XI. ENUMERASI Penghitungan jumlah mikrobia dapat berdasarkan Total Cell Count (TCC) dan Viable Cell Count. Perbedaan :
ENUMERASI ISOLASI PURIFIKASI IDENTIFIKASI
Enumerasi yaitu penghitungan jumlah mikrobia per satuan berat atau volume.
Metode enumerasi 1. TPC: Total Plate Count -
Pour plate
-
Spread plate
-
Drop plate
2. MPN : Most Probable Number 3. Membrane Filter Persyaratan jumlah koloni dalam TPC Bakteri dan Yeast 30 < n < 300 atau 25 < n < 250 Jamur 15
Menyebabkan
supress
sehingga
mengganggu
pertumbuhan
mikrobia Æ menghambat pembentukan koloni -
memungkinkan terbentuknya 1 koloni oleh lebih dari 1 sel
Keuntungan perhitungan dengan TPC 1. sangat peka, dapat menghitung sampai dengan 20 sel/ml 2. murah 3. beban pekerjaan tidak terlalu besar 4. reproducibility tinggi 5. dapat menunjukkan perbedaan jenis-jenis mikrobia 6. dapat diteruskan dengan isolasi
Universitas Gadjah Mada
Membrane Filtration Sampel disaring secara aseptis melewati membran penyaring steril berpori-pori 0.45μ. Membran dengan sel-sel mikrobia yang tertahan padanya ditumbuhkan pada media agar yang sesuai dan diinkubasikan pada kondisi yang juga cocok. Kemudian dihitung jumlah koloni yang tumbuh dan dikembalikan perhitungannya atas dasar volume sampel dan pengencerannya. Keuntungan : -
sangat sensitif, dapat untuk menghitung sampai 10~3 sel/ml.
-
dapat dikerjakan dengan media selektif terhadap mikrobia tertentu.
Kelemahan : tidak efisien Alat: Polyethylene Membrane Filter (Sartorius) atau Seitz Filter
MPN : Most Probable Number Penghitungan jumlah mikrobia dengan pendekatan statistik didasarkan atas perbandingan tabung yang menunjukkan pertumbuhan, dari 3 seri pengenceran atau lebih. Suspensi sampel
A = 1000 sel/ml B = 100 sel/ml C = 10 sel/ml D = 1 sel/ml E = 0.1 sel/ml
1 ml suspensi A, B, C, atau D bila diinokulasikan dalam 1 tabung media cair yang cocok akan mengakibatkan adanya pertumbuhan pada tabung. 1 ml suspensi E bila ditumbuhkan dalam media yang sama memiliki kemungkinan (probability) 1 : 10.
Universitas Gadjah Mada
Atas dasar perhitungan kemungkinan adanya pertumbuhan pada tabung tersebut secara statistis disusun tabel hubungan antara jumlah tabung yang ada pertumbuhan dari berbagai pengenceran, dengan jumlah mikrobia. Tabel tersebut dikenal sebagai Tabel McCrady. Tabel untuk 3 tabung maupun Tabel untuk 5 tabung. Contoh : -
sampel dengan pengenceran 10-1, 10-2, 10-3
-
dari masing-masing pengenceran diinokulasikan 5 x 1 ml dalam 5 tabung media yang sesuai
-
setelah diinkubasikan diperoleh sbb : pengenceran 10-1 = 5 tabung + pengenceran 10-2 = 3 tabung + pengenceran 10-3 = 0 tabung +
Maka dinyatakan dalam hasil pengamatan berupa seri angka 530. Kemudian seri ini dicocokkan dengan Tabel McCrady untuk 5 tabung, diperoleh perkiraan populasi mikrobia dalam sampel adalah 109 sel/gram. MPN dihitung dengan asumsi: 1. sel terdistribusi rata dalam sampel 2. tidak ada sel yang saling terkait 3. tiap 1 sel atau lebih dalam media mampu menunjukkan pertumbuhan dalam tabung 4. tidak ada kontaminasi Keuntungan : 1. dapat dipersiapkan sebelumnya, untuk pekerjaan di lapangan 2. dapat dikerjakan dengan media selektif untuk memperkirakan populasi mikrobia khusus, misalnya coliform dengan lactose broth Kelemahan : 1. perlu banyak tabung 2. pekerjaan banyak
Universitas Gadjah Mada
PREPARASI SAMPEL Perencanaan sampling Untuk menentukan jumlah dan ukuran sampel dipengaruhi oleh faktor-faktor: 1. jumlah mkrobia 2. keseragaman/penyebaran mikrobia POPULASI MIKROBIA
SAMPEL YANG DIAMBIL
----------------------------------------------------------------------------------------------makin besar
makin kecil ukuran
makin homogen
makin sedikit jumlah
makin sedikit
makin besar ukuran
makin tidak homogeny
makin banyak jumlah
----------------------------------------------------------------------------------------------Biasanya diatur dalam standar mutu Umumnya diambil 10 g atau 10 cc sampel untuk disuspensikan Sekurang-kurangnya 1 g bila sampel sedikit Cara sampling -
Aseptik - dengan peralatan steril yang sesuai Æ pipet untuk sampel cair Æ pisau, pinset, spatula, cangkul, bar untuk sampel padat Æ wadah untuk penimbangan
-
Waktu - memungkinkan secepatnya dianalisis Æ 2-3 jam sampel sudah dianalisis Æ 10-12 jam dalam suhu 4 °C tidak menyebabkan perubahan jumlah mikrobia dalam sampel berbiak dan mati.
