengandung senyawa fenolik walaupun kadarnya rendah. Menurut Blainski et al. (2013) reagen Folin-Ciocalteu mempunyai kelemahan, yaitu sangat cepat terurai dalam larutan alkali sehingga dapat menimbulkan endapan dan kekeruhan yang dapat menganggu pengukuran absorbansi. Pengatasan kelemahan tersebut dalam penelitian ini adalah dengan mengambil supernatan bagian atas untuk diukur dalam spektrofotometer. Supernatan tersebut dianggap tidak mengandung endapan sehingga tidak mengganggu dalam pengukuran. H. Hasil Uji Aktivitas Antioksidan 1. Penentuan Operating Time (OT) Penentuan OT bertujuan untuk mendapatkan rentang waktu pengukuran absorbansi yang tepat, dimana reaksi antara senyawa uji, dan senyawa pembanding sudah mereduksi radikal bebas DPPH dengan sempurna sehingga memberikan absorbansi yang stabil. Apabila nilai absorbansi stabil maka pengukuran bisa reprodusibel dan meminimalkan kesalahan analisis. DPPH dapat


memberikan serapan karena mempunyai gugus kromofor dan auksokrom, selain itu juga adanya delokalisasi elektron sehingga menghasilkan warna ungu. Pengukuran absorbansi dilakukan dengan mereaksikan larutan DPPH dengan larutan rutin sebagai kontrol positif pada tiga konsentrasi yang berbeda yaitu konsentrasi rendah, tengah, dan tinggi. Setiap konsentrasi akan memberikan nilai absorbansi yang berbeda pada panjang gelombang maksimum, sehingga ketiga konsentrasi tersebut akan mempresentasikan operating time pada masing – masing konsentrasinya. Konsentrasi rutin yang digunakan yaitu 5 μg/mL, 15μg/mL, dan 25μg/mL. Pengukuran OT dilakukan setiap 5 menit dalam jangka waktu 60 menit menggunakan spektrofotometer visibel dengan panjang gelombang serapan maksimum teoritis pada penelitian Dehpour et al. (2009) yaitu pada 517 nm. Operating Time ditentukan berdasarkan waktu ketika nilai absorbansi mulai stabil atau selisih nilai absorbansi tiap selang waktu mulai kecil. Dari hasil yang ditampilkan grafik (Gambar 15) didapatkan operating time rutin yaitu 30 menit. Hal ini ditunjukkan dengan absorbansi yang stabil pada menit ke 30, yang berarti reaksi sudah berjalan sempurna setelah 30 menit.


0,6

Absorbansi

0,55 5 µg/mL

0,5

15 µg/mL 0,45

25 µg/mL

0,4 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 Waktu (menit)

Gambar 15. Grafik penentuan OT rutin 2. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum (λ maks) Penentuan panjang gelombang maksimum bertujuan untuk menentukan panjang gelombang yang dapat memberikan absorbansi optimal dengan adanya sedikit perubahan konsentrasi dari hasil reaksi antara radikal DPPH dengan senyawa uji atau senyawa pembanding. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum dilakukan pada 3 konsentrasi DPPH yang berbeda yaitu 20 , dan 40

30

. Setiap konsentrasi akan memberikan nilai absorbansi yang

berbeda pada panjang gelombang serapan maksimum, sehingga ketiga konsentrasi tersebut akan mempresentasikan panjang gelombang maksimum pada masing – masing konsentrasinya. Scanning panjang gelombang maksimum dilakukan pada rentang panjang gelombang 400 nm – 700 nm. Pemilihan rentang panjang gelombang 400 nm – 700 nm didasarkan pada penelitian Dehpour et al. (2009), bahwa panjang gelombang maksimum DPPH secara teoritis adalah 517 nm yang masuk kedalam rentang tersebut. DPPH memiliki kromofor dan auksokrom pada strukturnya, serta adanya delokalisasi elektron disekitar molekulnya, sehingga


menimbulkan warna ungu yang dapat diukur serapannya pada panjang gelombang visibel. Tabel V. Hasil scanning panjang gelombang serapan maksimum DPPH Konsentrasi larutan DPPH 20 30 40

λ maksimum hasil scanning (nm) 516 516 516

λ maksimum yang digunakan

λ maksimum teoritis

516

517

Panjang gelombang serapan maksimum yang didapatkan yaitu 516 (Tabel V), sedangkan panjang gelombang serapan maksimum secara teoritisnya 517 nm. Perbedaan panjang gelombang yang diperoleh dengan panjang gelombang secara teoritis masih dapat diterima karena menurut Farmakope Indonesia edisi IV (1995), pergeseran panjang gelombang yang diperbolehkan yaitu 2 nm dari batas yang ditentukan. I. Hasil Uji Aktivitas Antioksidan Pengujian aktivitas antioksidan ekstrak etanol buah buni dilakukan dengan metode penangkapan radikal bebas 2,2-difenil-1-pikrihidrazil (DPPH). Metode DPPH merupakan salah satu metode yang paling sering digunakan untuk menguji aktivitas antioksidan suatu tanaman. Prinsip metode DPPH adalah penangkapan elektron bebas dari senyawa radikal yang menyebabkan berkurangnya intensitas warna radikal DPPH dari warna ungu menjadi kuning (Dehpour et al., 2009). Metode ini tidak spesifik untuk antioksidan jenis tertentu, tetapi dapat digunakan untuk pengujian aktivitas antioksidan secara keseluruhan dalam sampel yang dianalisis.


Suatu senyawa dapat dikatakan memiliki aktivitas antioksidan jika mampu mendonorkan elektronnya sehingga membuat DPPH menjadi stabil. Peristiwa tersebut menyebabkan penurunan intensitas warna DPPH dari berwarna ungu menjadi kuning, hal ini menandakan bahwa sifat DPPH sebagai radikal bebas menurun atau bahkan hilang. Pada pengukuran dengan spektrofotometer visibel nilai absorbansi yang terbaca adalah nilai warna ungu DPPH yang tersisa. Menurut Molyneux (2004), penurunan warna DPPH ini diikuti juga oleh penurunan absorbansi DPPH sehingga aktivitas antioksidan penangkapan radikal dapat diketahui dengan menghitung rasio penurunan absorbansi DPPH. Makin kuat suatu senyawa antioksidan yang ada dalam senyawa uji dapat menyebabkan warna DPPH makin memudar. Dalam penelitian ini menggunakan rutin sebagai kontrol positif karena rutin merupakan senyawa golongan flavonoid yang telah diketahui mempunyai aktivitas antioksidan. Rutin memiliki gugus fenol didalam strukturnya yang bertanggung jawab dalam aktivitas antioksidan dengan mereduksi DPPH sehingga terjadi penurunan intensitas warna ungu menjadi kuning. Perubahan warna tersebut sebanding dengan jumlah radikal bebas DPPH yang ditangkap oleh senyawa antioksidan. Parameter pengukuran aktivitas antioksidan mengunakan DPPH adalah IC50. Inhibitory concentration 50 adalah konsentrasi dari senyawa atau ekstrak yang mempunyai aktivitas antioksidan yang dapat menghambat radikal bebas (dalam penelitian ini DPPH) sebesar 50 % yang diperoleh dari suatu persamaan regresi linear yang menyatakan hubungan antara konsentrasi senyawa atau ekstrak


dengan %IC. Semakin kecil konsentrasi yang dapat menimbulkan IC50 maka aktivitas antioksidan dari senyawa atau ekstrak tersebut semakin baik (Zou et al., 2004). Tabel VI. Hasil pengukuran aktivitas antioksidan rutin dengan metode DPPH Replikasi

Konsentrasi ( 29,4 39,2 49 58,8 68,6 30 40 50 60 70 30 40 50 60 70

1

2

3

Absorbansi kontrol DPPH

0,535

0,501

0,514

Absorbansi larutan rutin 0,403 0,361 0,315 0,268 0,233 0,365 0,324 0,300 0,260 0,235 0,373 0,332 0,290 0,255 0,218

%IC 24,6730 32,5234 41,1215 49,9065 56,4486 27,1457 35,3293 40,1198 48,1038 53,0938 27,4319 35,4086 43,5798 50,3891 57,5875

Persamaan regresi linear y = 0,8259x + 0,4674 r = 0,9990

y = 0,6467x + 8,4231 r = 0,9963

y = 0,7529x + 5,2335 r = 0,9993

70 60

% IC

50 40 30

y = 0.7529x + 5.2335 r = 0.9993

20 10 0 0

20

40 Konsentrasi μg/mL

60

80

Gambar 16. Kurva persamaan regresi linier aktivitas antioksidan rutin replikasi 3


Tabel VII. Hasil pengukuran aktivitas antioksidan ekstrak etanol buah buni dengan metode DPPH Replikasi

Konsentrasi (


600 1000 1400 1800 2200 600 1000 1400 1800 2200 599.76 999.6 1399.44 1799.28 2199.12

1

2

3

0,577

0,605

0,590

Absorbansi ekstrak etanol buah buni 0,403 0,361 0,315 0,268 0,233 0,504 0,444 0,400 0,342 0,288 0,480 0,423 0,371 0,330 0,284


%IC 20,1040 28,0763 39,1611 47,1404 54,9393 16,6942 26,6116 33,8843 43,4711 52,3967 18,6441 26,6116 33,8843 43,4711 52,3967

y = 0,0222x + 6,8271 r = 0,9980

y = 0,0221x + 3,7190 r = 0,9992

y = 0,0211x + 5,4739 r = 0,9987

60 50

% IC

40 30 y = 0.0221x + 3.719 r = 0.9992

20 10 0 0

500

1000 1500 Konsentrasi μg/mL

2000

2500

Gambar 17. Kurva persamaan regresi linier aktivitas antioksidan ekstrak etanol buah buni replikasi 2

Dari gambar 16 dan 17 dapat dilihat bahwa kurva persamaan regresi linear rutin replikasi 3 dan ekstrak etanol buah buni replikasi 2 mempunyai nilai r paling


baik yaitu yaitu 0,9993 dan 0,9992. Menurut Gandjar dan Rohman (2007) persamaan regresi dengan linieritas terbaik yaitu jika nilai r mendekati 1. Dari tabel VI dan VII dapat dilihat bahwa konsentrasi rutin dan ekstrak buah buni berbanding lurus dengan %IC. Hal ini dikarenakan semakin besar konsentrasi rutin ataupun ektrak etanol buah buni maka semakin banyak pula pendonor elektron yang mereduksi DPPH, sehingga warna DPPH menjadi memudar. Pengukuran aktivitas antioksidan rutin dan ektrak etanol buah buni dilakukan sebayak 3 kali replikasi. Tabel VIII. Hasil IC50 rutin dan ekstrak etanol buah buni Rutin Rata-rata ± SD (

Replikasi IC50 ( 1 59,9741 61,2413 ± 2,6536 2 64,2909 3 59,4588 Ekstrak Etanol Buah Buni Replikasi IC50 ( Rata-rata ± SD ( 1 1944,7252 2 2094,1629 2049,7099 ± 91,2742 3 2110,2417

% CV 4,3330

% CV 4,4530

Hasil pengukuran aktivitas antioksidan yang dinyatakan dalam nilai IC50 ditunjukkan pada tabel VIII. Rata-rata IC50 rutin adalah 61,2413 ± 2,6536

,

hasil IC50 dalam penelitian ini berbeda jauh dengan penelitian yang dilakukan oleh Sintayehu et al. (2012) dengan IC50 rutin sebesar 3,53

, Sedangkan

rata – rata IC50 ekstrak etanol buah buni adalah 2049,7099 ± 91,2742

,

Penelitian yang dilakukan oleh Haripyaree et al. (2010) didapatkan IC50 ekstrak metanol buah buni sebesar 100,08 pada penelitian ini tergolong kecil.

, sedangkan hasil kadar antioksidan


Perbedaan IC50 yang besar tersebut disebabkan perbedaan pelarut, dan cara ekstraksi yang digunakan peneliti. Pada penelitian ini, peneliti menggunakan etanol 96%, sehingga tidak semua fenolik yang bersifat polar tersari secara sempurna. Etanol 96 % merupakan pelarut polar tetapi tidak lebih polar daripada metanol. Menurut Boeing et al. (2014) solvasi etanol dalam melarutkan senyawa fenolik yang berefek antioksidan lebih rendah daripada metanol, karena etanol mempunyai rantai C yang lebih panjang daripada metanol, sehingga senyawa senyawa fenolik yang bersifat polar akan lebih terlarut pada metanol. Jika kadar senyawa fenolik yang diperoleh kecil maka dapat dimungkinkan kadar antioksidan yang diperoleh juga kecil. Perendaman yang terlalu lama menyebabkan buah buni kontak dengan etanol terlalu lama. Menurut Maslukhah et al. (2016) terlalu lama kontak dengan pelarut dapat berdampak negatif pada ekstrak yang dihasilkan. Waktu paparan dengan pelarut yang terlalu lama menyebabkan paparan oksigen lebih banyak, sehingga meningkatkan peluang terjadinya oksidasi senyawa fenolik. Waktu ekstraksi yang berlebihan, tidak dapat mengekstrak komponen fenolik lebih banyak, hal ini telah dijelaskan dalam hukum kedua difusi yaitu bahwa kesetimbangan akhir akan dicapai antara konsentrasi zat terlarut dalam matriks tanaman dan pelarutnya setelah waktu tertentu. Hal ini menyebabkan fenolik yang terekstrak menjadi turun, sehingga kadar antioksidan yang dihasilkan pun juga kecil. Terdapat perbedaan besar antara IC50 rutin dan ekstrak etanol buah buni, nilai IC50 rutin lebih rendah daripada ekstrak etanol buah buni. Menurut Fidrianny