SUSPENSI SAMPEL merupakan cara melepas/mengambil populasi mikrobia dari sampel Sampel cair Æ homogenisasi dalam larutan pengencer Sampel padat Æ blending : penghancuran sampel
Universitas Gadjah Mada
- blender - stomacher rinsing : bilasan swabbing : usapan Larutan pensuspensi/pengencer : mampu mensuspensikan mikrobia, mempertahankan mikrobia tetap hidup, tetapi tidak berbiak contoh : air pepton (Peptone water) larutan pepton 0.1% bufer phosphate bufer trypton larutan Ringer = NaCI 0.9% dalam H 2O Penggunaan air steril menyebabkan kematian sel mikrobia 40-60% dalam 20 menit dan 90% dalam 1 jam. Jika digunakan, pengerjaannya harus cepat. Dalam Total Plate Count biasanya disiapkan suatu seri pengenceran sesuai dengan perkiraan kandungan mikrobia dalam sampel.
RAPID MICROBIOLOGICAL METHODS Metode penghitungan yang dkehendaki mempunyai kelebihan •
Murah
•
Cepat
•
valid
1. mempercepat teknik kultivasi 2. pengujian biokimiawi secara cepat misal: dengan APP system dan ATM system coagulase test untuk S. aureus urease test untuk Salmonella 3. Pengukuran metabolisme total kontaminan misal: - Methylene Blue Test untuk milk Æ warna Reazurin Test untuk daging giling Æ warna Glucose broth untuk ikan Æ penurunan pH
Universitas Gadjah Mada
Kelemahan : •
kecepatan metabolisme mikrobia tidak sama
•
bahan yang sudah mendapat perlakuan akan memberi hasil yang tidak korelatif Æ populasi sudah dipengaruhi perlakuan (misalnya pendinginan)
MENERA KERUSAKAN BAHAN -
ammonia, asam amino bebas, basa volatil --> pada ikan
-
Extract Release Volume (ERV) --> pada telur, daging unggas •
perubahan kemampuan menahan air oleh jaringan akibat kerusakan mikrobiologis
•
homogenat sampel disaring dengan kertas Whatman No. 1 selama 15 menit daging baik
- ERV tinggi
daging rusak - ERV rendah -
Tri-Metil Amin (TMA) --> pada ikan
METODA NON-TRADISIONAL -
menggunakan isotop •
sampel disaring dengan membran filtrasi lalu dibiakkan pada medium selektif dengan label radioaktif (misal Lactose-C untuk coliform); C*O2 radioaktif ditera.
•
Pada penggunaan untuk daging beku, dalam 6 jam inkubasi sudah dapat ditentukan apakah populasi mikrobianya tinggi (>10 5 /g) untuk ditolak atau masih dapat diterima (< 10 5 /g)
-
•
alat dan bahan mahal
•
kurang aman --> bahaya radiasi, perlu tenaga trampil
mengukur ATP luciferase •
Luciferin + ATP --------------> senyawa yang bercahaya dapat O2
•
Kelemahan :
diukur
- bahan pangan punya ATP - sel mati masih punya ATP
Universitas Gadjah Mada
intensitasnya
- ATP yeast + mold > ATP bakteri
-
mengukur impedance Pertumbuhan
mikrobia
menyebabkan
kerusakan/pemecahan
senyawa pada jaringan bahan. Hal tersebut dapat mengakibatkan perubahan kemampuannya menahan/meneruskan aliran listrik, yang dapat diukur dan dikorelasikan dengan populasi mikrobia.
-
Enzyme Immuno-Assay misal: ELISA = Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay
Prinsip kerja : -
Antibodi akan terbentuk bila ada antigen (benda asing yang dianggap mengganggu), dan berusaha menghancurkannya (immune system)
-
Reaksi immunitas antigen - antibody (=immunoglobulin) ini spesifik dan akurat
-
Dengan menempelkan enzim pada antibody tertentu yang khusus diproduksi untuk bereaksi dengan mikrobia tertentu dapat dideteksi mikrobia ybs melalui reaksi oleh enzim yang ditempelkan.
IMMUNO ASSAY Dasar: -
Antibodi
akan
terbentuk
bila
ada
benda
asing
yang
dianggap
mengganggu (antigen) dan berusaha mengeliminasinya (immune system) -
Reaksi imunitas antigen-antibodi-(immunoglobulin) ini spesifik dan akurat
-
Antibodi dapat dimanfaatkan sebagai pemburu antigen (racun, mikrobia) yang dicari.
Terbentuknya kompleks antigen-antibodi dapat menimbulkan endapan/clump atau aglutinasi tetapi tidak jelas dan sukar diamati. Solusi: pemberian label/tag pada protein antibodinya dengan molekul pelacak yang terikat secara kimiawi. Syarat: -
Ikatan
yang
terbentuk
tidak
menyebabkan
melemahkan) immunoactivity Antigen-Antibody
Universitas Gadjah Mada
gangguan
(merusak/
-
Terbentuk/terjadi immobilisasi antara antigen atau antibodi dengan suatu solid-support, tanpa mengganggu immunoactivity dan/atau spesifitasnya
Label yang sudah digunakan : -
molekul radioaktif
-
chemiluminescent molecules
-
Enzyme (stabil, mudah operasinya, substratnya mudah disiapkan, mudah ditera secara colorimetric atau spectrophotometric) •
Horseradish peroxydase
•
Alkaline phosphatase
•
B-galactosidase
•
Asetyl-cholinesterasi
Solid support yang sudah digunakan: polystyrene, polyvinil, polyacrylamide, glass, silica, nylon, titanous ydroxide, nitrocellulose, agarose Aplikasi :
Immunocapture, misal ELISA Agglutinous Assay — adanya lebih dari satu binding site --> cross linked terjadi molekul besar atau clumping cells --> visible
-
Elisa tersedia berupa kits yang makin ringkas, dapat diautomisasi dengan komputer.
-
Sensitif 1 jig atau ng toksin; 104 -105 sel/ml
-
Cepat1-2jam
Teknologi Immuno-Assay
-
Produksi antibody (Immunoglobulin) o
menyuntikkan antigen (Ag) tertentu (misalnya Salmonella, racun, protein tertentu) pada hewan (kelinci, kambing, domba, dsb)
o
mengambil
darah
hewan
yang
telah
disuntik
dan
dipisahkan serum yang mengandung antibody tertentu -
Produksi Antibody yang ditempeli enzim
-
Pengujian sampel terhadap mikrobia atau racun (antigen) tertentu o
Menempelkan antigen (sampel) atau antibody pada suatu bahan (fase padatan tertentu)
Universitas Gadjah Mada
o
Mereaksikan antigen dengan antibody atau antibody dengan antigen
o
Mereaksikan enzim yang menempel pada antibody dengan substrat yang sesuai
o
Mendeteksi atau menera reaksi enzim terhadap substrat
o
Mengevaluasi hasil reaksi
Ada 3 cara mereaksikan antigen-antibody dan peneraan reaksi enzimnya 1. Enzyme Immuno-Assay Langsung a. Menempelkan Ag (sampel) pada padatan penyangga. Bahanbahan yang tidak menempel dicuci.
b. Mereaksikan antibody yang ditempeli enzim (E-Ab) dengan Antigen (Ag). Bahan-bahan yang tidak menempel dicuci.
c. Mereaksikan substrat yang sesuai dengan enzim yang menempel pada antibody
Universitas Gadjah Mada
d. Menera reasksi E + S
P+E
Misalnya dengan spektrofotometer dapat ditera pengurangan substrat atau terbentuknya produk. 2. Enzyme Immuno-Assay Sandwich
3. Enzyme Immuno-Assay Tidak Lansung
Universitas Gadjah Mada
Enzim yang telah digunakan a.l: Peroksidase, alkaline phosphatase, glikosidase Penyangga fase padat yang telah digunakan untuk menempel (immobilized) a.l.: -
tabung polistiren
-
tabung polivinil
Keduanya berisi suspensi Titanous hidroksida
DNA PROBE Prinsip kerja : -
DNA memiliki benang double helix yang komplementer secara spesifik satu sama lain, dengan urutan basa nukleotida sebagai cirinya.
-
Benang double helix dapat terurai secara reversibel dengan perlakuan panas atau perlakuan kimia.
-
Benang tunggal DNA dapat dipecah dengan enzim nuclease menjadi segmen-segmen kecil yang masih membawa ciri genetik.
-
Segmen DNA tunggal ini dapat bergabung dengan benang tunggal komplementernya yang utuh.
Urutan kerja dalam penentuan dengan DNA probe : a. sampel ditampung dalam bahan penyangga, misal membran filter b. diperlakukan dengan detergen untuk membuka double heliks c c. perlakukan dengan enzim untuk melepas double heliks Bahan-bahan non DNA didigesti, benang DNA dilekatkan pada penyangga (filter) d. DNA-probe (segmen DNA yang diberi label isotop) direaksikan pada bahan,
segmen-segmen
DNA
akan
mencari
pasangannya
dan
menempel. e. Sisa DNA-probe yang tidak terikat dicuci, DNA probe yang menempel (terikat) dihitung. DNA probe dapat ditempeli muatan radioaktif, enzim, senyawa fluorescent atau antibodi.
Universitas Gadjah Mada
Biosensor Mengubah proses reaksi dari suatu metoda penentuan, misalnya enzimatis menjadi sinyal fisis, kemudian sinyal tersebut diperkuat dan selanjutnya dibaca dengan komputer Æ print out hasil.
Universitas Gadjah Mada