et al. (2014) kekuatan antioksidan dapat digolongkan menjadi 4, yaitu sangat kuat, kuat, sedang, dan lemah. Dalam penelitian ini hasil yang didapatkan yaitu rutin memiliki daya antioksidan yang kuat sedangkan ekstrak etanol buah buni memiliki daya antioksidan yang lemah. Hal ini menunjukkan bahwa aktivitas antioksidan rutin lebih besar daripada ekstrak etanol buah buni. Terdapat korelasi antara kandungan fenolik total dengan aktivitas antioksidan (IC50), semakin banyak senyawa fenolik yang terdapat dalam suatu ekstrak maka aktivitas antioksidan semakin tinggi (IC50 semakin kecil) (Sivaci dan Duman, 2014). Uji statistik dilakukan setelah mendapatkan nilai IC50, hal ini untuk menguji kebermaknaan nilai IC50 rutin dan ekstrak etanol buah buni. Uji statistik dilakukan menggunakan software R seri i386 3.2.4. Pertama, dilakukan uji normalitas data untuk melihat apakah data terdistribusi secara normal atau tidak. Jumlah data yang dimiliki oleh peneliti kurang dari 50, maka digunakan uji normalitas Shapiro-Wilk (Dahlan, 2012). Hasil uji statistik yang didapatkan yaitu, nilai p-value IC50 rutin adalah 0,1857 sedangakan p-value IC50 ekstrak etanol buah buni adalah 0,1684. Nilai pvalue rutin dan ekstrak etanol buah buni lebih besar dari 0,05 (taraf kepercayaan 95%), hal ini menandakan bahwa nilai signifikansi yang dihasilkan lebih besar daripada nilai signifikansi yang telah ditentukan, sehingga nilai IC50 rutin dan ekstrak etanol buah buni terdistribusi secara normal. Uji yang kedua yaitu uji variansi data yang bertujuan untuk mengetahui apakah dua kelompok data atau lebih mempunyai variansi yang sama atau tidak.


Hasil yang didapatkan untuk uji variansi ini adalah p-value = 0,001689. Nilai p yang didapatkan < 0,05 (taraf kepercayaan 95%) sehingga dapat disimpulkan bahwa IC50 rutin dan ekstrak etanol buah buni mempunyai variansi data yang tidak homogen. Uji yang ketiga adalah uji parametrik yaitu uji t tidak berpasangan, hal ini bertujuan untuk menguji perbedaan antara dua kelompok data dengan objek yang berbeda yaitu kontrol negatif dan ekstrak etanol buah buni, dilihat dari perbedaan rata – ratanya IC50. Hasil pengujian statistik diperoleh nilai p-value sebesar 6,4695 x 10-3. Nilai p-value tersebut menunjukkan bahwa ekstrak etanol buah buni berbeda bermakna bermakna dengan kontrol negatif. Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak etanol buah buni mempunyai aktivitas antioksidan.


BAB V KESIMPULAN A. Kesimpulan 1. Kandungan fenolik total ekstrak etanol buah buni sebesar 0,2794 ± 0,0048 mg ekivalen asam galat per gram ekstrak etanol buah buni. 2. Nilai aktivitas antioksidan ekstrak etanol buah buni menggunakan metode DPPH yang dinyatakan sebagai IC50 sebesar 2049,7099 ± 91,2742 μg/mL. B. Saran 1. Perlu dilakukan optimasi lama waktu metode ekstraksi dengan maserasi terhadap kandungan senyawa fenolik pada buah buni. 2. Perlu dilakukan identifikasi semua kandungan senyawa spesifik yang berefek sebagai antioksidan pada buah buni.

64


DAFTAR PUSTAKA Agoes, G., 2009, Serial Farmasi Industri – 2 : Teknologi Bahan Alam, edisi revisi, Penerbit ITB, Bandung, hal.31-32. Alfian, R., Susanti, H., 2012, Penetapan Kadar Fenolik Total Ekstrak Metanol Kelopak Bunga Rosella Merah (Hibiscus sabdariffa Linn) Dengan Variasi Tempat Tumbuh Secara Spektrofotometri, Jurnal Ilmiah Kefarmasian, 2 (1), 73-80.. Ardhie, A.M., 2011, Radikal Bebas dan Peran Antioksidan Dalam Mencegah Penuaan, Medicinus, 24 (1), 5. Badarinath, A.V., Rao, K.M., Chetty, C.M.S., Ramkanth, S., Rajan, T.V.S., Gnanaprakash, K., 2010, A Review on In-vitro Antioxidant Methods : Comparisions, Correlations and Considerations, International Journal of PharTech Research, 2 (2), 1276-1285. Budiarto, E., 2002, Biostatistika untuk Kedokteran dan Kesehatan Masyarakat, Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta, hal. 95. Butkhup, L., Samappito, S., 2008, Analysis of Anthocyanin, Flavonoids, and Phenolic Acid in Tropical Bignay Berries, International Journal of Fruit Science, 8(1), 15–34.iradical and Antimicrobial Capacities, Journal of Food Biochemistry, 35, 1671-1679. Butkhup, L., Samappito, S., 2011, Phenolic Constituents of Extract From Mao Luang Seeds and Skin-Pulp Residue and Its Antiradical and Antimicrobial Capacities, Journal of Food Biochemistry,35, 1671-1679. Butkhup, L., Samappito, S., 2011, Phenolic Constituents of Extract from Mao Luang Seeds and Skin-Pulp Residue ands Its Antiradical and Antimicrobial Capacities, Journal of Food Biochemistry, 35 (2011), 16711679. Blainski, A., Lopes, G.C., de Mello, J.C.P., 2013, Application and Analysis of the Folin Ciocalteu Method for the Determination of the Total Phenolic Content from Limonium brasiliense L, Molecules, 18 : 6852-6865. Boeing, J.S., Barizao, E.O., Silva, B.C.E., Montanher, P.F., Almeida, V.D.C., Visentainer, J.V., 2014, Evaluation of Solvent Effect on the Extraction of Phenolic Compounds and Antioxidant Capacities from the Berries : Application of Principal Component Analysis, Chemistry Central Journal, 8 (48), 1-9. Chawda, H.S., 2011, Prospective Study of Antioxidants, Its Mechanism and Potential Role in Cancer, International Journal of Research in Pharmaceutical and Biomedical Science, 2 (3), 888-894.


Cindrić I.J., Kunštic M., Zeiner M., Stingeder G., Rusak G., 2011, Sample Preparation Methods for the Determination of the Antioxidative Capacity of Apple Juices, Croat. Chem. Acta, 84 (3), 435-438. Cooper-Driver, G.A., Balick, M.J., 1978, Effects of Fields Preservation on The Flavonoid Content of Jessenia Bataua, Botanical Museum Leaflets Harvard University, 26 (8), 257-265. Dahlan, 2012, Statistik untuk Kedokteran dan Kesehatan, Salemba Medika, Jakarta, hal.17. Dai, J., Mumper, J., 2010, Plant Phenolics : Extraction, Analysis and Their Antioxidant and Anticancer Properties, Molecules, 15, 7313-7352. Damayanthi, E., Kustiyah, L., Khalid, M., Farizal, H., 2010, Aktivitas Antioksidan Bekatul Lebih Tinggi Daripada Jus Tomat dan Penurunan Aktivitas Antioksidan Serum Setelah Intervensi Minuman Kaya Antioksidan, Journal of Nutrition and Food, 5(3) : 205-210. Dehpour, A.A., Ebrahimzadeh, M.A., Fazel, N.S., Mohamad, N.S., 2009, Antioxidant Activity of Methanol Extract of Ferula Assafoetida and Its Essential Oil Composition, Grasas Aceites, 60(4), 405-412. Depkes RI, 1995, Farmakope Indonesia, edisi 4, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta, hal. 1006, 1036, 1066. Depkes RI, 2000, Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta, pp. 10-11. Doss, A.V., Thangavel, K.P., 2011, Antioxidant and Antimicrobial Activity Using Different Extracts of Anacardium Occidentale L., International Journal of Applied Biology and Pharmaceutical Technoloy, 2, 436-443. Dos Santos, S, X., Mazo, L.H., Cavalheiro, E.T., 2008, The Use Of a GraphiteSilicone Rubber Composite Electrode in The Determination of Rutin in Pharmaceutical Formulation, J. Braz, Chem, Soc., 19 (8) : 1601. Droge, W., 2002, Free Radicals in the Physiological Control, Physiol Rev.,82, 4894. Fessenden, R. J., Fessenden, J.S., 1982, Kimia Organik, Edisi Ketiga, jilid 2, Jakarta, Erlangga, pp. 436 – 437. Fidrianny, I., Darmawati, A., Sukrasno, 2014, Antioxidant Capacities From Different Polarities Extracts of Cucurbitaceae Leaves Using FRAP, DPPH Assays and Corelation With Phenolic, Flavonoid, Carotenoid Content, International Journal of Pharmachy and Pharmaceutical Science, 6 (2), 852-862.


Fiuza, et al., 2004, Phenolic Acid Derivates With Potential Anticancer Properties a Structure Activity Relationship Study. Part 1 : Methyl, Propyl, and Octyl Esters of Caffeic and Gallic Acids, Bioorganic and Medicinall Chemistry,12, 3581-3589. Fu, L., Xu, B.T., Gan, R.Y., Zhang, Y., Xu, X.R., Xia, E. Q., Li, H., B., 2011, Total Phenolic Contents and Antioxidant Capacities of Herbal and Tea Infusion, Int. J. Mol. Sci., 12, 2112-2124. Gandjar, I. G., Rohman, A., 2007, Kimia Farmasi Analisis, Pustaka Pelajar, Yogyakarta, pp. 253 – 254, 353-360. Gulcin, I., Uguz, M.T., Oktay, M., Beydemir, S., Kufrevioglu, O.I., 2004, Evaluation of the Antioxidant and Antimirobial Activities of Clary Sage (Salvia sclarea L.), Turk. J. Agric. For., 28, 25-33. Gupta, V. K., Sharma, S. K., 2006, Plants as Natural Antioxidant, Natural Product Radiance, Vol. 5(4) : 326-334. Haci, I.A.E., Didi, A., Bekkara, F.A., Gherib, M., 2009, In Vitro Antioxidant Activity and Total Phenolic Contents in Methanol Crude Extracts From The Algerian Medicinal Plant Limoniastrum feei, Scientific Study and Research, X(4), 329-336. Handa, S.S., Khanuja, S. P. S., Longo, G., Rakesh, D.D, 2008, Extraction Technologies for Medicinal and Aromatic Plants, International Centre For Science And High Technology, Trieste, pp. 22 – 23. Hariana, A., 2013, 262 Tumbuhan Obat dan Khasiatnya, edisi revisi, Penerbit Swadaya, Jakarta, pp.79. Haryanto, S., 2009, Ensiklopedi Tanaman Obat Indonesia, Palmall, Yogyakarta, pp. 109-111. Hayati, E.K. Halimah, N., 2010, Phytochemical Test and Brine Shrimp Lethality Test Against Artemia salina Leach of Anting – Anting (Acalypha indica Linn.) Plant Extract, ALCHEMY, 1 (2), 53-103. Kardinan, A., 2005, Tanaman Penghasil Minyak Atsiri, Agromedia, Jakarta, hal.1-2. Kassem, M. E. S., Hashim, A. N., Hassanein, H. M., 2013, Bioactivity of Antidesma bunius Leaves (Euphorbiaceae) and Their Major Phenolic Constituents, European Scientific Journal, 9 (18), 217-228. Khoddami, A., Wilkes, M.A., Roberts, T.H., 2013, Techniques for Analysis of Plant Phenolic Compounds, Molecules, 18 : 2328-2375.


Koleva, I.I., van Beek, T.A., Linssen, J.P.H., de Groot, A., Evstatieva, L.N., 2002, Screening of Plant Extracts For Antioxidant Activity : A Comparative Study on Three Testing Methods, Phytochemical Analysis, Vol. 13, 8-17. Kovacs, et al., 1993, Process For The Complex Processing And Preservation of Alimentary Plants, Particulary Seasonal Alimentary Plants, United States Patent, 1-12. List, P.H., Schmidt, P.C., 2000, Phytopharmaceutical Technology, CRC Press, USA, pp.107,109. Lizardo, R.C.M., Mabesa, L.B., Dizon, E.I., Aquino, N.A., 2015, Functional and antimicrobial properties of bignay [Antidesma bunius (L.) Spreng], International Food Research Journal 22 (1), 88-95. Lopez, M., Martinez, F., Del-Valle, C., Ferrit, M., Luque, R., 2003, Study of Phenolic Compounds as Natural Antioxidants by a Fluorescence Method, J.Talanta, 60, 610-612. Markham, K.R., 1988, Cara Mengidentifikasi Flavonoid, ITB, Bandung, hal.15. Marliana, S.D., Suryanti, V., Suyono, 2005, Skrining Fitokimia dan Analisis Kromatografi Lapis Tipis Komponen Kimia Buah Labu Siam (Sechium edule Jacq. Swartz.) dalam Ekstrak Etanol, Biofarmasi, 3 (1), 26-31. Maslukhah, Y.,L., Widyaningsih, T.D., Waziiroh, E., Wijayanti, N., Sriherfyna, F.H., 2016, Faktor Pengaruh Ekstraksi Cincau Hitam (Mesona palustris BL) Skala Pilot Plant : Kajian Pustaka, Jurnal Pangan dan Agroindustri, 4 (1), 245-252. Maulida, R., Guntarti, A., 2015, Pengaruh Ukuran Partikel Beras Hitam (Oryza sativa L.) Terhadap Rendemen Ekstrak dan Kandungan Total Antosianin, Pharmaciana, 5 (1), 9-16. Micor, J.R.L., Deocaris, C.C. Mojica, E.R.E, 2005, Biological Activity of Bignay (Antidesma bunius (L.) Spreng) Crude Extract in Artemia Salina, J. Med. Sci., 5 (3), 195 – 198. Molyneux, P., 2004, The Use of The Stable Free Radical Diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) for Estimating Antioxidant Activity, Songklanakarin J.Sci.Technol, 26 (2), 211-219. Moniruzzaman, M., Khalil, M.I., Sulaiman, S.A., Gan, S.H., 2012, Advances in the Analytical Methods For Determining the Antioxidant Properties of Honey : A Review, Afr J Tradit Complement Altern Med., 9 (1), 36-42. Nafisah, M., Tukiran, Suyatno, Hidayati, N., 2014, Phytochemical Screening Test On Hexan, Chloroform and Methanol Extracts of Patikan Kebo (Euphorbiae hirtae), Prosiding Seminar Nasional Kimia, hal.279-286.


Nunes, X.P., et al., 2012, Biological Oxidation and Antioxidant Activity of Natural Products, University Federal Sao Fransisco, Brazil, pp. 1-20. Orwa, C., Mutua, A., Kindt, R., Jamnadass, R., Anthony, S., 2009, Agroforestry Database 4.0: Antidesma bunius, http://www.worldagroforestry.org/treedb/AFTPDFS/Antidesma_bunius.P DF, diakses pada tanggal 29 Mei 2016. Padmasari, P.D., Astuti, K.W., Warditiani, N.K., 2013, Skrining Fitokimia Ekstrak Etanol 70% Rimpang Bangle (Zingiber purpureum Roxb.), Jurnal Farmasi Udayana, hal.1-7. Putri, N.K., Gunawan, I.,W.,G., 2015, Aktivitas Antioksidan Antosianin Dalam Ekstrak Etanol Kulit Buah Naga Super Merah (Hylocereus costaricensis) Dan Analisis Kadar Totalnya, Jurnal Kimia, 9 (2), 243-251. Pallipane, K.B., Rolle, R., 2008, Good Practice For Assuring The Post-Harvest Quality Of Exotic Tree Fruit Crops Produced In Jamaica, FAO, Rome, pp. 12. Pengelly, A., 2006, The Constituents of Medicinal Plants : An Introduction To The Chemistry and Theraputics of Herbal Medicines, 2nd edition, Allen & Unwin, Australia, pp.15-25. Prakash, A., Rigelhof, F., Miller, E., 2001, Antioxidant Activity, Medallion Laboratories-Analytical Progress, 19(2), 1-4. Prior, R.L., Wu, X., Schaich, K., 2005, Standardized Methods for the Determination of Antioxidant Capacity and Phenolics in Foods and Dietary Supplements, J. Agric. Food Chem., 53, 4290-4302. Proestos, C., Sereli, D., Komaitis, M., 2006, Determination of Phenolic Compounds in Aromatic Plants by RP-HPLC and GC-MS, Food Chemistry, 95, 44-52. Puspitasari, L., Swastini, D.A., Arisanti, C.I.A., 2013, Skrining Fitokimia Ekstrak Etanol 95% Kulit Buah Manggis (Garcinia mangostana L.), Jurnal Farmasi Udayana,, hal.1-5. Putri, N.K.M., Gunawan, I.W.G, Suarsa, I.W., 2015, Aktivitas Antioksidan Antioksidan Dalam Ekstrak Etanol Kulit Buah Naga Super Merah (Hylocereus costaricensis) Dan Analisis Kadar Totalnya, Jurnal Kimia, 9 (2), 243-251). Rahardjo, M., Darwati, I., Shusena, A., 2006, Produksi Dan Mutu Simplisia Purwoceng Berdasarkan Lingkungan Tumbuh Dan Umur Tanaman, Jurnal Bahan Alam Indonesia, 5,310 – 316.


Rakasiwi, B.L., Soegihardjo, 2014, Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol Daging Buah Buni (Antidesma bunius (L.) Spreng) Terhadap Staphylococcus aureus ATCC 25922 dan Escherichia coli ATCC 25923, Journal Farmasi Sains dan Komunitas, 11 (1), 23-31. Sangi, M., Runtuwene, M.R.J., Simbala, H.E.I., Makang, V.M.A., 2008, Analisis Fitokimia Tumbuhan Obat Di Kabupaten Minahasa Utara, Chem. Prog., 1(1), 47-53. Sari, D.K., Wardhani, D.H., Prasetyaningrum, A., 2013, Kajian Isolasi Senyawa Fenolik Rumput Laut Euceuma Cottonii Berbantu Gelombang Micro Dengan Variasi Suhu dan Waktu, Jurnal Teknik Kimia, 3 (19), 38-43. Savatovis, S.M., Cetkovic, G.S., Canadonovic-Brunet, J.M., Djilas, S.M., 2012, Kinetic behavior of the DPPH radical-scavenging activity of tomato waste extracts, J. Serb. Chem. Soc., 77(0), 1-12. Schirmer, R.E., 1990, Modern Methods of Pharmaceutical Analysis, 2nd Edition,Volume III, CRC Press Inc., Boca Raton, Florida. Sing, Y.Y., 2007, Determination of Synthetic Phenolic Antioxidant in Food Item Using HPLC and Total Antioxidants Using Fia Approaches, Thesis, 3-5, Universiti Sains Malaysia, Penang. Sintayehu, B., Asres, K., Raghavendra, Y., 2012, Radical Scavenging Activities of the Leaf extracts and a Flavonoid Glycoside Isolated fromCineraria abyssinica Sch. Bip. Exa. Rich, Journal of Applied Science, 2 (4), 44-49. Sivaci, A.,Duman, S., 2014, Evaluation of Seasonal Antioxidant Activity and Total Phenolic Compounds in Stems and Leaves of Some Almond (Prunus amygdalus L.) Varieties, Biological Research, 47 (9), 1-5. Sochor, J., Zitka, O., Skutkova, H., Pavlik, D., Babula, P., Krska, B., Horna, A., Adam, V., Provaznik, I., Kizek, R., 2010, Content of Phenolic Compounds and Antioxidant Capacity in Fruits of Apricot Genotypes, Molecules, 15(9) : 6285-6305. Tanjung, B.LM., Utami, F.H., 2008, Pengaruh pH dan Kecepatan Pengadukan Pada Ekstraksi Protein dari Tulang Ayam dengan Solvent Larutan NaOH, Jurusan Teknik Kimia, Fakultas Teknik, Universitas Diponegoro, Semarang, hal.1-8. Taroreh, M., Raharjo, S., Hastuti, P., Murdiati, A., 2015, Ekstraksi Daun Gedi (Abelmoschus manihot L) Secara Sekuensial Dan Aktivitas Antioksidannya, AGRITECH, 35 (3), 280-287.


Tiwari, P., Kumar, B., Kaur, M., Kaur, G., Kaur, H., 2011, Phytochemical screening and Extraction : A review, International Pharmaceutica Sciencia, 1 (1), 98-106. United States Departemet of Agriculture, 2014, Antidesma bunius (L.) Spreng, http:// plants. usda. gov/ core / profile ? symbol = ANBU3, diakses pada tanggal 24 Januari 2016. Valko, M., Leibfritz, D., Moncol, J., Cronin, M. T. D., Mazur, M., Telser, J., 2007, Free Radicals and Antioxidants in Normal Physiological Functions and Human Disease, The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, 39 : 44–84. Van Steenis C.G.E., 1992, Flora : untuk sekolah di Indonesia, Cetakan keenam, PT Pradnya Paraminta, Jakarta, hal. 35-259. Vermerris, W., Nicholson, R., 2008, Phenolic Compound Biochemistry, Springer, USA, pp. 1-2. Wagner, K.M., 2013, Like Dissolves Like, Princeton University Chemistry Department, pp. 1-5. Watson, D. G., 2010, Analisis Farmasi : Buku Ajar Untuk Mahasiswa Farmasi Dan Praktisi Kimia Farmasi, Edisi 2, EGC, Jakarta, pp. 105. Williamson, E.M., David, T.T., &Fred., 1996, Selection, Preparation and Pharmacological Evaluation of Plant Material, Wiley & Sons Ltd, England, pp. 16-17. Zou, Y., Lu, Y., Wei, D., 2004, Antioxidant Activity of a Flavonoid- Rich Extract of Hypericum perforatum L. In Vitro, Journal of Agricultural and Food Chemistry,52, 5032-5039.


LAMPIRAN

72


Lampiran 1. Surat determinasi tanaman


Lampiran 2. Gambar tanaman buah buni di taman Kampus III Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.

Lampiran 3. Ekstrak etanol buah buni


Lampiran 4. Foto hasil uji saponin

Keterangan : A. Blanko sampel B. Sampel setelah digojog

Lampiran 5. Foto hasil uji flavonoid

Keterangan :

A. Blanko sampel B. Sampel + logam Mg + HCl

A

B


Lampiran 6. Foto hasil uji triterpenoid dan steroid

Blanko Sampel

Sampel + Liebermann Burchard

Lampiran 7. Uji minyak atsiri

Larutan ekstrak etanol buah buni

Larutan ekstrak etanol buah buni setelah diuapkan


Lampiran 8. Foto uji alkaloid

Keterangan : A. Blanko sampel B. Sampel + pereaksi Mayer C. Sampel + pereaksi Dragendroff

A

B

C

Lampiran 9. Foto uji tannin dan polifenol

Keterangan : A. Blanko sampel B. Sampel + FeCl310 % C. Sampel + Gelatin 1 %

A

B

C


Lampiran 10. Foto uji antosianin

Keterangan :

A. Blanko sampel B. Sampel + HCl 2 M C. Sampel + NaOH 2 M

A

B

C

Lampiran 11. Foto uji antrakuinon

Keterangan uji antrakuinon dengan metode Brontrager : A. Blanko sampel B. Sampel + benzena + amonia


Keterangan uji antrakuinon dengan metode Brontrager termodifikasi : A. Blanko sampel B. Sampel + KOH + H2O2 + benzena + ammonia


Lampiran 12. Perhitungan rendemen ekstrak etanol buah buni Bobot buah buni yang digunakan adalah 1000 gram Total berat ekstrak etanol buah buni = 138,41 g Rendemen ekstrak etanol buah buni = = = 13,841 % Lampiran 13. Data penimbangan untuk penetapan kadar fenolik total a. Data penimbangan asam galat Replikasi Replikasi Replikasi 1 (g) 2 (g) 3 (g) Berat kertas 0,2435 0,2403 0,2478 Berat kertas + asam 0,2685 0,2655 0,2732 galat Berat kertas + sisa 0,2436 0,2405 0,2482 Berat asam galat 0,0249 0,0250 0,0250 b. Data penimbangan Natrium karbonat Replikasi 1 (g) Berat kertas 0,2466 Berat kertas + 2,3683 Natrium karbonat Berat kertas + sisa 0,2468 Berat Natrium 2,1215 karbonat

Replikasi 2 (g) 0,2440 2,3660

Replikasi 3 (g) 0,2408 2,3628

0,2444 2,1216

0,2409 2,1219

c. Data penimbangan ekstrak etanol buah buni Replikasi Replikasi 1 (g) 2 (g) Berat gelas arloji 33,3512 32,8026 Berat gelas arloji + 33,6012 33,0526 ekstrak Berat gelas arloji + 33,3515 32,8027 sisa Berat ekstrak 0,2497 0,2499

Replikasi 3 (g) 32,5339 32,7841 32,5341 0,2500


Lampiran 14. Data optimasi penetapan kandungan fenolik total a. Penentuan operating time (OT) asam galat Waktu Absorbansi Absorbansi Absorbansi (menit) konsentrasi konsentrasi konsentrasi 50 µg/mL 100 µg/mL 150 µg/mL 5 0,265 0,423 0,684 10 0,280 0,448 0,713 15 0,287 0,454 0,733 20 0,285 0,461 0,741 25 0,288 0,466 0,748 30 0,288 0,470 0,753 35 0,288 0,472 0,756 40 0,289 0,473 0,759 45 0,289 0,473 0,761 50 0,289 0,473 0,762 55 0,289 0,473 0,763 60 0,287 0,472 0,763 1. Spektrum asam galat konsentrasi 50 µg/mL


2. Spektrum asam galat konsentrasi 100 µg/mL

3. Spektrum asam galat konsentrasi 150 µg/mL

OT yang diperoleh 30 menit b. Penentuan λ maksimum asam galat Konsentrasi seri asam Absorbansi galat 0,264 50 0,501 100 0,778 150

λ maksimum (nm) 750 746 740


1. Spektrum λ maksimum asam galat konsentrasi seri asam galat 50





Lampiran 15. Data penetapan kandungan fenolik total a. Konsentrasi asam galat 1. Konsentrasi larutan stok asam galat Replikasi 1 498 Replikasi 2 500 Replikasi 3 500 2. Konsentrasi seri larutan asam galat Contoh perhitungan konsentrasi seri larutan asam galat replikasi 3 : Seri 1 Seri 4 C1.VI = C2.V2 C1.V1 = C2.V2 500 µg/mL.0,5 mL = C2.10 mL 500 µg/mL.1,25 mL = C2.10 mL C2 = 50 µg/mL C2 = 125 µg/mL Seri 2 Seri 5 C1.V1 = C2.V2 C1.V1 = C2.V2 500 µg/mL.0,75 mL = C2.10 mL 500 µg/mL.1,5 mL = C2.10 mL C2 = 75 µg/mL C2 = 150 µg/mL Seri 3 C1.V1 = C2.V2 500 µg/mL.1 mL = C2.10 mL C2 = 100 µg/mL Perhitungan konsentrasi seri larutan asam galat : Replikasi C1 (µg/mL) V1 (mL) C2 (µg/mL) V2 (mL) 498 1 49,8 10 498 1,5 74,7 10 1 498 2 99,6 10 498 2,5 124,5 10 498 3 149,4 10 500 1 50 10 500 1,5 75 10 2 500 2 100 10 500 2,5 125 10 500 3 150 10 500 1 50 10 500 1,5 75 10 3 500 2 100 10 500 2,5 125 10 500 3 150 10


Kurva baku asam galat Replikasi Konsentrasi (µg/mL) Absorbansi

1

2

3

b.

50 75 100 125 150 50 75 100 125 150 50 75 100 125 150

0,268 0.344 0,498 0,622 0,749 0,239 0,369 0,475 0,585 0,724 0,232 0,360 0,482 0,587 0,717

Persamaan regresi linear y = 0,0050x + 0,0002 r = 0,9961

y = 0,0047x + 0,0040 r = 0,9989

y = 0,0048x – 0,0032 r = 0,9995

Konsentrasi Natrium karbonat Konsentrasi larutan Natrium karbonat 1 M Molaritas = 1 M x 0,02 L = 0,02 mol Massa yang ditimbang = mol x Mr = 0,02 mol x 106 = 2,12 gram Replikasi 1 106075 Replikasi 2 106080 Replikasi 3 106095 Persamaan regresi linear yang digunakan adalah y = 0,0048x – 0,0032

c. Penetapan kandungan fenolik total larutan uji 1. Konsentrasi ekstrak etanol buah buni Konsentrasi stok Replikasi 1 25010


Replikasi 2 24990 Replikasi 3 25000 Konsentrasi intermediet Replikasi 1 C1 . V1 = C2 . V2 .3,6 mL = C2.10 mL C2 = 9003,6 Replikasi 2 C1 . V1 = C2 . V2 .3,6mL= C2.10 mL C2 = 8996,4 Replikasi 3 C1 . V1 = C2 . V2 .3,6 mL = C2 . 10 mL C2 = 9000

Konsentrasi larutan seri Replikasi 1 C1 . V1 = C2 . V2 .2,5 mL = C2.5 mL C2 = 4501,8 Replikasi 2 C1 . V2 = C2 . V2 . 2,5 mL = C2.5 mL C2 = 4498,2 Replikasi 3 C1 . V1 = C2 . V2 . 2,5 mL = C2 . 5 mL C2 = 4500

2. Absorbansi ekstrak etanol buah buni Replikasi Absorbansi 1 0,681 2 0,661 3 0,660 3. Konsentrasi ekstrak etanol buah buni Replikasi 1 Persamaan regresi linear y = 0,0048x – 0,0032 0,681 = 0,0048x – 0,0032 x = 142,5417 Replikasi 2 Persamaan regresi linear y = 0,0048x – 0,0032 0,661= 0,0048x – 0,0032 x = 138,3750 Replikasi 3 Persamaan regresi linear y = 0,0048x – 0,0032 0,660 = 0,0048x – 0,0032 x = 138,1667


4. Kandungan fenolik total ekstrak etanol buah buni Kandungan fenolik total = konsentrasi ekstrak etanol . Replikasi 1 Kandungan fenolik total = 0,1425 mg/mL . = 0,2849 mg ekivalen asam galat per gram ekstrak Replikasi 2 Kandungan fenolik total = 0,1384 mg/mL . = 0,2769 mg ekivalen asam galat per gram ekstrak Replikasi 3 Kandungan fenolik total = 0,1382 mg/mL . = 0,2764 mg ekivalen asam galat per gram ekstrak Replikasi x (mg/mL)

1 2 3

4501,8 4498,2 4500

volume (mL)

massa (g)

0,5 0,5 0,5

0,2501 0,2499 0,2500

Kandungan x± SD %CV fenolik total (mg ekivalen asam galat per gram ekstrak etanol buah buni) 0,2849 0,2794 1,718 ± 0% 0,2769 0,0048 0,2764


Lampiran 16. Data penimbangan untuk pengujian aktivitas antioksidan a. Penimbangan DPPH Replikasi 1 (g) Berat kertas 0,2412 Berat kertas + 0,2464 DPPH Berat kertas + sisa 0,2414 Berat DPPH 0,0050 b. Penimbangan rutin Replikasi 1 (g) Berat kertas 0,2516 Berat kertas + rutin 0,2566 Berat kertas + sisa 0,2517 Berat rutin 0,0049

Replikasi 2 (g) 0,2435 0,2486

Replikasi 3 (g) 0,2480 0,2534

0,2436 0,0050

0,2484 0,0050

Replikasi 2 (g) 0,2362 0,2415 0,2365 0,0050

Replikasi 3 (g) 0,2421 0,2472 0,2422 0,0050

c. Data penimbangan ekstrak etanol buah buni Replikasi 1 Replikasi 2 (g) (g) Berat gelas arloji 32, 5350 33,3522 Berat gelas arloji + 32,7851 33,6026 ekstrak Berat gelas arloji + 32,5351 33,3526 sisa Berat ekstrak 0,2500 0,2500

Replikasi 3 (g) 32,5349 32,7850 32,5351 0,2499


Lampiran 17. Data perhitungan konsentrasi DPPH, larutan pembanding dan larutan uji a. Konsentrasi DPPH 1. Konsentrasi stok 2. Konsentrasi DPPH yang digunakan Replikasi 1 Replikasi 1 C1 . V1 = C2 . V2 . 5 mL = C2 . 25 mL Replikasi 2 C2 = 19,6 Replikasi 2 C1 . V1 = C2 . V2 Replikasi 3 . 5 mL = C2 . 25 mL C2 = 20 Replikasi 3 C1 . V1 = C2 . V2 . 5 mL = C2 . 25 mL C2 = 20 b. Konsentrasi rutin 1. Konsentrasi larutan stok Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3

2. Konsentrasi seri larutan rutin Contoh perhitungan konsentrasi seri larutan rutin replikasi 2 Seri 1 Seri 4 C1 . VI = C2 . V2 C1 . V1 = C2 . V2 . 3 mL = C2 . 10 mL . 6 mL = C2 . 10 mL C2 = 30 C2 = 60 Seri 2 Seri 5 C1 . V1 = C2 . V2 C1 . V1 = C2 . V2 . 4 mL = C2 . 10 mL . 7 mL = C2 . 10 mL C2 = 40 C2 = 70 Seri 3 C1 . V1 = C2 . V2 . 5 mL = C2 . 10 mL C2 = 50


Perhitungan konsentrasi seri larutan rutin : Replikasi C1 (µg/mL) V1 (mL) C2 (µg/mL) V2 (mL) 98 3 29,4 10 98 4 39,2 10 1 98 5 49 10 98 6 58,8 10 98 7 68,6 10 100 3 30 10 100 4 40 10 2 100 5 50 10 100 6 60 10 100 7 70 10 100 3 30 10 100 4 40 10 3 100 5 50 10 100 6 60 10 100 7 70 10 c. Konsentrasi ekstrak etanol buah buni 1. Konsentrasi larutan stok Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3 2. Konsentrasi intermediet Replikasi 1 C1 . V1 = C2 . V2 . 2 mL = C2 . 10 mL C2 = 5000 Replikasi 2 C1 . V1 = C2 . V2 . 2 mL = C2 . 10 mL C2 = 5000 Replikasi 3 C1 . V1 = C2 . V2 . 2 mL = C2 . 10 mL C2 = 4998


3.

Konsentrasi larutan seri Contoh perhitungan konsentrasi seri larutan sampel replikasi 3: Replikasi 3 Seri 1 Seri 4 C1 . V1 = C2 . V2 C1 . V1 = C2 . V2 . 0,6 mL = C2 . 5 mL . 1,8 mL = C2 . 5 mL C2 = 599,76 Seri 2 C2 = 1799.28 C1 . V1 = C2 . V2 Seri 5 C1 . V1 = C2 . V2 . 1 mL = C2 . 5 mL . 2,2 mL = C2 . 5 C2 = 999,6 mL Seri 3 C1 . V1 = C2 . V2 C2 = 2199.12 . 1,4 mL = C2 . 5 mL C2 = 1399

Perhitungan konsentrasi seri larutan ekstrak etanol buah buni : Replikasi C1 (µg/mL) V1 (mL) C2 (µg/mL) V2 (mL) 5000 0,6 600 5 5000 1 1000 5 1 5000 1,4 1400 5 5000 1,8 1800 5 5000 2,2 2200 5 5000 0,6 600 5 5000 1 1000 5 2 5000 1,4 1400 5 5000 1,8 1800 5 5000 2,2 2200 5 0,6 599.76 5 4998 1 999.6 5 3 4998 1,4 1399.44 5 4998 1,8 1799.28 5 4998 2,2 2199.12 5


Lampiran 18. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan a. Penentuan operating time (OT) Absorbansi Absorbansi Absorbansi Waktu konsentrasi konsentrasi konsentrasi (menit) rutin 5 rutin 15 µg/mL rutin 25 µg/mL µg/mL 5 0,538 0,504 0,497 10 0,533 0,500 0,488 15 0,529 0,495 0,484 20 0,528 0,493 0,482 25 0,528 0,491 0,482 30 0,529 0,488 0,481 35 0,531 0,488 0,480 40 0,533 0,489 0,480 45 0,535 0,489 0,482 50 0,538 0,491 0,483 55 0,542 0,492 0,483 60 0,547 0,493 0,485 1. Spektrum rutin konsentrasi 5 µg/mL


2. Spektrum rutin konsentrasi 15 µg/mL

3. Spektrum rutin konsentrasi 25 µg/mL

OT yang diperoleh 30 menit


b. Penentuan λ maksimum Konsentrasi Absorbansi seri DPPH 20 30 40

0,558 0,680 0,786

λ maksimum (nm) 516 516 516

1. Spektrum DPPH konsentrasi 20


xλ maksimum (nm)

λ maksimum teoritis (nm)

516

517




Lampiran 19. Uji aktivitas antioksidan menggunakan radikal DPPH %IC = 1.

Rutin

Replikasi

1

Replikasi

2

Replikasi

3

Konsentrasi ( 29,4 39,2 49 58,8 68,6 Konsentrasi ( 30 40 50 60 70 Konsentrasi ( 30 40 50 60 70


0,535


0,501


0,514

Absorbansi larutan pembanding 0,403 0,361 0,315 0,268 0,233 Absorbansi larutan pembanding 0,365 0,324 0,300 0,260 0,235 Absorbansi larutan pembanding 0,373 0,332 0,290 0,255 0,218

%IC


24,6730 32,5234 y = 0,8259x 41,1215 + 0,4674 r = 0,9990 49,9065 56,4486

%IC


27,1457 35,3293 40,1198 48,1038 53,0938

y= 0,6467x + 8,4231 r = 0,9963

%IC


27,4319 35,4086 43,5798 50,3891 57,5875

y= 0,7529x + 5,2335 r = 0,9993


Contoh perhitungan %IC replikasi 3 : a. Konsentrasi 30 c. Konsentrasi 50 %IC = %IC = %IC = 27,4319 % b. Konsentrasi 40 %IC =

%IC = 43,5798 % d. Konsentrasi 60 %IC =

%IC = 35,4086 %

%IC = 50,3891 % e. Konsentrasi 70 %IC = %IC = 57,5875 %

2. Ekstrak etanol buah buni Replikasi

1

Replikasi

2

Replikasi

3

Konsentrasi (

600 1000 1400 1800 2200 Konsentrasi (

600 1000 1400 1800 2200 Konsentrasi (

599.76 999.6 1399.44 1799.28 2199.12


0,577


0,605


0,590

Absorbansi ekstrak etanol buah buni 0,461 0,415 0,351 0,305 0,260 Absorbansi ekstrak etanol buah buni 0,504 0,444 0,400 0,342 0,288 Absorbansi ekstrak etanol buah buni 0,480 0,423 0,371 0,330 0,284

%IC 20,1040 28,0763 39,1611 47,1404 54,9393

%IC 16,6942 26,6116 33,8843 43,4711 52,3967

%IC 18,6441 26,6116 33,8843 43,4711 52,3967

Persamaan regresi linear y= 0,0222x + 6,8271 r = 0,9980

Persamaan regresi linear y= 0,0221x + 3,7190 r = 0,9992


y = 0,0211x + 5,4739 r = 0,9987


Contoh perhitungan %IC replikasi 2 : a. Konsentrasi 600 %IC = %IC = 16,6942 % b. Konsentrasi 1000 %IC = %IC = 26,6116 % c. Konsentrasi 1400 %IC = %IC = 33,8843 % d. Konsentrasi 1800 %IC = %IC = 43,4711 % e. Konsentrasi 2200 %IC = %IC = 52,3967 %


Lampiran 20. Perhitungan nilai IC50 rutin dan ektrak etanol buah buni 1. Rutin Replikasi Persamaan regresi linear y IC50 x (nilai IC50) 1 y = 0,8259x + 0,4674 50 59,9741 2 y = 0,6467x + 8,4231 50 64,2909 3 y = 0,7529x + 5,2335 50 59,4588 Replikasi

IC50

SD

1 2 3

59,9741 64,2909 59,4588

2,6536

x ( 61,2413

Replikasi 1 Persamaan regresi linear y = 0,8259x + 0,4674 50 = 0,8259x + 0,4674 x = 59,9741 Replikasi 2 Persamaan regresi linear y = 0,6467x + 8,4231 50 = 0,6467x + 8,4231 x = 64,2909

IC50 1944,7252 2094,1629 2110,2417

Replikasi 1 Persamaan regresi linear y = 0,0222x + 6,8271 50 = 0,0222x + 6,8271 x = 1944,7252 Replikasi 2 Persamaan regresi linear y = 0,0221x + 3,7190 50 = 0,0221x + 3,7190 x = 2094,1629

SD

61,2413 ± 2,6536

% CV 4,3330%

Replikasi 3 Persamaan regresi linear y = 0,7529x + 5,2335 50 = 0,7529x + 5,2335 x = 59,4588

2. Ekstrak etanol buah buni Replikasi Persamaan regresi linear 1 y = 0,0222x + 6,8271 2 y = 0,0221x + 3,7190 3 y = 0,0211x + 5,4739 Replikasi 1 2 3

x

y IC50 50 50 50

SD x( 91,2742 2049,7099

x (nilai IC50) 1944,7252 2094,1629 2110,2417 x SD 2049,7099 ± 91,2742

Replikasi 3 Persamaan regresi linear y = 0,0211x + 5,4739 50 = 0,0211x + 5,4739 x = 2110,2417

% CV 4,4530 %


Lampiran 21. Data uji statistik

1.

2.

Uji normalitas

Uji homogenitas


3.

Uji t independen


BIOGRAFI PENULIS

Penulis

skripsi

yang

berjudul

“Uji

Aktivitas

Antioksidan Dan Penetapan Kadar Fenolik Total Ekstrak Etanolik Buah Buni (Antidesma bunius (L.) Spreng) memiliki nama lengkap Margareta Novi Wijayanti. Dilahirkan di Gunungkidul pada tanggal 28 November 1994 dari pasangan Bapak Antonius Djumakir dan Ibu Lusia Sumiyem. Penulis merupakan anak kedua dari dua bersaudara. Penulis telah menyelesaikan pendidikan di TK Santa Ana pada tahun 1999 hingga 2000 lalu melanjutkan pendidikan di SD Kanisius Petung pada tahun 2000 hingga 2006. Penulis menempuh sekolah menengah di SMP 1 Wonosari pada tahun 2006 hingga 2009 kemudian melanjukan sekolah tingkat atas di SMA 2 Wonosari pada tahun 2009 hingga 2012. Penulis melanjutkan pendidikan perguruan tinggi di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta pada tahun 2012 hingga 2016. Selama menjadi mahasiswa di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma penulis cukup aktif dalam organisasi, kegiatan kemahasiswaaan dan kepanitiaan antara lain menjadi koordinator Divisi Pengembangan dan Pengkaderan Organisasi JMKI periode 2014/2015, Panitia Cara Belajar Ibu Aktif 2014, Panitia Pharmacy Road To School 2013, Panitia Pharmacy Performance 2013, Panitia Makrab Jaringan Mahasiswa Kesehatan Indonesia 2014, Panitia Seminar Nasional Interprofessional Health Care “Take Care Your Miraculous Filter Perfectly” 2014, Asisten Dosen Praktikum Bentuk Sediaan Farmasi 2013/2014, Asisten Dosen Praktikum Bentuk Sediaan Farmasi 2014/2015, Asisten Dosen Praktikum Kimia Organik II 2014/2015, dan Asisten Dosen Praktikum Farmakognosi Fitokimia 2015/2016.

UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN PENETAPAN KADAR FENOLIK

Recommend Documents